In vitro Rekonstitution von Zytoskelett-Netzwerken in phasengetrennten riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs)

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird eine einfache Ein-Topf-Rekonstitution von Zytoskelett-Netzwerken innerhalb von phasengetrennten Riesenvesikeln vorgestellt. Die Methode kann verallgemeinert und auf die Verkapselung oder den Einschluss einer Vielzahl von Biomolekülen angewendet werden.

Zusammenfassung

Biomimetische Lipidmembranen in Form von riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs) werden häufig verwendet, um das Verhalten zellulärer Membranen nachzuahmen, da die Proteinrekonstitution in GUVs erleichtert ist, die Visualisierung sowie die zelluläre Membran-Protein-Dynamik verstanden werden kann. Zellmembranen bestehen jedoch aus Lipid Rafts (oder Domänen), die durch das Vorhandensein verschiedener Lipide in der Zellmembran entstehen. Eine solche erhöhte Komplexität in Modellsystemen kann in phasengetrennte GUVs integriert werden, in denen die Lipidzusammensetzung fein abgestimmt werden kann. Während Verkapselungsmethoden zur Erzeugung homogener GUVs weithin bekannt sind, sind Methoden zur Verkapselung von Proteinen innerhalb phasengetrennter GUVs begrenzt. Hier stellt dieses Protokoll eine vereinfachte Ein-Topf-Produktion von phasengetrennten GUVs dar, die aus flüssigkeitsungeordneten (L_d) und flüssig geordneten (L_o) Domänen bestehen und verschiedene Zytoskelettproteine, d.h. FtsZ und Aktin, effizient verkapseln, was die Methode zu einem vielseitigen Werkzeug für die minimale Zellproduktion macht. Konkret wird bei diesem Ansatz ein Emulsionstransferprotokoll verwendet, um GUVs mit einer hohen Verkapselungseffizienz herzustellen. Bei diesem Verfahren wird zunächst eine Lipid-Monoschicht durch Emulgieren einer Proteinlösung in einem Lipid-Öl-Gemisch erzeugt, wobei Lipide mit unterschiedlichen Phasenübergangstemperaturen ausgewählt werden, um eine Phasentrennung in den resultierenden GUVs zu erzielen. Diese Emulsion wird sanft auf eine Lipid-in-Öl-Lösung in einem anderen Rohr übertragen, wodurch sich eine Wasser-Öl-Grenzfläche bildet. Die Lösung wird dann bei erhöhten Temperaturen (idealerweise bei 37 °C, um die Proteinaktivität zu erhalten) zentrifugiert, wonach GUVs für die Bildgebung gesammelt werden. Diese Methode vereinfacht die in vitro Rekonstitution von Zytoskelettproteinen innerhalb von phasengetrennten GUVs ohne einen umständlichen Laboraufbau und dient somit als geeignete Methode zur Untersuchung der Mechanik von Zytoskelett-Membran-Wechselwirkungen im Confinement.

Einleitung

Riesenvesikel dienen als Modellsysteme, um zelluläre Funktionen zu verstehen ^1,2. Ihre einfache Herstellung, Visualisierung, Abstimmbarkeit und In-vitro-Rekonstitution von Biomolekülen machen diese biomimetischen Modelle zum System der Wahl für viele Forschungsstudien ^3,4,5. Es gibt mehrere bekannte Verfahren zur Herstellung von GUVs, wie z. B. Elektroformation⁶, cDICE ^7,8, Emulsionstransfer und andere mikrofluidikbasierte Methoden ^9,10. Über die GUV-Herstellung mit solchen Methoden wird in der Literatur berichtet ^3,11. Darüber hinaus wurde in vitro die Rekonstitution von Zytoskelettnetzwerken innerhalb von GUVs zuvor unter Verwendung eines Emulsionstransferverfahrens beschrieben, da dieses Eintopfbildungsverfahren, das keinen komplexen Aufbau erfordert, einfach ist¹². Eine solche Rekonstitution wird jedoch sehr häufig in homogenen GUVs berichtet, einem System, das die Komplexität der Zellmembranen nicht vollständig nachahmt.

Dieses Protokoll beschreibt die in vitro Rekonstitution von Zytoskelett-Netzwerken innerhalb von phasengetrennten GUVs, was die Komplexität der Lipidmembran zeigt. Während zuvor berichtet wurde, dass solche Netzwerke an der Oberfläche der Membran (außen), aber nicht innerhalb der riesigen Vesikel binden^{13, 14}, konzentriert sich die vorliegende Emulsionstransfertechnik auf das Protokoll, um eine Phasentrennung zu erzielen und die Aktivität der Netzwerkbildung des Zytoskeletts beizubehalten. Eine der größten Herausforderungen bei dieser Technik ist die Temperatur. Herkömmliche Produktionsmethoden zur Erzeugung von phasengetrennten GUVs erfordern die Verwendung erhöhter Temperaturen, die je nach Phasenübergangstemperatur der Bestandteile der Lipide variieren. Zytoskelettproteine sind jedoch nicht in der Lage, bei solch hohen Temperaturen zu Strukturen höherer Ordnung zu polymerisieren 15,16,17. Somit verwendet dieses Protokoll nicht nur eine Lipidzusammensetzung, um eine Phasentrennung in GUVs bei Raumtemperatur zu erzielen, sondern optimiert auch die Bedingungen, um eine gute Ausbeute an GUVs bei physiologischen Temperaturen zu erzielen.

Ein weiterer Aspekt, der bei der Herstellung von rekonstituierten GUV-Systemen zu berücksichtigen ist, ist das Volumen der benötigten verkapselten Biomoleküle. Für die meisten Proteine kann die Herstellung größerer Volumina teuer und zeitaufwändig sein und mehrere Aufreinigungsrunden erfordern. Darüber hinaus erfordern In-vitro-Rekonstitutionsexperimente in der Regel eine erste explorative Phase, in der zunächst die Biomolekülkonzentrationen, Pufferzusammensetzungen usw. getestet werden, um einen optimierten Gehalt an innerer Lösung zu erreichen. Somit optimiert dieses Protokoll das GUV-Produktionsprotokoll für zwei verschiedene Assays, die sich an die oben genannten Prämissen anpassen. Einerseits beschreibt dieses Protokoll einen Assay, der das Standardprotokoll für invertierte Emulsionen optimiert, das relativ größere Mengen an Proteinen beinhaltet und eine GUV-Produktion mit hoher Ausbeute in Röhrchen erzeugt, die später auf bildgebende 96-Well-Platten übertragen werden. Auf der anderen Seite optimiert der hier beschriebene Ansatz auch das Protokoll für die phasengetrennte GUV-Produktion direkt in Imaging-Well-Platten, die geringere Volumina an Biomolekülen (~1/4 der für die Herstellung in Röhrchen erforderlichen Mengen) verwendet und die GUV-Erzeugung in Serie ermöglicht, wodurch viele verkapselte Bedingungen in einem Zentrifugationsschritt erreicht werden. Das hier vorgestellte Protokoll zeigt also eine Verkapselungsmethode, ermöglicht es dem Benutzer jedoch, je nach seinen Anforderungen eine der beiden Setups zu wählen.

Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll eine optimierte Methode zur Verkapselung von zwei verschiedenen Zytoskelett-Netzwerken: FtsZ und Aktin. Da diese beiden Proteine unterschiedliche Puffer- und Crowding-Bedingungen benötigen, befasst sich das Protokoll mit den nachfolgenden notwendigen Änderungen, um eine optimale Netzwerkrekonstitution zu erreichen. Daher kann der hier vorgestellte Ansatz für die Verkapselung beliebiger benötigter Biomoleküle in phasengetrennten GUVs verwendet und verallgemeinert werden.

Protokoll

Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Zubereitung der Lipidmischung

1. Nehmen Sie 0,5 ml Chloroform in einer 5-ml-Durchstechflasche aus Glas ein. Fügen Sie 17,5 μl DOPC, 7,4 μl DOPG, 29,6 μl DPPC (alle aus 25 g/l Lipidbrühen, die in Chloroform hergestellt wurden), 32,2 μl 10 g/l DPPG und 20,6 μl 18 g/l Cholesterin hinzu. Fügen Sie 1,2 μl 1 g/l Atto655-DOPE-Farbstoff hinzu. Die Lipidmischung vorsichtig vortexen, das Chloroform unter Stickstofffluss verdampfen und den dünnen Film in insgesamt 400 μl Chloroform wieder auflösen.
2. Für die Verkapselung von FtsZ wird die endgültige Lipidmischung im Verhältnis DOPC: DOPG: DPPC: DPPG: Chol (17,499: 7,5:31,5:13,5:30 mol Verhältnis) mit 0,001 mol% Atto655-DOPE markiert. Für die Herstellung von GUVs mit verkapseltem gebündeltem Aktin enthält die Lipidmischung biotinylierte Lipide, und sie wird im Verhältnis DOPC: DOPG: DPPC: DPPG: Chol: Biotinyl CAP PE (17.499: 7.5: 30.5: 13.5: 30:1) hergestellt und ist mit 0,001 mol% Atto655-DOPE markiert.
3. Lösen Sie die Lipidmischung (32 mM, 50 μL) in Chloroform auf und trocknen Sie sie in einem Glasfläschchen unter N₂ Gasstrom für ~15 min.
4. Das Glasfläschchen wird dann unter Vakuum in einem Exsikkator für ~30 min gelagert, um alle Spuren von Chloroformresten zu entfernen.
5. Dispergieren Sie den getrockneten Film in einer Mischung aus Decan (20 μL) und Mineralöl (500 μL) im Glasfläschchen, um die Endkonzentration von 3,2 mM zu erhalten, und beschallen Sie ihn bei erhöhten Temperaturen (~50 °C) für ~30 min mit einem Bad-Ultraschallgerät.
6. Übertragen Sie die Lipid-in-Öl-Mischung in ein Röhrchen und inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C für ~10 Minuten, bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren.
7. Bereiten Sie die innere Verkapselungsmischung für Proteine vor.

2. Vorbereitung der inneren Lösungen für die Verkapselung

1. FtsZ Filament Mischung
   1. Bereiten Sie die FtsZ-Proteinmischung in einem Gesamtvolumen von 10 μl in einem Mikroröhrchen vor. Für das filamentöse FtsZ-Netzwerk fügen Sie 0,87 μl 23 μM FtsZ-YFP-mts, 1,31 μl 381 g/l Ficoll70, 1,11 μl 271 g/l BSA und 1 μl 25 mM GTP zu 5,71 μl FtsZ-Reaktionspuffer (RB) hinzu. Das Gesamtvolumen der Lösung beträgt 10 μl und enthält 2 μM FtsZ-YFP-mts, 50 g/l Ficoll70, 30 g/l BSA und 2,5 mM GTP in der endgültigen Lösung. Bewahren Sie es auf Eis auf, bevor Sie es zur Verkapselung in GUVs verwenden.
      HINWEIS: Der FtsZ-Reaktionspuffer (RB) enthält 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM GluK, 5 mM GluMg.
2. Aktin-Bündel-Gemisch
   1. Für die Verkapselung von Aktinbündeln bereiten Sie zunächst einen 10 μL Aktin-Mastermix (A-Mix) vor, der 86 % G-Aktin, 10 % Atto488-Aktin und 4 % biotinyliertes Aktin in Wasser enthält. Bereiten Sie für diesen Schritt Protein-Stammlösungen gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Für eine Endkonzentration von 35,42 μM A-Mix fügen Sie dann 6,39 μ l 2 g/l G-Aktin, 1,48 μl 1 g/l Atto488-Aktin, 1,19 μl 0,5 g/l biotinyliertes Aktin und 0,9 μl H₂O hinzu. Auf Eis aufbewahren und vor Licht schützen.
   2. Um eine Vorpolymerisation und Bündelung von Aktin außerhalb der GUVs zu verhindern, bereiten Sie die endgültige Aktinlösung Minuten vor der Verkapselung vor. Die endgültige Lösung besteht aus 7 % Jodixanol, 0,01 g/l Neutravidin, 2,4 μM A-Mix, 0,6 μM Fascin, 10 g/l BSA, 20 g/l Ficoll70 und 5 mM ATP in Aktinpolymerisationspuffer.
      1. Um diese endgültige Lösung herzustellen, die immer auf Eis aufbewahrt werden muss, fügen Sie in der folgenden Reihenfolge hinzu: 2,92 μl 60% Jodixanol, 10,25 μl H₂O, 2,5 μl von 0,1 g/l Neutravidin, 0,92 μl von 271 g/l BSA, 1,31 μl von 381 g/l Ficoll70, 2,5 μl von 10x Aktin-Polymerisationspuffer, 1,69 μl 35,42 μM A-Mix, 1,65 μl 9 μM Fascin und 1,25 μl 100 mM ATP. Gut mischen und schnell die 5 μl nehmen, die zum Verkapseln benötigt werden.
         HINWEIS: Messen Sie die Osmolarität dieser inneren Lösung mit einem Osmometer (~430 mOsm/kg). Eine passende äußere Lösungsmischung mit der gleichen Osmolarität muss hergestellt werden, indem Glukose in Wasser verdünnt wird, bis der gleiche Osmolaritätswert erreicht ist (siehe Schritt 3.2). 10x Aktin-Polymerisationspuffer enthält 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM KCl und 50 mM MgCl₂.

3. GUV-Herstellung und In-vitro-Verkapselung

1. GUV-Produktion in Rohren: Verkapselung von FtsZ
   1. Für die FtsZ-Verkapselung geben Sie 500 μl FtsZ-Reaktionspuffer (RB) in ein 1,5-ml-Kunststoffröhrchen und fügen Sie vorsichtig 200 μl Lipid-in-Öl-Mischung (hergestellt in Schritt 1.6 oben) hinzu, um die Bildung einer Öl-Wasser-Grenzfläche und die Abscheidung einer Lipidmonoschicht an dieser Grenzfläche zu ermöglichen.
   2. Um die Emulsion zu bilden, nehmen Sie zunächst ein weiteres 1,5 mL Röhrchen und fügen Sie 200 μl Lipid-in-Öl hinzu. Inkubieren Sie dieses Röhrchen bei 37 °C für ~10 Minuten, bevor Sie die Emulsion bilden.
   3. Nach der Inkubation werden 5 μl der FtsZ-Proteinmischung (hergestellt in Nummer 2.1.1) in dieses Röhrchen gegeben. Das 5 μL Protein in wässrigen Medien sinkt als Tröpfchen auf den Boden des Röhrchens.
   4. Stellen Sie eine Emulsion her, indem Sie 5-6 Mal vorsichtig auf den Boden der Tube klopfen, bis die Lösung sichtbar trüb wird.
   5. Diese Emulsion wird vorsichtig pipettiert und auf die Öl-Wasser-Grenzfläche (siehe Schritt 3.1.1 vorbereitet) gelegt.
   6. Zentrifugieren Sie diese bei 6000 x g für 30 min bei einer vorgewärmten Temperatur von 37 °C und halten Sie diese Temperatur bis zum Ende der Vesikelproduktion.
   7. Lassen Sie die Probe vor der Bildgebung fast 30 Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen.
   8. Entfernen Sie die oberste Ölschicht, indem Sie vorsichtig von der Oberseite des Röhrchens pipettieren, so dass fast 100-200 μl Lösung für die Bildgebung übrig bleibt.
   9. Schneiden Sie mit einer Schere eine Pipettenspitze in einem schrägen Winkel ab und nehmen Sie vorsichtig 50-100 μl der GUV-Lösung vom Boden des Röhrchens auf. Diese Lösung wird für die Bildgebung verwendet.
2. GUV-Produktion direkt in 96-Well-Platten: Verkapselung von Aktin
   1. Für die Aktinverkapselung wird zunächst eine äußere Lösungsmischung (Glukose in Wasser) mit der gleichen Osmolarität wie die innere Aktinmischung hergestellt. Um die ~430 mOsm/kg der inneren Mischung zu erreichen, stellen Sie eine äußere Lösungsmischung her, indem Sie 198 μl 2 M Glukose in 802 μl H₂O hinzufügen.
   2. Um die Vesikel direkt auf einer Well-Platte herzustellen, passivieren Sie zunächst eine Well-Platte einer 96-Well-Platte. 100 μL 10 g/L BSA in die Vertiefung geben und 10-15 min inkubieren. Waschen Sie dann die Vertiefung fünfmal mit 100 μl äußerer Lösung und achten Sie darauf, den passivierten Glasboden nicht mit der Pipettenspitze zu berühren. Lassen Sie 100 μl der äußeren Lösungsmischung nach Beendigung des Waschvorgangs in der Vertiefung.
   3. Geben Sie vorsichtig 50 μl Lipid-in-Öl-Mischung in die Vertiefung, um die Lipid-Monoschicht auf der äußeren Lösung vorzubereiten. Um eine korrekte Abscheidung des Öls auf der wässrigen Phase zu gewährleisten, legen Sie die Pipettenspitze auf eine Seite der Vertiefung und lassen Sie das Öl von der Wand der Vertiefung gleiten.
   4. Um die Emulsion zu bilden, nehmen Sie zunächst ein 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie 100 μl Lipid-in-Öl hinzu. Inkubieren Sie dieses Röhrchen bei 37 °C für ~10 Minuten, bevor Sie die Emulsion bilden.
   5. 2,5 μl der endgültigen Aktinlösung (aus Schritt 2.2.2) in das Röhrchen mit 100 μl Lipid-in-Öl-Mischung geben (Schritt 1.6 oben). Das 2,5 μL große Protein sinkt in wässrigen Medien als Tröpfchen auf den Boden des Röhrchens.
   6. Stellen Sie eine Emulsion her, indem Sie 10-20 Mal vorsichtig auf den Boden der Tube klopfen, bis die Lösung sichtbar trüb wird.
   7. Diese Emulsion wird vorsichtig pipettiert und auf die Öl-Wasser-Grenzfläche (siehe Schritt 3.2.3 vorbereitet) gelegt. Tauchen Sie die Spitze der Pipette vorsichtig in die Mitte der Öl-Monoschicht und tragen Sie die Emulsion auf. Die Emulsion bildet eine trübe Wolke, die in der Phase der Öl-Monoschicht eingeschlossen ist.
   8. Die 96-Well-Platte wird bei 200 x g für 20 min bei einer vorgewärmten Temperatur von 37 °C zentrifugiert und diese Temperatur bis zum Ende der Vesikelproduktion gehalten.
      HINWEIS: Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 400 x g , um die Vesikelproduktionszeit zu verkürzen. Halten Sie sich jedoch an diese Zentrifugationsparameter, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Eine Zentrifugation über 400 x g führt zu verdichteten Vesikeln mit Lipidaggregaten, die sich am Boden der Speicherfolie ansammeln.
   9. Lassen Sie die Probe vor der Bildgebung fast 30 Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen.
      HINWEIS: Die direkte Bildgebung kann an einem Bohrloch durchgeführt werden, ohne dass die oberste Ölschicht entfernt oder die Vesikel in eine andere Kammer/Bohrung übertragen werden müssen.

4. Bildgebung und 3D-Bildrekonstruktion

1. Nehmen Sie eine 96er Bildgebungsplatte und passivieren Sie sie ~10 Minuten lang mit BSA, bevor Sie die Probe auf die Imaging-Well-Platte übertragen (siehe Schritt 3.2.2).
2. Übertragen Sie die GUV-Lösung auf die passivierte Well-Platte.
3. Stellen Sie die Well-Platte auf den Tisch eines inversen konfokalen Mikroskops auf einem 40-fach-Wasserobjektiv.
4. Konzentrieren Sie sich auf einen beliebigen Bereich of Interest (ROI) und nehmen Sie eine Z-Stack-Bildsequenz aus dem gewählten ROI mit festen Z-Schritt-Intervallen. Das Protokoll führt zu GUVs mit einer Größe von 5 bis 30 μm, so dass das Intervall je nach Bedarf auf 0,5 bis 1 μm festgelegt werden kann.
5. Speichern Sie jede Z-Stapel-Bildsequenz in .tiff Format.
6. Öffnen Sie eine Bildsequenz von Interesse in einer Bildverarbeitungssoftware (ImageJ/Fiji). Identifizieren Sie das Bild mit der höchsten Intensität. Halten Sie Strg+Umschalt+c gedrückt, um das Fenster Helligkeit & Kontrast zu öffnen, und klicken Sie auf Auto.
7. Gehen Sie im Menü ImageJ/Fiji zu Analysieren > Maßstab festlegen und geben Sie die bekannte physikalische Entfernung und deren Einheit für jedes Bildpixel ein.
8. Wechseln Sie im Menü ImageJ/Fiji zu Image > Stacks > Z-Projekt , um ein 3D-Bild aus dem Z-Stack zu rekonstruieren. Legen Sie den Projektionstyp auf Standardabweichung fest. Die Standardoptionen können für die restlichen Einstellungen (Slice starten und Slice stoppen) verwendet werden.
   HINWEIS: Achten Sie auf Projektionsartefakte der Standardabweichung, die sich aus überlappenden Z-Stapeln bei der 3D-Rekonstruktion ergeben. Um sicherzustellen, dass keine Artefakte vorhanden sind, entfernen Sie Z-Stapel in der unteren Hemisphäre der Kugel, um nur die Projektion der oberen Hälfte zu beobachten.

5. Statistische Analyse der GUV-Häufigkeit auf der Grundlage der Größe

1. Erfassen Sie Z-Stack-Bilder der interessierenden GUVs, wie in den Schritten 4.4 und 4.5 beschrieben. Um so viele GUVs wie möglich in einem weiten Sichtfeld abzubilden, erfassen Sie konfokale Stapel mit 1- oder 2-fachem Zoom.
2. Öffnen Sie die Z-Stack-Sequenzen in einer Bildverarbeitungssoftware (in diesem Fall ImageJ/Fiji), wie in 4.6 beschrieben.
3. Wählen Sie den Anzeigekanal aus, in dem das Membranfluoreszenzsignal erfasst wurde, indem Sie auf den Balken mit der Bezeichnung c unter dem Bild klicken. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast des Bildes an, wie in 4.6 beschrieben.
4. Navigieren Sie durch die verschiedenen aufgenommenen Ebenen, indem Sie auf die Z-Leiste unter dem geöffneten Bild klicken. Wählen Sie die Ebene aus, in der der Durchmesser des zu analysierenden Vesikels am größten ist.
5. Öffnen Sie den ROI-Manager in ImageJ/Fiji, indem Sie auf Analyze > Tools > ROI Manager klicken.
6. Klicken Sie mit den im Hauptfenster von ImageJ/Fiji verfügbaren Werkzeugen auf die ovale Auswahl.
7. Zeichnen Sie einen Kreis, der zum GUV passt, indem Sie der Fluoreszenzintensität der GUV-Membran folgen. Um eine Kreisauswahl zu zeichnen, drücken Sie die Umschalttaste und ziehen Sie die Maus, um den Kreis auf die Größe des Vesikels zu erweitern. Die Kreisauswahl kann verschoben werden, indem Sie gleichzeitig mit der linken Maustaste auf die Mitte des Vesikels klicken und die Maus an die gewünschte Stelle ziehen.
8. Speichern Sie die im ROI-Manager gezeichnete Kreisauswahl, indem Sie auf Hinzufügen [t] klicken, das sich im Optionsfeld des ROI-Managers befindet.
9. Um die Größe des Vesikels in Mikrometern zu erhalten, klicken Sie auf Messen , das sich auf dem Panel des ROI-Managers befindet. Es öffnet sich ein neues Fenster. Nehmen Sie den Wert, der in der Spalte "Major" oder "Minor" angezeigt wird (beide Spalten müssen denselben Wert haben, da sie sich auf die Ellipsenachsen beziehen), als Maß für den Vesikeldurchmesser.
10. Verwenden Sie eine Plottsoftware (Excel, Origin, Prism), um ein Balkendiagramm zu erstellen, in dem der Anteil der GUVs für verschiedene Größenbereiche angegeben wird.

Ergebnisse

In einem ersten Schritt wurden GUVs mit Membranphasentrennung nach einem modifizierten invertierten Emulsionsansatz hergestellt (Abbildung 1A). Dies führt zu einer hohen Ausbeute an GUVs, die eine in L_d - und L_o-Domänen entmischte Membran aufweisen, wie durch die Atto 655-DOPE-Markierung auf der_L-d-Domäne und dunkle Regionen, die unmarkierten_L-o-Domänen entsprechen, dargestellt wird (Abbildung 1B). Diese Methode liefert phasengetrennte GUVs mit Größen von 5 bis 30 μm (Abbildung 1C) bei erhöhten Temperaturen (alle Schritte wurden bei 37 °C durchgeführt und bei RT abgebildet). Darüber hinaus wurden die Zentrifugationsgeschwindigkeiten angepasst, um den Einbau der ursprünglichen Lipide in die GUVs zu gewährleisten und eine übermäßige Überpopulation zu vermeiden.

Um die erfolgreiche Verkapselung von Biomolekülen mit der im aktuellen Protokoll beschriebenen Emulsionsmethode zu demonstrieren, wurden sowohl FtsZ- als auch Aktin-Netzwerke in einzelnen Experimenten rekonstituiert. FtsZ-Netzwerke werden in GUVs rekapituliert, die als Filamente auftreten, die bevorzugt über ihre Membran-Targeting-Sequenz (MTS) an_L-d-Domänen in Gegenwart von 2,5 mM GTP und 50 g/L Ficoll70 binden (wie in Abbildung 2 dargestellt). Die Netzwerke wurden etwa 1 h nach dem Verkapselungsschritt beobachtet. Actomyosin-Netzwerke treten jedoch nach der Rekonstitution innerhalb von GUVs als dünne Bündel auf (im Gegensatz zu dicken Netzwerken von FtsZ) (Abbildung 3). Es ist zu beachten, dass biotinylierte Lipide eine entscheidende Rolle bei der Bindung der Aktomyosin-Netzwerke an die Membran der GUVs spielen. Ohne biotinylierte Lipide können Aktomyosin-Bündel keine gekrümmte Konfiguration annehmen und bleiben als gerade, kurze und steife Bündel im Lumen verbleiben, anstatt als verschränktes Netz aus langen Bündeln an der Membran zu haften (Abbildung 4).

Im modifizierten Emulsionsprotokoll wird die Zentrifugationsgeschwindigkeit angepasst, um phasengetrennte GUVs zu erhalten, wie bereits erwähnt. Höhere Zentrifugationsgeschwindigkeiten mit Proben, die Aktomyosin-Netzwerke enthalten (600 x g für 15 min), führen dazu, dass sich Vesikel in der Produktionsvertiefung zu einer gewebeähnlichen Konfiguration zusammenballen. Daher wurde in allen Standard-Rekonstitutionsexperimenten von Aktomyosin-Netzwerken die optimale Zentrifugationsgeschwindigkeit auf 200 x g eingestellt, um nicht-aggregierte GUVs zu erhalten (Abbildung 5).

Abbildung 1: Ein-Topf-Erzeugung von phasengetrennten GUVs unter Verwendung der Doppelemulsionstransfermethode. (A) Experimentelles Schema der Schlüsselschritte bei der Eintopfproduktion von phasengetrennten Vesikeln durch Doppelemulsionstransfer. (B) Konfokales Z-Projektionsbild der resultierenden GUVs, die nach dem in A beschriebenen Verfahren erzeugt wurden. Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm. (C) Balkendiagramm mit dem Anteil der phasengetrennten GUVs, die entsprechend ihrem Durchmesser erzeugt wurden. Durchgeführte Experimente n = 3, die Gesamtzahl der pro Experiment analysierten GUVs = 100. Die Daten werden als Mittelwerte angezeigt, einzelne Datenpunkte sind die drei unabhängigen Experimente. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der drei Experimente dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Phasengetrennte Vesikel mit verkapselten FtsZ-Netzwerken. (A) Konfokale 3D-Projektionsbilder, die auf einem vollständig erfassten Z-Stack eines phasengetrennten GUV durchgeführt wurden, das ein FtsZ-Netzwerk enthält. (B) Konfokale Z-Projektionsbilder, die nur auf der oberen Hälfte des Vesikels durchgeführt wurden. Aufgrund der heterogenen Bildung von Domänen über die Oberfläche des GUV zeigt die 3D-Rekonstruktion der aufgenommenen konfokalen Schnitte die Überlappung von Lipiddomänen aus dem oberen und unteren Bereich des Vesikels. Um Überlappungen zu vermeiden und die visuelle Inspektion der Domänen zu erleichtern, wird die untere Hälfte der erfassten Z-Stapel aus der Datei entfernt. Die resultierende obere Hälfte wird dann für ihre 3D-Projektion über die Standardabweichung verwendet. Die Maßstabsleisten sind beide 20 μm groß. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Phasengetrennte Vesikel mit verkapselten Aktomyosin-Netzwerken. (A) Konfokale Z-Projektionsbilder eines gesamten aufgenommenen Stacks mit einer Zoom-Out-Ansicht des Wells nach der Vesikelproduktion. Die hohe Ausbeute an erhaltenen Vesikeln ermöglicht die Untersuchung verschiedener Aktomyosinstrukturen innerhalb der Vesikel. Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm. (B) Konfokale Z-Projektionsbilder, die auf der oberen Hälfte eines Vesikels durchgeführt wurden. Um die visuelle Analyse von Lipiddomänen zu erleichtern, wird nur die obere Hälfte der Bildscheiben für eine 3D-Projektion verwendet. Der Maßstabsbalken beträgt 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Bedeutung von biotinylierten Lipiden für die Bildung von membrangebundenen Aktomyosin-Netzwerken in phasengetrennten Vesikel. Konfokale 3D-Projektionen, die phasengetrennte Vesikel mit nicht gebundenen Aktomyosin-Netzwerken darstellen. Wenn biotinylierte Lipide nicht in die Mischung eingebaut werden, bilden sich am Lumen Aktomyosin-Strukturen, die auf dem inneren Segel der Vesikel keine gekrümmte Konfiguration annehmen (rechtes Bild, Aktin markiert mit Atto488). Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Einfluss der Zentrifugationsgeschwindigkeit auf die Herstellung von phasengetrennten Vesikeln durch Emulsionstransfer. Konfokale 2D-Bilder, die eine GUV-Probe zeigen, die mit einer Zentrifugationskraft von 600 x g für 15 min erzeugt wurde. Die verwendete Zentrifugationsgeschwindigkeit, die höher ist als die optimierten 200 x g, führt dazu, dass sich die Vesikel in der Vertiefung zu einer gewebeähnlichen Konfiguration zusammenballen. Der Maßstabsbalken beträgt 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Eine der größten Herausforderungen für die in vitro Rekonstitution von membranbasierten Modellsystemen ist die Verkapselung von Proteinen in phasengetrennten GUVs, da diese bei hohen Temperaturen hergestellt werden. In der Tat kann die Erzeugung dieser Art von phasengetrennten Vesikeln durch Eintopfsynthese zu Schwierigkeiten führen, die sich aus dem Abbau von Proteinen bei erhöhten Temperaturen ergeben. Daher beschreibt dieses Protokoll die optimierten Bedingungen, um die Membranphasentrennung nach dem Doppelemulsionsverfahren für die GUV-Herstellung bei physiologischen Temperaturen bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der Aktivität der verkapselten Proteine zu beobachten. Dieser Ansatz führt eine negative Ladung in beide Domänen ein, um die Bindung aller gewünschten Proteine zu erleichtern, wenn elektrostatische Wechselwirkungen Voraussetzung sind. Im Falle der Verkapselung von FtsZ entwickeln sich trotz des Vorhandenseins negativer Ladung in beiden Domänen die Zytoskelettnetzwerke und binden bevorzugt an_L-d-Domänen , was darauf hindeutet, dass neben der negativen Ladung die Fluidität der Membran eine wesentliche Voraussetzung für die Proteinbindung ist¹⁸. Darüber hinaus entwickeln sich bei der Aktinverkapselung die Netzwerke über Membranregionen, in denen biotinylierte Lipide eingebaut sind¹⁹.

Obwohl der Emulsionstransfer-Assay in der Literatur weit verbreitet ist, wurde er bisher nur zur Herstellung homogener GUVs eingesetzt. Dieses Protokoll besteht daher aus mehreren modifizierten Aspekten des Assays, die die Beobachtung der Domänenbildung in der Membran ermöglichen. Einer der wichtigsten Aspekte in diesem Zusammenhang ist die Temperatur. Um Domänen zu beobachten und die Funktionalität der Proteine (insbesondere die Bildung von Zytoskelett-Netzwerken) zu erhalten, verwendet dieses Protokoll 37 °C, um GUVs herzustellen. Einerseits verlieren die verkapselten Proteine bei der Herstellung von GUVs bei einer höheren Temperatur ihre Funktionalität, da sie sich im Lumen befinden und nicht zu Strukturen höherer Ordnung polymerisieren. Werden GUVs hingegen bei einer niedrigeren Temperatur hergestellt, wird eine Phasentrennung in der Membran nicht beobachtet. So werden 37 °C in den Experimenten zur optimalen Temperatur für die GUV-Produktion.

Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll zwei mögliche Assay-Systeme zur Herstellung von GUVs nach dem gleichen Emulsionstransferprinzip bietet: in Röhrchen und Well-Platten. Beides birgt Vor- und Nachteile, die der Anwender möglicherweise in der Versuchsplanungsphase berücksichtigen muss, um festzustellen, welches System am besten zu seinen Anforderungen passt. Kunststoffröhrchen benötigen keine Zentrifuge, die mit einem Rotor für Well-Platten ausgestattet ist, sie sind einfacher zu handhaben und ermöglichen die Kontrolle des Verdünnungsfaktors der Vesikel nach der Produktion und vor der Bildgebung. Sie erfordern jedoch höhere Volumina (sowohl für die Öl- als auch für die wässrige Phase) und die Entfernung der Ölschicht nach der Produktion für die GUV-Extraktion, wodurch Ölreste in der Bildgebungsbohrung zurückbleiben können, wenn dieser Schritt nicht sorgfältig durchgeführt wird. Alternativ erfordern Well-Platten die Verwendung eines geringeren Probenvolumens, ermöglichen die Verkapselung verschiedener innerer Bedingungen in Serie und gleichzeitig und erfordern keine GUV-Extraktion, da Vesikel direkt nach der Produktion in derselben Produktionsvertiefung abgebildet werden können. Der Hauptnachteil von Well-Platten ist die Aggregation von Vesikeln und die Notwendigkeit, die Zentrifugationsparameter anzupassen, um eine ähnliche Vesikelproduktionsausbeute wie bei Röhrchen zu erreichen.

Unabhängig vom verwendeten Verkapselungssystem (Röhrchen oder Well-Platten) zeigt dieser Ansatz, dass optimale Crowding-Bedingungen erforderlich sind, um die GUVs herzustellen und die Polymerisation von verkapselten Proteinen zu erleichtern. Insbesondere wurde nach diesem Protokoll der beste Zustand für GUVs mit verkapseltem FtsZ mit 30 g/L BSA und 50 g/L Ficoll70¹⁸ beobachtet; während für Aktin eine Mischung aus 10 g/l BSA, 7 % Iodixanol und 20 g/l Ficoll70 erforderlich war¹⁹.

Ein weiterer wichtiger Aspekt bei der GUV-Herstellung ist die Zentrifugationsgeschwindigkeit und -zeit. Für die Bildung von FtsZ-Netzwerken unter den oben genannten Crowding-Konzentrationen ergibt das Zentrifugieren bei 6000 x g für 30 min eine Population von GUVs, die gut verteilt und über die Imaging-Well-Platte verteilt sind. Umgekehrt ermöglichen für Aktin 200 x g für 20 min die Generierung einer hohen GUV-Produktionsausbeute. Wenn die Zentrifugationsgeschwindigkeit oder -zeit verringert wird, wird die Ausbeute der GUVs beeinflusst, während eine Erhöhung über die genannten Werte hinaus zur Aggregation der GUVs führt. Unter den genannten Bedingungen erzeugt dieses Protokoll GUVs mit maximaler Verkapselungseffizienz sowie einzelne GUVs, die nicht zusammenkleben.

Während dieses Protokoll auf beliebige Lipide und verkapselte Biomoleküle verallgemeinert werden kann, bestimmen die gewünschte Membranzusammensetzung und der Inhalt der Vesikel die Zentrifugationsparameter, die die Erzeugung von phasengetrennten Vesikeln ermöglichen. Daher dient dieses Protokoll als Richtlinie, um die Herstellung verschiedener Vesikel mit Membrandomänen zu ermöglichen.

Solche Methoden der in vitro Rekonstitution innerhalb phasengetrennter GUVs sind entscheidend, um die komplizierte Protein-Membran-Dynamik, die durch Lipiddomänen vermittelt wird, unter Berücksichtigung der Komplexität der Zellmembranen^{zu verstehen 14}. Die geringe Größe und die hohe Dynamik dieser Lipiddomänen erschweren die Charakterisierung von Grenzflächenwechselwirkungen in vivo. Daher sind GUVs aufgrund ihrer relativ einfachen Präparation und physikalisch-chemischen Modulation sowie ihrer Eignung für die Analyse mit Lichtmikroskopie ein wichtiges Werkzeug²⁰.

Darüber hinaus stellt die Verkapselung funktioneller Moleküle in heterogenen Biogrenzflächen vielversprechende Anwendungen im Bereich der Nanomedizin dar. Insbesondere die Entwicklung funktionalisierter Wirkstoffabgabesysteme mit unterschiedlichen Eigenschaften, die sich aus der asymmetrischen Verteilung und Aufteilung von Biomolekülen in begrenzte Bereiche auf ihrer Oberfläche ergeben²¹. Arzneimittel-Lipid-Wechselwirkungen spielen eine wichtige Rolle für die pharmakokinetischen Eigenschaften von Arzneimitteln, wie z. B. deren Transport, Verteilung und Akkumulation, die letztendlich die Wirksamkeit der verwendeten Arzneimittel beeinflussen²². Daher ist das Verständnis der Rolle dieser Wechselwirkungen auf die pharmakokinetischen Eigenschaften von Arzneimitteln für die Entwicklung wirksamer Arzneimittel von entscheidender Bedeutung. Modell-Lipidmembranen können erforscht werden, um ihre Mechanismen der Wechselwirkungen mit Peptiden, Polymeren und Nanocarriern zu verstehen²³. So können Veränderungen in der Lipidzusammensetzung von Zellen und Gewebe bei bestimmten Krankheitszuständen biophysikalische Wechselwirkungen verändern, die zur Entwicklung zielspezifischer Wirkstoffe und Wirkstoffabgabesysteme untersucht werden könnten²⁴.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier beschriebene Protokoll eine einfache Strategie zur Erzeugung von phasengetrennten GUVs mit verkapselten Proteinen bietet, die an ihrem inneren Lipidsegel verankert sind. Die Erzeugung dieser vesikulären Systeme ist vielversprechende Anwendungen in Bereichen wie der Biotechnologie und der synthetischen Biologie, wo Mehrkomponenten-Anordnungen mit komplexen Funktionalitäten zur Nachahmung zellähnlicher Funktionen innovative Lösungen und neue Anwendungen bringen könnten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (Natriumsalz) (DOPG)	Avanti Polare Lipide	840475	In Chloroform
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC)	Avanti Polare Lipide	850375	In Chloroform
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(cap biotinyl) (Natriumsalz) (18:1 Biotinyl Cap PE)	Avanti Polare Lipide	870273	In Chloroform
1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (Natriumsalz) (DPPG)	Avanti Polare Lipide	840455	In Chloroform
1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC)	Avanti Polare Lipide	850355	In Chloroform
96-Well Flat-Bottom Microplate (SensoPlate)
Aktin (Alpha-Aktin, Skelettmuskel, Kaninchen)	HYPERMOL	8101-01
Atto488-Aktin (Alpha-Aktin, Skelettmuskel, Kaninchen)	HYPERMOL	8153-01
Atto655-DOPE	ATTO-TEC	AD 655-16
Pulverbad-Ultraschallgerät	Branson	1510R-MTH	Bransonic Ultraschallreiniger
Biotin-Aktin (Alpha-Aktin Skelettmuskel, Kaninchen)	HYPERMOL	8109-01
BSA	Sigma Aldrich	A6003
Zentrifuge	Eppendorf	5424R
Zentrifuge	Eppendorf	5804 R
Chloroform	Sigma Aldrich	67-66-3
Cholesterin (Schaf)	Avanti Polare Lipide	700000	In Chloroform
Decane	TCI Deutschland GmbH	D0011
Fascin (Mensch, rekombinant)	Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)	CS-FSC01-A
Ficoll70	Sigma Aldrich	F2878
Jodixanol (OptiPrep)	Sigma Aldrich	D1556
LSM800 konfokaler Laser Rastermikroskop	Carl Zeiss		C-Apochromat 40  &mal;  /1.2 Objektiv zum Eintauchen in Wasser. Diodengepumpte Festkörperlaser: 488&dünnsp; nm und 640  Nm.
Mineralöl	Sigma Aldrich	8042-47-5
Myosin II (Skelettmuskel des Kaninchens)	Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)	MY02-A
Neutravidin	Thermo Fisher Scientific Inc.	31000
Osmometer	Fiske Associates		Fiske Mikro-Osmometer Modell 120
Greiner Bio-One	GmbH	07-000-109