Ein multimodales Weitfeld-Fourier-Transformations-Ramanmikroskop

Zusammenfassung

Ein Weitfeld-Fourier-Transformationsmikroskop, das auf einem kompakten und ultrastabilen bibrechenden Interferometer basiert, ermöglicht die parallele Erfassung von Spektren für alle Pixel eines 2D-Detektors. Der Zeitdomänenansatz ermöglicht die Entschränkung von Photolumineszenz- und Raman-Signalen und ermöglicht eine schnelle Raman-Abbildung (~5 ms/Pixel) mit einer räumlichen Auflösung von ~1 μm und einer spektralen Auflösung von 23 ^cm-1 .

Zusammenfassung

Die Raman-Mikroskopie ist eine leistungsstarke Technik zur Bestimmung der chemischen Zusammensetzung einer Probe. Die Hauptherausforderung der hochmodernen spontanen Raman-Mikroskope, die auf Punkt-Scanning-Frequenzbereichsdetektion basieren, ist die Erfassung von Raman-Karten großer Flächen aufgrund typischerweise langer Pixel-Dwell-Zeiten (0,1–1 s). Das hier vorgestellte Weitfeld-Fourier-Transformationsmikroskop (FT) ermöglicht eine schnelle Messung erweiterter Proben mit ~1 μm räumlicher Auflösung und ~23 ^cm-1 Spektralauflösung. Es basiert auf einem ultrastabilen und kompakten Doppelbrechungsinterferometer mit gemeinsamem Pfad, das entlang des Detektionspfades eines kommerziellen Mikroskops hinzugefügt wird und die parallele Aufnahme von Spektren für alle Pixel eines 2D-Detektors ermöglicht und so die Messzeit deutlich verkürzt (10–100-fach schneller). Der Zeitdomänenansatz adressiert effektiv eine weitere Einschränkung der Frequenzbereichstechnik, nämlich das Entwirrung des Raman-Signals vom photolumineszentischen Hintergrund, in dem das Raman-Signal vergraben sein kann. Dieses Protokoll beschreibt, wie hyperspektrale Messungen mit einem aufgerüsteten kommerziellen Mikroskop durchgeführt werden: die Ausrichtung des Beleuchtungsschemas, die Kriterien zur Auswahl der Messparameter und die Datenanalyse zur Wiederholung und Untersuchung von Spektren.

Einleitung

Spektralbildgebung ist eine Technik, die sowohl spektrale als auch räumliche Informationen liefert und in verschiedenen Bereichen angewandt wurde, von Mikroskopie¹ bis Fernerkundung². Multispektrale und hyperspektrale Bildgebung werden danach unterschieden, ob für jeden Pixel eines 2D-Sensors nur wenige diskrete Spektralbänder oder ein kontinuierliches Spektrum aufgezeichnet werden. Raman-Bildgebung ist eine besondere Anwendung der spektralen Bildgebung.

Die Raman-Streumikroskopie ist eine leistungsstarke Technik zur Messung der Schwingungsfrequenzen ν_R eines Systems. Schwingungsmoden sind mit den chemischen Bindungen verbunden, weshalb die Raman-Spektroskopie³ die Untersuchung der chemischen Zusammensetzung von Proben in biologischer⁴ und Materialwissenschaften⁵ ermöglicht. Bei der spontanen Raman-Spektroskopie wird die Probe mit monochromatischer Strahlung bei der Frequenz ν₀, der sogenannten Pumpe, beleuchtet. Ein Teil des Pumplichts, der mit den Schwingungsmoden wechselwirkt, kann eine inelastische Streuung erfahren, was zu Photonen bei den Frequenzen ν_S (ν_AS)=ν₀-(+) ν_R führt, wobei ν_R die molekulare Schwingungsfrequenz innerhalb der Probe ist. Das niederenergetische gestreute Licht (ν_S) wird als Stokes-Strahlung bezeichnet, während das energiereichere (ν_AS) als Anti-Stokes-Strahlung bezeichnet wird. Im thermischen Gleichgewicht besetzen die meisten Moleküle niedrigere Energiezustände, daher sind die Anti-Stokes-Komponenten deutlich schwächer als die von Stokes. Aus diesem Grund detektiert die Raman-Streumikroskopie typischerweise Stokes-Photonen. Da Moleküle und Festkörper mehrere Schwingungsmoden besitzen, ist das Raman-Spektrum durch unterschiedliche Bänder gekennzeichnet, die zusammen eine einzigartige chemische Signatur bilden, die die Materialidentifikation und -analyse ermöglicht. Die Hauptherausforderung dieses Ansatzes ist der extrem geringe Querschnitt der spontanen Raman-Streuung, wobei nur eines von über 10⁹–10¹² Photonen diesen Prozess durchläuft.

In einer Standardkonfiguration eines Raman-Streumikroskops ist das Anregungslicht eng auf einen Punkt der Probe fokussiert. Nach der Ablehnung der elastisch gestreuten Pumpphotonen (typischerweise bei spektralen Filtern) wird das verbleibende Licht gesammelt und mit einem Frequenzspektrometer (z. B. dispersivem Gitter) charakterisiert; Die spektrale Auflösung dieser Geräte kann ~0,5–1 ^cm-1 erreichen. Die Messung wird für jeden Punkt (x,y) im Sichtfeld (FOV) einer Probe mit einer Methode namens Punkt- oder Rasterscanning⁶ wiederholt. Es gibt zwei Hauptprobleme dieses Ansatzes: (1) Der niedrige Querschnitt der spontanen Raman-Streuung erfordert typischerweise lange Integrationszeiten (0,1–1 s), um für jeden Pixel des Spektrometers genügend Photonen zu sammeln, daher kann die Raman-Abbildung einer erweiterten Probe lange Messzeiten erfordern; (2) Die Anregung durch das Pumplicht führt auch zu Photolumineszenz (PL), die sich mit dem spontanen Raman-Signal überlappt und es oft übertönen kann.

Um die Erfassungsgeschwindigkeit zu erhöhen, ist es möglich, den Linienscanning-7-Ansatz anzuwenden, bei dem die Pumpe entlang einer Linie des Sichtfelds (z. B. an der Koordinate x) fokussiert wird und das gesammelte Signal (PL- oder Raman-Streuung) von einem Spektrometer mit einem 2D-Sensor dispersiert wird, wodurch für die gegebene Koordinate x ein 2D-Datensatz entsteht, in dem eine Achse dem Spektrum und die andere einer räumlichen Koordinate y entspricht. Dennoch leidet diese Implementierung weiterhin unter den erheblichen Verlusten, die durch den Eingangsspalt des Spektrometers verursacht werden, dessen schmale Breite eine bessere spektrale Auflösung bietet, aber auch die Menge des gesammelten Lichts begrenzt.

Eine Weitfeldkonfiguration kann besser sein, um die Messzeit zu verkürzen: Bei dieser Methode wird ein großer Bereich der Probe beleuchtet und das Spektrum für alle Pixel eines 2D-Sensors gleichzeitig erfasst. In diesem Fall können spektrale Informationen entweder mit einem Set von Bandpassfiltern⁸ oder einem abstimmbaren Spektralfilter⁹ vor einer monochromen Bildkamera gesammelt werden. Außerdem basiert diese Methode auf einem Frequenzbereichsansatz und erhält nur eine diskrete Anzahl von Spektralbändern.

Eine alternative Methode zur Messung eines Spektrums ist der Fourier-Transform-(FT)-Ansatz. Es handelt sich um eine Zeitdomänentechnik, die auf dem Satz¹⁰ von Wiener-Kintchin basiert, der besagt, dass die Leistungsspektraldichte eines Signals die Fourier-Transformation seiner zeitlichen Autokorrelation ist. In der Optik wird dies in der Praxis erreicht, indem zwei verzögerte Nachbildungen der Wellenform mit einem Interferometer erzeugt werden. Ihre Interferenz wird von einem Detektor als Funktion der relativen Verzögerung gemessen, was zum sogenannten Interferogramm¹¹ führt. Der FT-Ansatz wird weit verbreitet verwendet, um Spektren im Infrarotspektralbereich zu messen, wo er als Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR)¹² bezeichnet wird. FTIR wird routinemäßig verwendet, um das Absorptionsspektrum von Schwingungsübergängen im mittleren infraroten Spektralbereich (~2,5−25 μm, Wellenlänge) zu messen.

Der Zeitdomänen-FT-Ansatz bietet einige Vorteile gegenüber herkömmlichen dispersiven Spektrometern: Er erreicht einen höheren Durchsatz durch das Fehlen von Schlitzen (Jacquinots Etendue-Vorteil¹²); Es bietet eine flexible spektrale Auflösung, die nur vom Scanbereich abhängt. Außerdem eignet sie sich gut für Weitfeldkonfigurationen: Tatsächlich misst die Methode bei Verwendung eines 2D-Detektors pro Pixel parallel ein Interferogramm, wodurch die gleichzeitige Aufzeichnung kontinuierlicher Spektren über alle Pixel ermöglicht wird. Andererseits muss ein FT-Bildgebungssystem zwei anspruchsvolle Anforderungen erfüllen: (1) Die relative Verzögerung zwischen den beiden Lichtrepliken muss auf einen kleinen Bruchteil des optischen Zyklus geregelt werden; (2) Der Phasenwechsel zwischen Strahlen, die in einem einzelnen Pixel interferieren, muss begrenzt sein, um eine gute Kohärenz und damit einen hohen Kontrast zu gewährleisten. Einige Lösungen wurden auf Basis von Interferometern mit gemeinsamem^{Pfad 13, 14} oder fast¹⁵ vorgeschlagen, sind jedoch recht umständlich oder haben eine spektrale Auflösung größer als 100 ^cm-1.

In dieser Arbeit wird ein neuartiges Weitfeldmikroskop beschrieben, das die Aufnahme von Fotolumineszenz- und Raman-Streubildern ermöglicht. Der innovative Block dieses Systems ist ein kompakter und ultrastabiler gemeinsamer Pfad-Doppelbruchinterferometer, genannt Translating-Wedge-based Identical Pulses eNcoding System (TWINS)¹⁶. Es ermöglicht Verzögerungsabtastungen von Hunderten optischer Zyklen mit einer Phasengenauigkeit von nur einem kleinen Bruchteil des optischen Zyklus selbst und hoher Stabilität. Die beiden Lichtrepliken haben orthogonale Polarisationen und bewegen sich kollinär durch denselben gemeinsamen Weg, daher werden sie nicht von Bahnlängenschwankungen beeinflusst, wie sie typisch für einen Doppelstrahl-Interferometer sind. Das in Abbildung 1 dargestellte Schema besteht aus zwei Blöcken von doppelbrechenden Kristallen mit orthogonalen optischen Achsen: einer (B₂) mit fester Länge und der andere (B₁), der in zwei Keile aufgeteilt ist, die entlang der gemeinsamen Hypotenusrichtung bewegt werden können. Einfallendes Licht ist um P₁ bei 45° bezüglich der optischen Achse des doppelbrechenden Kristalls polarisiert, sodass die Hälfte der Energie entlang der gewöhnlichen Polarisation und die andere Hälfte entlang der außergewöhnlichen liegt. Während sie entlang der doppelbrechenden Blöcke verlaufen, akkumulieren die beiden orthogonalen Komponenten eine relative Verzögerung, die fein angepasst wird, indem die Gesamtdicke von Block B₁ durch Änderung des Einsatzes des Keils variiert wird. Der zweite Polarisator P₂ projiziert die Feldkomponenten auf eine gemeinsame lineare Polarisation, sodass sie interagieren. Die Verzögerung τ zwischen Repliken hängt von der Keilverschiebung x entlang der gemeinsamen Hypotenuse ab (Gleichung 1), mit c Lichtgeschwindigkeit, α Spitzenwinkel der Keile, Δn = n_{e-n o} Differenz in gewöhnlichen und außergewöhnlichen Brechungsindexen (Doppelbrechung). Da die spektrale Auflösung Δv umgekehrt proportional zum Scanbereich ist, T=|T_{2-T 1}|, mit T₁, T₂ als Anfangs- und Endverzögerung des Interferogramms, erfordert die hohe spektrale Auflösung, die von der Raman-Spektroskopie erforderlich ist, hohe Doppelbrechung und lange Keiltranslationen. Einer der häufigsten doppelbrechenden Kristalle ist YVO₄ (Yttrium Orthovanadat) besonders geeignet für seinen hohen Δn- und Transparenzbereich im sichtbaren-nahen Infrarotbereich. Die Keile sind mit einem Apexwinkel von 10° konstruiert, sodass das Interferometer bei einer Scanlänge von 15,3 mm eine Verzögerung von 2500 fs bei 600 nm erzeugen kann, was eine spektrale Auflösung von 23 ^cm-1 über den gesamten interessierenden Spektralbereich erreicht (die Empfindlichkeit der Siliziumkamera stellt die obere Grenze). Diese Arbeit wird die Strategie für eine korrekte Einstellung der Interferogrammabnahme (d. h. Schritt- und Scanbereich) darstellen, um die gewünschte spektrale Auflösung zu erreichen und mit dem breitbandigen Hintergrund umzugehen, wodurch das Raman-Signal von der Photolumineszenz getrennt wird.

Wie von Candeo et ^al.17 beschrieben, kann dieses birefringente Spektrometer mit einem kommerziellen optischen Mikroskop kombiniert werden, um hyperspektrale Messungen durchzuführen. Die Anforderungen sind folgende: ein umkonfigurierbares optisches Mikroskopgehäuse, ein TWINS-Doppelbruchinterferometer, eine rauscharme monochrome Kamera (z. B. CCD oder sCMOS) und eine schmalbandige Laserquelle. Für letztere sind typische Anregungswellenlängen für Raman- und Fluoreszenzspektroskopie 355 nm, 488 nm, 514 nm, 532 nm, 633 nm und 785 nm. Obwohl hochspektrale Reinheitslaser, wie der in der Materialtabelle aufgeführte, die beste Wahl sind, kann aufgrund der begrenzten spektralen Auflösung des Instruments auch ein Laser mit breiterer Linienbreite, z. B. ~0,1 nm, verwendet werden. Das Mikroskop wird aufgerüstet, indem das TWINS im Detektionspfad zwischen der Röhrenlinse und dem monochromen Detektor platziert wird. Diese Konfiguration sorgt für eine gleichmäßige Pfadverzögerung im Sichtfeld und einen durchschnittlichen Kontrast von 55 %. Der Anregungspfad ist so konzipiert, dass die Probe gleichmäßig beleuchtet wird: In der Praxis wird die Ausgangsspitze einer großkernigen Multimodefaser auf der Probenebene abgebildet. Durch die Verwendung eines mechanischen Scramblers werden die Moden im Kern der Faser stark gekoppelt, wodurch ein flaches Profil auf der Probenebene entsteht. Zusätzlich mittelt eine schwingende Schwingspule das für monochromatische Strahlung typische Speckle-Muster. Eine Charakterisierung dieser Zylinder-Beleuchtung ist in ergänzender Abbildung 1 dargestellt. Der Strahl wird durch ein unendlich-korrigiertes Objektiv auf die Probe fokussiert, das ebenfalls rückgestreutes Raman- und Lumineszenzlicht in Richtung des Detektionspfads sammelt. Die Filter, die zur Ablehnung der Beleuchtung erforderlich sind, werden detailliert behandelt.

Um zu zeigen, wie breitbandige und schmalbandige spektrale Merkmale mit diesem hyperspektralen Mikroskop gemessen werden sowohl Lumineszenz als auch Raman-Streuung für eine Testprobe gemessen, die speziell zu illustrativen Zwecken ausgewählt wurde. Die Probe besteht aus einer Mischung von drei Pulverpigmenten mit bekannten Raman-Spektren: zwei Polymorphen von Titanweiß (TiO₂), nämlich Rutil und Anatase sowie Kadmiumsulfidgelb (CdS). Dasselbe Verfahren kann jedoch für ein breiteres Anwendungsspektrum verwendet werden, von Materialwissenschaften bis Biologie.

Der Zweck dieses Artikels ist es, die Schritte zur Durchführung einer hyperspektralen Messung zu veranschaulichen, während Candeo et ^al.17 die Montage und Ausrichtung des TWINS-Interferometers detailliert beschrieben werden. Daher sollte ein interessierter Experimentator mit einem vorgefertigten Interferometer beginnen, das auf dieser Technologie basiert.

Das Protokoll beginnt mit der Probenvorbereitung und der Einrichtung des Mikroskops, um die Raman-Streuung und PL-Photonen anzuregen und zu sammeln. Anschließend werden die Scanparameter (Scanlänge, Abtastschritt) und Erfassungsparameter (Belichtungszeit, Hardware-Binning) entsprechend den Anforderungen des untersuchten Signals eingestellt. Abschließend wird die Nachbearbeitungs-Pipeline vorgestellt, die das Verfahren zur Abrufung des Spektrums an jedem Pixel (spektraler Hyperwürfel, Abbildung 2B) aus dem erworbenen zeitlichen Datensatz (temporaler Hyperwürfel, Abbildung 2A) detailliert darstellt und die Algorithmen für Rauschreduktion und fortgeschrittene Spektralanalyse darstellt. Der gesamte Arbeitsablauf ist in Abbildung 3 dargestellt.

Protokoll

Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Probenvorbereitung

VORSICHT: Tragen Sie während dieser Vorbereitung Latexhandschuhe, da CdS-Pigment giftig ist, besonders beim Einatmen.

1. Verwenden Sie einen Schaber und geben Sie 20 mg von jedem Pigmentpulver auf einer präzisen Waage, wodurch ein Verhältnis von 1:1:1 erhalten wird.
   HINWEIS: Reinigen Sie die Schaberspitze bei jeder Probe sorgfältig, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
2. Mische das Pulver mit einem Mörtel, um Klumpen zu entfernen.
3. Gießen Sie die resultierende Mischung auf einen Objektträger; Verwenden Sie die Schaberspitze, um sie vorsichtig zu pressen und eine nahezu gleichmäßige Schichtdicke zu erhalten.
4. Tragen Sie Nagellack an den Rändern eines Mikroskop-Deckdeckels auf. Lege es auf die Mischung, mit dem Nagellack nach unten, und übe genug Druck aus, um es zu versiegeln. Lass es ein paar Sekunden trocknen, damit der Lack aushärtet.

2. Mikroskop-Aufbau

VORSICHT: Tragen Sie eine Schutzbrille, wenn der Laser eingeschaltet ist, da die maximale Leistung auf der Probenebene 300 mW beträgt.

HINWEIS: Die Leistung des Pumpenlasers bleibt von Temperaturschwankungen unbeeinflusst, solange er innerhalb des im Datenblatt angegebenen Temperaturbereichs betrieben wird (z. B. 10–40 °C für den in der Materialtabelle angegebenen Laser).

1. Richten Sie das TWINS-Interferometer entlang des Detektionspfads des Mikroskops aus.
   HINWEIS: Wie von Candeo et al. ¹⁷ dargelegt, muss das Interferometermodul zwischen der Röhrenlinse und dem Detektor angebracht werden, um einen angemessenen Abstand zwischen ihnen zu gewährleisten. Für das bei dieser Arbeit verwendete Mikroskop ist dies nur gewährleistet, wenn das Okularmodul entfernt wird.
2. Um das Koehler-Beleuchtungsschema an eine Laseranregung anzupassen, wird die eingebaute Anregungslampe des Mikroskops entfernt und mit einem Mikroskopobjektiv das Licht am Ausgang einer großkernigen Multimodefaser aufgenommen.
   HINWEIS: Die Objektivvergrößerung bestimmt die Größe des Beleuchtungsmusters, wenn die Spitze der Faser mit der Probenebene konjugiert wird. Eine mögliche Wahl ist ein 10x/0,25-0,30 Ziel.
3. Wählen Sie die Anregungswellenlänge und fokussieren Sie den Anregungslaser am Eingang der Großkern-Multimodefaser. Schalte die Kamera ein und starte eine Visualisierungssoftware.
   1. Befestigen Sie einen mittleren Abschnitt der Faser an die vibrierende Membran einer Schwingspule, wodurch der Sprenkel entfernt wird. Mechanisch verschlüsseln Sie die Glasfaser, indem Sie sie straff biegen, um alle räumlichen Modi zu verbinden. Schalte den Laser ein.
   2. Bereiten Sie eine Testprobe zur Ausrichtung vor, z. B. fluoreszierende rote Markierstreifen auf einem Mikroskopdeckblatt.
   3. Stellen Sie die Position der Faserspitze in Bezug auf das Beleuchtungsoptiksystem an, indem Sie die Faser mit einer präzisen Translationsstufe bewegen, um einen Punkt mit gleichmäßiger Intensität und gut definierten Kanten auf der Probenebene zu erhalten.
      HINWEIS: Für alle gemeldeten Messungen wird ein 532-nm-Laser verwendet. Mit einer 400-μm-Kernfaser deckt der Durchmesser des Spots 82 % der Kamerabreite ab.
4. Verwenden Sie ein Filterset für die Anregungs- und Detektionspfade, wobei folgende Kriterien angewendet werden (ergänzende Abbildung 2):
   1. Verwenden Sie einen Narrow Bandpass-Filter bei 532 nm (2,0-nm Bandbreite), um die Laserleitung zu reinigen und jegliche Pump-Seitenbänder abzulehnen, die durch nichtlineare Verbreiterung durch Ausbreitung in der Faser entstehen.
   2. Verwenden Sie einen dichroitischen Spiegel (DM in Abbildung 1), um das Laserlicht auf die Probe zu reflektieren und die vom Objektiv gesammelte rotverschobene Rückstreustrahlung zu übertragen.
   3. Verwenden Sie einen Langpassfilter (LPF in Abbildung 1) bei 532 nm, um Restbeleuchtungslicht abzuweisen.
   4. Während der Raman-Streumessung verwenden Sie einen Kurzpassfilter (SPF in Abbildung 1) bei 600 nm, um Hintergrundfluoreszenz zu unterdrücken.
5. Messen Sie die Leistung auf der Sample-Ebene mit einem Leistungsmessgerät. Dämpfen Sie den Pumpstrahl, um eine Intensität an der Probe zu erhalten, die keinen Schaden verursacht (etwa 2 W/cm^², wie in Tabelle 1 angegeben). Verwenden Sie einen Verschluss für den Laser, während Sie die anderen Messparameter einstellen.
   HINWEIS: Aufgrund des niedrigen Querschnitts der spontanen Raman-Streuung ist eine hohe Leistungsdichte erforderlich, um die Signalerfassung zu verbessern. Allerdings muss die Probenschadensschwelle berücksichtigt werden. Im Gegensatz zu Punktscanningssystemen beleuchtet ein Weitfeldsystem einen großen Bereich, wodurch die Energieabfuhr weniger effizient ist und ein sorgfältiges Energiemanagement erforderlich ist, um Probenschäden zu vermeiden.
6. Stellen Sie die Probe auf die Mikroskopbühne und stellen Sie den Fokus ein.
   HINWEIS: Um den Fokus leicht zu finden, beleuchte die Probe zunächst mit einer weißen Lampe in Transmission oder Reflexion. Im letzteren Fall konnte eine neben dem Mikroskop platzierte Glühbirne verwendet werden. Der Probenfokus wird anschließend mit dem Pumpenlaserlicht optimiert.

3. Messparameter

1. Schalten Sie den Treiber des Motors ein, der die Keiltranslation vornimmt. Steuern Sie die Hardwarekomponenten (Kamera und Motor) gleichzeitig, um hyperspektrale Messungen durchzuführen (Beispiel für eine Benutzeroberfläche in ergänzender Abbildung 3).
2. Stellen Sie die Aufnahmeparameter der Kamera, die Belichtungszeit und das Hardware-Binning ein, um die Signalintensität zu optimieren, wobei folgende Anweisungen folgen:
   1. Da ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) im temporalen Signal zu einem hohen SNR in den wiedergewonnenen Spektren führt, sollte eine lange Belichtungszeit bevorzugt werden, die den Sensordynamikbereich besser ausfüllt.
      HINWEIS: Für schwache Signale, wie auch bei der Raman-Streuung, muss ein Kompromiss zwischen Signalpegel und Gesamtmessungszeit gefunden werden: Die längste Belichtungszeit ist möglicherweise nicht machbar.
   2. Wähle Hardware-Binning, um vor dem Auslesen Ladung von mehr Pixeln zu sammeln.
      HINWEIS: Das Summieren der Ladung und eine einzelne Auslesung bietet eine bessere Rauschleistung als das Auslesen mehrerer Pixel und dann das Summieren des Signals in der Nachbearbeitung. Die Wahl des Binnings wird auch durch die akzeptable Verringerung der räumlichen Auflösung bestimmt.
3. Wählen Sie die Scan-Parameter, die Gesamtlänge des Scans und den Stichprobenschritt gemäß den folgenden Kriterien:
   1. Um eine hohe spektrale Auflösung für Raman-Peaks zu erreichen, setzen Sie eine asymmetrische lange Keiltranslation (-2526 fs→ -36 fs). Führen Sie hingegen einen symmetrischen Scan um die Null-Verzögerungsposition (-65 fs → 65 fs) durch, um mehr breitbandige spektrale Merkmale des PL-Signals zu ermitteln.
   2. Mit Gleichung 1 für die Verzögerung τ als Funktion der Keil-Translation x wählt man den Abtastungsschritt, um den Nyquist-Grenzwert für die interessierende spektrale Bandbreite zu erfüllen.
      HINWEIS: Gegeben die minimale Wellenlänge des Spektrums λ_min, wird (Gleichung 2) aufgelegt.
      
      wobei die Doppelbrechung Δn wellenlängenabhängig ist (siehe Sellemeiersche Gleichungen).
4. Öffnen Sie den Verschluss, um den Laser auf die Probe zu richten. Wenn eine Abnahme der Signalintensität festgestellt wird, wartet, bis die Probe einen stationären Zustand erreicht hat (typischerweise einige Sekunden).
   HINWEIS: Um die Abnahme der Signalintensität auszugleichen, passen Sie Binning und Belichtungszeit an, um ein gutes SNR zu erhalten.
5. Beginnen Sie mit der Aufnahme eines monochromen Bildes für jede Keilposition, d. h. zeitliche Verzögerung zwischen Repliken von jedem Punkt des 2D-Sensors.
   HINWEIS: Die Erfassungssoftware sollte zwei Variablen speichern: den temporalen Hyperwürfel (2D-Bildset) und den Vektor der motorischen Positionen, der vom Encoder während des Scans aufgezeichnet wird.
6. Sobald die Messung abgeschlossen ist, schalten Sie den Laser aus und beginnen Sie mit der Datenanalyse.

4. Verarbeitung des erworbenen Datenwürfels

1. Generiere den spektralen Hyperwürfel aus dem erfassten Datensatz und folge diesen Anweisungen:
   1. Lade die Motorpositionskorrekturdatei für den jeweiligen Schrittmotor (siehe Diskussion).
   2. Laden Sie die Frequenzkalibrierungsdatei für das spezifische Interferometer, um gemessene räumliche Frequenzen (Pseudofrequenzen) mit realen optischen Frequenzen zu verknüpfen (siehe Abschnitt Diskussion).
   3. Wählen Sie den Frequenzbereich für die Spektren, die durch Fourier-Transformation der Interferogramme aller Pixel berechnet werden.
   4. Unter den^{verfügbaren Apodisationsfunktionen 12} zur Fensterung des gemessenen Interferogramms wählen Sie diejenige, die einen guten Kompromiss zwischen spektraler Erweiterung und Artefaktreduktion in den wiedergewonnenen Spektren bietet, wie zum Beispiel das Happ-Genzel-(Hamming-)Fenster.
   5. Erzeugen Sie den spektralen Hyperwürfel, indem Sie die apodisierten Interferogramme für alle Pixel mit Fourier transformieren. Speichere es in komplexen Werten.
      HINWEIS: Das komplexe Spektrum von FT enthält zusätzliche Informationen, die nützlich sind, um den Datensatz zu entrauschen und die durchschnittlichen Spektren eines ausgewählten Pixelsatzes zu extrahieren.
2. Sobald der spektrale Hyperwürfel berechnet wurde, führen Sie verschiedene Untersuchungen durch, z. B. ermitteln Sie das durchschnittliche Spektrum in ausgewählten Bereichen; erzeugt ein falschfarbiges RGB-Bild; Kartenspektralgipfel; Hintergrund abziehen.
3. Um spektrales Rauschen zu reduzieren, das signifikante Spitzen, insbesondere in Raman-Spektren, überdecken kann, implementieren Sie die Singular Value Decomposition (SVD)¹⁸ durch folgende Schritte:
   1. Formen Sie den temporalen Hyperwürfel in eine Matrix A um, mit Interferogrammen entlang seiner Reihen.
   2. Führe die SVD der Matrix aus und erhalte U-, S- und V-Matrizen, so dass A = USV^T gilt.
      HINWEIS: U-Spalten sind die räumlichen Verteilungen der Eigenvektoren von V (Spalten), während S eine diagonale Matrix mit singulären Werten (SVs) in absteigender Reihenfolge ist.
   3. Forme jede Spalte von U in eine Matrix von Pixeln um und führe ihre 2D-FT aus, um ihre räumlichen Frequenzen zu erhalten.
   4. Da hohe Frequenzen mit sehr abrupten Veränderungen in der Abbildung verbunden sind, betrachten Sie sie als Rauschen; Definiere einen quadratischen Bereich, der im berechneten Fourier-Raum zentriert ist und niedrige (hauptsächlich Signal-) und hohe (hauptsächlich Rausch-) Frequenzen trennt.
      HINWEIS: Eine mögliche Wahl für diesen Bereich ist eine Seite von 1/4 in Bezug auf die Größe des Fourier-Raums.
   5. Berechnen Sie das räumliche Signalverhältnis (SSR) für jede SV, indem Sie die Summe der Pixelintensitäten (komplexer Modul) innerhalb der Grenze durch die Summe der Intensitäten außerhalb der Grenze teilen. Plotte SSR als Funktion der SV-Nummer.
   6. Definieren Sie eine Schwelle für SSR, also die Anzahl der signifikanten SVs, die beibehalten werden müssen, um den Beitrag zu Rauschen im Datensatz zu reduzieren und Artefakte zu vermeiden.
      HINWEIS: SSR zeigt typischerweise einen abnehmenden Trend, der mit zunehmender Anzahl der Einzelwerte in ein Plateau abflacht. Eine Faustregel ist, singuläre Werte bis zu dem Punkt beizubehalten, an dem das Plateau beginnt.
   7. Setze alle unteren SVs auf null in der diagonalen Matrix S, erhalte S_entrauscht, und berechne einen entlarmten temporalen Hyperwürfel als_{US-entrauschtes} V^T.
      HINWEIS: SVD ist eine Matrixfaktorisierung, die auch auf den umgeformten spektralen Hyperwürfel angewendet werden kann (mit Zeilen, die Spektren statt Interferogramme enthalten).
4. Wiederhole die Schritte 4.1-4.2 mit dem entrauschten temporalen Hyperwürfel, um die Spektren abzurufen.
5. Laden Sie das Programm über den Link in Reference¹⁹ herunter, um eine tiefere Analyse des Datensatzes mit dem Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares (MCR-ALS)-Algorithmus durchzuführen.
   HINWEIS: Softwareentwickler liefern eine detaillierte Beschreibung des^{Algorithmus 20}. Es handelt sich um eine iterative Methode zur Lösung des Mischanalyseproblems: Jedes Spektrum wird als lineare Kombination reiner Spektralprofile ausgedrückt. Mit einer Matrixdarstellung: B = C R^T+E, wobei B der Datensatz ist, C die Konzentrationen für jedes Spektrum enthält, Spalten von R die Referenzspektren der Bestandteile sind und E den Fehler ausdrückt.
   1. Formen Sie den spektralen Hyperwürfel in eine Matrix mit N_pix x N_Frequenzen um, mit N_pix Gesamtpixelzahl und N_{Frequenzvektorlänge} .
   2. Wählen Sie die Anzahl der in der Probe erwarteten Arten aus und laden Sie deren Referenzspektren.
      HINWEIS: Referenzspektren können für jedes Pigment einzeln gemessen werden. Andernfalls erstellt das Programm eine SVD des Datensatzes und verwendet für die ersten Schätzungen so viele Hauptkomponenten wie die ausgewählten Bestandteile.
   3. Selektive Einschränkungen: Wiedergewonnene Spektralprofile müssen nicht-negativ und möglichst ähnlich zu Referenzspektren sein.
   4. Plotten Sie die Konzentrationskarte (umgeformte C-Spalten) und die Spektren (R-Spalten) für jede Art.
   5. Exportieren Sie diese Karten und verwenden Sie sie, um ein Falschfarbbild zu erzeugen (Abbildung 4A), womit die Analyse abschließt.
      HINWEIS: Die Programme, die zur Ermittlung der hier präsentierten Ergebnisse verwendet werden, sind nicht öffentlich zugänglich, können aber auf Anfrage von den Autoren bezogen werden.

Ergebnisse

Abbildung 4A zeigt die Raman-Karte für eine ausgewählte Region der Pulvermischung. Es handelt sich um eine falschfarbige Darstellung der mit MCR-ALS abgerufenen Häufigkeitskarten, wie in Schritt 4.5 beschrieben. Sie liefert Informationen über die Zusammensetzung der Proben, da die drei Arten innerhalb des Sichtfelds klar unterschieden werden können. Abbildung 4B zeigt die durchschnittlichen Spektren in den ausgewählten Bereichen...

Diskussion

Ein Weitfeld-FT-Multimodalmikroskop wurde für die Erfassung spontaner Raman-Streu- und Lumineszenzbilder eingeführt und ist in der Materialwissenschaft anwendbar. Die Anwendbarkeit auf biologische Proben wird von Candeo et ^al.17 demonstriert, die ein hyperspektrales Fluoreszenzbild gefärbter menschlicher Zellen präsentieren. Die Hauptherausforderung für Raman-Streumessungen in diesem Bereich besteht darin, Photoschäden zu verhindern, die durch ineffiziente Wärmeab...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anatase	Kronos	1200	Polymorph des weißen TiO2 pigments
Kadmiumsulfidpulver	Kremer Pigmente GmbH & Co.	21060	Kadmiumgelb, Farbindex dunkel/PY35
Kamera	Andor	Luca R	Elektronenmultiplizierende CCD-Kamera mit 1004x1002 Pixeln 8µ m x 8µ m
Reinigungsfilter	Semrock	LL01-532-12.5	Ø 1/2" 2,0 nm- FWHM Laser-Linienfilter bei 532 nm
Deckzettel	BRAND GmbH & Co	4700 55	Borosilikatglas 22x22x0,15 mm Mikroskopabdeckungen
Dichroischer Spiegel	Semrock	Di02-R532-25x36	25,2x35,6 mm einkantiger Laser-Dichroic-Strahlteiler bei 532 nm
Glasfaser	Thorlabs	M74L05	400µ m-Kerngröße, NA 0,39 Multimode-Glasfaser
Laser	Hubner Photonik	Cobolt Samba 1000	CW-Dioden-Pumplaser mit 532 nm, maximale Leistung 1000 mW
Langpassfilter	Semrock	LP03-532RU-25	Ultra steiler Langpass-Kantenfilter bei 532 nm
Mikroskop	Leica	DMRBE	Trinokulares Forschungsmikroskop
Ziel	Leica	PL-FLUOTAR, 10x/0,30	Anregungs- und Sammelobjektiv mit 10-facher Vergrößerung, 0,3 NA
Ziel	Newport	M-10X	Objektivlinse im Beleuchtungsweg, mit 10-facher Vergrößerung, 0,25 NA
Rutil	Kronos	2900	Polymorph des weißen TiO2 pigments
Kurzpassfilter	Thorlabs	FESH600	Ø 25,0 mm Kurzpassfilter mit abschneidender Wellenlänge 600
Folien	Marienfeld	1000612	76x26x1 mm Mikroskop-Objektträger