Methodenartikel

Quantifizierung von Violacein in Chromobacterium violaceum und seine Hemmung durch bioaktive Verbindungen

DOI:

10.3791/68507

⸱

8. August 2025

 ,  ,  , 
1Food Research Center, Department of Food and Experimental Nutrition, Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo (USP)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das Ziel dieses Protokolls ist die Quantifizierung der Violaceinproduktion durch Chromobacterium violaceum ATCC 12472 als Proxy für die Beurteilung der Quorum-Sensing-Hemmung durch bioaktive Verbindungen.

Zusammenfassung

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Bakterien kommunizieren über ein System, das als Quorum Sensing (QS) bekannt ist und es ihnen ermöglicht, ihr Verhalten als Reaktion auf Veränderungen der Zelldichte zu koordinieren. Dieser Prozess umfasst die Produktion, Sekretion und den Nachweis kleiner extrazellulärer Signalmoleküle, die normalerweise als Autoinduktoren (AI) bezeichnet werden. QS reguliert eine Vielzahl von Genen und Funktionen, darunter die Bildung und Ausbreitung von Biofilmen, die Motilität des Schwarms, die Produktion von Virulenzfaktoren, Antibiotikaresistenz und Biolumineszenz. Die QS-Hemmung hat sich zu einer vielversprechenden Antivirulenzstrategie gegen antibiotikaresistente Bakterien entwickelt, da sie im Vergleich zu herkömmlichen Antibiotika einen geringeren Selektionsdruck ausübt. Im Bakterium Chromobacterium violaceum ATCC 12472 steuern die QS-Proteine CviI/CviR, die homolog zu den LuxI/LuxR-Typ-QS-Proteinen von Aliivibrio fisheri sind, viele Gene, darunter auch diejenigen, die für die Produktion des violetten Pigments Violacein verantwortlich sind. C. violaceum wurde häufig als Biosensorstamm in QS-Inhibitionsstudien verwendet, insbesondere zur Hemmung der Violaceinproduktion. Viele Verbindungen haben das Potenzial, QS zu hemmen, indem sie an QS-Proteine binden, entweder an LuxI- oder LuxR-Homologe, und so die QS-Schaltkreise stören. Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Quantifizierung von Violacein, das von C. violaceum ATCC 12472 produziert wird, und seine Hemmung durch bioaktive Verbindungen in Konzentrationen, die das Bakterienwachstum nicht beeinflussen. Der hier beschriebene Assay zeigt eine signifikante Verringerung der Violaceinproduktion durch die getesteten Verbindungen. Diese Studie unterstreicht das Potenzial für die Verwendung dieses Protokolls, um vielversprechende Kandidaten in der QS-Hemmungsforschung zu screenen.

Einleitung

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Bakterien können über ein System namens QS kommunizieren, das eine koordinierte Modulation ihres Verhaltens als Reaktion auf Veränderungen der Zelldichte ermöglicht. Dieser Prozess beinhaltet die Produktion, Sekretion und den Nachweis von kleinen extrazellulären Signalmolekülen, auch Autoinduktoren genannt, die die Kommunikation sowohl zwischen verschiedenen Spezies als auch innerhalb derselben Spezies ermöglichen 1,2.

Diese Kommunikation ist in der Lage, Gene und Funktionen wie Biofilmbildung und -dispersion, Motilität und Adhäsion, Zellproliferation, Synthese von Exoenzymen und Siderophoren, Sporulation, Säureresistenz, horizontaler Gentransfer, Antibiotikaresistenz, Biolumineszenz, Produktion von Exopolysacchariden usw. zu regulieren 3,4,5. Angesichts der Relevanz von QS-regulierten Phänotypen besteht ein großes Interesse an der Entwicklung von Systemen, die in der Lage sind, in diese zelluläre Kommunikation einzugreifen. Die Hemmung des QS-Signalwegs wird auch als Quorum Quenching (QQ)6 bezeichnet. QQ kann auf verschiedene Weise auftreten, einschließlich Inhibitoren der Synthese von Autoinduktoren, enzymatischer Inaktivierung dieser Signale und Moleküle mit antagonistischer Wirkung auf diese Moleküle 4,7.

Die wachsende Bedrohung durch Antibiotikaresistenzen hat die Forschung nach alternativen Therapien vorangetrieben, einschließlich Quorum Sensing Inhibitoren (QSIs), die die bakterielle Kommunikation stören, ohne Krankheitserreger direkt abzutöten. Diese Verbindungen können in Kombination mit Antibiotika synergistische Effekte zeigen, die bakterielle Anfälligkeit erhöhen und eine Reduzierung der Antibiotikadosis ermöglichen, was eine Schlüsselstrategie zur Verlangsamung der Resistenzentwicklung ist. Zum Beispiel verzögern Resveratrol und Kanamycin zusammen das Wachstum von Aeromonas hydrophila 8, während N-Acetylcystein mit Tobramycin synergistisch wirkt, um die Biofilme von Pseudomonas aeruginosa zu stören 5.

Angesichts des übermäßigen Einsatzes von Antibiotika und der stagnierenden Medikamentenentwicklung bieten Antivirulenzansätze wie die QS-Hemmung einen Paradigmenwechsel9. Anstatt auf die Lebensfähigkeit abzuzielen, zielen sie auf Virulenzfaktoren ab, wodurch Bakterien weniger schädlich und anfälliger für Wirtsimmunität oder Antibiotika werden5. Diese Strategie führt im Vergleich zu herkömmlichen Antibiotika zu einem schwächeren Selektionsdruck, wodurch die Resistenz minimiert und die nützliche Mikrobiota erhaltenbleibt 10,11. Trotz vielversprechender Laborergebnisse ist die Validierung in der Praxis durch klinische Studien noch wenig erforscht12. Die QS-Hemmung stellt eine vielversprechende Ergänzung zu Antibiotika dar, aber ihre Umsetzung in die Praxis erfordert weitere Nachweise für Wirksamkeit und Sicherheit in komplexen biologischen Umgebungen.

C. violaceum ist ein Beta-Proteobacterium, das violette Kolonien mit einer glatten und glänzenden Oberfläche bildet. Sie sind fakultativ anaerobe Bazillen und bilden keine Sporen13. Der Mechanismus von QS in C. violaceum beinhaltet eine positive Rückkopplungsschleife, die auf dem Gensystem analog zum Lux-Modell von Aliivibrio fisheri basiert, das die Proteine CviI (homolog zu LuxI) und CviR (homolog zu LuxR; Abbildung 1). Violacein zeigt eine biozide Aktivität gegen verschiedene Organismen, einschließlich Pilze, Bakterien, Nematoden und Viren, insbesondere während der mikrobiellen stationären Wachstumsphase, wenn die Populationsdichte extrem hoch ist und die Nährstoffe fast erschöpft sind. Folglich kann die Violaceinproduktion als eine kompetitive Strategie zur Verlängerung des Überlebens der mikrobiellen Kolonie angesehen werden14.

Pflanzen produzieren Verbindungen, die aus dem Sekundärstoffwechsel stammen und eine entscheidende Rolle bei der Steigerung ihrer Fähigkeit spielen, sich an ungünstige Umgebungen anzupassen. Diese Metaboliten wie Alkaloide, Phenole, Flavonoide, Chinonen, Tannine, Terpene und Lektine sind weithin als Abwehrmechanismen gegen Pflanzenfresser und Mikroorganismen anerkannt15. Das Potenzial pflanzlicher Wirkstoffe wie QSI hat aufgrund der dynamischen Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroorganismen besondere Aufmerksamkeit erhalten. Studien zu Pflanzen-Krankheitserreger-Interaktionen in der Rhizosphäre haben gezeigt, dass Pflanzen auf bakterielle Autoinduktoren reagieren können, indem sie bioaktive Verbindungen sezernieren, die als Inhibitoren gegen Krankheitserreger wirken können16.

In dieser Studie beschreiben wir eine praktische Methode, die darauf abzielt, die Violaceinproduktion durch C. violaceum zu quantifizieren, wobei der Schwerpunkt auf der Hemmung durch bioaktive Verbindungen liegt. Diese Methode dient als erstes Screening-Instrument für die Auswahl von Verbindungen mit potenziellen QSI-Aktivitäten. Es bietet einen schnellen und praktischen Ansatz für die zukünftige therapeutische Entwicklung gegen gramnegative pathogene Bakterien. Dieses standardisierte Protokoll wird nützlich sein, da es eine detaillierte Beschreibung liefert, die in früheren Studien nicht durchgeführt wurde, und den Vergleich zwischen verschiedenen Studien in der Zukunft erleichternwird 17,18,19.

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Protokoll

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1. Vorbereitung der Kulturen (Abbildung 2)

  1. Züchten Sie im Reagenzglas eine 5 mL Kultur von C. violaceum ATCC 12472 in Luria Bertani Bouillon (LB: Trypton 10 g/L, Hefeextrakt 5 g/L, 5 g/L NaCl) bei 30 °C in einem Schüttelinkubator (220 U/min) für 24 h.
  2. Die Kultur wird auf einen OD595-Wert von 0,1 in LB-Brühe eingestellt, was ungefähr 1 x 108 KBE/ml entspricht.

2. Zubereitung der Verbindung

  1. In einer 96-Well-Platte mit flachem Boden werden LB-Bouillon und die bioaktive Verbindung gemäß einer seriellen Verdünnungsberechnung gemäß der nachstehenden Beschreibung hinzugefügt. Abhängig von ihrer Löslichkeit werden bioaktive Verbindungen in der Regel in reinem DMSO oder einer DMSO:Wasser-Lösung (1:1) verdünnt.
    HINWEIS: Bei Methoden zur Bewertung der QSI ist es entscheidend sicherzustellen, dass die verwendeten Konzentrationen unter der minimalen Hemmkonzentration (sub-MIC) liegen, was bedeutet, dass sie das Bakterienwachstum nicht beeinflussen. Daher wird empfohlen, Wachstumskurven-Assays in unterschiedlichen Konzentrationen durchzuführen, um zu bestätigen, dass die Verbindung spezifisch die Zell-zu-Zell-Kommunikation und nicht die mikrobielle Lebensfähigkeit hemmt. In der ergänzenden Abbildung 1 finden Sie Wachstumskurven-Assays der getesteten bioaktiven Verbindungen, die in diesem Protokoll verwendet werden.
  2. Um die Konzentration der bioaktiven Verbindung in der Vertiefung unter Berücksichtigung einer Stammlösung von Farnesol und Linalool bei 20 mg/ml und einer Zielkonzentration von 200 μg/ml in der Vertiefung sowie von Resveratrol bei 2,5 mg/ml in der Stammlösung und 25 μg/ml in der Vertiefung zu berechnen, führen Sie die Berechnung wie folgt durch:
    C1V1 = C2V2
    20.000 μg/mL xV 1 = 200 μg/mL x 200 μL
    V1 = 40.000/20.000 μL
    V1 = 2 μL
    wobei C1 = Konzentration der Stammlösung (20 mg/ml, was 20.000 μg/ml entspricht); V1 = Volumen der zuzugebenden Stammlösung; C2 = gewünschte Endkonzentration (200 μg/ml); V2 = Endvolumen in der Vertiefung (200 μL).

3. Serielle Verdünnung20 und Plattenvorbereitung (Abbildung 3)

HINWEIS: Die serielle Verdünnung wird verwendet, um schnell einen Konzentrationsbereich einer getesteten Verbindung zu bewerten. Bei diesem Verfahren wird die Verbindung sukzessive in einem konstanten Verhältnis, in diesem Fall 1:2, verdünnt. Jede Verdünnung verringert die Konzentration der Verbindung um die Hälfte im Vergleich zur vorherigen Konzentration, was zu einem Bereich abnehmender Konzentrationenführt 20.

  1. In der ersten Spalte der seriellen Verdünnung fügen Sie 196 μl LB-Bouillon hinzu (in unserem Beispiel die Spalten 3, 5 und 7). In den folgenden Vertiefungen der seriellen Verdünnung werden 100 μl LB-Bouillon hinzugefügt (in unserem Fall die Spalten 4, 6 und 8).
  2. Dann wird das 2-fache der im vorherigen Schritt (2.2) berechneten Menge an bioaktiver Verbindung hinzugefügt, um eine serielle Verdünnung durchzuführen. Die Berechnung ergab 2 μl jeder getesteten Verbindung, um die Endkonzentration in der ersten Vertiefung zu erreichen, also fügen Sie 4 μl der Verbindung hinzu (Spalten 3, 5 und 7).
  3. Übertragen Sie die Hälfte des Gesamtvolumens der Vertiefung (100 μl) in die nächste Säule (in unserem Fall die Spalten 4, 6 und 8) und so weiter bis zur letzten gewünschten Konzentration, wenn Sie eine serielle Verdünnung durchführen. Denken Sie daran, den Inhalt vor der Übertragung gründlich zu mischen.
    HINWEIS: In diesem Versuchsaufbau haben wir der Einfachheit halber nur zwei Konzentrationen verwendet und alle Verbindungen passen in nur eine Platte.
  4. Das Experiment wird in mindestens dreifacher Ausführung pro Konzentration jeder Verbindung durchgeführt. Drei biologische Replikate werden ebenfalls empfohlen. Wechseln Sie die Spitze und wiederholen Sie den Vorgang bis zur letzten gewünschten Konzentration. Nehmen Sie in der letzten Spalte (in unserem Fall 4, 6 und 8) 100 μl davon und verwerfen Sie sie.
  5. Geben Sie 80 μl LB-Bouillon in alle Vertiefungen, insgesamt 180 μl (Reihen B bis D). Fügen Sie dann 20 μl der in Schritt 1.2 standardisierten C. violaceum-Kultur hinzu und stellen Sie ein Endvolumen von 200 μl pro Vertiefung (Reihen B bis D) sicher. Achten Sie darauf, die Pipettenspitzen jedes Mal zu wechseln, wenn Sie die Vertiefungen wechseln, um eine Verschleppung höherer Konzentrationen zwischen den Vertiefungen oder eine Kontamination zu vermeiden.
  6. Wenn die Verbindung in einem Lösungsmittel gelöst ist, stellen Sie sicher, dass Sie die Kontrolle mit diesem Lösungsmittel vorbereiten. Wir haben DMSO verwendet. In diesem Fall ist eine Lösungsmittelkontrolle vorzubereiten, bei der es sich um die unbehandelte Kontrolle UC (ohne bioaktive Verbindung; Spalte 9) handelt. Fügen Sie 2 μl DMSO pro Kontrollvertiefung hinzu. Dies ergibt eine maximale Konzentration von 1% DMSO im Test.
    HINWEIS: DMSO bei 1% beeinflusst das Bakterienwachstum nicht 21,22.
  7. Bereiten Sie den Rohling vor oder kontrollieren Sie die Farbe, wenn Sie pigmentierte Verbindungen verwenden, ohne Bakterien. Nachdem Sie 80 μl LB-Bouillon in alle Vertiefungen gegeben haben, insgesamt 180 μl (Reihen B bis D, wie zuvor beschrieben), fügen Sie 20 μl LB-Brühe in die entsprechenden leeren Vertiefungen hinzu, insgesamt 200 μl (Reihen E bis G). Dies geschieht, weil es eine gewisse Hintergrundfärbung durch Kristallviolett gibt, die von den OD-Messwerten abgezogen werden muss, wie in Schritt 5 dieses Protokolls beschrieben wird.
  8. Wenn eine Säule leer bleibt, füllen Sie sie mit 200 μl LB-Bouillon oder sterilem destilliertem Wasser (Spalten 1, 2, 10, 11 und 12). Dieser Schritt ist wichtig, um ein übermäßiges Austrocknen des Mediums im Inkubator zu verhindern.

4. Inkubation und Extraktion von Violacein

  1. Decken Sie die Platte je nach verwendetem Spektralphotometer mit einem Deckel oder einer Siegelfolie (wie in der Materialtabelle angegeben) ab, um eine Verdunstung zu verhindern.
  2. Die Platte bei 30 °C und 130 U/min 24 h lang inkubieren. Dann die Platte aus dem Inkubator nehmen, in einen Trockenbrutator bei 60 °C stellen, den Deckel abnehmen und die Platte vollständig trocknen lassen (ca. 8 h).
  3. Nachdem die Platte getrocknet ist, nehmen Sie sie aus dem Inkubator und geben Sie 200 μl reines DMSO in jede Vertiefung und decken Sie sie dann ab. Stellen Sie die Platte bei 25 °C in einen Inkubator und schütteln Sie sie 30 Minuten lang bei 130 U/min, um das Violacein-Pigment aufzulösen.
  4. Nehmen Sie nach dieser Zeit die Platte aus dem Inkubator und geben Sie 100 μl in eine andere Mikroplatte, wobei Sie den Kontakt zwischen der Spitze und den Wänden der Vertiefung vermeiden sollten.

5. Quantifizierung der Violaceinproduktion

  1. Quantifizieren Sie die Menge der Violaceinproduktion durch Messung der Absorption bei 595 nm mit einem geeigneten Plattenspektrophotometer (Materialtabelle). Die Hemmung des Violacein-Pigments ist proportional zu den niedrigeren Absorptionswerten.
  2. Quantifizieren Sie die Violaceinproduktion, indem Sie eine Negativkontrolle (unbehandelte Kontrolle) als Referenz für eine 100%ige Violaceinproduktion verwenden (Tabelle 1). Subtrahieren Sie zunächst den Absorptionswert des Rohlings von jeder Behandlungswiederholung, um die Absorption zu erhalten, die ausschließlich dem Violacein-Pigment entspricht (ohne Interferenz durch die Brühe oder die Verbundfarbe). Berechnen Sie dann den Prozentsatz der Violaceinproduktion für jede Behandlung unter Verwendung der folgenden Gleichung.
    %Violacein-Produktion = (OD der bioaktiven Verbindung / OD der unbehandelten Kontrolle) x 100
  3. Berechnen Sie die statistischen Analysen in drei Replikaten. Die Ergebnisse können an ANOVA übermittelt werden, gefolgt von Tukeys Test mit der GraphPad Prism 8.0-Software. Der Wert von p <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

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Ergebnisse

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Für die hier gezeigten Ergebnisse wurden drei bioaktive Verbindungen verwendet, die zuvor von unserer Forschungsgruppe8 untersucht wurden, Resveratrol, Farnesol und Linalool. Jede Verbindung wurde auf ihre Fähigkeit getestet, die Violaceinproduktion in C. violaceum ATCC 12472 zu hemmen, einem Phänotyp, der durch das QS-System über das vioABCDE-Operon 23 reguliert wird.

Die Ergebnisse bestätigen die Wirksamkeit unseres Protokolls...

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Diskussion

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Die erste Methode zur Extraktion und Charakterisierung von Violacein aus C. violaceum entstand in den 1990er Jahren, wobei der Schwerpunkt auf der Identifizierung geeigneter Kohlenstoffquellen für die Pigmentsynthese lag. Bei diesem Verfahren wurde Violacein - zusammen mit den Zellen und dem Kulturmedium - getrocknet, in Ethanol resuspendiert und dann durch Überstandsextraktion getrennt. Das nun in Ethanol gelöste Violacein wurde anschließend wieder getrocknet, wodurch eine rein...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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Wir danken dem Nationalen Rat für wissenschaftliche Entwicklung (CNPQ) durch die Stipendien #403661/2023-4 und #444794/2024-7 und dem Stipendium #306685/2022-1, der Forschungsstiftung von São Paulo (FAPESP) für die Stipendien #2024/05158-6 und 2023/17090-4 und der finanziellen Unterstützung des Lebensmittelforschungszentrums (FoRC) #2013/07914-8.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMSO Synth
FarnesolSigma-AldrichNr. F20395%
LinaloolSigma-AldrichNr. L260297%
Luria-Bertani MediumDifco244620
Optischer KlebefilmThermo Fischer4311971Mikroverstärker
ResveratrolSigma-AldrichNr. R5010≥ 99% (HPLC)
Synergy HTX Multimode-LesegerätBiotek
Gewebekulturplatten 96 VertiefungKasviNr. K12-096

Referenzen

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Quorum SensingViolacein QuantifizierungQuorum Sensing InhibitionSerielle Verd nnungMikroplatten AssayOptische DichteAntibiotikaresistenzVirulenzfaktoren

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