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Synthese von 13C2-Retinylacetat und Dosisvorbereitung für Retinol-Isotopenverdünnungstests

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DOI:

10.3791/68535

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22. August 2025

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1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Wisconsin-Madison

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Retinylacetat wird normalerweise mit zwei 13C markiert, wenn die Gaschromatographie-Verbrennungs-Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie für die Serum- und Muttermilchanalyse verwendet wird. Diese Arbeit beschreibt die Synthese von 13C2-Retinylacetat und die Vorbereitung von Dosen für Retinol-Isotopenverdünnungstests, die mit einer Verdrängerpipette oder Tuberkulinspritze verabreicht werden.

Zusammenfassung

Der Retinol-Isotopenverdünnungstest (RID) ist die empfindlichste Methode zur Beurteilung des Vitamin-A-Status durch Schätzung der Gesamtleberreserven, die als Referenzstandard gelten. Für die massenspektrometrische Detektion von Gaschromatographie und Verbrennung und Isotopenverhältnis wird der Retinol-Einheit 13C zugesetzt. Das synthetische Verfahren für 13-C-Retinylacetat beginnt mit dem natürlich vorkommenden β-Ionon. Kurz gesagt, C18-Tetraenketon wird aus β-Ionon synthetisiert und gereinigt. Wenn ein 13C 4-Retinylacetat gewünscht wird, kann das Carbanion von 13C2-markiertem Triethylphosphonoacetat verwendet werden, um zwei 13C zu der β-Ionon-Einheit hinzuzufügen, bevor die drei Kohlenstoffe von Aceton hinzugefügt werden, um das C18-Tetraen-Keton zu synthetisieren. Ist ein 13C 3-Retinylacetat gewünscht, könnten die drei Kohlenstoffe des Acetons mit 13C markiert werden.

Für das am häufigsten verwendete 13-C2-Retinylacetat für zukünftige Analysen mittels Gaschromatographie-Verbrennungsisotopenverhältnis-Massenspektrometrie wird ein modifiziertes Wittig-Horner-Verfahren verwendet, und unmarkiertes C18-Tetraenketon wird mit dem Carbanion von 13C2-markiertem Triethylphosphonoacetat umgesetzt, um zwei -13C's an die 14 und 15 Positionen des Retinolmoleküls hinzuzufügen. Der entstehende Ethylester wird zum Alkohol reduziert und mit Essigsäureanhydrid zu 13C2-Retinylacetat verestert. Das all-trans-Isomer wird auf 8 %-wasserdeaktiviertem Aluminiumoxid unter Verwendung von relativ harmlosen, leicht flüchtigen Lösungsmitteln - Hexanen und Diethylether - gereinigt, die durch Rotationsverdampfung und Sonifikation von Öldosen entfernt werden. Das Produkt zeichnet sich durch Ultraviolett-sichtbare (UV-Vis) Spektroskopie, Dünnschichtchromatographie (DC) und Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) gegen analytische Standards aus. Die konzentrierte Dosis wird aufgelöst in Sojaöl bei -80 °C gelagert. Die Enddosen werden in Sojaöl verdünnt (~200 μL/Dosis) und durch UV-Vis-Spektroskopie gegen das Vehikel-Sojaöl quantifiziert. Die Dosen werden für die Verabreichung an Menschen mit einer Verdrängerpipette oder Tuberkulinspritzen für den RID-Test gemessen. Unter Verwendung geeigneter Annahmen werden die Gesamtkörpervorräte berechnet und die Gesamtleberreserven geschätzt.

Einleitung

Die Retinol-Isotopenverdünnung (RID) ist der einzige Biomarker für den Vitamin-A-Status, der die Vitamin-A-Speicher des Körpers (TBS) quantitativ misst und mit geeigneten Annahmen die Gesamtleberreserven (TLR) abschätzen kann. Es ist die empfindlichste Methode, um den Vitamin-A-Status und die Auswirkungen von Eingriffen zu messen, die entweder vorgeformtes Retinol oder Provitamin-A-Carotinoide enthalten. Obwohl die RID technisch anspruchsvoll ist, ist sie genau und minimalinvasiv, da im Gegensatz zu Leberbiopsien nur Blutproben erforderlich sind1. Der RID-Test beinhaltet die Verabreichung von deuteriertem oder 13C-markiertem Retinylacetat, abhängig von der Massenspektrometerplattform. Vor der Verabreichung der Dosis wird eine Blutprobe zu Studienbeginn entnommen, was bei der Verwendung von 13C-Markierungen unerlässlich ist, aber auch an einer zufällig ausgewählten Untergruppe durchgeführt werden kann. Eine zweite Probe wird entnommen, nachdem das 13-C-markierteRetinylacetat mit TBS1 gemischt wurde.

Zu den Vitamin-A-Interventionen zur Vorbeugung von Mangelerscheinungen gehören die Anreicherung von Lebensmitteln, die Biofortifikation, die Diversifizierung der Ernährung und die Nahrungsergänzung. In einigen Ländern gab es jedoch überlappende Interventionen, die sich an dieselben Personen richteten, was zu Hypervitaminose A2 führte, so dass ein Überwachungsrahmen zur Bewertung der Programmergebnisse erforderlich war. Daher sind Methoden erforderlich, die den Vitamin-A-Status quantitativ messen. Die Internationale Atomenergie-Organisation (IAEO) fördert in Zusammenarbeit mit den Mitgliedstaaten die friedliche Nutzung von Isotopen in Forschung und Evaluierung, was die Anwendung des RID-Tests unterstützt. Der RID-Test gewinnt an Dynamik und könnte bald in großen Bevölkerungsumfragen eingesetzt werden, um den Vitamin-A-Status von Mangel bis Überschuss in Ländern zu beurteilen, die Vitamin-A-Interventionen durchführen3.

Zuvor wurde 10,11,14,15-13 C 4-Retinylacetat unter Verwendung von Modifikationen von Bergen et al. für deuteriertes Retinylacetat 4,5 synthetisiert. Diese Verbindung wurde in Experimenten an Ratten6 und am Menschen mit Gaschromatographie-Verbrennungs-Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (GCCIRMS) verwendet, die für die Analyse angepasst war7. Aus diesen wertvollen Experimenten stellten wir fest, dass GCCIRMS so empfindlich ist, dass vier 13C für den RID-Test mit GCCIRMS nicht erforderlich waren. Daher wird der Aufwand für den Tracer reduziert, indem nur zwei 13C's in den Positionen 14 und 15 des Retinolmoleküls verwendet werden (Abbildung 1). Diese Modifikation senkt die mit der Synthese verbundenen Kosten und führt aufgrund des Synthesewegs zu höheren Erträgen. Hierin wird ein hochskaliertes Protokoll für seine Synthese beschrieben.

GCCIRMS ist für die Messung stabiler Isotope8 sensitiver als andere Arten der Massenspektrometrie und kann auf Veränderungen in der Ernährung und natürliche Veränderungen der 13-C-Anreicherung im Serumretinol reagieren. Dies wurde bei Rennmäusen9 und Menschen10beim Verzehr von Mais sowie bei Menschen, die an einer pflanzlichen Intervention teilnahmen11 beschrieben. In der Tat variiert die natürliche Häufigkeit von 13C zwischen verschiedenen Populationen und muss bei Probanden bestimmt werden, die an RID-Evaluierungen teilnehmen12. Es wurden jedoch kleine Untergruppen für die Messung der natürlichen Anreicherung mit dem RID bei ghanaischen und thailändischen Kindern13,14 und thailändischen Frauen15 verwendet. Die individuelle 13-C-Anreicherung zu Studienbeginn sollte bestimmt werden, um die genaueste Bestimmung der TBS auf individueller Ebenezu gewährleisten 12.

Protokoll

HINWEIS: Bei der Rekrutierung von Probanden für Forschungs-, Interventions- oder Evaluierungsstudien muss die Genehmigung durch das Institutional Review Board (IRB) mit geeigneten Einwilligungsverfahren eingeholt werden.

1. Synthese von 13C2-Retinylacetat (Abbildung 2)

HINWEIS: Alle synthetischen Verfahren und Quantifizierungen werden unter Goldfluoreszenzlicht durchgeführt, um einen Abbau und eine Isomerisierung der Verbindung zu verhindern.

  1. Synthetisieren Sie β-Ionylacetat in einer großen Charge aus kommerziell erhältlichem β-Ionon. Bedecken Sie z. B. Natriumhydrid (NaH) (4 g, 0,16 mol) mit 100 mL Ether. Unmarkiertes Triethylphosphonoacetat (36 g, 0,16 mol) in 100 mL Ether tropfenweise zugeben und 2 h lang rühren. H2 wird freigesetzt und die ursprüngliche Suspension wird klar und bernsteinfarben.
    ACHTUNG: Natriumhydrid (NaH) ist ein starkes Reduktionsmittel, das in einer Vielzahl von chemischen Reaktionen nützlich ist. Laborbrände können jedoch aufgrund seiner stark exothermen Reaktion mit Wasser in der Atmosphäre auftreten 16,17. Es wird empfohlen, auf ein Sicherheitsdatenblatt zuzugreifen. zusätzliche Richtlinien für den Umgang mit mäßig pyrophoren Feststoffen wie NaH wurden veröffentlicht18. Halten Sie es in Öl oder nicht reaktivem Lösungsmittel suspendiert, während Sie Reaktionsgefäße und Lagerbehälter mit Inertgas (z. B. Stickstoff oder Argon) spülen, das Reaktionsgefäß kühlen und in verschlossenen Behältern aufbewahren, die in einer trockenen Umgebung aufbewahrt werden. In unserem Labor wird NaH in kleinen Mengen (~1 g) unter einer Stickstoffumgebung in Fläschchen überführt und dann bis zur Verwendung in einem verschlossenen Exsikkator gelagert.
  2. Fügen Sie β-Ionon (21 g, 0,12 mol) in 40 mL Ether hinzu und reagieren Sie über Nacht (~15 h bei 20 °C). An Tag 2 wird die Reaktion mit Wasser abgeschreckt und das Ethyl-β-ionylidenacetat in Hexane extrahiert und in einer Reihe von Scheidetrichtern wiederholt mit Wasser gewaschen, um die Rückgewinnung zu maximieren. Die organische Schicht (wasserfreies MgSO4) trocknen, filtrieren und konzentrieren
    HINWEIS: Die Dünnschichtchromatographie (DC) erkennt in dieser Phase der Synthese in der Regel nur geringfügige Verunreinigungen. Dieser kann über einen längeren Zeitraum bei -80 °C gelagert werden, bevor mit den nächsten Schritten fortgefahren wird.
  3. Ethyl-β-ionylidenacetat (28 g, 0,11 mol) mit 120 mL 1 molaren Lithiumaluminiumhydrid (LiAlH4) in Diethylether umsetzen. Tauchen Sie das Reaktionsgefäß in ein Trockeneis-Acetonbad und rühren Sie die Lösung kontinuierlich um, um β-Ionyliden-Ethanol zu erhalten.
    ACHTUNG: Lithiumaluminiumhydrid (LiAlH4) ist ein starkes Reduktionsmittel. Greifen Sie auf ein Sicherheitsdatenblatt zu und lesen Sie zusätzliche Richtlinien für den Umgang mit mäßig pyrophoren Feststoffen wie z. B. LiAlH418,19. Das Hauptziel der meisten Sicherheitsvorkehrungen besteht darin, das Risiko einer Exposition von LiAlH4 gegenüber der Atmosphäre zu minimieren und unkontrollierte Reaktionen zu verhindern. Dies beinhaltet im Allgemeinen das Aufbewahren dieser Verbindungen in Öl oder nicht reaktivem Lösungsmittel während der Handhabung, das Spülen von Reaktionsgefäßen und Lagerbehältern mit Inertgas (wie Stickstoff oder Argon), das Kühlen des Reaktionsgefäßes und das Lagern von LiAlH4 in verschlossenen Behältern, die in einer trockenen Umgebung aufbewahrt werden. In unserem Labor wird Lithium-Aluminiumhydrid in verschlossenen 1-Mol-Flaschen anstelle der Pulverform gekauft, wobei die erforderlichen Mengen mit einer Spritze entfernt und die Atmosphäre der Flasche durch Stickstoff ersetzt wird.
  4. Löse 28 g (0,12 mol) β-Ionyliden-Ethanol in 300 ml Hexanen auf. Geben Sie ca. 50 g 90 %MnO 2 pro Tag über 3 Tage (51 g, 52 g und 54 g) hinzu und rühren Sie das Reaktionsgemisch länger (oft 2 Tage bei 20 °C). Zum Schluss 35 gMnO 2 zugeben und über Nacht ca. 15 Stunden ziehen lassen; Die Reaktion ist zu etwa 90 % abgeschlossen. Das β-Ionylidenacetaldehyd aus demMnO 2 filtrieren und mit Dichlormethan waschen.
  5. Rohes β-Ionylidenacetaldehyd (22 g, 0,10 mol) wird in 150 mL Aceton unter ständigem Rühren gelöst und 10 mL 1 N Natriumhydroxid tropfenweise zugegeben. Lassen Sie die Reaktion 6 Stunden einwirken.
  6. Extrahieren Sie das C18-Tetraenketon mit Hexanen und waschen Sie es wiederholt mit Wasser unter Verwendung einer Reihe von Scheidetrichtern, um die Rückgewinnung zu maximieren. Trocknen Sie die resultierende Lösung mit einem Rotationsverdampfer, um rohes cis-trans C18-Tetraenketon zu erhalten. Da das trans-Isomer für Studien am Menschen am wünschenswertesten ist, reinigen Sie das Gemisch auf 4 % wasserdeaktiviertem Kieselgel (300 g) mit einem langsamen Gradienten von 0-10 % Ethylacetat in Hexan.
  7. NaH (1,2 g, 0,05 mol) mit 50 mL Äther verrühren. 13C 2-Triethylphosphonoacetat (11 g, 0,049 mol), gelöst in 50 mL Ether, tropfenweise zugeben und 2 h lang rühren. C18-Tetraenketon (12 g, 0,044 mol) in 50 mL Ether auflösen und über Nacht bei 20 °C reagieren.
  8. Die Reaktion mit Wasser abschrecken und den 14,15-13 C 2-Retinsäureethylester mit Hexanen extrahieren und in einem Scheidetrichter mit Wasser waschen. Trocknen Sie die organische Schicht mit wasserfreiem MgSO4 und Konzentrat; Reinigen Sie auf 8 % wasserdeaktiviertem neutralem Aluminiumoxid (400 g) mit einem langsamen Gradienten von 0 bis 3 % Diethylether in Hexan, um cis/trans-Isomere zu erhalten.
    HINWEIS: Oft enthält die erste Reinigung Verunreinigungen, die von der TLC beurteilt werden. Verunreinigungen werden visualisiert, indem die DC-Platte mit Joddampf reagiert wird. Wenn Verunreinigungen vorhanden sind, ist es entscheidend, 400 g 8 % wasserdeaktiviertes neutrales Aluminiumoxid mit 100 % Hexanen zu reinigen, um reinen 14,15-13 C 2-Retinsäureethylester zu erhalten.
  9. 14,15-13 C 2-Retinsäureethylester (3,7 g) mit 15 mL 1 molaren Lithiumaluminiumhydrid in einem Trockeneisacetonbad unter Rühren zu 14,15-13 C2-Retinol reduzieren (Abbildung 1).
  10. 14,15-13 C 2-Retinol (3,5 g) in 20 ml Triethylamin auflösen. Unter Rühren der Lösung 3,5 ml Essigsäureanhydrid mit 7 ml Triethylamin mischen und tropfenweise in den Kolben geben. Den Kolben über Nacht in den Kühlschrank stellen, damit sich das 14,15-13 C 2-Retinylacetat bildet (ca. 15 h).
  11. 3,9 g rohes 14,15-13 C 2-Retinylacetat in Hexane extrahieren, trocknen, konzentrieren und reinigen auf 500 g 8 % wasserdeaktiviertem neutralem Aluminiumoxid mit einem langsamen 0-3 %igen Diethylether im Hexangradienten. Überwachen Sie Fraktionen mit einem Spektralphotometer für ultraviolettes sichtbares Licht (UV-Vis) bei 325 nm. Entfernen Sie alle verbleibenden Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer. Bewerten Sie das Endprodukt mit HPLC und Photodiodendetektion, um das cis/trans-Verhältnis zu bestimmen. Ein Beispiel für ein fortschrittliches Gradientensystem zur Trennung des cis/trans-Profils mittels Ultradruckflüssigkeitschromatographie ist in der ergänzenden Abbildung S1 zu finden.
    HINWEIS: Das cis/trans-Verhältnis beträgt zu diesem Zeitpunkt in der Regel >95 % All-Trans .
  12. Für die Lagerung all-trans 14,15-13 C 2-retinylacetat in Sojaöl in Lebensmittelqualität ohne weitere Zusätze auflösen und in Braunglas, das mit Stickstoff bei -80 °C gespült wird, aufbewahren und als konzentriertes Material kennzeichnen.

2. Dosierungsvorbereitung von öligen Lösungen von mit stabilen Isotopen markiertem Retinylacetat

HINWEIS: Isotopenmarkiertes Retinylacetat wurde in Kapseln20 oder in Öllösungen verabreicht, die mit einer 250-μl-Verdrängerpipette21 oder einer medizinischen Spritze22 verabreicht wurden (Abbildung 3). Wir haben die Stabilität von Kapseln getestet (Abbildung 4), die unten beschrieben wird.

  1. Lösen Sie das markierte Retinylacetat direkt nach der Synthese in ~15 ml unangereichertem Pflanzenöl (z. B. Sojaöl in Lebensmittelqualität) auf, bevor es zu kristallisieren beginnt, und lagern Sie es in einem 24-ml-Braunfläschchen bei -30 bis -80 °C, bis es zur Zubereitung der endgültigen Dosen bereit ist.
    1. Wenn das etikettierte Retinylacetat gekauft wurde, brechen Sie die Oberseite der vakuumversiegelten Ampulle vorsichtig ab, indem Sie sie mit einer Feile einritzen, oder brechen Sie das Siegel einer Flasche mit Schraubverschluss auf. Je nach benötigter Masse geben Sie eine abgewogene Menge in eine braune 24-ml-Flasche und fügen Sie eine kleine Menge Pflanzenöl hinzu (10 mL sind wahrscheinlich ausreichend). Beschallen Sie die Mischung, bis eine klare Lösung entsteht.
  2. Schätzen Sie die benötigte Menge an Endöl, indem Sie die Anzahl der Probanden mit 200 μl multiplizieren. Wenn beispielsweise 60 Probanden aufgenommen werden sollen, stellen Sie etwa 70 Dosen her, um genug für die Verschwendung (ca. 10-20%) zu haben. Somit sind 70 × 200 μl 14 mL.
    HINWEIS: Verlassen Sie sich nicht auf die Masse des synthetischen Öls oder der Kristalle. Sie müssen ein Spektralphotometer verwenden, um die Dosen zu quantifizieren. Jedes synthetische Vitamin A enthält Lösungsmittelreste. Diese können durch Sonifikation oder unter einem sanften Stickstoffstrom abgebaut werden, sind aber der Hauptgrund, warum die Masse allein nicht zur Bestimmung der Isotopendosis herangezogen werden kann.
    Wenn die markierten Retinylacetatlösungen sehr lange im Gefrierschrank aufbewahrt werden, ohne verwendet zu werden, sollten sie erneut analysiert werden, um festzustellen, ob ein erheblicher Abbau stattgefunden hat.
  3. Zur Quantifizierung von Retinylacetat:
    1. Schalten Sie ggf. das UV-Vis-Spektralphotometer (vorzugsweise scannendes Zweistrahl-Spektralphotometer) und den angeschlossenen Computer ein. Starten Sie das UV-Vis-Spektralphotometer gemäß den Anweisungen des Herstellers. Lassen Sie das Spektralphotometer vor der Messung mindestens 30 Minuten lang aufwärmen.
    2. Stellen Sie zwei 25-ml-Messkolben und -verschlüsse auf und füllen Sie sie mit jeweils 25 mL Hexanen fast bis zur Leitung. Einen Kolben mit "Öl" oder "Leer" und den anderen mit "Vitamin A" oder "Dosis" beschriften; Legen Sie dann die Vitamin-A-Flasche beiseite, bis die Rohlinge durchlaufen sind.
    3. Gießen Sie etwas reines Sojaöl in einen Einweg-Plastikbecher und geben Sie 20-40 μl in den Ölkolben, um das System zu leeren.
      HINWEIS: Wir verwenden oft 20 μl, aber solange das Blind- und das Isotopendosisvolumen gleich sind, kann man mehr verwenden.
    4. 4-5x invertieren, um das Öl und die Hexane zu mischen, dann beide Spektralphotometer-Quarzküvetten mit dieser Lösung spülen und beide ~75% voll füllen.
    5. Setzen Sie beide Küvetten in das Spektralphotometer ein und achten Sie darauf, die durchsichtige Vorder- und Rückseite nicht zu berühren (Griff nur an den matten Seiten). Um die beste Genauigkeit zu erzielen, richten Sie die nummerierte Vorderseite jeder passenden Küvette in Richtung des Benutzers.
    6. Schließen Sie die lichtblockierende Tür über den Proben.
    7. Klicken Sie auf die Funktion Blank oder Baseline und lassen Sie das System die Baseline-Absorption von Öl und Hexanen messen. Dadurch wird die Absorption der Oil Blank Hexan-Lösung korrigiert. Scannen von 260 bis 400 nm; Vergewissern Sie sich, dass der Messwert bei 400 nm "Null" ist, nachdem dieser Vorgang abgeschlossen ist. Wenn nicht, drücken Sie die Nulltaste und führen Sie den Scan erneut aus. Sobald das System fertig ist, ist es bereit, die Dosisabsorption von Retinylacetat zu messen.
    8. Den Inhalt der Probenküvette verwerfen und mit der Dose Hexan-Lösung auffüllen. Platzieren Sie die Probe an der entsprechenden Stelle und scannen Sie die Spektren. Wählen Sie den Peak aus und lesen Sie die Absorption ab. Reines Retinylacetat hat nur ein Lambda-Maximum bei 325 nm.
      HINWEIS: Wenn Sie mehr als einen Peak haben oder einen bei 280 nm haben, ist das Retinylacetat abgebaut und sollte nicht zur Dosierung verwendet werden.
  4. Berechnungen für Schritt 2.3
    HINWEIS: Der E 1%, 1 cm für Retinol beträgt 1.810 bei 325 nm in Hexanen. Sie quantifizieren das Retinylacetat in Retinol-Äquivalenten.
    1. Teilen Sie die Extinktion durch 0,181, um die μg/ml Lösung zu erhalten.
    2. Multiplizieren Sie mit 25 ml, um die μg in 20 Mikrolitern Öllösung zu erhalten.
      HINWEIS: Beispiel: Die Absorption von 20 μl Öl in 25 ml Hexanen beträgt 0,295.
      0,295/0,181 = 1,630 μg/ml × 25 mL = 40,75 μg in 20 μl Öl
      Wenn Sie 286 μg für die Dosis benötigen, sind das 140,4 μl. Das ist 1 μmol, aber 288 μg 13C 2-Retinol werden aufgrund des Etiketts im Darm hergestellt. Möglicherweise möchten Sie eine Verdünnung vornehmen, um näher an die Dosismenge von 200 μl zu gelangen, und die obige Quantifizierung wiederholen.
  5. Vorbereitung der Kapseln zur Prüfung der Stabilität
    1. Trennen Sie die Kapseln in den größeren weißen Boden und die kleineren blauen Kappen.
    2. Legen Sie die weißen Kapselböden in Pipettenspitzenschachteln (96 Kapseln pro Packung) und schließen Sie sie, um das Eindringen von Staub in die Kapseln zu verhindern, und legen Sie die blauen Kappen über Nacht in eine Plastiktüte mit Reißverschluss. Entsorgen Sie Kapseln, die gerissen sind.
    3. Lassen Sie die Retinylacetatöllösung auf Raumtemperatur kommen. Gießen Sie eine kleine Menge (~5 mL) in einen kleinen, unbenutzten Plastikbecher.
    4. Bereiten Sie eine Repeater-Pipette vor, indem Sie die 5-ml-Spritze (wobei 1 = 100 μl) befüllen und auf "2" stellen, um 200 μl pro Auslösedruck abzugeben.
    5. Laden Sie das Retinylacetatöl in die Repetierpipette, indem Sie den Ladearm nach oben ziehen. Geben Sie mindestens 4 x 200 μl Aliquote zurück in den Becher, um Luftblasen von der Spitze zu entfernen.
    6. Geben Sie 1 x 200 μl aliquot pro weißem Kapselboden ab, indem Sie die Spitze der Pipette leicht mit der Innenwand der Kapsel berühren und den Auslöser drücken.
    7. Sobald die Repetierpipette fast leer ist, ziehen Sie mehr Öl auf.
    8. Nachdem Sie einen vollständigen Satz von 96 Kapseln fertiggestellt haben, geben Sie das Öl zurück in den Becher und beginnen Sie dann, die blauen Kappen leicht auf jeden weißen Boden zu schieben, wobei Sie darauf achten, dass die Kappen nicht reißen.
    9. Nachdem alle Kappen auf den Kapseln sind, heben Sie jede Kapsel heraus, vergewissern Sie sich, dass die Kappe fest sitzt, und setzen Sie sie dann wieder in die Spitzenbox ein.
    10. Lagern Sie die Kapseln bei den gewählten Temperaturen und Bedingungen. Dunkelheit kann erreicht werden, indem die Kapseln in Gestellen unter Aluminiumfolie gelagert werden. Im Folgenden finden Sie Beispiele:
      ein.  im Gefrierschrank: -20 °C im Dunkeln
      b.  im Kühlschrank: 4 °C im Dunkeln
      c. auf der Bank: 20 °C (Raumtemperatur) im Dunkeln
      d. auf der Werkbank, aber ohne Platz: 20 °C (Raumtemperatur) bei normaler Leuchtstoffröhrenbeleuchtung
      e.  in einem Ofen, wodurch höhere Umgebungstemperaturen an anderen Orten nachgebildet werden: 37 °C im Dunkeln

3. Verabreichung der Dosis

HINWEIS: Die Verdrängerpipette wurde direkt mit Tuberkulinspritzen verglichen, um die Genauigkeit und Präzision unter Technikern zu bestimmen (Abbildung 5).

Die Dosen werden mit 250 μl Rainin-Verdrängerpipetten oder 1 ml-Tuberkulinspritzen verabreicht.

  1. Tauen Sie die gefrorenen Dosen auf oder legen Sie sie in einen Kühlschrank mit Eisbeuteln, wenn Sie zum Einsatzort gehen. Während des Transports tauen die Dosen in der Regel auf.
  2. Nehmen Sie das Braunglasfläschchen aus dem Kühler und öffnen Sie es. Bewahren Sie das Fläschchen in einem "Becher" oder Becherglas auf, um ein Umkippen zu verhindern.
  3. Führen Sie die Pipettenspitze oder die Tuberkulinspritze in das Öl ein und ziehen Sie eine kleine Menge auf. Drücken Sie den Kolben schnell nieder, um eventuell gebildete Blasen zu entfernen. Ziehen Sie langsam die benötigte Volumenmenge in die Pipette oder Spritze. Achten Sie darauf, dass keine Blasen vorhanden sind.
  4. Wische die Außenseite der Spitze mit einem Taschentuch ab. Berühren Sie nicht das Ende der Pipettenspitze oder der Spritze, da dies die Flüssigkeit herauszieht.
  5. Legen Sie die Spitze in den Mund des Teilnehmers, lassen Sie das Öl in den Mund ab und weisen Sie die Person an, den Mund zu schließen und zu schlucken.
    HINWEIS: Es ist hilfreich, wenn die Teilnehmer ihren Kopf für die Dosierung leicht nach hinten neigen können.
  6. Verabreichen Sie nach der Dosis einen "Chaser" oder einen fettigen Snack mit mindestens 10 g Fett. Verabreichen Sie bei Kleinkindern 1 ml unangereichertes Öl, das auf einem Plastiklöffel als Verfolgungsmesser verabreicht wird. Für ältere Kinder und Erwachsene sind ein halbes Erdnussbutter-Sandwich, eine gebratene weiße Kartoffel oder ein Baguette mit Schokoladenaufstrich gute Snacks zum Abschluss.
    HINWEIS: Es sollten informative Recherchen durchgeführt werden, um festzustellen, welcher Snack lokal akzeptabel ist.

Ergebnisse

Ausgehend von kommerziell erhältlichem β-Ionon wurden 28 g Ethyl-β-ionylidenacetat synthetisiert. Nach der Reduktion wurden 22 g β-Ionylidenacetaldehyd unter basischen Bedingungen mit Aceton zu C18-Tetraenketon umgesetzt; Es wurden 12 g gereinigtes C18-Tetraen-Keton erhalten, das ~90% all-trans war. Dies wurde anschließend mit dem Carbanion von 13C-2-Triethylphosphonoacetat unter Verwendung eines modifizierten Wittig-Horner-Verfahrens umgesetzt, um zwei 13C's an den Positionen 14, 15 des Retinolmoleküls hinzuzufügen. Der resultierende Ethylester (3,7 g Ausbeute) wurde zum Alkohol reduziert und zu 13C2-Retinylacetat verestert, wobei Essigsäureanhydrid in Triethylamin gelöst wurde. Das synthetische Vitamin wurde auf 8 % wasserdeaktiviertem Aluminiumoxid unter Verwendung der leicht flüchtigen organischen Lösungsmittel Hexane und Diethylether gereinigt. Das resultierende Präparat wurde mittels UV-Vis-Spektroskopie, DC und HPLC charakterisiert. Für die Langzeitlagerung wird das markierte Retinylacetat gelöst in Sojaöl bei -80 °C gelagert.

Das oben beschriebene erfolgreiche Syntheseschema für 14,15-13 C2-Retinylacetat ist in Abbildung 2 dargestellt. Der gesamte Signalweg, der mit β-Ionon beginnt, besteht aus sieben Schritten. Die erste Ausbeute betrug 0,9 g all-trans 14,15-13 C 2-retinylacetat. Cis/trans-Isomerenfraktionen (1,2 g) wurden kombiniert und auf 300 g 8 % wasserdeaktiviertem neutralem Aluminiumoxid aufgereinigt, um zusätzliche 0,3 g all-trans 14,15-13 C 2-retinylacetat zu erhalten.

Um die Stabilität von Retinylacetat in Kapseln zu bestimmen, wurde Retinylacetat (1 g) in Hexanen gelöst und durch offene Säulenchromatographie unter Verwendung von 300 g 8% wasserdeaktiviertem Aluminiumoxid mit Hexanen als Lösungsmittel gereinigt. Das Retinylacetat wurde mittels DC- und UV-Vis-Spektroskopie überwacht, wobei nur die reinen Fraktionen verwendet wurden. Dieses Verfahren ist identisch mit dem, das bei der Synthese und Reinigung von 13C2-Retinylacetat im Labor Tanumihardjo für den RID-Test verwendet wird, wie oben beschrieben. Das gereinigte Retinylacetat wurde in Sojaöl gelöst, das organische Lösungsmittel durch einen Rotationsverdampfer entfernt und mehr Öl bis zu einer Endkonzentration von 7,5 μM hinzugefügt (um 1,5 μmol pro 200 μl zu erhalten, dem Mittelpunkt zwischen der Dosis für einen Erwachsenen und ein Kind für den RID-Test, wenn GCCIRMS zur Analyse verwendet wird). Die Konzentration wurde wie oben beschrieben mittels UV-Vis-Spektroskopie bestimmt.

Ein Aliquot von 200 μl des Öls wurde für die Stabilitätsstudie in Zellulosekapseln der Größe 3 (maximales Volumen 300 μl) verteilt. Die Kapseln jeder Dosis wurden unter fünf Bedingungen gelagert. Die Dunkelheit wurde erreicht, indem die Kapseln in Gestellen unter Aluminiumfolie gelagert wurden. Für jede Bedingung wurden Kapseln (150) vorbereitet, also insgesamt 750 Kapseln: i) im Gefrierschrank: -20 °C im Dunkeln; ii) im Kühlschrank: 4 °C im Dunkeln; iii) auf der Bank: 20 °C (Raumtemperatur) im Dunkeln; iv) auf der Werkbank, aber ohne Platz: 20 °C (Raumtemperatur) bei normaler Leuchtstofflampe; v) in einem Ofen, wobei höhere Umgebungstemperaturen an anderen Orten nachgebildet werden: 37 °C im Dunkeln.

In der Kapselstabilitätsstudie wurden zu jedem Zeitpunkt drei Kapseln aus jeder Bedingung gemessen (-20 °C, 4 °C, Raumtemperatur dunkel, Raumtemperatur hell, 37 °C). Alle Kapseln wurden auf Raumtemperatur kommen gelassen (die Kapseln bei Raumtemperatur wurden zuerst analysiert); Temperaturschwankungen verursachen Absorptionsschwankungen. Die Kapseln wurden bis zu 480 Tage abgemessen. Die Kapseln blieben neun Monate lang bei -20 °C und 4 °C stabil (Abbildung 4).

Es wurde ein Methodenvergleich durchgeführt, um Tuberkulinspritzen zum Einmalgebrauch mit den Rainin-Verdrängerpipetten als Referenzstandard zu vergleichen. Die Rainin-Verdrängerpipette wurde unter Berücksichtigung der lokalen Temperatur und des lokalen Drucks mit Wasser kalibriert und dann mit drei Spitzen in dreifacher Ausfertigung getestet, um das Zielölvolumen zu bestimmen, das bei einer Einstellung von 200 μl auf ein tariertes Wägeschiffchen abgegeben wurde. Das Dosierprotokoll wurde von 10 Technikern mit unterschiedlicher Erfahrung durchgeführt. Für jeden Techniker wurden acht Spritzen in dreifacher Ausfertigung getestet und mit der Pipettenreferenz verglichen. Die Seiten der Pipette wurden mit einem Taschentuch abgewischt und das Öl schräg in das Waagschinchen gegeben, um sicherzustellen, dass maximal Öl freigesetzt wurde. Die Techniker waren während des gesamten Protokolls blind für die Ergebnisse der abgegebenen Masse; Die Ölmasse wurde von einem separaten Techniker aufgezeichnet. Der Vorgang wurde mit 200 μl Sojaöl unter Verwendung von acht Tuberkulinspritzen (z. B. Norm-Ject) wiederholt.

R Statistical Software wurde verwendet, um ein Varianzkomponentenmodell (FitVCA)22 anzupassen (Abbildung 5). Zu den gemessenen Variabilitätsfaktoren gehörten Techniker, Spritze innerhalb Techniker und Replikationsfehler. Der mittlere (95 % KI) normalisierte Spritzenabgabewert im Vergleich zum Pipettenabgabevolumen betrug 0,996 (0,912; 1,08). Die Varianz des Replikationsfehlers machte 64,8 % der Gesamtvarianz aus, was darauf hindeutet, dass die größte Ursache für die Variabilität bei wiederholten Messungen innerhalb derselben Spritze lag. Die prozentuale Abweichung zwischen Techniker und Spritze innerhalb des Technikers war mit 22,9 % bzw. 12,3 % viel geringer.

Die Untergruppenanalyse wurde durchgeführt, indem die Techniker auf der Grundlage der Erfahrung in zwei Gruppen (n = 5/Gruppe) aufgeteilt wurden. Die mittlere normalisierte Spritzenabgabe war in beiden Gruppen ähnlich, aber das 95%-KI war bei Technikern mit mehr Erfahrung enger; 1,001 (0,939, 1,063) bzw. 0,998 (0,900, 1,100). Bei erfahreneren Technikern ergab sich die größte Varianz aus der Spritze innerhalb des Technikers (57,0 %) und dem Replikationsfehler (42,9 %), während bei weniger erfahrenen Technikern die größte Varianz aus dem Techniker (32,7 %) und dem Replikationsfehler (67,2 %) stammte.

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Abbildung 1: Die Struktur von Retinol mit den nummerierten Kohlenstoffen. Die 13C's werden normalerweise in den Positionen 14 und 15 für die Verwendung mit Gaschromatographie-Verbrennungs-Massenspektrometrie hinzugefügt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Das synthetische Schema von 14,15-13 C 2-Retinylacetat, das in Retinol-Isotopenverdünnungstests verwendet wird, wenn die Gaschromatographie-Verbrennungs-Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie für die Serum- oder Muttermilchanalyse verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Eine 1-ml-Tuberkulinspritze ohne Totvolumen an der Spitze und die 250-μl-Direktverdrängerpipette, die für die Dosierung in Tracerstudien verwendet wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Abbaukurven von Retinylacetat, das in Kapseln unter fünf verschiedenen Bedingungen gelagert wird. Die Bedingungen betragen -20 °C, 4 °C, 20 °C (Raumtemperatur) im Dunkeln, 20 °C (Raumtemperatur) unter Standard-Leuchtstoffröhrenlicht und 37 °C. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Varianzkomponentenanalyse der Dosisabgabemenge im Vergleich von 1-ml-Tuberkulinspritzen mit einer 250-μl-Verdrängerpipette bei 10 Technikern, die während der Bewertung für die Ergebnisse verblindet waren. Die Werte beziehen sich auf die abgegebene Ölmasse (200 μl) aus Spritzen, normiert auf die Verdrängerpipette. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung S1: Ein Beispiel für die abschließende Reinheitsprüfung des 14,15-13C-Retinylacetats mittels Ultradruckflüssigkeitschromatographie. Die entsprechenden Spektren sind charakteristisch für die cis/trans-Formen des Vitamins. Die UPLC-Bedingungen waren Lösungsmittel A 70:25:5 (Acetonitril:Wasser:Isopropanol) mit 10 mM Ammoniumacetat und Lösungsmittel B war 75 % Acetonitril, 25 % Isopropanol. Bei der verwendeten Säule handelte es sich um eine Acquity UPLC, BEH C18 1,7 μM, 2,1 x 100 mm Säule. Die Säule wurde auf 29 °C eingestellt und die Durchflussrate betrug 0,4 mL/min. Der Gradient begann mit 100 % Lösungsmittel A und hielt 5,0 Minuten lang, gefolgt von einem Übergang zu 98 % Lösungsmittel B um 7 Minuten und hielt ihn für 8 Minuten, bevor er über 1 Minute wieder auf 100 % Lösungsmittel A überging und für eine 4-minütige Äquilibrierung gehalten wurde. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Während es kommerzielle Quellen für deuteriertes und 13-C-markiertes Retinylacetat gibt, gibt es in der Literatur für erfahrene organische Chemiker mehrere Synthesewege für Retinol. Wir wählten einen synthetischen Weg für deuteriertes Retinylacetat und nahmen entsprechende Anpassungen vor, um dem Rückgrat des Retinolanteils 13C hinzuzufügen, die oben beschrieben sind. Die Synthese von 14,15-13 C2-Retinylacetat erfolgte unter Verwendung eines siebenstufigen Verfahrens, beginnend mit dem kommerziell erhältlichen β-Ionon. β-Ionon ist ein natürlich vorkommender Pflanzenbestandteil und trägt zu Düften, wie z. B. von Rosen, bei. Der wichtigste Schritt auf dem Syntheseweg ist die Bildung des C18-Tetraenketons. Diese Zwischenverbindung muss mindestens 90 % rein sein, damit die nachfolgenden Schritte eine gute Ausbeute erzielen.

Die Markierung erfolgte unter Verwendung eines modifizierten Wittig-Homer-Verfahrens mit kommerziell erhältlichem 13C 2-Triethylphosphonoacetat. Die markierten Verbindungen werden im RID-Test zur Bestimmung der TBS und zur Abschätzung der TLR verwendet. Die Methode verwendet GCCIRMS zur Analyse von Retinol, das aus Serum oder Muttermilch von Personen gereinigt wurde, denen physiologische Konzentrationen der markierten Verbindungen verabreicht wurden. Die gebräuchlichsten Dosen sind 1 μmol für Kinder und 2 μmol für Erwachsene. Während die GCCIRMS-Analyse empfindlich auf die Isotopenanreicherung reagiert, erfordert die Serumanalyse mindestens 400 μl Serum, um genügend Retinolmasse für die Einführung in den GC zu erhalten.

Der 13C-RID-Test wurde in klinischen Studien23,24 und in Gruppen afrikanischer Kinder25 eingesetzt, wobei geplant ist, ihn in Zukunft für bevölkerungsbezogene Arbeit zugänglich zu machen. Wir haben die Experimente mit Kapseln und Spritzen durchgeführt, um zu untersuchen, ob diese Modifikationen für die Populationsarbeit geeignet sind. Die Kapseln mussten sich in einer aufrechten Position befinden, sonst liefen sie aus; Wir verwarfen schnell die Idee, dass sie in normalen bernsteinfarbenen Pillenflaschen für den Feldeinsatz aufbewahrt werden könnten. Die Kapseln waren nur ~9 Monate bei Kühl- und Gefriertemperaturen stabil. Die Herstellung von versiegelten Kapseln kann die Stabilität verbessern, indem die geringe Exposition gegenüber der Atmosphäre während der Lagerung reduziert wird. Die Verwendung von Kapseln sollte vor der Implementierung von Anwendergruppen getestet und validiert werden.

Die endgültigen Öllösungen sind bei Raumtemperatur ~2 Monate lang stabil, aber sobald sie anfangen, sich zu zersetzen, setzt sich der Abbau schnell fort. Für RID-Tests ist keine Teilaktivität akzeptabel, da die dosierte Menge bei der Berechnung der TBS verwendet wird. Es ist am besten, die Lösungen während des Gebrauchs auf Eisbeuteln auf dem Feld aufzubewahren und sie so schnell wie möglich nach Abschluss der Dosierung wieder einzufrieren. Es ist am besten, nur ein paar Dosen mehr als für den Tag benötigt mitzubringen und den Rest eingefroren zu halten. Einfrieren und Auftauen haben keinen Einfluss auf diese Lösungen, da das Öl selbst Antioxidantien enthält. Die Öllösungen sind robuster als Blutproben, müssen aber dennoch immer im Dunkeln aufbewahrt und bei Nichtgebrauch eingefroren werden.

Die Dosen werden mit 250 μl Rainin-Verdrängerpipetten oder 1 ml-Tuberkulinspritzen verabreicht. Luftverdrängungspipetten sind nicht für Dosen geeignet, die in Öl gelöst sind. Unser Labor hat diese beiden Methoden experimentell verglichen (siehe Repräsentative Ergebnisse). Die Verabreichung mit der Pipette oder Spritze ist mit einigen Abweichungen ähnlich. Rainin-Verdrängerpipetten werden für Forschungs- oder klinische Studien empfohlen, aber Spritzen können für populationsbasierte Arbeiten verwendet werden. Es werden Spritzen mit wenig Totvolumen in der Spitze empfohlen, um die Dosiergenauigkeit zu maximieren (z. B. Norm-Ject).

Die Berechnungen für den RID-Test umfassen die Menge der verabreichten Dosis, und der Fehler in der Menge der verabreichten Dosis ist proportional zum Fehler in der resultierenden Schätzung der TBS. Bei der Verwendung von Tuberkulinspritzen im Vergleich zu Pipetten mit positiver Verdrängung lag die mittlere normalisierte Spritzenabgabe nahe bei 1, was darauf hindeutet, dass Spritzen für Populationsstudien eine genaue Dosisabgabe liefern können. Die Konfidenzgrenzen von 95 % lagen bei etwa ± 8 % der Zieldosis. Techniker mit mehr Erfahrung mit den Spritzen hatten ein engeres KI von 95 % (± 6 %) und einen geringeren Varianzbeitrag des Technikers im Vergleich zu Technikern mit weniger Erfahrung (± 10 %). Dies legt nahe, dass vor der Implementierung in der Praxis ein Schulungsprotokoll und eine Validierung mit Fahrzeugöl durchgeführt werden sollten. Diese Ergebnisse verdienen eine weitere Validierung in jedem Labor, das Einweg-Tuberkulinspritzen als kostengünstige und zeitsparende Verabreichungsmethode zur Verabreichung der Dosen in Dosis-Wirkungs- und RID-Tests in populationsbasierten Studien verwenden möchte.

Wir haben uns für die Direktverdrängerpipette für Forschungs- und klinische Studien entschieden, bei denen der RID-Test verwendet wird, um die Genauigkeit auf individueller Ebene zu maximieren, da ihre angegebene Genauigkeit und Präzision ≤1 % beträgt. Im Vergleich dazu ist der modifizierte relative Dosis-Wirkungs-Test qualitativ, und es basieren keine Berechnungen auf der Menge der verabreichten Dosis1. Daher haben wir empfohlen, in bevölkerungsbasierten Erhebungen Spritzen für den Test zu verwenden und die Dosis in etwa 0,7 ml Vehikel aufzulösen.

Der RID-Test ist eine empfindliche Methode zur Quantifizierung von TBS und zur Schätzung der TLR, die als Referenzstandard zur Bewertung des Vitamin-A-Status gilt. Es wurde in vielen Forschungsanwendungen mit Deuterium- oder 13C-Markierungverwendet. In aktuellen und zukünftigen Anwendungen wird der RID-Test in klinischen Umgebungen und in Bevölkerungsuntergruppen in Umfragen eingesetzt. Die Vereinfachung der Dosierung wird für diese Anwendungen wichtig sein.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte mit dem Inhalt dieses Manuskripts.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch NIH-R01 DC019357 und das IAEO Coordinated Research Project E43035 finanziert. Wir danken Nicholas Keuler von der Statistical Consulting Group an der University of Wisconsin-Madison für die Unterstützung bei der Analyse des Methodenvergleichs mit Einmalspritzen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AcetanhydridSigma Aldrich242845
AcetonSigma Aldrich179124
AluminiumoxidSigma Aldrich199974
BecherJeglicheJedes Glaslieferunternehmen 
Beta-IononSigma AldrichW259500
ÄtherSigma Aldrich673811
Glaspasteur-PipettenJeglicheJedes Glaslieferunternehmen 
HexaneSigma178918
markiertes TriethylphosphonoacetatSigma Aldrich293202
Lithium-Aluminiumhydrid-LösungAcros Bio199511000
ManganoxidSidma Aldrich310700
VerdrängerpipettenRainin17008579
RetinylacetatSigma AldrichNr. R4632
ScheidetrichterJeglicheJedes Glaslieferunternehmen 
KieselgelSigma Aldrich1.07734
NatriumhydridAldrich223441
NatriumhydroxidFisher ScientificNr. S318-100
SpektralphotometerJeder ScanvorgangDoppelträger wird bevorzugt
TriethylaminSigma Aldrich471283
TriethylphosphonoacetatAldrichNr. T61301
Tuberkulin-SpritzeNorm-JectNr. 19G334
PflanzenölSojabohneLebensmittelgeschäft
Messkolben (25 mL)JeglicheJedes Glaslieferunternehmen 

Referenzen

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