Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Induktion von Lungenfibrose bei Mäusen durch wiederholte oropharyngeale Verabreichung von Bleomycin, das pathologische Merkmale hervorbringt, die denen der idiopathischen Lungenfibrose sehr ähnlich sind.
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Methodenartikel
Verfeinertes Mausmodell der idiopathischen Lungenfibrose
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Tiermodelle spielen eine entscheidende Rolle, um Krankheitsmechanismen zu verstehen und mögliche Therapieansätze zu testen. Traditionelle Mausmodelle der idiopathischen Lungenfibrose (IPF), die auf einer Einzeldosis-Bleomycin-Injektion beruhen, können jedoch die komplexen pathologischen Merkmale, die bei IPF-Patienten beobachtet wurden, nicht genau replizieren. In dieser Studie wird eine verbesserte Methode vorgestellt, bei der zwei aufeinanderfolgende oropharyngeale Verabreichungen von Bleomycin bei Mäusen verwendet werden, die das Fortschreiten der IPF effektiver nachahmt. Dieses neuartige Protokoll induziert wichtige pathologische Veränderungen, wie z. B. die Bildung von wabenartigen Zysten, fibroblastischen Herden und die Bronchiolisierung des Alveolarepithels, die der Histopathologie der menschlichen IPF sehr ähnlich sind. Durch die Verwendung dieses Modells sind wir in der Lage, die fortschreitenden fibrotischen Veränderungen über einen längeren Zeitraum zu erfassen, was zuverlässigere Einblicke in die Pathogenese der IPF ermöglicht. Darüber hinaus bietet dieser Zwei-Dosen-Ansatz mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Einzeldosismodellen, darunter eine bessere Reproduzierbarkeit und eine robustere Darstellung des Krankheitsverlaufs. Diese Methode verbessert unsere Fähigkeit, die Mechanismen, die der IPF zugrunde liegen, zu untersuchen und mögliche therapeutische Interventionen zu bewerten. Das vorgeschlagene Protokoll bietet einen bedeutenden Fortschritt in der präklinischen Forschung und stellt ein wertvolles Werkzeug dar, um sowohl die Biologie der Lungenfibrose als auch die Wirksamkeit neuartiger Behandlungen zu untersuchen.
Einleitung
Die idiopathische Lungenfibrose (IPF) ist eine fortschreitende und tödliche interstitielle Lungenerkrankung, die durch eine irreversible Schädigung des Lungenparenchyms gekennzeichnet ist und zu schwächenden Symptomen wie Dyspnoe und einer starken Verschlechterung der Lebensqualität führt 1,2. Histologisch manifestiert sich die IPF wie die übliche interstitielle Pneumonie (UIP) mit räumlich heterogener Fibrose, Bronchiolisierung des Alveolarepithels und fibroblastischen Herden3. Trotz ihrer klinischen Bedeutung unterstreichen die komplexe Pathogenese der IPF und die begrenzten therapeutischen Möglichkeiten den dringenden Bedarf an robusten experimentellen Modellen, um das mechanistische Verständnis und die Therapieentwicklung voranzutreiben.
Bestehende Bleomycin-Modelle mit einer Einzeldosis sind zwar weit verbreitet4, rekapitulieren jedoch nicht die wichtigsten pathologischen Merkmale der menschlichen IPF, wie z. B. die KRT5+-Basalzellkapseln 5,6,7 und persistente fibroblastische Herde, und weisen eine selbstauflösende Fibrose auf 8. Die wiederholte Verabreichung von Bleomycin verbessert die pathologische Treue 9,10, wird jedoch durch technische Komplexität, hohe Mortalität und verlängerte Modellierungszyklen behindert11,12. Um diese Einschränkungen zu beheben, haben wir ein optimiertes Mausmodell mit zweimal wiederholter oropharyngealer Bleomycin-Verabreichung entwickelt13. Dieser Ansatz kombiniert die pathologische Vollständigkeit der repetitiven Verletzungsmodelle 9,10 mit den technischen Vorteilen der nicht-invasiven Verabreichung, wodurch eine anhaltende fibrotische Progression über 60 Tage hinaus bei gleichzeitig niedriger Mortalität erreicht wird. Durch die genaue Nachahmung der menschlichen IPF-Pathologie, einschließlich wabenartiger Zystenbildung und persistierender Fibrose, bietet unsere Methode eine robuste Plattform für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen und die Bewertung therapeutischer Interventionen.
Das Protokoll eignet sich besonders für Forscher, die chronisch fibrotische Modelle ohne chirurgische Komplikationen benötigen. Es bietet erhebliche Vorteile gegenüber bestehenden Ansätzen in Bezug auf Reproduzierbarkeit, klinische Relevanz und Einhaltung von Tierschutzrichtlinien. Aufbauend auf etablierten oropharyngealen Techniken fördern diese Verfeinerungen die präklinische IPF-Forschung, indem sie kritische Lücken zwischen experimentellen Modellen und der Pathologie menschlicher Krankheiten schließen.
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Protokoll
Hier wurden C57BL/6 männliche Mäuse im Alter von 4-6 Monaten verwendet. Alle Versuche mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit dem Tierprotokoll durchgeführt, das vom Labortierforschungszentrum der Sun Yat-sen Universität genehmigt wurde (Zulassungsnummer SYSU-IACUC-MED-2021-B0076). Die Studie hielt sich an die Tierhaltungsrichtlinien, die vom Sun Yat-sen University Institutional Animal Care and Use Committee festgelegt wurden.
1. Vorbereitung auf das Experiment
- Reagenzien: Erwerben Sie Bleomycin-Pulver, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Isofluran.
- Ausrüstung: Besorgen Sie sich Pipettenspitzen (200 μl), Pipette, Tracheal-Injektionsständer, 1 mL Pipettenspitzenbox und Alkohol-Wattebällchen.
2. Experimenteller Ablauf
- Bereiten Sie eine Bleomycin-Stammlösung in einer Konzentration von 1,5 mg/ml mit PBS als Lösungsmittel vor. Aliquotieren Sie 600 μl der Stammlösung in 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen und verdünnen Sie sie mit 1200 μl PBS, um eine 3-fache Verdünnung zu erreichen (Endkonzentration: 0,5 mg/mL).
HINWEIS: Die Bleomycin-Stammlösung wurde bei -20 °C gelagert und blieb bis zu 3 Monate lang stabil. - Wiegen Sie jede Maus vor der oropharyngealen Verabreichung. Berechnen Sie das erforderliche Volumen der Bleomycin-Lösung basierend auf dem Körpergewicht der Maus. Die Dosierung beträgt 1,5 mg/kg, und das Injektionsvolumen (in μl) entspricht dem Gewicht der Maus (in Gramm) multipliziert mit 3 (aufgrund der 3-fachen Verdünnung).
- Legen Sie mehrere mit Alkohol getränkte Wattebällchen auf den Boden einer 1-ml-Pipettenspitze. Geben Sie 1 ml Isofluranflüssigkeit auf das Wattepad am Boden der Pipettenspitze. Legen Sie die Maus sofort in die Pipettenspitzenbox, um eine Anästhesie einzuleiten. Überwachen Sie die Maus, bis sich ihre Atmung verlangsamt, was auf eine angemessene Anästhesie hinweist, und entfernen Sie sie dann sofort.
HINWEIS: Während der Induktion der Isofluran-Anästhesie in einer verschlossenen Pipettenspitzenbox zeigen Mäuse einen charakteristischen respiratorischen Übergang von der anfänglichen Tachypnoe zur nachfolgenden Bradypnoe. Die sofortige Entfernung zu Beginn der Bradypnoe ist entscheidend, um eine Überdosierung von Anästhetika zu verhindern. Eine vorzeitige Entfernung während der Tachypnoe kann zu einer vorzeitigen Erregung während der Verabreichung von oropharyngealem Bleomycin führen. - Befestigen Sie die Maus auf dem Trachealinjektionsständer, indem Sie ihre Zähne einhaken. Ziehen Sie die Zunge vorsichtig mit einer Pinzette heraus und halten Sie sie mit Daumen und Zeigefinger fest (vermeiden Sie die Verwendung einer Pinzette, um Beschwerden zu minimieren). Bedecken Sie die Nase der Maus mit dem Mittelfinger, um die richtige Abgabe zu gewährleisten.
- Aspirieren Sie mit einer 200-μl-Pipettenspitze das berechnete Volumen der verdünnten Bleomycin-Lösung und verabreichen Sie die Bleomycin-Lösung langsam in den Oropharynx der Maus, ohne die Pipettenspitze tief einzuführen. Dieser Ansatz minimiert Gewebeschäden und gewährleistet eine effektive Verabreichung.
- Achten Sie auf ein deutliches gurgelndes Geräusch, das anzeigt, dass die Lösung erfolgreich in die Lunge gelangt ist. Sobald der Ton verstummt, nehmen Sie die Maus vom Ständer und legen Sie sie zur Wiederherstellung auf ein Heizkissen.
HINWEIS: Ein charakteristisches gurgelndes Geräusch dient als zuverlässiger Indikator für die erfolgreiche Abgabe von Bleomycin in den Oropharynx. Das Fehlen dieses akustischen Hinweises deutet auf eine Ösophagusablagerung hin, bei der das Subjekt aufgrund fehlgeschlagener Verabreichung von nachfolgenden experimentellen Verfahren ausgeschlossen wird. - Wiederholen Sie das oropharyngeale Verabreichungsverfahren 7 Tage nach der Anfangsdosis.
3. Entnahme von Gewebe
- Euthanasieren Sie die Mäuse durch Zervixdislokation zu den festgelegten Zeitpunkten (14 und 60 Tage nach der letzten Verabreichung von Bleomycin).
- Führen Sie eine Mittellinien-Sternotomie durch, um die Brusthöhle freizulegen. Das linke Vorhofohr wurde operativ eingeschnitten. Anschließend perfundieren Sie die Lunge durch den rechten Ventrikel mit 10 ml eiskaltem PBS, um zirkulierende Blutzellen zu entfernen.
- Kanülieren Sie die Luftröhre und blasen Sie die Lunge mit 1 % Paraformaldehyd (PFA) auf, um eine vollständige Gewebefixierung zu gewährleisten.
- Schneiden Sie die Lungen heraus und tauchen Sie sie 1 h lang bei Raumtemperatur in 1 % PFA, um eine korrekte Fixierung zu ermöglichen.
- Für die Gewebeaufbereitung spülen Sie die fixierten Gewebe in PBS 3x für jeweils 5 min aus. Dehydrieren Sie das Gewebe nacheinander mit einer abgestuften Ethanolserie: 70 % Ethanol, 95 % Ethanol und 100 % Ethanol, um bei jedem Schritt eine vollständige Dehydrierung zu gewährleisten. Nach der Dehydrierung das Gewebe 1 h lang bei Raumtemperatur von Xylol reinigen. Anschließend wird das Gewebe mindestens 2 Stunden lang oder bis zur vollständigen Infiltration bei 60 °C in geschmolzenes Paraffinwachs eingebettet. Zum Schluss wird das eingebettete Gewebe mit einem Rotationsmikrotom in einer Dicke von 7 μm geschnitten.
4. Stichproben-Bewertung
- Führen Sie Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) und Masson-Trichrom-Färbung durch, um den Schweregrad der Fibrose zu beurteilen.
- Für die H&E-Färbung führen Sie eine sequentielle Xylol-Deparaffinisierung für 5 min, 2x und eine abgestufte Ethanol-Rehydrierung mit 100 % Ethanol für 5 min durch, gefolgt von 100 % Ethanol für 1 min, dann 95 % Ethanol für 1 min und schließlich 80 % Ethanol für 1 min. Mit destilliertem Wasser abspülen. 5 min mit Hämatoxylin färben, anschließend 3x mit Leitungswasser abspülen und 5 min einweichen. Führen Sie dann 1 min lang einen 80%igen Ethanoldip und eine Gegenfärbung mit Eosin für 45 s durch. Führen Sie eine Dehydrierung mit abgestuftem Ethanol mit 95 % Ethanol für 5 Dips durch, gefolgt von 100 % Ethanol für 5 Dips und tauchen Sie schließlich 2 Minuten lang in 100 % Ethanol ein. Mit Xylol reinigen, indem Sie 5 min, 2x eintauchen und dann eine neutrale Balsammontage durchführen.
- Bei der Masson-Färbung werden die Objektträger nach der Entparaffaffinierung wie in Schritt 4.1.1 in ddH2O gespült und 5 s lang mit Ponceau S-Fuchsin gefärbt, gefolgt von einer 0,2%igen schwachen sauren Lösung (Essigsäure/Wasser) 1 min lang gespült. Die Differenzierung in Phosphomolybdsäurelösung für 5 min mit anschließender Spülung mit schwacher Säure für 1 min, gefolgt von einer Anilinblau-Gegenfärbung für 1 min und einer abschließenden Wäsche mit schwacher Säure für 1 min. Dehydrieren Sie die Abschnitte durch gradiertes Ethanol, beginnend mit 95 % Ethanol für 2-3 s, gefolgt von absolutem Ethanol für 5-10 s, 2x. In Xylol löschen und mit Harz einbinden.
- Durchführung immunhistochemischer (IHC) und Immunfluoreszenzfärbung (IF) für Marker wie α-SMA, KRT5 und ΔN-p6314,15 zur Beurteilung des fibrotischen und epithelialen Remodelings.
- Für die immunhistochemische Färbung ist die Entparaffinierung und Rehydrierung von paraffineingebetteten Gewebeschnitten vor der Antigengewinnung in siedendem 0,1 M Natriumcitratpuffer (pH 6,0) mit 0,5 % Tween-20 für 90 s durchzuführen. Quenchierung der endogenen Peroxidaseaktivität mit 3 % H2O2, gefolgt von Membranpermeabilisierung mit 0,5 % Triton X-100/PBS und unspezifischer Blockierung. Inkubation in einem Primärantikörper bei 4 °C über Nacht, gefolgt von einer 1-stündigen Inkubation bei Raumtemperatur mit speziesangepassten Sekundärantikörpern und einer 30-minütigen Streptavidin-HRP-Konjugation. Verwenden Sie für die chromogene Entwicklung das Vector SK-4100 DAB-Substrat mit Hämatoxylin-Gegenfärbung, Ethanol-Dehydratisierung und neutraler Balsammontage, um das Protokoll abzuschließen.
- Für die Immunfluoreszenzfärbung werden biotinylierte Ziele nach immunhistochemischer Standardprozessierung (Entparaffinierung, Antigengewinnung, Blockierung, Inkubation von Primär- und Sekundärantikörpern) mit Streptavidin-konjugiertem Alexa Fluor 594 oder 647 (1:500 Verdünnung, 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur) markiert. Führen Sie eine nukleare Gegenfärbung mit DAPI (20 μg/mL Endkonzentration) für 5 Minuten durch, gefolgt von einer Einbettung mit Antifading-Medium, um die Fluoreszenzsignale zu erhalten.
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Ergebnisse
Im Vergleich zur traditionellen Einzeldosis-Verabreichung von oropharyngealem Bleomycin rekapituliert diese Methode erfolgreich charakteristische pathologische Merkmale der IPF, einschließlich fibroblastischer Herde (Abbildung 1B), Wabenbildung (Abbildung 1G) und Bronchiolisierung des Alveolarepithels (Abbildung 1H). Wichtig ist, dass das Modell die Persistenz dieser Merkmale über die Zeit demonstriert (Abbildun...
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Diskussion
In dieser Studie präsentieren wir ein verfeinertes Mausmodell der IPF unter Verwendung einer zweimal wiederholten oropharyngealen Verabreichung von Bleomycin. Dieser Ansatz adressiert die kritischen Einschränkungen traditioneller Einzeldosismodelle, die es versäumen, wichtige pathologische Merkmale der menschlichen IPF zu rekapitulieren, wie z. B. KRT5+ und p63+ Basalzellkapseln 7,14,15, persist...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.
Danksagungen
Diese Forschung wurde vom Shenzhen Scienceand Technology Program (Grant #JCYJ20230807110800002 to C.L.), der Natural Science Foundation of Guangdong (#2024A1515011087 to C.L.) und dem Science and Technology Program of Guangzhou (# 202201020299 to Z.L.) finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Verwendetes Reagenz | |||
| bleomycin | MCE | HY-17565 | |
| H& E Färbeset | Solarbio GmbH | Nr. G1120 | |
| Isofluran | RWD | Nr. R510-22-10 | |
| Das Färbeset von Masson | Solarbio GmbH | Nr. G1340 | |
| PBS | Bioscharf | BL302A | |
| Verwendete Antikörper | Verdünnung | ||
| α-SMA | Abcam (Englisch) | AB5694 | 1:100 |
| Cytokeratin 5 | Immunoway | Nr. YT1271 | 1:100 |
| DeltaN p63 | CST | 67825 | 1:100 |
| Ziege Anti-Kaninchen IgG H& L(Biotin) | Abcam (Englisch) | AB6720 | 1:800 |
| Hydroxyprolin | CST | 73812 | 1:100 |
| Peroxidase-konjugiertes Streptavidin | Jackson | 016-030-084 | 1:100 |
| Streptavidin / AF594 | Biografie | bs-0437P-AF594 | 1:500 |
Referenzen
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