Methodenartikel

Verhaltensanalyse der lokomotorischen Dysfunktion bei Drosophila melanogaster als Aussage für Neurotoxizität

DOI:

10.3791/68517

⸱

18. Juli 2025

 ,  ,  ,  , 
1Center of Biotechnology of Azores (CBA), University of the Azores, 2Mesosystem Investigação & Investimentos by Spinpark

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das Protokoll stellt eine kostengünstige Methode mit hohem Durchsatz zur Beurteilung der Neurotoxizität in der Fruchtfliege durch die Quantifizierung der Bewegungsstörung als Alternative zu herkömmlichen Säugetiermodellen dar. Ziel ist es, die neurotoxischen Wirkungen von pharmazeutischen Wirkstoffen, Umwelteinflüssen oder genetischen Veränderungen anhand eines sensitiven, reproduzierbaren und ethisch günstigen Modells zu bewerten.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll stellt eine kostengünstige Methode mit hohem Durchsatz zur Beurteilung der Neurotoxizität bei der Fruchtfliege (Drosophila melanogaster) durch Quantifizierung der lokomotorischen Dysfunktion dar. Traditionelle Säugetiermodelle sind zwar effektiv, aber ressourcenintensiv und ethisch eingeschränkt, was die Notwendigkeit alternativer In-vivo-Modelle unterstreicht. Der vorliegende Ansatz integriert den klassischen Kletterassay mit einer Echtzeit-Monitoring-Plattform, um motorische Beeinträchtigungen bei einzelnen Fliegen zu erfassen. Dieses kombinierte System verbessert die Empfindlichkeit, Automatisierung und Reproduzierbarkeit und bietet eine skalierbare Strategie für neurotoxikologische Screenings. Zu den kritischen Verfahrensschritten gehören standardisierte Aufzuchtbedingungen, eine sorgfältige Anästhesie und Handhabung, um die Sterblichkeit oder Verhaltensänderungen der Fliegen zu minimieren, sowie die ordnungsgemäße Kalibrierung des Systems. Die mikrokapillarbasierte Fütterung ermöglicht die optionale Integration der Ingestionsquantifizierung, die die Bewegungsanalyse ergänzt und bei Bedarf die Bewertung der Substanzaufnahme ermöglicht. Die Methode unterstützt Echtzeit- und Langzeit-Verhaltensüberwachung, reduziert die Verzerrung des Beobachters und ermöglicht eine tägliche Fortschrittsbewertung ohne Unterbrechung des Experiments. Die Prüfung der Lichtpräferenz kann durch direkte Messungen integriert werden. Die Plattform bietet erhebliche Vorteile bei der Verhaltensauflösung, dem Durchsatz und der Datenkonsistenz. Obwohl es nicht über Echtzeit-Fluoreszenzfähigkeiten verfügt, die in einigen alternativen Systemen zu finden sind, bleibt es für groß angelegte Verhaltensscreenings hochwirksam. Dieses Protokoll ist besonders wertvoll für Labore, die die neurotoxischen Wirkungen von pharmazeutischen Verbindungen, Umwelteinflüssen oder genetischen Veränderungen anhand eines empfindlichen, reproduzierbaren und ethisch günstigen In-vivo-Modells bewerten möchten.

Einleitung

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Die Bewertung der Neurotoxizität ist entscheidend für die Bewertung der potenziellen nachteiligen Auswirkungen von Umwelt- und Arzneimittelverbindungen auf das sich entwickelnde Nervensystem1. Herkömmliche Neurotoxizitätstests stützen sich auf Säugetiermodelle, wie z. B. Nagetiere, die teuer, zeitaufwändig und ethisch eingeschränkt sind2. Daher sind alternative Modelle notwendig, die ein schnelles Hochdurchsatz-Screening von Neurotoxinen ermöglichen3. Studien zeigen, dass sich die Fruchtfliege aufgrund ihrer gut charakterisierten Genetik, ihrer konservierten neurologischen Entwicklungswege und ihres kurzen Lebenszyklus zu einem leistungsfähigen Modellorganismus für die Untersuchung der Neurotoxizität entwickelt hat 4,5. Unter den verhaltensbezogenen Endpunkten dient die motorische Dysfunktion als sensitiver und quantifizierbarer Biomarker für neurologische Entwicklungsstörungen, der die Früherkennung neurotoxischer Wirkungen ermöglicht, die mit neurologischen Störungen beim Menschen korrelieren können6.

Lokomotorische Assays an Fliegen liefern ein quantifizierbares Maß für die Neurotoxizität und ermöglichen Dosis-Wirkungs-Bewertungen, was sie für die Risikominderung des menschlichen Neurotoxizitätsrisikos relevant macht7. Der negative Geotaxis-Assay (Klettern) ist ein weit verbreiteter Ansatz, bei dem Fliegen instinktiv aufsteigen, nachdem sie auf den Boden eines Fläschchens geklopft wurden, was ihren Grad der motorischen Entwicklung, Koordination und des Gleichgewichts widerspiegelt 8,9. Während diese Methode einfach, kostengünstig und nützlich für die Beurteilung schwerer Bewegungsanomalien und offensichtlicher Störungen ist, bietet sie nur eine eindimensionale Bewertung der Bewegung und kann bei der Erkennung subtiler motorischer Beeinträchtigungen, verfeinerter Veränderungen und der langfristigen Verhaltensüberwachung von Symptomen, die durch Neurotoxine induziert werden, nicht empfindlich sein8. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden fortschrittlichere Motion-Tracking-Technologien wie das Ethoskop-System entwickelt10. Bei diesem automatisierten Aufzeichnungssystem handelt es sich um ein Video-Tracking-Gerät mit hohem Durchsatz, das speziell für die Analyse des Verhaltens von Fliegen mit hoher Präzision und Reproduzierbarkeit entwickelt wurde11. Im Gegensatz zu herkömmlichen Lokomotor-Assays bietet dieses System eine kontinuierliche Echtzeit-Überwachung der Bewegung und erfasst subtile Verhaltensanomalien, die bei herkömmlichen Kletter-Assays möglicherweise übersehen werden 11,12,13. Die Technologie verfügt über eine automatisierte Videoverfolgung mit einem infrarotbeleuchteten Kamerasystem, das die Flugbewegungen kontinuierlich mit hoher Auflösung aufzeichnet, wodurch Beobachterverzerrungen vermieden und die experimentelle Reproduzierbarkeit verbessertwerden 13. Darüber hinaus erkennt es Mikrobewegungen, unterscheidet Geh-, Ruhe- und Feinbewegungen wie Putzen, Füttern oder Zucken und ermöglicht so eine detailliertere Analyse des motorischen Verhaltens13. Eine langfristige Verhaltensüberwachung ist möglich, die eine kontinuierliche Verfolgung über längere Zeiträume ermöglicht und damit ideal für die Beurteilung progressiver neurotoxischer Wirkungen ist10. Die Skalierbarkeit und der hohe Durchsatz des Videoaufzeichnungssystems ermöglichen die parallele Verfolgung mehrerer Fliegen und erleichtern so das gleichzeitige Screening mehrerer neurotoxischer Verbindungen und genetischer Erkrankungen10. Darüber hinaus integriert das System Open-Source-Software, die es Forschern ermöglicht, Analysepipelines basierend auf experimentellen Anforderungen anzupassen, einschließlich Schlaf-Wach-Zyklen, zirkadianen Rhythmen und detaillierten Bewegungsmetriken10,14. Jüngste Fortschritte, wie z. B. die Integration von Ethoscopy, einem Python-basierten Framework, haben die Datenanalyse verbessert und die Zugänglichkeit und Reproduzierbarkeit in Verhaltensstudien verbessert14. Dieser Rahmen ermöglicht es Forschern, komplexere Fortbewegungsanalysen durchzuführen und gleichzeitig Barrieren für Laien zu reduzieren. Das Ethoskop-Labor, eine Jupyter-basierte Umgebung, erleichtert die nahtlose Datenverarbeitung, fördert die gemeinsame Forschung und gewährleistet die experimentelle Reproduzierbarkeit14.

Durch die Nutzung der Hochdurchsatz-Video-Tracking-Plattform neben herkömmlichen Kletter-Assays bietet diese Studie eine umfassende und empfindliche Bewertung der motorischen Dysfunktion nach Exposition gegenüber entwicklungsbedingten Neurotoxinen. Die Fähigkeit, feinskalige Defekte des Bewegungsapparates zu analysieren, macht es zu einem leistungsstarken Werkzeug für das Screening von Verbindungen, die die neuronale Entwicklung und die motorische Koordination stören. Die Verwendung von Fruchtfliegen für das Neurotoxizitäts-Screening bietet mehrere Vorteile, darunter Kosteneffizienz und Hochdurchsatzfähigkeit, im Vergleich zu Wirbeltiermodellen, bei denen groß angelegte Screenings aus Kostengründen oft begrenzt sind15. Das Fliegenmodell ermöglicht schnelle genetische Manipulationen, um Krankheitszustände nachzuahmen und molekulare Signalwege zu identifizieren, die von Neurotoxinen beeinflusst werden16. Obwohl sie einfacher sind als das Nervensystem von Säugetieren, behalten Fliegen wichtige konservierte Signalwege bei, die an der neuronalen Entwicklung und der motorischen Kontrolle beteiligt sind17. Hochauflösende Tracking-Methoden wie das Echtzeit-Videorekordersystem verbessern die Datengenauigkeit und Reproduzierbarkeit und ermöglichen eine frühzeitige Erkennung von motorischen Defiziten, die durch die Exposition gegenüber Giftstoffen verursacht werden11.

Die Integration von Tracking-Technologie und traditionellen Kletterassays ermöglichte eine kontinuierliche, hochauflösende Verhaltensüberwachung und bietet eine robuste und skalierbare Methode zur Erkennung subtiler motorischer Beeinträchtigungen, die durch die Exposition gegenüber Neurotoxinen induziert werden. Die Kombination aus genetischen Werkzeugen, einem kurzen Lebenszyklus und fortschrittlicher Verhaltensanalyse positioniert die Fruchtfliege als leistungsstarke Alternative zu Wirbeltiermodellen für das Neurotoxizitäts-Screening und trägt letztendlich zu einer sichereren Medikamentenentwicklung und verbesserten Umweltrisikobewertungen bei.

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Protokoll

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Als Beispiel wurde dieses Protokoll verwendet, um das neurotoxische Potenzial der Physalis physalis Giftfraktion zu bewerten. Die Kontrollgruppe erhielt nur den physiologischen Puffer und die Saccharoselösung ohne die Testverbindung. Alle Versuche wurden am Stamm W118 durchgeführt. Für Versuche mit Drosophila ist keine ethische Freigabe erforderlich, da sie nicht unter die Tierschutzvorschriften fallen.

1. Reagenzien und Probenvorbereitung

  1. Bereiten Sie je nach den Anforderungen des spezifischen Assays einen biologischen Puffer wie PBS (10 mM, pH 7,0) oder HEPES (10 mM, pH 7,0) und eine 10 M Stammlösung mit Saccharose vor. Berechnen Sie das Probenvolumen basierend auf der Anzahl der Wiederholungen und der Dauer des Experiments.
  2. Die Probe wird mit einem biologischen Puffer, der mit Saccharoselösung bis zu einer Endkonzentration von 1 M ergänzt wird, auf die gewünschte Konzentration verdünnt. Wenn die Probe transparent ist, können Sie geeignete Lebensmittelfarbe (z. B. 0,1 mg/ml blauer oder roter Farbstoff) hinzufügen, um das Fütterungsverhalten visuell zu beurteilen. In der vorliegenden Studie wurde die Giftfraktion von Physalia physalis mit PBS auf eine Endkonzentration von 10 μg/μl verdünnt und weiter mit Saccharoselösung und Lebensmittelfarbstoff ergänzt.
  3. Bereiten Sie eine Negativkontrolllösung vor, die nur den Puffer enthält, und ergänzen Sie die Lösung mit Saccharose bis zu einer Endkonzentration von 1 M und Lebensmittelfarbstoff. In der vorliegenden Studie wurde PBS, ergänzt mit Saccharose und Lebensmittelfarbstoff, als Negativkontrolllösung verwendet.
  4. Für Fruchtfliegenmedien ist das Protokoll inNummer 18 zu befolgen.

2. Pflege von biologischem Material

  1. Gesunde, geschlechtsreife adulte Fliegen in eine Flasche mit frisch zubereitetem Futtermedium umfüllen. Um fortzufahren, klopfen Sie die Fliegen auf den Boden der Flasche, öffnen Sie sie und übertragen Sie sie durch Flascheninversion in eine neue Flasche mit Fliegenmedium. Stellen Sie die Flasche in einen auf 25 °C eingestellten Inkubator mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und 50 % Luftfeuchtigkeit. Lassen Sie die Fliegen über Nacht (ca. 16-22 Stunden) Eier legen, um genügend synchronisierte Eier zu sammeln.
  2. Verwenden Sie nach der Eiablage eine neue Flasche mit 70 % Ethanol, um die erwachsenen Fliegen zu entsorgen. Dies verhindert eine zusätzliche Eiablage und gewährleistet eine Synchronisierung des Alters, was entscheidend ist, um eine Kohorte von Erwachsenen mit minimalen Altersunterschieden zu erhalten.
  3. Um eine gleichmäßige Entwicklung zu unterstützen, halten Sie die Flaschen unter den gleichen kontrollierten Bedingungen (25 °C, 12 h Hell-Dunkel-Zyklus, 50 % Luftfeuchtigkeit). Die erwachsenen Tiere beginnen um den 9. oder 10. Tag herum zu schlüpfen. Die Überwachung des Entwicklungsfortschritts kann helfen, den Zeitpunkt des Schlüpfens der adulten Tiere zu antizipieren.
  4. Halten Sie die gesammelten Fliegen unter denselben kontrollierten Bedingungen, bis sie das gewünschte Alter für den Assay erreicht haben. Verwenden Sie sie innerhalb von 24-48 Stunden nach dem Auflaufen. Dieser kontrollierte Alterungsprozess sorgt für die Minimierung der Variabilität und erhöht die Zuverlässigkeit der Versuchsergebnisse.

3. Negativer Geotaxis-Assay

HINWEIS: Eine schematische Darstellung des negativen Geotaxis-Assays ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt.

  1. Setzen Sie die Fliegen am Tag des Experiments vorsichtig in eine leere Flasche um.
  2. Die Fliegen müssen vor dem Transfer kurz auf dem Eis betäubt werden, um die Bewegung und den Handhabungsstress zu minimieren. Legen Sie zu diesem Zweck die Flasche mit den Fliegen in eine Schachtel mit Eis und decken Sie die gesamte Flasche ab.
  3. Klopfen Sie nach 1 Minute vorsichtig auf die Flasche, um sicherzustellen, dass alle Fliegen betäubt sind. Halten Sie sie länger 1 Minute auf Eis, um eine vollständige Betäubung zu gewährleisten, ohne Stress auszulösen oder ihre Kletterfähigkeit zu beeinträchtigen.
    HINWEIS: Beachten Sie, dass bestimmte Anästhetika, wie z. B. CO2 , nachfolgende Verhaltensweisen beeinflussen können, einschließlich eines beeinträchtigten Kletterverhaltens, und die Ergebnisse des negativen Geotaxis-Assays beeinflussen können.
  4. Während die Fliegen betäubt sind, bereiten Sie einen kleineren, mit Eis gefüllten Behälter vor und legen Sie eine Petrischale oder eine flache, saubere Oberfläche auf das Eis, um eine gekühlte Plattform zu schaffen. Dieser Aufbau trägt dazu bei, die Anästhesie während der Sortierung aufrechtzuerhalten und die Bewegung der Fliegen nach der Bergung zu minimieren.
  5. Beurteilen Sie die Anästhesie, indem Sie die vollständige Immobilisierung der Fliegen nach 2 Minuten auf dem Eis bestätigen. Sobald sie vollständig betäubt sind, übertragen Sie die Fliegen vorsichtig, indem Sie das Röhrchen über eine gekühlte Petrischale drehen und vorsichtig auf sie klopfen, um sie freizusetzen. Die kalte Oberfläche trägt dazu bei, dass die Fliegen während der Handhabung bewegungsunfähig bleiben.
  6. Trennen Sie mit einem feinen Pinsel und unter einem Stereomikroskop (bei 10- und 20-facher Vergrößerung, falls verfügbar) männliche und weibliche Fliegen vorsichtig anhand von Unterscheidungsmerkmalen wie Größe und Pigmentmustern. Die Männchen sind in der Regel kleiner mit breiten schwarzen Bändern, während die Weibchen größer sind und einen helleren, länglichen Hinterleib haben. Führen Sie diesen Schritt so schnell wie möglich durch, um die Wirkung der Anästhesie auf Fliegen zu minimieren.
    HINWEIS: Wenn die Unterscheidung nach Geschlecht für den Versuch nicht erforderlich ist, lassen Sie den Schritt der Trennung aus. Minimieren Sie die Einwirkzeit und gehen Sie schonend mit den Fliegen um, um Stress und mögliche Verhaltensänderungen zu reduzieren.
  7. Füllen Sie die sortierten Fliegen vorsichtig in leere Fläschchen mit entsprechender Zuordnung um. Lassen Sie sie sich etwa 30 Minuten lang in einer kontrollierten Umgebung (25 °C, 12 h/12 h Hell-Dunkel-Zyklus, 50 % Luftfeuchtigkeit) von der Anästhesie erholen, bevor Sie mit dem Assay fortfahren.
  8. Für die Zubereitung der Mikrokapillarfütterung verwenden Sie eine Pipette, um 10 μl der Testlösung manuell in jedes Mikrokapillarröhrchen zu laden. Stellen Sie sicher, dass das Volumen über alle Proben hinweg konsistent ist, um die Fütterungsbedingungen zu standardisieren.
  9. Geben Sie mit einer Pipette 3-5 μl Mineralöl in das offene Ende der Mikrokapillare. Dadurch wird verhindert, dass die Probe während des Experiments verdampft und ausläuft.
  10. Führen Sie die vorgefüllten Mikrokapillaren durch die Löcher in den Stopfen des Wattestäschchens ein und stellen Sie sicher, dass sie sicher sitzen. Verwenden Sie bei Bedarf zuvor zugeschnittene Spitzen, um die Baumwolle fest anzuliegen, ohne den Luftstrom zu behindern.
  11. Die Fläschchen mit den Fliegen werden in einen auf 25 °C eingestellten Inkubator mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 h/12 h gestellt. Lassen Sie sie für die Dauer des Experiments und ersetzen Sie die Mikrokapillaren täglich manuell durch frisch zubereitete Lebensmittel, um eine gleichmäßige Exposition zu gewährleisten. Die Expositionsdauer hängt von der Toxizität und der Art der Probe ab und erstreckt sich in der Regel zwischen 2 und 7 Tagen.
  12. Übertragen Sie die Fliegen in Abständen von 12 Stunden in ein sauberes, leeres Fläschchen, um die Bewegungsaktivität zu beurteilen.
  13. Messen und markieren Sie mit einem Permanentmarker eine Linie 7 cm vom Boden des Fläschchens entfernt. Diese Höhe dient als Kletterziel.
  14. Positioniere eine Kamera oder ein Handy an einem stabilen Ort, um das Kletterverhalten aufzuzeichnen. Sorgen Sie für eine ausreichende Beleuchtung und einen transparenten Hintergrund für die Analyse. Vergewissern Sie sich, dass der Versuchsaufbau mit dem Sichtfeld der Kamera kompatibel ist.
  15. Tippen Sie vorsichtig auf das Fläschchen, um die Fliegen nach unten zu bringen, und beginnen Sie dann sofort mit der Aufnahme. Vermeiden Sie übermäßige Gewalteinwirkung, die die Fliegen verletzen oder desorientieren könnte.
  16. Überprüfen Sie die Aufzeichnungen und messen Sie die Zeit, die jede Fliege benötigt, um die markierte 7-cm-Linie zu erreichen. Legen Sie ein maximales Zeitlimit fest (z. B. 30 s); Weisen Sie diese Zeit jeder Fliege zu, die die Linie nicht erreicht.
  17. Achten Sie genau auf abnormale Verhaltensweisen wie unkoordinierte Bewegungen, verzögerten Beginn des Kletterns oder unregelmäßige Klettermuster. Diese Anzeichen können auf die neurotoxischen Wirkungen der getesteten Verbindung hinweisen.
    HINWEIS: Detaillierte Anweisungen zur Futterzubereitung finden Sie im Capillary Feeder (CAFE) Assay-Protokoll19. Diese Methode bietet präzise Richtlinien für die Vorbereitung von flüssigen Nahrungsquellen für Fruchtfliegen, um eine genaue Quantifizierung der Nahrungsaufnahme zu gewährleisten und die Variabilität in Fütterungsversuchen zu minimieren.

4. Echtzeit-Überwachungs-Assays

HINWEIS: Für die Einrichtung, einschließlich der schematischen Darstellung der Komponenten des Tracking-Systems und des Kalibrierungsprotokolls, beachten Sie bitte frühere Veröffentlichungen11,12. Einen allgemeinen Überblick über die Versuche gibt die ergänzende Abbildung 2.

  1. Echtzeit-Fortbewegungs-Assay (Tracking-Assay)
    1. Wiederholen Sie die Schritte 3.8-3.9, um die Fütterungsmikrokapillaren mit dem Proben- und Mineralölsiegel vorzubereiten.
    2. Bereiten Sie die einzelnen Fortbewegungskammern mit durchsichtigen Plastikstrohhalmen von jeweils ca. 6 cm Länge vor. Diese Strohhalme dienen als kostengünstige und transparente Gehäuse, die sich für Aufnahmen eignen. Die Röhren sollten mit der Schlafarena11 kompatibel sein, die 20 Röhren für Hochdurchsatz-Verhaltensstudien beherbergt.
    3. Verschließen Sie ein Ende jedes Strohhalms mit einer transparenten Folie, um einen luftdichten Verschluss zu gewährleisten. In der Nähe des abgedichteten Endes ein kleines Loch schaffen, um das Einführen der zuführenden Mikrokapillare aufzunehmen. Stellen Sie sicher, dass das Loch groß genug ist, um die Mikrokapillare sicher zu halten, ohne während des Assays Lecks oder Bewegungen zu verursachen.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.6, um zu betäuben, optional zu trennen und mit einem feinen Pinsel vorsichtig eine betäubte Fliege in jedes Röhrchen zu setzen. Versiegeln Sie das offene Ende jedes Schlauchs mit einer transparenten Folie oder einem Wattestopfen, um den Luftstrom und die Eindämmung der Fliegen zu gewährleisten.
    5. Legen Sie die zusammengesetzten Röhrchen in die Arena und stellen Sie sicher, dass jede Mikrokapillare für den täglichen Austausch von außen zugänglich bleibt. Führen Sie in jedes Röhrchen eine vorgefüllte Mikrokapillare ein. Lassen Sie die Fliegen sich ca. 30 Minuten lang erholen und akklimatisieren, bevor Sie mit dem Assay beginnen.
    6. Stellen Sie das Gerät in eine Kammer mit kontrollierten Umgebungsbedingungen (z. B. 25 °C, 12 h/12 h Hell-/Dunkelzyklus, 50 % Luftfeuchtigkeit). Verbinden Sie das Gerät mit dem Netzwerk oder dem lokalen Tracking-System.
    7. Greifen Sie auf die Plattform zu, und suchen Sie das Gerät, das dem Experiment zugewiesen ist. Stellen Sie sicher, dass das System jede Fliege genau verfolgt, wie durch die Markierungen angezeigt. Geben Sie alle relevanten experimentellen Metadaten ein und beginnen Sie mit der Aufzeichnung des Assays. Verwenden Sie für eine erweiterte Datenanalyse das rethomics-Framework, ein R-Paket, das für die Analyse von Verhaltensdaten mit hohem Durchsatz entwickelt wurde11,12.
    8. Ersetzen Sie täglich die Nahrung in den Mikrokapillaren durch frisch zubereitete Lösungen. Inspizieren Sie jede Fliege täglich, um das Überleben und das korrekte Verhalten während des Versuchszeitraums sicherzustellen, der sich in der Regel über 3 bis 5 Tage erstreckt.
  2. Beurteilung des zirkadianen Rhythmus
    1. Um den zirkadianen Rhythmus von Fliegen und ihre möglichen Veränderungen zu untersuchen, stellen Sie sicher, dass das Experiment synchron mit einem definierten Hell-Dunkel-Zyklus beginnt. Halten Sie während der gesamten Aufnahmephase eine Licht-/12-Stunden-Dunkel-Photoperiode von 12 Stunden aufrecht, um Störungen des endogenen Rhythmus zu vermeiden. Sobald die Bedingungen festgelegt sind, wiederholen Sie die Schritte 4.1.1 bis 4.1.8 und stellen Sie sicher, dass alle Verfahren über die Hell-Dunkel-Phasen hinweg konsistent durchgeführt werden.
  3. Bewertung des Hell/Dunkel-Präferenzverhaltens
    1. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.11, um Fliegen vorzubereiten und Mikrokapillaren zu füttern.
    2. Sobald die Fütterungsfläschchen vorbereitet sind, stellen Sie sie in den Inkubator, damit die Fliegen die Testprobe 2 Stunden lang fressen können (oder eine andere Dauer, die anhand früherer Daten zur Bewegungsaktivität bestimmt wurde).
    3. Um das Lichtpräferenzverhalten zu beurteilen, bereiten Sie einzelne Fortbewegungskammern vor, die 50 % jedes Rohrs mit Aluminiumfolie abdecken, um einen definierten dunklen Bereich zu schaffen. Stellen Sie eine konsistente Abdeckung über alle Röhrchen sicher, um einen standardisierten Vergleich zu ermöglichen.
    4. Die Schritte 4.1.2 bis 4.1.4 werden wiederholt, um die Fliegen einzeln in die Bewegungskammern zu übertragen, wobei das Einsetzen von Mikrokapillaren weggelassen wird.
    5. Legen Sie die vorbereiteten Röhren in die Arena und lassen Sie die Fliegen ca. 30 Minuten lang akklimatisieren.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.6-4.1.7 und zeichnen Sie das Verhalten der Fliegen 60 Minuten lang auf. Röhren, in denen eine reduzierte Bewegung aufgezeichnet wird, können auf eine dunkle Präferenz hinweisen, da das Tracking-System die Fliegen, die sich im folienbedeckten Bereich befinden, nicht erkennt, um eine Obstruktion zu signalisieren.

5. Datenanalyse

  1. Bereiten Sie die Metadatenvorlage vor, indem Sie alle erforderlichen Informationen wie ID, Behandlung, Details zur Verbindung, Assay-Dauer und andere relevante Variablen enthalten. Ein Vorlagenbeispiel und die entsprechende Datenverarbeitungspipeline sind in der ergänzenden Tabelle 1 enthalten.
  2. Speichern Sie die fertige Metadatendatei im CSV-Format. Um die Kompatibilität zu gewährleisten, öffnen Sie die CSV-Datei in einem Texteditor, um sicherzustellen, dass sie keine unnötigen Zeichen oder Formatierungsprobleme enthält. Entfernen Sie alle überflüssigen Zeichen, falls vorhanden.
  3. Bevor Sie mit der Datenanalyse fortfahren, erstellen Sie eine Sicherungskopie der Daten. Öffnen Sie ein Terminal und führen Sie den folgenden Befehl aus: sudo python backup_tool.py. Dieser Schritt schützt die Daten vor potenziellem Verlust oder Beschädigung während der Analyse.
  4. Identifizieren und notieren Sie den Speicherort der Datendateien, die dem Experiment entsprechen. Stellen Sie sicher, dass diese Dateien für die Analyse zugänglich sind.
  5. Analysieren Sie Daten mit Rethomics. Öffnen Sie RStudio und laden Sie die notwendigen Rethomics-Pakete für die Verhaltensdatenanalyse. Detaillierte Anleitungen und Tutorials finden Sie auf der Website von Rethomics: https://rethomics.github.io/scopr.html

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Ergebnisse

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Als Beispiel wurde dieses Protokoll verwendet, um das neurotoxische Potenzial der Physalis physalis Giftfraktion zu bewerten. Die behandelte Gruppe bestand aus Fliegen, die mit einem physiologischen Puffer gefüttert wurden, der mit Saccharoselösung (bis zu einer Endkonzentration von 1 M) und der Testgiftfraktion ergänzt wurde. Die Kontrollgruppe erhielt nur den physiologischen Puffer und die Saccharoselösung ohne die Testverbindung. Alle Versuche wurden am Stamm W118 durchgeführt.

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Diskussion

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In erster Linie ist die Festlegung einer nicht-letalen (subletalen) Dosis ein kritischer erster Schritt für die Durchführung der Neurotoxizitätsexperimente. Dies stellt sicher, dass die Fliegen während der gesamten Studie lebensfähig bleiben, was die Beobachtung von Verhaltens- und Bewegungseffekten ohne den Störfaktor der Mortalität ermöglicht. In unserer Studie wurde die subletale Dosis der Physalia physalis Giftfraktion auf 10 μg/μl bestimmt. Um robuste und reproduzierbare Er...

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Offenlegungen

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Die Autorin Zuzanna Tomkielska war bei Mesosystem S.A. angestellt, und die Autorin Ana Casas ist ebenfalls mit Mesosystem S.A. verbunden. Die übrigen Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Danksagungen

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Diese Forschung wurde durch das EEA Grants-Projekt MOD finanziert. PN. FRM.059.PT.V03 – Physalia physalis: eine innovative und ungenutzte Quelle für kosmetische Produkte mit hohem Mehrwert; durch den "Pacto da Bioeconomia Azul" (Projekt-Nr. C644915664-00000026) im Rahmen von WP5 – Algae Vertical, finanziert aus dem Europäischen Fonds Next Generation EU und dem portugiesischen Aufbau- und Resilienzplan (PRR); und von der Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) über die CBA (UIDB/05292/2020 und UIDP/05292/2020).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Aluminiumfolie --
Blauer Farbstoff   RAYNER-Rayners blauer Farbstoff 28ml
Kamera Modul 2 NoIRHimbeere Pi 096-4062Lieferung auf Mauser.pt
Baumwoll-RovingSigma-AldrichBR28205
Drosophila VorratsflaschenVWRVWRI734-1249Flaschenflieger Rund 60Z
Drosophila-FläschchenVWRWRI734-2255
Petrischale aus GlasSigma-AldrichBR455701
Mikrohämatokrit-KapillareSigma-AldrichBR749321
MicroSD-Karte--Producernt empfiehlt die Verwendung einer SD-Karte mit mindestens 32 GB Speicherplatz für Raspberry Pi OS-Installationen
Micro-USB-StromversorgungHimbeere Pi 096-4585Lieferung auf Mauser.pt
Mineralöl BIO-RAD#1632129
Pinsel--
Phosphatgepuffertes Saliin (PBS)Komponenten, die von verschiedenen Unternehmen bezogen wurden-Puffer zur Zubereitung von Lebensmitteln für die Kontrollgruppe und zur Verdünnung der Probe; 10 mM pH 7
Stopfen für Drosophila-Fläschchen und -FlaschenVWRVWRI734-2875
Stopfen für Drosophila-Fläschchen und -FlaschenVWRVWRI734-2673
SiegelfolieSigma-AldrichHS234526C
Einplatinencomputer  (3 Modell B)Himbeere Pi 096-5700Lieferung auf Mauser.pt
SaccharoseSigma-AldrichNr. S9378
Transparenter Kunststoff-Strohhalm--Alle, die mit der Ethoskopischen Schlafarena kompatibel sind (6,5 cm x 0,5 cm)

Referenzen

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