Anwendung des Dixon-Up-and-Down-Designs zur Schätzung der minimalen Alveolarkonzentration von Sevofluran bei Ratten mit verfeinerter Bewegungsklassifizierung

Zusammenfassung

Das hierin vorgestellte Protokoll versucht, die Tiefe der Anästhesie unter Verwendung des Dixon-Auf-und-Ab-Designs bei sedierten Ratten zu bewerten, die einem standardisierten Schmerzreiz ausgesetzt wurden. Darüber hinaus wird eine Klassifizierung der verschiedenen beobachteten Bewegungsmuster vorgenommen.

Zusammenfassung

Bei der Verwendung von flüchtigen Anästhetika ist das Standardmaß für die Wirksamkeit die minimale Alveolarkonzentration (MAC), definiert als die Alveolarkonzentration, bei der 50% der Probanden keine motorische Reaktion auf einen schmerzhaften Reiz zeigen. In klinischen und experimentellen Studien besagt der derzeitige Konsens, dass nur "grobe zielgerichtete Bewegungen" als positive motorische Reaktion gelten und daher auf eine zu milde Sedierung hinweisen können. Das angemessene Maß an Anästhesie, sowohl bei Menschen als auch bei Tieren, variiert jedoch individuell und hängt von verschiedenen Einflussfaktoren ab, wie z. B. anderen verabreichten Medikamenten. Es wurden zwei Tierstudien an Ratten durchgeführt, um die Auswirkungen von Tetrahydrocannabinol und Ethanol auf Sevofluran, eines der am häufigsten verwendeten flüchtigen Anästhetika, zu untersuchen. Zur Schätzung des MAC wurde das Up-and-Down-Design von Dixon verwendet. Für das erste Tier wurde eine vorher festgelegte Dosis von Sevofluran gewählt. Nach einer Äquilibrierungsphase von 15 min wurde mit Hilfe einer chirurgischen Klemme ein standardisierter Schmerzreiz auf das distale Drittel des Rattenschwanzes aufgebracht. Die Reaktion des Tieres auf den Reiz wurde als positiv oder negativ dokumentiert. Wenn eine positive motorische Reaktion auftrat, wurde die Dosis für das nächste Tier erhöht. Zeigte die Ratte hingegen keine motorische Reaktion, wurde die Dosis für das folgende Tier verringert. Die isotonische Regression und die Bootstrap-Methode wurden verwendet, um die MAC- und 95%-Konfidenzintervalle zu schätzen. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Beurteilung der Anästhesietiefe bei Ratten unter Verwendung des Up-and-Down-Designs. Es bietet auch eine neuartige und detaillierte Beschreibung und Kategorisierung von Bewegungsmustern bei sedierten Ratten, wenn ein standardisierter schmerzhafter Stimulus angewendet wird, um die Reproduzierbarkeit für zukünftige Studien zu verbessern.

Einleitung

Sevofluran ist eines der am häufigsten verwendeten flüchtigen Inhalationsanästhetika¹. Seine Wirksamkeit wird anhand der minimalen Alveolarkonzentration (MAC) bewertet, die als die Alveolarkonzentration definiert ist, bei der 50 % der Patienten keine motorische Reaktion auf einen schmerzhaften Reiz zeigen ^2,3,4. Um die MAC zu ermitteln, können Ratten aufgrund ihrer größeren Homogenität im Vergleich zum Menschen als Tiermodelle verwendet werden. Der Schmerzreiz wird typischerweise mit einer chirurgischen Klemme am distalen Drittel des Schwanzes der Ratte appliziert². Die Verwendung alternativer Methoden zur Schmerzuntersuchung würde keine Vergleichbarkeit mit bereits durchgeführten Studien gewährleisten und könnte daher zu abweichenden Ergebnissen führen. Aufgrund der großen Vielfalt an Bewegungsmustern als Reaktion auf den Reiz besagt der derzeitige Konsens, dass nur "grobe zielgerichtete Bewegungen" als positive motorische Reaktionen anzusehen sind³. In dieser Definition fehlt es jedoch an einer weiteren Präzisierung der spezifischen Kategorien, die als "grob zweckmäßig" gelten würden und in welchem Umfang eine Bewegung dieses Kriterium erfüllen sollte. Dies ist von größter Bedeutung, da eine motorische Reaktion auf einen Reiz im klinischen Umfeld auf eine unzureichende Sedierungstiefe hinweisen kann.

Verschiedene Faktoren beeinflussen den Narkosezustand, darunter^das 5. Lebensjahr, Komorbiditäten⁶, Leberfunktionsstörungen⁷ oder Hypothermie⁸. Darüber hinaus beeinflussen die Medikamente, die zusammen mit Anästhetika verabreicht werden, die Tiefe der Anästhesie erheblich. Zum Beispiel reduzieren Fentanyl und Propofol, die häufig während der Induktionsphase verwendet werden, die erforderliche Menge an Sevofluran ^9,10. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Lidocain oder Pregabalin die MAC von Sevofluran senken können^11,12. Darüber hinaus kann auch der kürzliche Konsum von Alkohol oder Substanzen wie Tetrahydrocannabinol (THC) die MAC senken und so die Anästhesietiefe erhöhen^13,14. Umgekehrt wurde vermutet, dass Sympathomimetika die Sedierung durch Stimulierung des Zentralnervensystems aufhellen können¹⁵.

Um die Reproduzierbarkeit für zukünftige Studien zu verbessern, werden ein detailliertes Protokoll und Videobeschreibungen zur Beurteilung der MAC bei Ratten unter Verwendung des Auf- und Ab-Designs¹⁶ von Dixon bereitgestellt. Im Gegensatz zu früheren MAC-Studien beschreibt dieses Protokoll detaillierte Verfahrensschritte, um die Reproduzierbarkeit in allen Laboren zu unterstützen. Darüber hinaus wurde das Videomaterial aus zwei zuvor veröffentlichten Studien erneut analysiert und die motorischen Reaktionen anhand ihres Ausmaßes und Musters klassifiziert (koordinierte Bewegungen - Rollen, Dehnen, Salzen und unkoordiniertes Bewegungscurling). Daher bietet diese Studie auch eine innovative und gründliche Beschreibung und Klassifizierung von Bewegungsmustern bei sedierten Ratten als Reaktion auf einen standardisierten schmerzhaften Stimulus, um die Reproduzierbarkeit für zukünftige Forschungen zu verbessern.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden vom Intramuralen Ausschuss für Tierversuche der Medizinischen Universität Wien und der zuständigen Zulassungsbehörde (Bundesministerium für Frauen, Wissenschaft und Forschung) genehmigt. Die Experimente wurden unter ständiger Narkose durchgeführt. Die Tiere nehmen Schmerzen nicht bewusst wahr, auch wenn eine Bewegung stattfinden sollte¹⁷. Es wurden erwachsene Wistar-Ratten im Alter von 81 bis 95 Tagen verwendet.

1. Versuchstiere und Unterbringung

1. Halten Sie die Tiere nach Gewicht und Geschlecht. Trennen Sie Männchen und Weibchen und halten Sie sie mindestens 14 Tage lang unter, bevor Sie mit dem Experiment beginnen, um eine Akklimatisation zu ermöglichen. Setzen Sie maximal drei Ratten über 400 g oder vier Ratten unter 400 g pro Käfig.
2. Halten Sie die Umgebungsbedingungen mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus, einer Umgebungstemperatur von 22 °C und einer Luftfeuchtigkeit zwischen 45 % und 65 % aufrecht.
3. Wiegen Sie jedes Tier regelmäßig und notieren Sie das Körpergewicht vor jedem Eingriff.
4. Transportieren Sie die Tiere individuell vom Stallbereich zur Versuchseinrichtung. Decken Sie jeden Käfig mit einem Tuch ab, um den visuellen Stress zu reduzieren, und halten Sie ungetestete Tiere in einem separaten Raum unter, um experimentelle Verfahren zu vermeiden.

2. Einrichtung der Ausrüstung

1. Stellen Sie sicher, dass alle erforderlichen Geräte funktionsfähig und verfügbar sind, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Führen Sie Geräteprüfungen gemäß institutionellen Richtlinien oder Standardarbeitsanweisungen durch, einschließlich Dichtheitsprüfungen, Kalibrierungen und Leistungsfunktionstests, falls zutreffend.
2. Verwenden Sie eine luftdichte, transparente Kammer (15 cm × 20 cm × 9 cm), um die Ratte zu platzieren. Stellen Sie sicher, dass die Kammer mit einer 15-mm-Öffnung ausgestattet ist, um den Schwanz nach außen zu führen und gleichzeitig Gasleckagen zu minimieren.
3. Verbinden Sie die Zuflussleitung mit einem Sevofluran-Verdampfer und einer Sauerstoffquelle.
4. Verbinden Sie die Abflussleitung auf der gegenüberliegenden Seite der Kammer sowohl mit einem Gasextraktionssystem als auch mit einem Anästhesiemonitor, um die Sevofluran-Konzentrationen aufzuzeichnen.
5. Vergewissern Sie sich, dass das Rektalthermometer, die Heizdecke und die Infrarot-Heizlampe betriebsbereit sind. Testen Sie das Thermometer mit einem Referenzgerät, überprüfen Sie, ob die Heizdecke die Zieltemperaturbereiche erreicht, und stellen Sie sicher, dass sich die Infrarotlampe einschaltet und eine stabile Leistung beibehält. Positionieren Sie die Lampe direkt über der Prüfkammer in sicherem Abstand gemäß den örtlichen Sicherheitsverfahren.
6. Bereiten Sie eine 25 cm lange arterielle Klemme vor, die für den standardisierten Schmerzreiz verwendet wird.

3. Vorbereitung des Arzneimittels

1. THC-Zubereitung (optional)
   1. Verwenden Sie eine THC-Formulierung mit einer Konzentration von 25 mg/ml. Berechnen Sie das erforderliche Volumen für jedes Tier, indem Sie das Körpergewicht in Kilogramm mit (10 mg/kg/25 mg/ml) multiplizieren, was 0,4 ml pro kg Körpergewicht ergibt.
   2. Verwenden Sie eine Verdrängerpipette, um das genau berechnete Volumen für jedes Tier zu ermitteln. Zu diesem Zeitpunkt nicht verabreichen. Bereiten Sie die Pipette vor und legen Sie sie für die spätere Verabreichung während des Verabreichungsschritts des Arzneimittels beiseite (siehe Schritt 4.6).
   3. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, die für die Sonde geeignet ist, z. B. eine, die bis zu 0,3 ml Flüssigkeit sicher aufnehmen kann. Führen Sie die Mundsonde direkt mit der geladenen Pipette durch. Entsorgen Sie die Pipettenspitze nach jedem Gebrauch, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
2. Ethanol-Zubereitung (optional):
   1. Ethanol in der erforderlichen Dosierkonzentration von 1 g/kg oder 2 g/kg herstellen. Verwenden Sie eine hochkonzentrierte Formulierung von Ethanol (z. B. 96-100 %) als Basis und lösen Sie es in 0,9 % Kochsalzlösung bis zu einem Gesamtvolumen von 10 ml/kg Körpergewicht für jedes einzelne Tier auf. Verwenden Sie das gleiche Volumen Kochsalzlösung allein wie das entsprechende Placebo. Befolgen Sie alle institutionellen Sicherheitsrichtlinien, insbesondere in Bezug auf den Umgang und die Lagerung von brennbaren Stoffen.
   2. Verwenden Sie eine geeignete Spritze (5 mL oder 10 mL, je nach Gewicht des Tieres), um das genau berechnete Volumen für jedes einzelne Tier zu ermitteln. Verabreichen Sie die Substanz zu diesem Zeitpunkt nicht. Bereiten Sie die Spritze vor und legen Sie sie während des Verabreichungsschritts des Arzneimittels für die intraperitoneale Injektion beiseite (siehe Schritt 4.6). Befestigen Sie eine 23-G-Nadel für die Verabreichung und decken Sie sie mit einer entsprechenden Kappe ab, um Verletzungen bis zum Gebrauch zu vermeiden.

4. Anwendung des Arzneimittels

1. Induzieren Sie eine Anästhesie für die Verabreichung des Arzneimittels, indem Sie die Ratte in die Kammer legen und sie mit 3,5 Vol.-% Sevofluran in 100 % Sauerstoff bei 3 l/min fluten.
2. Warten Sie ca. 3-5 Minuten, bis das Tier visuell bewusstlos ist.
3. Führen Sie den Aufrichtreflextest durch, indem Sie die Kammer vorsichtig kippen, um das Tier auf den Rücken zu rollen. Wenn es nicht versucht, sich innerhalb von 10 s aufzurichten, gehen Sie von einer ausreichenden Anästhesietiefe aus.
4. Reduzieren Sie die Sevoflurankonzentration vorübergehend auf 0 und spülen Sie die Kammer 15 s lang mit 100 % Sauerstoff, um die Exposition des Experimentators gegenüber Anästhesiegas zu minimieren.
5. Nehmen Sie das Tier aus der Kammer und legen Sie es vor ein Gasförderrohr, das die gleiche Sevofluran-Konzentration liefert, um die Anästhesie während der Verabreichung aufrechtzuerhalten. Überspringen Sie diesen Schritt, wenn die Verabreichung der Prüfsubstanz kurz genug ist, um eine Genesung nach der Anästhesie zu vermeiden.
6. Verabreichung von Substanzen pro Versuchsdesign: Verabreichen Sie 10 mg/kg THC über die Magensonde oder verabreichen Sie 1 g/kg oder 2 g/kg Ethanol intraperitoneal. Weitere Informationen zur Vorbereitung finden Sie in Abschnitt 3 und befolgen Sie die institutionellen Richtlinien für die Durchführung von Sondensonden und intraperitonealen Verabreichungsverfahren.
7. Bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück, damit es sich erholen kann.
8. Warten Sie 1 Stunde für Ethanol und 2 Stunden für THC, bevor Sie mit dem Verfahren fortfahren.

5. Anästhesieeinleitung für MAC-Tests

1. Nach der Wartezeit stellen Sie die Ratte wieder in die luftdichte Prüfkammer und fluten sie mit dem ermittelten Gemisch aus Sevofluran und Sauerstoff. Sorgen Sie für einen konstanten Sauerstofffluss von 3 L/min. Bestimmen Sie die individuelle Sevoflurankonzentration (Schritt 9.1) für jedes Tier, beginnend mit 2,6 Vol.-% (oder einem anderen vorgegebenen Ausgangswert auf der Grundlage statistischer Planung) für das erste Tier in jeder Gruppe. Eine detaillierte Beschreibung des Up-and-Down-Designs finden Sie weiter unten.
2. Schalten Sie die Infrarot-Heizlampe ein.
3. Warten Sie ca. 3-5 Minuten, bis das Tier visuell bewusstlos ist.
4. Führen Sie den Aufrichtreflextest durch, indem Sie die Kammer vorsichtig kippen, um das Tier auf den Rücken zu rollen. Wenn es nicht versucht, sich innerhalb von 10 s aufzurichten, gehen Sie von einer ausreichenden Anästhesietiefe aus.
5. Reduzieren Sie die Sevoflurankonzentration vorübergehend auf 0 und spülen Sie die Kammer 15 s lang mit 100 % Sauerstoff, um die Exposition des Experimentators gegenüber Anästhesiegas zu minimieren.
6. Öffnen Sie schnell die Kammer und setzen Sie das Rektumthermometer ein. Überwachen Sie die Körperkerntemperatur während des gesamten Eingriffs und passen Sie die Intensität der Infrarot-Heizlampe und der Heizdecke entsprechend an.
7. Führe den Schwanz durch die kleine Öffnung in der Kammer nach draußen.
8. Schließen Sie die Kammer schnell.
9. Stellen Sie sofort die gewünschte Sevofluran-Konzentration wieder her, bevor Sie fortfahren.

6. Gleichgewichtszeit

1. Warten Sie einen Zeitraum von 15 Minuten für die Äquilibrierung.
2. Überwachen Sie kontinuierlich die Kerntemperatur des Tieres (37,2 °C ± 0,3 °C) und stellen Sie die Heizgeräte entsprechend ein, um die Normothermie aufrechtzuerhalten.

7. Schmerzreiz

1. Identifiziere das distale Drittel des Schwanzes.
2. Wenden Sie den Schmerzreiz an, indem Sie die Klemme in ihrer dritten Position (ca. 50 N Kraft) arretieren.
3. Lassen Sie die Klemme in ihrer dritten Position verriegelt, bis die Ratte eine positive Bewegungsreaktion zeigt, jedoch maximal 1 Minute lang.
4. Vermerken Sie im Protokoll das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein einer motorischen Reaktion. Geben Sie eine kurze Beschreibung der beobachteten Bewegung in Bezug auf ihr Muster und ihre Ausdehnung an. Für die Klassifizierung der Bewegungsmuster siehe Nummer 11.

8. Rückforderung

1. Schalten Sie den Vaporizer und die Heizlampe aus und setzen Sie die Ratte wieder in den Käfig.

9. Auf- und Ab-Design

1. Bestimmen Sie die Sevofluran-Konzentration für das folgende Experiment mit dem Up-and-Down-Design von Dixon. Wenn das vorherige Tier eine motorische Reaktion auf den Reiz zeigte, erhöhen Sie die Konzentration für das nächste Tier um 0,2 %pt. Zeigt das vorherige Tier hingegen keine motorische Reaktion, ist die Konzentration um 0,2 %pt zu verringern.

10. Euthanasie (falls zutreffend)

HINWEIS: Euthanasie ist nicht von Natur aus ein notwendiger Teil der Experimente. Der zuständige Intramurale Ausschuss für Tierversuche ist zu konsultieren. Für die beiden genannten Studien wurde entschieden, intrakardiale Blutabnahmen durchzuführen und die Tiere anschließend einzuschläfern. Die Tiere wurden nicht wie in Schritt 8.1 beschrieben in den Käfig zurückgebracht, sondern das Verfahren wurde direkt mit Schritt 9.1 fortgesetzt.

1. Bereiten Sie die Euthanasielösung vor, indem Sie 300 mg Pentobarbital in 1 ml Kochsalzlösung auflösen. Ziehen Sie die Lösung in eine Spritze und halten Sie sie nach der Blutabnahme sofort einsatzbereit.
2. Nehmen Sie die Ratte aus der Schachtel und platzieren Sie sie vor einem Beatmungsschlauch, der 3,5 Vol.-% Sevofluran in 100 % Sauerstoff liefert, um eine konstante Anästhesie aufrechtzuerhalten. Positionieren Sie das Tier auf dem Rücken, um einen ungehinderten Zugang zum Brustbereich zu ermöglichen.
3. Führen Sie die intrakardiale Blutabnahme mit einer 23 g Nadel und einer 5 mL Spritze durch. Berühren Sie den Herzschlag vorsichtig mit einem Finger, um das Herz zu lokalisieren. Führen Sie die Nadel gerade kaudal zum Xiphoidfortsatz ein, leicht links von der Mittellinie und in einem flachen Winkel.
4. Aspirieren Sie vorsichtig, während Sie die Nadelposition einstellen, bis der Blutfluss zu beobachten ist. Sammeln Sie das erforderliche Volumen.
5. Entfernen Sie nach Abschluss der Blutabnahme vorsichtig die Spritze von der Nadel und setzen Sie die vorgeladene Spritze mit der Pentobarbitallösung auf. Verabreichen Sie den gesamten 1 ml der Lösung intrakardial, um die Euthanasie in Übereinstimmung mit den institutionellen ethischen Richtlinien zu gewährleisten.

11. Fortsetzung der Versuche

1. Wiederholen Sie den Versuch ab Schritt 3 für jedes Versuchstier einzeln.

12. Klassifizierung von Bewegungsmustern (fakultativ)

1. Klassifizieren Sie Verhaltensreaktionen in die folgenden Kategorien:
   1. Rollen: Als Rollen klassifizieren, wenn die Verhaltensreaktion eine axiale Drehung des Körpers beinhaltet, typischerweise entlang der Längsachse.
   2. Dehnung: Als Dehnung klassifizieren, wenn die Verhaltensreaktion durch eine beidseitige, symmetrische Ausdehnung der Gliedmaßen und des Körpers nach außen gekennzeichnet ist.
   3. Saltatorische Bewegung: Wird als saltatorische Bewegung klassifiziert, wenn die Verhaltensreaktion aus plötzlichen, auf die Hinterbeine fokussierten Tritte oder Zuckungen besteht, die kurzen, hüpfenden Ausbrüchen des ganzen Körpers ähneln.
   4. Curling: Klassifizieren Sie es als Curling, wenn die Verhaltensreaktion eine unkoordinierte, nach innen gerichtete Bewegung unterschiedlicher Intensität beinhaltet, die dazu führt, dass sich der Körper in Richtung seiner Mitte beugt.

Ergebnisse

In der THC-Studie betrug die Bootstrap-Schätzung des MAC 2,8 Vol% in der Kontrollgruppe (95 % CI: 2,7-2,9 Vol%) und 2,1 Vol% in der 10 mg/kg THC-Gruppe (95 % CI: 1,8-2,4 Vol%)¹³.

In der Ethanolstudie betrug die geschätzte MAC in der Kontrollgruppe 2,24 Vol.-% (95 %-KI: 1,97-2,94 Vol.-%). In der Gruppe mit 1 g/kg Ethanol betrug sie 1,65 Vol.-% (95 %-KI: 1,40-1,98 Vol.-%) und in der Gruppe mit 2 g/kg Ethanol 1,08 Vol.-% (95 %-KI: 0,73-1,42 Vol.%)¹⁴...

Diskussion

Diese Studie verfeinert das Protokoll zur Bestimmung der MAC von Sevofluran bei Ratten, indem sie kritische methodische Schritte detailliert beschreibt und gemeinsame Herausforderungen anspricht, um zu einem standardisierteren und reproduzierbareren Ansatz zur Beurteilung der Anästhesietiefe beizutragen.

Eine genaue MAC-Bestimmung ist sowohl für experimentelle als auch für klinische Anästhesiepraktiken unerlässlich. Diese Arbeit leistet einen Beitrag zur beste...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Luftdichte transparente Kammer	N/A	N/A	Generisch
Arterielle Klemme	KLS Martin	13-410-22-07	ca. 25 cm
Drä mehr Primus	Drä ger Austria GmbH	Primus
Drä ger Vapor 2000	Drä ger Austria GmbH	Dampf 2000
Homöotherme Deckensteuereinheit	Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, USA	50-7137	230 V
Manueller mobiler Säuglingswärmer	Fisher/Paykle, Auckland, Neuseeland	IW9210/920