Multielektroden-Array-Aufzeichnungen von Netzhautwellen mit hoher Dichte unter Verwendung einer Elektrophysiologie-Plattform

Summary

Multielektroden-Arrays mit hoher Dichte (HD-MEAs) werden verwendet, um spontane Netzhautwellen zu untersuchen, die eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung neuronaler Schaltkreise spielen. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Präparation von Netzhautgewebe von Mäusen und zur Durchführung elektrophysiologischer Aufzeichnungen mit HD-MEAs auf einer elektrophysiologischen Plattform.

Abstract

Spontane Netzhautwellen sind ein Kennzeichen der retinalen Netzwerkaktivität während der Entwicklung und spielen eine entscheidende Rolle bei der Bildung des visuellen Systems, indem sie die Verfeinerung von Axonen, die Permeabilität des Gefäßsystems und die allgemeine Reifung der neuronalen Schaltkreise beeinflussen. Diese Wellen werden üblicherweise in ex vivo Netzhautpräparationen unter Verwendung von Multielektrodenarrays (MEAs) untersucht, die elektrophysiologische Aufzeichnungen großer Populationen der Aktivität von retinalen Ganglienzellen (RGC) ermöglichen. Die MEA-basierte Elektrophysiologie hat sich aufgrund ihrer einfachen Handhabung zur schnellen Erfassung von Hochdurchsatzdaten zu einem leistungsfähigen Werkzeug entwickelt, wodurch sie sich ideal für die Untersuchung der Netzhautaktivität unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen eignet.

In diesem Protokoll skizzieren wir die kritischen Schritte zur Vorbereitung von Netzhautgewebe für die Erfassung elektrophysiologischer Daten mit Hilfe einer High-Density-MEA (HD-MEA) auf einer elektrophysiologischen Plattform. Der Prozess beginnt mit der sorgfältigen Isolierung intakter Netzhäute von neugeborenen Tieren unter physiologischen Bedingungen. Nach der Präparation wird die Netzhaut sorgfältig auf einen HD-MEA-Chip montiert, der aus einem Gitter von 26.400 Elektroden besteht, das in der Lage ist, gleichzeitige extrazelluläre Aufzeichnungen von mindestens 1.000 RGCs durchzuführen. Die Aufzeichnungen können bis zu mehreren Stunden dauern. Letztendlich bietet dieser methodische Ansatz wertvolle Anwendungen bei der Untersuchung der Netzhautentwicklung, von Krankheiten und potenziell speziesübergreifenden Vergleichsstudien und trägt zu breiteren Fortschritten in den Neurowissenschaften und der Sehforschung bei.

Introduction

Spontane Netzhautwellen sind periodische Ausbrüche korrelierter Aktivität, die in der sich entwickelnden Netzhaut vor dem Einsetzen des Sehvermögens beobachtet wurden. Bei Mäusen verändern sich die Schaltkreise, die Netzhautwellen auslösen und ausbreiten, während der Entwicklung rapide und beginnen embryonal und enden mit der Augenöffnung (postnataler Tag 14)¹. Mit der Entwicklung von Netzhautschaltkreisen ändern sich die raumzeitlichen Eigenschaften der Netzhautwellen dramatisch ^2,3. Mehrere Studien belegen, dass diese spezifischen raumzeitlichen Eigen....

Protocol

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Isolierung und Aufbereitung von Netzhautgewebe von neugeborenen Mäusen für MEA-Aufzeichnungen von Netzhautwellen unter Verwendung der HD-MEA-Plattform von Maxwell Biosystems. Das Verfahren ist so konzipiert, dass die physiologischen Bedingungen erhalten bleiben und sichergestellt wird, dass das Netzhautgewebe strukturell intakt, frei von Beschädigungen und richtig vorbereitet für einen optimalen Elektrodenkontakt bleibt. Diese Versuche wurden vom Vanderbilt Animal Care and Use Program unter der Protokollnummer M2200056-00 genehmigt. Die Mäuse (1-2 Wochen alt, beide Geschlechter) wurden in e....

Results

Hochdurchsatz-Aufzeichnungen und Analysen von Netzhautwellen mit HD-MEAs
Wir führten eine einstündige HD-MEA-Aufzeichnung von spontanen Netzhautwellen durch (Abbildung 2). Ein Rasterdiagramm der neuronalen Aktivität zeigt das strukturierte Muster der Netzhautwellen, wobei jeder Punkt ein detektiertes Aktionspotential einer einzelnen Elektrode darstellt (Abbildung 2A, unten). Die Summierung der Aktivität über die Elektroden hi.......

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll bietet ein reproduzierbares Hochdurchsatzverfahren zur Präparation von Netzhautgewebe und zur Durchführung von HD-MEA-Aufzeichnungen und bietet ein robustes Verfahren zur Untersuchung der Netzhautnetzwerkaktivität. Die HD-MEA-Technologie bietet erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen elektrophysiologischen und bildgebenden Verfahren, insbesondere bei der Erfassung von Hochdurchsatzdaten. HD-MEA liefert Echtzeit-Aufzeichnungen der spontanen Netzhautwell.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL Einweg-Transferpipette (mit abgeschnittenem Ende)	Fisherbarnd	13-711-9CM	Hilft beim Bewegen der Netzhaut zwischen Petrischale.
Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF)			Erhält die physiologischen Bedingungen für das Netzhautgewebe; bestehend aus NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, CaCl2, MgCl2, Glukose und mit Carbogen blasiert.
CaCl2	Fisher Chemicals	C79-500	Zur Herstellung von künstlichem Liquor cerebrospinalis (aCSF)
Carbogen-Versorgung (95% O2, 5% CO2)			Wird verwendet, um aCSF mit Sauerstoff anzureichern und die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten.
Skalpell mit gebogener Klinge (#10)	Integra	4-110	Wird verwendet, um Gewebe mit Präzision zu schneiden.
Präpariermikroskop (Stereoskop)	Zeiss	Stemi 508	Unverzichtbar für die Visualisierung und Handhabung von Netzhautgewebe.
Glukose	Fisher Chemicals	BP350-1	Zur Herstellung von künstlichem Liquor cerebrospinalis (aCSF)
Inline-Heizung	Multichannel System	TC02	Erwärmt aCSF auf 32-34°; C für optimale Bedingungen.
Ismatec Perfusionssystem	Ismatec	ISM4208	Sorgt für einen kontinuierlichen Fluss von sauerstoffreichem aCSF.
KCl	Fisher Chemicals	P271-500	Zur Herstellung von künstlichem Liquor cerebrospinalis (aCSF)
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5504-100g	Zur Aufbereitung von künstlichem Liquor cerebrospinalis (aCSF)
MaxOne Recording Unit	Maxwell Biosystems	MX1-BRD	Schnittstelle zwischen MaxOne Chip und System
MaxOne System	Maxwell Biosystems	MX1-SYS Core-System	für MEA-basierte elektrophysiologische Rekodierungen.
MaxOne Tissue Holder mit 3-Achsen-Mikromanipulator und austauschbaren Einsätzen	Maxwell Biosystems	MX1-HLD	Sorgt für eine präzise Platzierung der Netzhaut auf dem MEA-Chip.
MEA-Chip (MX1-S-CHP, MaxWell Biosystems)	Maxwell Biosystems	MX1-S-CHP	Mikroelektroden-Array mit hoher Dichte zur Aufzeichnung der neuronalen Aktivität.
MgCl2	Fisher Chemicals	M33-500	Zur Herstellung von künstlichem Liquor cerebrospinalis (aCSF)
NaCl	Fisher Chemicals	S271-1	Zur Herstellung von künstlichem Liquor cerebrospinalis (aCSF)
NaHCO3	Fisher Chemicals	S233-500	Zur Herstellung von künstlichem Liquor cerebrospinalis (aCSF)
Nadel (30 G x ½)	BD Biosciences	305106	Hilft bei der Herstellung von Schnitten in der Hornhaut.
Neugeborene Tiere (P1-P14; Maus)			Modellorganismen wie Mäuse, Ratten oder andere, die für Netzhautstudien verwendet werden.
PC mit MaxLab Live Scope Software	HP	Z4	Wird zur Datenerfassung und Analyse von Aufnahmen verwendet.
Petrischale (35 mm oder 60 mm)	Pyrex	3483E12	Wird als Arbeitsbereich zum Sezieren verwendet.
Roboz Micro Adson-Pinzette (RS-5232, 4.75" lang, 1 x 2 Zähne, 0.5 mm Spitze)	Roboz	RS-5232	Spezialisierte Pinzette für die Feindissektion.
Roboz Federschere (RS-5671, 10 mm Schneide, 0,15 mm Spitzenbreite, 3¾ " Gesamtlänge)	Roboz	RS-5671	Präzisionsschere zum Schneiden von empfindlichem Gewebe.
Einhaarpinsel			Kleiner Pinsel, der zu einem einzigen Haar modifiziert wurde, um empfindliches Gewebe zu handhaben.
Zwei Pinzetten mit feiner Spitze	Roboz	RS-5060	Wird für die Handhabung von empfindlichem Gewebe verwendet.
Whatman Filterpapiere (#1), in kleine Stücke geschnitten	GE Healthcare	1001-042	Wird zum Behandeln und Trocknen von Netzhautgewebe verwendet.