Neuronale Ferroptose-Abschwächung durch RKIP-Hemmung nach spontaner intrazerebraler Blutung über die Aktivierung des NRF2/HO-1-Signalwegs

Die spontane intrazerebrale Blutung (ICH) ist eine zerebrovaskuläre Erkrankung, die durch Blutungen aufgrund von intrakraniellen Gefäßschäden, Nekrosen und Gefäßrupturen gekennzeichnet ist, die häufig die Basalganglien betreffen und einen der Hauptsubtypen des hämorrhagischen Schlaganfalls darstellen¹. Die Sterblichkeitsrate bei Patienten, bei denen eine ICH diagnostiziert wurde, liegt bei etwa 50 %, und ein erheblicher Teil der Überlebenden erleidet einen schweren Verlust der Selbstständigkeit². Die derzeitigen Behandlungsmöglichkeiten für spontane ICH sind begrenzt, da keine bestehenden Therapien gezeigt haben, dass sie die Mortalität signifikant senken oder die neurologischen Ergebnisse nach der ICH deutlich verbessern.

Ferroptose, eine eisenabhängige Form des programmierten Zelltods, wird durch Lipidperoxidation, Akkumulation von Eisenionen und Erschöpfung von Glutathion definiert, was sie in genetischer, morphologischer und biologischer Hinsicht von anderen Formen des programmierten Zelltods unterscheidet³. Immer mehr Beweise unterstreichen die Rolle der neuronalen Ferroptose in der Pathologie der ICH. Das Raf-Kinase-Inhibitor-Protein (RKIP), auch bekannt als Phosphatidylethanolamin-bindendes Protein 1 (PEBP1), ist an der neuronalen Entwicklung beteiligt und bildet durch seine Bindung an die 15-Lipoxygenase (15LOX), einen Schlüsselregulator der Ferroptose⁴, den 15LOX/PEBP1-Komplex. Die spezifische Rolle und die Mechanismen von RKIP bei der Ferroptose, die mit dem Fortschreiten der spontanen ICH verbunden sind, sind jedoch noch unerforscht.

Diese Studie untersuchte die Anti-Ferroptose-Effekte der RKIP-Hemmung auf Neuronen und zeigte, dass die Hemmung der RKIP-Expression die neuronale Ferroptose nach ICH unterdrücken kann, möglicherweise durch Aktivierung des Kernfaktor-E2-verwandten Faktor 2/Häm-Oxygenase-1 (NRF2/HO-1)-Signalwegs. Diese Erkenntnisse sind wichtig für die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien, die auf die Pathogenese der ICH abzielen.

Kultur von PC12-Zellen
Die PC12-Zelllinie wurde in einem Wachstumsmedium des Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) vermehrt, das 10 % fötales Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin enthielt, wobei die Behandlung routinemäßig unter Standardkulturbedingungen (37 °C, 5 % CO₂ -befeuchtete Atmosphäre) durchgeführt wurde. Für experimentelle Verfahren wurden adhärente Zellen auf Kulturgefäße plattiert und proliferieren gelassen, bis nahezu konfluente Monoschichten (ca. 90 % Oberflächenbedeckung) erreicht wurden. Die zelluläre Dissoziation wurde durch eine enzymatische Behandlung mit 0,25%iger Trypsin-EDTA-Lösung erreicht, gefolgt von drei aufeinanderfolgenden Subkulturzyklen, um die Stabilität der Population zu gewährleisten. Die prozessierten Zellen wurden anschließend für nachgelagerte experimentelle Anwendungen und analytische Bewertungen bereitgestellt.

Assays zur Zellviabilität
Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde bewertet, um die Zytotoxizität von Hemin und Locostatin auf PC12-Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers des Assay-Kits zu bewerten. PC12-Zellen wurden gleichmäßig in 96-Well-Platten ausgesät und 24 Stunden lang mit Hemin oder Locostatin kultiviert. Nach dem Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wurden die Zellen 90 Minuten lang bei 37 °C in RPMI-1640-Medium mit 10%iger Tetrazoliumsalzlösung inkubiert. Die Werte der optischen Dichte (OD) wurden dann bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader gemessen.

Quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)
Die Gesamt-RNA wurde aus PC12-Zellen mit dem RNA-Extraktionsreagenz extrahiert. Zunächst wurde die Probe im Extraktionsreagenz homogenisiert, um eine gründliche Lyse zu gewährleisten. Chloroform wurde der Mischung zugesetzt, kräftig geschüttelt und zentrifugiert, um die Phasen zu trennen (12.000 × g, 15 min, 4 °C). Die wässrige Phase, die die RNA enthielt, wurde gesammelt, und die RNA wurde durch Zugabe von Isopropanol (wässrige Phase: iPrOH = 1:1) ausgefällt und bei Raumtemperatur inkubiert. Die RNA wurde zentrifugiert, um sie zu pelletieren (12.000 × g, 10 min, 4 °C), 1 ml 70 % Ethanol wurde hinzugefügt, um Verunreinigungen zu entfernen, und schließlich wurde das RNA-Pellet in RNase-freiem Wasser zur Lagerung bei -80 °C aufgelöst. Komplementäre DNA (cDNA)-Templates wurden durch reverse Transkription mit dem RT Master Mix erzeugt. Die resultierenden Templates wurden dann im Verhältnis 1:5 verdünnt und einer quantitativen Real-Time-PCR auf einem Real-Time-PCR-Instrument unterzogen. Jede Probe wurde in dreifacher Ausfertigung amplifiziert, und die relative Menge des PCR-Produkts wurde gemittelt. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt, wobei β-Aktin als Haushaltsgen dient. Die relative mRNA-Konzentration wurde mit der Formel E = ^2-ΔΔCt bestimmt, und der Wert des kritischen Schwellenzyklus (CT) wurde für jede Reaktion aufgezeichnet.

Intrazelluläre Assays für reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und Lipidhydroperoxid (LPO)
Die ROS- und LPO-Spiegel wurden mittels Durchflusszytometrie gemessen. PC12-Zellen wurden 24 h lang mit Hemin (80 μM), Locostatin (5 μM) und ML385 (5 μM) behandelt und 3x mit PBS im Geschirr gewaschen. Die Zellen wurden dann bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 40 min in Gegenwart von 2',7'-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA), einer ROS-Sonde, und BODIPY 581/591 C11, einer LPO-Sonde, inkubiert. Nach PBS-Waschungen zur Entfernung überschüssiger Sonden wurde die Fluoreszenzintensität mittels Durchflusszytometrie gemessen. Eine konsistente Gating-Strategie wurde auf alle Proben angewendet: Zuerst wurden die Zellen auf FSC-A vs. SSC-A gegated, um Trümmer auszuschließen, dann wurden einzelne Zellen durch FSC-A- vs. FSC-H-Gating ausgewählt. Ungefärbte Zellen und Zellen, die nur mit Hämin behandelt wurden, wurden als Negativ- und Positivkontrollen verwendet, um die Fluoreszenzkompensation und die Gates zu etablieren. Die Daten wurden mit der verknüpften Software analysiert.

Proteinextraktion und Western Blot
Vollständige Proteinextraktion
Der Überstand der behandelten PC12-Zellen wurde verworfen, gefolgt von drei Waschgängen mit eiskaltem PBS. Die Zellen wurden mit Trypsin geerntet und 5 Minuten lang bei 200 × g zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstands wurde das Zellpellet in einem kalten Radio-Immunpräzipitationsassay (RIPA)-Lysepuffer homogenisiert, der 10 % Proteaseinhibitor und 10 % Phosphataseinhibitor enthielt. Nach einer 30-minütigen Inkubation auf Eis wurde das Lysat bei 12.000 × g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert. Der klare Überstand wurde mit Loading Buffer (4:1) gemischt und 5 min lang auf 95 °C erhitzt, um die Proteine zu denaturieren. Die Proteinproben wurden für die spätere Verwendung bei -80 °C gelagert.

Western-Blot-Analyse
Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE unter Verwendung eines Stapelgels und eines Auflösungsgels getrennt, wobei die Proben in die Vertiefungen geladen wurden. Die Elektrophorese wurde bei 80 V für das Stapelgel und 120 V für das auflösende Gel durchgeführt. Die Proteine wurden mit einem Transfersystem bei einem konstanten Strom von 300 mA für 1-2 h auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran (1 min lang in Methanol voraktiviert) übertragen. Die Membran wurde mit 5 % Magermilch in TBST für 2 h bei Raumtemperatur verstopft, um eine unspezifische Bindung zu verhindern. Nach drei Waschgängen mit TBST (jeweils 10 Minuten) wurde die Membran über Nacht bei 4 °C inkubiert, wobei die folgenden Primärantikörper in TBST verdünnt wurden: Kaninchen-Anti-ACSL4 (1:1.000), Kaninchen-Anti-GPX4 (1:1.000), Kaninchen-Anti-HO-1 (1:2.000), Kaninchen-Anti-NRF2 (1:1.000), Kaninchen-Anti-RKIP (1:1.500) und Maus-Anti-β-Aktin (1:5.000). Die Membran wurde 3 x 10 min mit TBST gewaschen und 2 h bei Raumtemperatur mit HRP-konjugierten Sekundärantikörpern inkubiert: HRP-markiertes Goat Anti-Mouse IgG (1:1.000), HRP-markiertes Goat Anti-Rabbit IgG (1:1.000). Nach weiteren TBST-Waschungen für 3 x 5 min wurden die Proteinsignale mit einem ECL Western Blot Kit visualisiert und mit der ImageJ Software quantifiziert.

Immunfluoreszenz-Färbung
Die Zellen wurden auf Deckgläser ausgesät, die zuvor in Kulturplatten gelegt wurden, und ließen sie anhaften. Nach experimentellen Behandlungen wurde der Überstand verworfen und die Zellen wurden 3x mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert, gefolgt von drei PBS-Wäschen. Anschließend wurden die Zellen 10 min lang bei Raumtemperatur mit 0,1% Triton X-100 permeabilisiert und 3x mit PBS gewaschen. Die unspezifische Bindung wurde durch 30-minütige Inkubation mit 3% Rinderserumalbumin (BSA) bei Raumtemperatur blockiert. Primäre Antikörper wurden über Nacht bei 4 °C appliziert: Kaninchen anti-HO-1 (1:500), Kaninchen anti-NRF2 (1:500). Nach drei PBS-Waschungen am nächsten Tag wurden die Zellen 1 h lang bei Raumtemperatur im Dunkeln mit fluoreszierenden Sekundärantikörpern inkubiert: Alexa Fluor 488-markiertes Goat Anti-Rabbit IgG (1:500). Nach den letzten Waschungen wurden die Proben mit Einbettmedium eingefasst, das 4',6-Diamidino-2'-phenylindol (DAPI) für die nukleare Gegenfärbung enthielt. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen.

Statistische Analyse
Die Messdaten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (S.D.) ausgedrückt. Für die Analyse wurden quantitative Daten entnommen, die die Ergebnisse von drei unabhängigen Replikat-Assays darstellen. Für Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurde ein t-Test angewendet, während für Vergleiche zwischen mehreren Gruppen eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) verwendet wurde, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test für Mehrfachvergleiche. Ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Hemin kann eine Schädigung der Plasmamembran induzieren, daher wird es häufig für die Konstruktion von in vitro Zellmodellen von ICH verwendet. In dieser Studie wurden die Auswirkungen der Hämin-Behandlung bei unterschiedlichen Konzentrationen und Dauerdauern auf die Lebensfähigkeit von PC12-Zellen untersucht, während gleichzeitig die Expressionsdynamik des RKID-Proteins unter entsprechenden experimentellen Bedingungen durch Western-Blot-Analyse analysiert wurde (Abbildung 1A). Die Zellviabilität war bei Häminkonzentrationen von 60 μM oder höher signifikant reduziert (Abbildung 1B), und diese Reduktion erfolgte dosisabhängig mit steigenden Konzentrationen. Darüber hinaus war die Hämin-Zytotoxizität zeitabhängig und erreichte innerhalb der ersten 24 Stunden der Exposition ihren Höhepunkt, bevor sie allmählich abnahm (Abbildung 1C). Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass die RKIP-Proteinexpression bei 80 μM Hämin signifikant erhöht war (Abbildung 1D,E) und ihren Höhepunkt 24 Stunden nach der Stimulation erreichte (Abbildung 1F,G). Basierend auf diesen Erkenntnissen wählten wir 80 μM Hemin und eine 24-stündige Behandlungsphase für nachfolgende Experimente, um die zugrunde liegenden Mechanismen und beteiligten Signalwege aufzuklären.

Um die Rolle von RKIP bei der neuronalen Ferroptose nach ICH zu untersuchen, verwendeten wir Locostatin, um die RKIP-Expression zu hemmen (Abbildung 2A). Locostatin bindet an RKIP, stört die Wechselwirkungen zwischen RKIP und sowohl der Raf-1-Kinase als auch der GRK2, wodurch die funktionellen Effekte von RKIP abgeschwächt werden, um den inhibitorischen Zweck zu erreichen. In dieser Studie setzten wir Locostatin als RKIP-Inhibitor ein, um die damit verbundenen molekularen Mechanismen zu untersuchen 5,6. Die Zytotoxizität von Locostatin wurde zunächst über einen Konzentrationsbereich von 0-40 μM mit dem Viabilitätsassay bewertet. Die Ergebnisse zeigten keine signifikante Zytotoxizität bei ≤5 μM, was einen sicheren Konzentrationsbereich für nachfolgende Experimente darstellt (Abbildung 2B). Darüber hinaus konnten wir die inhibitorische Wirkung von 5 μM Locostatin auf die RKIP-Expression mittels Western Blotting und RT-qPCR-Analysen bestätigen. Der Western Blot zeigte eine signifikante Abnahme der RKIP-Proteinspiegel (Abbildung 2C,D), während die RT-qPCR eine Abnahme der RKIP-mRNA-Spiegel zeigte (Abbildung 2E). Diese Ergebnisse zeigen die Wirksamkeit von 5 μM Locostatin bei der Hemmung der RKIP-Expression.

In dieser Studie wurde ein Hämin-induziertes PC12-Zellmodell der intrazerebralen Blutung (ICH) entwickelt, um die regulatorische Funktion von RKIP bei der Ferroptose abzugrenzen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Hämin-Stimulation die RKIP-Expression signifikant erhöhte und gleichzeitig die Lebensfähigkeit der Zellen verringerte. Basierend auf bestehenden Studien spekulierten wir, dass der Hämin-induzierte Zelltod in engem Zusammenhang mit Ferroptose stehen könnte, einem eisenkatalysierten Lipidperoxidationsprozess, der durch pathologische Eisenablagerung in zellulären Kompartimenten und erhöhte Konzentrationen von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) gekennzeichnet ist.

Um den Zusammenhang zwischen RKIP und Ferroptose weiter zu untersuchen, behandelten wir Hämin-stimulierte PC12-Zellen mit Locostatin. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass die Expression der Acyl-CoA-Synthetase long-chain family 4 (ACSL4), einem Schlüsselfaktor der Ferroptose, in der mit Hämin behandelten Gruppe signifikant erhöht war (Abbildung 3A,B). ACSL4 ist ein kritisches Pro-Death-Gen bei Ferroptose, das die Veresterung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFAs) fördert und dadurch die zelluläre Empfindlichkeit gegenüber Ferroptose erhöht. Darüber hinaus war die Expression von Glutathionperoxidase 4 (GPX4), einem Ferroptose-Inhibitor, in der mit Hämin behandelten Gruppe signifikant verringert (Abbildung 3A,C). GPX4 ist ein wichtiger Regulator der Ferroptose, der die Lipidperoxidation hemmt, indem er Lipidperoxide abfängt und so die Zellen vor oxidativen Schäden schützt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hämin-Stimulation die Ferroptose in PC12-Zellen erhöht. Im Vergleich zur Hämin-Gruppe kehrte die pharmakologische Hemmung von RKIP mit Locostatin diese Veränderungen jedoch um, was darauf hindeutet, dass die Unterdrückung der RKIP-Expression die Ferroptose in PC12-Zellen hemmte. Auch auf mRNA-Ebene wurden konsistente Ergebnisse beobachtet (Abbildung 3 F,G).

Wir untersuchten auch die Expression von Ferroptose-verwandten Signalwegmolekülen. Es wurde gezeigt, dass der NRF2/HO-1-Signalweg eine Schlüsselrolle bei der Ferroptose spielt. Basierend darauf stellten wir die Hypothese auf, dass die RKIP-Hemmung die neuronale Ferroptose durch Aktivierung des NRF2/HO-1-Signalwegs unterdrücken könnte. Um diese Hypothese zu testen, stimulierten wir zunächst PC12-Zellen mit Hemin und fanden heraus, dass die Expression des NRF2-Proteins signifikant erhöht war (Abbildung 3A,D), zusammen mit einem signifikanten Anstieg seines nachgeschalteten Produkts HO-1 (Abbildung 3A,E). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hämin-induzierte Ferroptose den NRF2/HO-1-Signalweg aktiviert, der eine schützende Wirkung auf Zellen ausübt. Als wichtiger Regulator zellulärer antioxidativer Reaktionen erhöht NRF2 die zelluläre antioxidative Kapazität, indem es die Expression von nachgeschalteten Zielgenen wie HO-1 reguliert und dadurch die Ferroptose hemmt. Anschließend erhöhte die Behandlung mit Locostatin die Expression von HO-1 und NRF2 im Vergleich zur mit Hämin behandelten Gruppe weiter (Abbildung 3A,D). Auch auf mRNA-Ebene wurden konsistente Ergebnisse beobachtet (Abbildung 3I,J), die weiter bestätigen, dass die Hemmung von RKIP die Ferroptose in Hämin-stimulierten PC12-Zellen unterdrückt, indem NRF2 und sein nachgeschaltetes Molekül HO-1 moduliert werden.

Bemerkenswert ist, dass ein anderer Ferroptose-Inhibitor, Ferritin-Schwerkette 1 (FTH1), eine erhöhte Expression bei Hämin-Stimulation zeigte, und seine Expression war weiter erhöht, wenn RKIP gehemmt wurde (Abbildung 3H). FTH1 ist ein Hauptbestandteil des Ferritins, das für die Speicherung und Oxidation von Eisen verantwortlich ist. Es wandelt Eisenionen in eine stabilere Form um und reduziert so den durch freies Eisen induzierten oxidativen Stress. Die Hochregulierung von FTH1 nach Hämin-Stimulation kann eine kompensatorische Reaktion auf die Eisenüberladung darstellen, da die Zellen versuchen, überschüssiges Eisen zu speichern, um oxidative Schäden zu vermeiden. Der weitere Anstieg der FTH1-Expression nach der Behandlung mit Locostatin deutet auf einen reduzierten Gehalt an freiem Eisen und eine erhöhte antioxidative Kapazität hin, was die Schlussfolgerung stützt, dass die RKIP-Hemmung die Hämin-induzierte Ferroptose in PC12-Zellen unterdrückt.

Die ROS- und Lipidhydroperoxid (LPO)-Spiegel in PC12-Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die Behandlung mit Hemin führte zu einem signifikanten Anstieg der ROS- und LPO-Spiegel, der sich nach der Verabreichung von Locostatin umkehrte. Dieser Befund deutet darauf hin, dass die Hemmung von RKIP dazu beitragen kann, die Ferroptose in Neuronen zu unterdrücken (Abbildung 4A-D).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Hämin-induzierte Dosis und die zeitabhängige Verringerung der Lebensfähigkeit der PC12-Zellen mit einem deutlichen Anstieg der RKIP-Proteinspiegel einhergingen. Dieser Prozess war mit erhöhten ACSL4-Spiegeln und einer unterdrückten Expression von GPX4 verbunden. Gleichzeitig wurde eine signifikante Akkumulation von Markern für oxidative Schäden (ROS und LPO) beobachtet, wobei beide als Haupttreiber der Ferroptose dienen, indem sie oxidativen Stress und Lipidmembranstörungen vermitteln. Darüber hinaus deutet die Hochregulierung des Eisenspeicherproteins FTH1 auf eine kompensatorische zelluläre Reaktion auf Eisenüberladung hin. Entscheidend ist, dass die pharmakologische Hemmung von RKIP durch Locostatin diese Veränderungen rückgängig machte und die Hämin-induzierte Ferroptose aufhob (Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3 und Abbildung 4).

Die Ergebnisse der Assays zeigten, dass die Hemmung von RKIP die neuronale Ferroptose effektiv unterdrückte und die NRF2/HO-1-Expression regulierte. Angesichts der Tatsache, dass der NRF2/HO-1-Signalweg eine Schlüsselrolle bei der Ferroptose spielt, wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Unterdrückung der neuronalen Ferroptose, die bei der RKIP-Hemmung beobachtet wurde, durch die Stimulation dieses Signalwegs vermittelt werden könnte. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden weitere Experimente durchgeführt (Abbildung 5A).

ML385, ein selektiver NRF2-Inhibitor, wurde verwendet, und die Ergebnisse bestätigten, dass die NRF2-Expression sowohl auf Protein- (Abbildung 5B, C) als auch auf mRNA-Ebene (Abbildung 5E) wirksam reduziert war. Zusätzlich wurde die Expression von HO-1, einem nachgeschalteten Molekül von NRF2, untersucht. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die RKIP-Hemmung zwar zunächst die HO-1-Expression erhöhte, dieser Effekt jedoch nach NRF2-Hemmung umgekehrt wurde (Abbildung 5B,D,F). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die RKIP-Hemmung die neuronale Ferroptose durch Aktivierung des NRF2/HO-1-Signalwegs abschwächen kann. Die Immunfluoreszenzfärbung unterstützte diese Ergebnisse zusätzlich, da eine nukleäre Translokation von NRF2 nach RKIP-Hemmung beobachtet wurde (Abbildung 5G-J).

Anschließend untersuchten wir die Spiegel von ROS und LPO in PC12-Zellen mittels Durchflusszytometrie. Wir fanden heraus, dass die Hemmung von NRF2 mit ML385 die Locostatin-induzierte Reduktion der ROS- und LPO-Spiegel umkehrte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die RKIP-Suppression die neuronale Ferroptose hemmen kann, indem sie den NRF2/HO-1-Signalweg aktiviert (Abbildung 6A-D).

DATENVERFÜGBARKEIT:
Die während der aktuellen Studie generierten Datensätze sind in der Zusatzdatei 1 enthalten.

Abbildung 1: Aufbau eines in vitro Krankheitsmodells durch Hämin-stimulierte PC12-Zellen. (A) Schematische Darstellung des Aufbaus des Hämin-stimulierten PC12-Zellmodells. (B) Bestimmung der optimalen Häminkonzentration für die in vitro Etablierung eines intrazerebralen Blutungsmodells unter Verwendung des Zellviabilitätsassays zur Beurteilung der zellulären Lebensfähigkeit. (C) Zellviabilitätsassay mit PC12-Zellen, die mit Hämin (80 μM) für verschiedene Zeitpunkte behandelt wurden. (D,E) Repräsentative Western-Blot-Analyse und quantitative Auswertung der RKIP-Expressionsniveaus in PC12-Zellen, die mit unterschiedlichen Hämin-Konzentrationen behandelt wurden (24 h). (F,G) Repräsentative Western-Blot-Analyse und quantitative Bewertung der RKIP-Expressionsniveaus in PC12-Zellen, die für unterschiedliche Zeiträume mit Hämin (80 μM) beworfen wurden. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3) dargestellt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abkürzungen: CCK8 = Cell Counting Kit-8; WB = Western Blot; RKIP = Raf-Kinase-Inhibitor-Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Wirkung von Locostatin auf die RKIP-Expression in PC12-Zellen, die mit Hämin stimuliert wurden. (A) Schematische Darstellung des experimentellen Verfahrens zur Behandlung von Locostatin in PC12-Zellen. (B) Die Zellviabilität von PC12-Zellen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Locostatin behandelt wurden, wurde mit dem Zellviabilitätsassay bewertet. (C,D) Die Expression von RKIP in PC12-Zellen, die mit Hemin (80 μM, 24 h) und/oder Locostatin (5 μM, 24 h) behandelt wurden, wurde mittels Western Blot analysiert, wobei repräsentative Blots und statistische Analysen gezeigt wurden. (E) Die RKIP-mRNA-Expression in PC12-Zellen, die mit Hemin (80 μM, 24 h) und/oder Locostatin (5 μM, 24 h) behandelt wurden, wurde mittels RT-qPCR gemessen. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD (n=3) dargestellt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abkürzungen: CCK8 = Cell Counting Kit-8; WB = Western Blot; RT-qPCR = Quantitative reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion; ROS = Reaktive Sauerstoffspezies; LPO = Lipidperoxidation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Wirkung der RKIP-Hemmung auf die Ferroptose in PC12-Zellen nach Hämin-Stimulation. (A-E) Western-Blot-Analyse von Proteinexpressionsänderungen in ACSL4, GPX4, NRF2 und HO-1 in PC12-Zellen, die mit Hämin (80 μM, 24 h) und/oder Locostatin (5 μM, 24 h) behandelt wurden. (F-J) RT-qPCR-Analyse der mRNA-Expressionsniveaus von ACSL4, GPX4, NRF2, HO-1 und FTH1 in PC12-Zellen, die mit Hemin (80 μM, 24 h) und/oder Locostatin (5 μM, 24 h) behandelt wurden. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD (n=3) dargestellt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abkürzungen: WB = Western Blot; RT-qPCR = Quantitative reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion; RKIP = Raf-Kinase-Inhibitor-Protein; ACSL4 = Acyl-CoA-Synthetase langkettige Familie 4; GPX4 = Glutathionperoxidase 4; NRF2 = Kernfaktor E2-bezogener Faktor 2; HO-1 = Häm-Oxygenase-1; FTH1 = Ferritin-Schwerkette 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Einfluss der RKIP-Hemmung auf oxidativen Stress in PC12-Zellen nach Hämin-Stimulation. (A,C) Durchflusszytometrische Analyse der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies in PC12-Zellen, die mit Hämin (80 μM, 24 h) und/oder Locostatin (5 μM, 24 h) behandelt wurden. (B,D) Durchflusszytometrische Analyse der Lipidperoxidation in PC12-Zellen, die mit Hemin (80 μM, 24 h) und/oder Locostatin (5 μM, 24 h) behandelt wurden. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3) dargestellt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abkürzungen: ROS = Reaktive Sauerstoffspezies; LPO = Lipidperoxidation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Die Rolle von NRF2 bei antiferroptotischen Effekten, die durch RKIP-Hemmung vermittelt werden. (A) Schematische Darstellung des experimentellen Verfahrens zur Behandlung von PC12-Zellen unter verschiedenen Bedingungen. (B-D) Western-Blot-Analyse von Proteinexpressionsänderungen in NRF2 und HO-1 unter verschiedenen Behandlungsbedingungen in PC12-Zellen mit Hämin (80 μM, 24 h) und/oder Locostatin (5 μM, 24 h) und/oder ML385 (5 μM, 24 h). (E,F) RT-qPCR-Analyse der mRNA-Expressionsniveaus von NRF2 und HO-1 in PC12-Zellen, die mit Hämin (80 μM, 24 h) und/oder Locostatin (5 μM, 24 h) und/oder ML385 (5 μM, 24 h) behandelt wurden. (G-J) Immunfluoreszenzanalyse der NRF2- und HO-1-Expression und Quantifizierung der mittleren Fluoreszenzintensität in PC12-Zellen, die mit Hämin (80 μM, 24 h) und/oder Locostatin (5 μM, 24 h) und/oder ML385 (5 μM, 24 h) behandelt wurden. Maßstabsleisten = 50 μm. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3) dargestellt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abkürzungen: WB = Western Blot; RT-qPCR = Quantitative reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion; IF-Färbung = Immunfluoreszenz-Färbung; NRF2 = Kernfaktor E2-bezogener Faktor 2; HO-1 = Häm-Oxygenase-1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Die Rolle von NRF2 bei der Unterdrückung von oxidativem Stress, der durch RKIP-Hemmung vermittelt wird. (A,C) Durchflusszytometrische Analyse der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies in PC12-Zellen mit Hämin (80 μM, 24 h) und/oder Locostatin (5 μM, 24 h) und/oder ML385 (5 μM, 24 h). (B,D) Durchflusszytometrische Analyse der Lipidperoxidation in PC12-Zellen, die mit Hämin (80 μM, 24 h) und/oder Locostatin (5 μM, 24 h) und/oder ML385 (5 μM, 24 h) behandelt wurden. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3) dargestellt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abkürzungen: ROS = Reaktive Sauerstoffspezies; LPO = Lipidperoxidation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Schematische Darstellung der RKIP-Hemmung, die die neuronale Ferroptose nach spontaner ICH durch Aktivierung des NRF2/HO-1-Signalwegs abschwächt . Unsere Ergebnisse zeigen, dass die RKIP-Hemmung die NRF2-Kerntranslokation effektiv fördert, die Lipid-ROS-Akkumulation unterdrückt und folglich vor Hämin-induzierter Ferroptose und oxidativem Stress schützt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Primer für die quantitative reverse Transkriptions-PCR.

Ergänzende Datei 1: Rohe und verarbeitete quantitative Daten, die die ersten sechs Zahlen unterstützen, einschließlich CCK-8-Assays, Western Blot, RT-qPCR und Durchflusszytometrie-Analysen. Die Daten sind nach Abbildungsunterfeldern organisiert und enthalten alle Replikatwerte, die für statistische Analysen verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Autoren erklären, dass ihnen keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen bekannt sind, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten.