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Methodenartikel

Untersuchung der anatomischen Merkmale retinaler Ganglienzellen unter N-Methyl-D-Asparaginsäure (NMDA)-induzierter Exzitotoxizität

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DOI:

10.3791/68537

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19. September 2025

 ,  , 
1Ruiz Department of Ophthalmology and Visual Science, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center at Houston (UTHealth)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit beschreiben wir die Verwendung einer genetisch gerichteten Markierungsmethode für alkalische Phosphatase (AP), um die anatomischen Merkmale und Phänotypen der Mausnetzhaut unter NMDA-induzierter Exzitotoxizität zu untersuchen. In Verbindung mit mehreren Subtyp-spezifischen Reporterlinien von retinalen Ganglienzellen (RGC) decken wir neue Phänotypen in sterbenden RGCs während des gesamten degenerativen Prozesses auf.

Zusammenfassung

Retinale Ganglienzellen (RGCs) sind die Ausgangsneuronen der Netzhaut, die für die Übertragung visueller Informationen an das Gehirn verantwortlich sind. In der reifen Netzhaut der Maus wurden über 40 RGC-Typen auf der Grundlage genomischer, morphologischer und funktioneller Merkmale identifiziert. Die RGC-Degeneration ist ein Kennzeichen verschiedener schwächender Netzhauterkrankungen, darunter das Glaukom und die traumatische Optikusneuropathie. Ein tieferer Einblick in die zellulären und molekularen Mechanismen, die der Degeneration, dem Überleben und der Resilienz von RGC bei verschiedenen Krankheitszuständen zugrunde liegen, ist entscheidend für die Entwicklung wirksamer therapeutischer Interventionen. Um die RGC-Degeneration zu untersuchen, haben wir eine einfache, aber leistungsfähige Technik verwendet, die zuvor in umfangreichen Netzhautentwicklungsstudien für RGC-Morphologien und zentrale Projektion eingesetzt wurde. Hier wenden wir diese Methode an, um die anatomischen Phänotypen von RGCs unter NMDA-induzierter Exzitotoxizität zu bewerten. Dieser Ansatz ermöglicht die Visualisierung einer großen Anzahl degenerativer RGCs im Laufe der Zeit, was es uns ermöglicht, die Abfolge degenerativer Ereignisse zu kartieren, charakteristische Phänotypen sterbender RGCs zu identifizieren und RGCs zu unterscheiden, die resistent gegen NMDA-induzierte Schäden sind.

Einleitung

Ein Schädel-Hirn-Trauma (TBI) ist eine plötzliche Verletzung, die neuronale Schäden am Gehirn verursacht. Bei schweren Formen des SHT, wie sie durch Autounfälle oder Sportkollisionen und Explosionsverletzungen durch Explosionen verursacht werden, können mechanische Kräfte die Zellarchitektur stören, was zu Entzündungen, oxidativem Stress, Exzitotoxizität und schließlich zum neuronalen Tod führt 1,2.

Die Netzhaut, der am leichtesten zugängliche Teil des Zentralnervensystems (ZNS), diente als Modell-TBI-System, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der Exzitotoxizität zugrunde liegen, und um Strategien für therapeutische Interventionen zu entwickeln 3,4,5. Die relevantesten Netzhautmodelle für SHT-Studien sind das Sehnervenquetschmodell und die N-Methyl-D-Asparaginsäure (NMDA)-induzierte Exzitotoxizität der Netzhaut. Im NMDA-induzierten Exzitotoxizitäts-Retina-Modell wurden retinale Ganglienzellen (RGCs) als die anfälligste Art von retinalen Neuronen identifiziert, da RGCs Glutamat als wichtigen exzitatorischen Neurotransmitter und verschiedene Arten von Glutamatrezeptoren, einschließlich AMPA-Rezeptoren (AMPARs), KAPA-Rezeptoren (KAPARs) und NMDA-Rezeptoren, verwenden, um das Axonpotenzialauszulösen 6. Neben RGCs könnten auch andere Netzhautzellen und neuronale Schaltkreise von der NMDA-Behandlung betroffen sein 7,8,9. Die intravitreöse Verabreichung von NMDA führt zu einer verlängerten Öffnung des NMDA-Rezeptors, was zu einem übermäßigen Einstrom von Kalzium in die Zellen führt, was zu einer überexzitatorischen neuronalen Aktivität und einer unausgewogenen Kalziumhomöostase führt 10,11,12,13.

Der NMDA-Rezeptor ist ein heteromerer Komplex, der aus drei Untereinheiten besteht: GluN1, GluN2 und GluN3 14,15,16,17,18. GluN1, kodiert von Grin1, enthält in Mäusen acht Isoformen aufgrund des alternativen Spleißens von Grin1. Es gibt vier verschiedene GluN2-Untereinheiten (a-d), die von vier separaten Genen kodiert werden: Grin2a-2d. Es gibt zwei verschiedene GluN3-Untereinheiten (a und b), die von Grin3a und 3b kodiert werden. Laut scRNA-seq-Daten 19,20 ist Grin1 in den meisten RGC-Subtypen (Abbildung 1A) sowie in einigen wenigen Amagrinzell-Subtypen (AC) mit schwachen bis moderaten Expressionsniveaus (Abbildung 1B) stark exprimiert. Grin2a ist in weniger RGC- und AC-Subtypen angereichert, während Grin2b in den meisten RGC- und vielen AC-Subtypen moderat exprimiert wird (Abbildung 1A,B). Die Expressionsniveaus von Grin2c, Grin2d und Grin3b in RGCs und ACs sind extrem niedrig (Abbildung 1A,B). Die Grin3a-Expression ist bei einigen RGC-Subtypen und schwach bei einigen ACs zu sehen (Abbildung 1A,B). Zusätzlich zur Rolle der NMDA-Rezeptoren wurde in mehreren Krankheitsmodellen eine durch Kalziumeinstrom ausgelöste Exzitotoxizität durch Kalzium-permeable AMPARs beschrieben21. Die Expression von NMDA-Rezeptor-Untereinheiten könnte Hinweise darauf geben, warum die NMDA-induzierte Exzitotoxizität hauptsächlich auf RGCs sowie ACsabzielt 9,10,14,22,23.

Zu den herkömmlichen Methoden zur Beurteilung von Brutto-NMDA-induzierten Netzhautphänotypen gehören die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) zum Nachweis histologischer Anomalien, der TUNEL-Assay für den Zelltod und die Immunfluoreszenzfärbung (IF) unter Verwendung eines zelltypspezifischen Biomarkers 8,10,24,25,26 . Auf zellulärer Ebene wurden konfokale Bildgebungs- und Farbstofffülltechniken verwendet, um die Abfolge von Ereignissen bei sterbenden RGCs im NMDA-induzierten Netzhautmodell zu untersuchen. Diese Methoden haben wertvolle Einblicke in die subzellulären Kompartimente der sterbenden RGCs geliefert und die Identifizierung der Arten von resilienten RGCs ermöglicht, die unter NMDA-Insult27,28 überleben.

Hier verwenden wir die genetisch aktivierte alkalische Phosphatase (AP)-Färbung, um die anatomischen Merkmale und Phänotypen von retinalen Neuronen der Maus unter NMDA-induzierter Exzitotoxizität zu untersuchen 29,30,31. Der Grund für die Wahl dieser Methode liegt in ihrer Einfachheit, Kosteneffizienz und der Möglichkeit, einen umfassenden Überblick über die anatomischen Merkmale neuronaler Subtypen über die gesamte Netzhaut zu erhalten, wodurch sie sich gut für grobe Untersuchungen und groß angelegte vergleichende Analysen eignet. Dieser Ansatz liefert neue Einblicke in die Reaktion unterschiedlicher, genetisch markierter retinaler Neuronen auf NMDA sowohl auf grober als auch auf subzellulärer Ebene. Wir gehen davon aus, dass diese Strategie breit anwendbar sein wird, um morphologische Veränderungen in verschiedenen Krankheitsmodellen zu bewerten, die die neuronale Architektur und die synaptische Organisation beeinflussen 4,26,32,33.

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Protokoll

Alle Tierverfahren folgten der US-amerikanischen Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der McGovern Medical School der University of Texas in Houston genehmigt. Die Zusammensetzungen der Lösungen sind in der Werkstofftabelle aufgeführt.

1. Injektion von Tamoxifen

  1. Mischen Sie 30 mg Tamoxifen mit 30 μl Ethanol. In minderkochendem Wasser 1 ml Sonnenblumenöl und das Tamoxifen/Ethanol-Gemisch erhitzen.
  2. Nachdem sich das Tamoxifen im Ethanol aufgelöst hat, geben Sie schnell 1 ml erhitztes Sonnenblumenöl in die Tamoxifenlösung. Durch Pipettieren gut mischen.
  3. Es wurden Mäuse beiderlei Geschlechts in verschiedenen Altersgruppen zwischen 2 und 6 Monaten verwendet. Injizieren Sie die Tamoxifenlösung in einer Dosis von 100 μg/g Körpergewicht intraperitoneal mit einer Insulinspritze. Bestimmen Sie die Anzahl der Tamoxifen-Injektionen anhand der Mauslinie. In diesem Protokoll wurde Tamoxifen an vier aufeinanderfolgenden Tagen einmal täglich verabreicht.
    HINWEIS: Da die Tamoxifenlösung mit dichtem Öl gemischt wird, ist es schwierig, sie mit einer Spritze zu handhaben, die eine abnehmbare Nadel hat. Daher wird für die Tamoxifen-Injektion bevorzugt eine Insulinspritze mit aufgesetzter Nadel verwendet.
  4. Halten Sie die Maus in Gruppen von nicht mehr als 5 Personen in individuell belüfteten Käfigen. bis zur NMDA-Injektion.

2. Injektion von NMDA-Lösung in die Augen der Maus

  1. Bereiten Sie 20 mM NMDA-Lösung in sterilem 1x PBS vor. Waschen Sie den Nano-Injektor mit einer 35G-Nadel mit 100 % Ethanol 20x und waschen Sie ihn dann zusätzlich 20x mit sterilem Reinstwasser. Füllen Sie den Nano-Injektor mit 1 μl NMDA-Lösung.
  2. Betäuben Sie die Maus durch intraperitoneale Injektion eines Ketamin/Xylazins in 1X PBS (80/10 mg pro kg Körpergewicht) Lösungsgemisch. Beurteilen Sie die Bewusstlosigkeit durch reflexartige Rückzugsreaktion auf das Einklemmen von Schwanz und Zehen.
  3. Platzieren Sie die betäubte Maus auf einem Stereomikroskop. Positionieren Sie die Maus mit dem rechten Auge nach oben und der Nase nach rechts. Tragen Sie einen Tropfen 0,5% iger Proparacainhydrochloridlösung zur Lokalanästhesie auf den rechten Augapfel auf.
  4. Verwenden Sie eine sterile 30G-Injektionsnadel, um den Limbus in der 7-Uhr-Position zu punktieren, wodurch ein kleines Loch entsteht. Überwachen Sie die Position und Richtung der Nadel unter dem Stereomikroskop. Stellen Sie sicher, dass die Größe der Injektionsnadel etwas größer ist als die der Nanoinjektionsnadel, um ein einfaches Einführen zu ermöglichen.
  5. Entfernen Sie die Injektionsnadel vorsichtig aus dem Augapfel und entsorgen Sie sie ordnungsgemäß. Führen Sie die Nanoinjektionsnadel mit dem Stereomikroskop in einem Winkel von 45° durch den Limbus in den Glaskörper ein.
  6. Injizieren Sie langsam 1 μl NMDA-Lösung in den Glaskörper. Halten Sie die Nanoinjektionsnadel nach der Injektion ca. 10 s lang im Glaskörper, um ein Abfließen der injizierten Lösung zu verhindern.
  7. Ziehen Sie die Nanoinjektionsnadel vorsichtig und langsam aus dem Öhr zurück. Tragen Sie 0,5% Erythromycin-Augensalbe auf die Hornhaut des injizierten Auges auf.
  8. Platzieren Sie die Maus in einem Käfig auf einem Heizkissen. Überwachen Sie die Maus alle 15 Minuten, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat. Halten Sie die Maus ein bis zwei Wochen lang bis zur Gewebeentnahme.

3. Gewebeentnahme und Färbung der alkalischen Phosphatase (AP)

  1. Euthanasieren Sie die Maus mit CO2 -Erstickung, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation. Schneiden Sie die Muskeln, die mit dem Augapfel und dem Sehnerv verbunden sind, vorsichtig mit einer Vanna-Schere ab.
  2. Der Augapfel wurde dann mit einer Pinzette aufgenommen und in separate beschriftete 2,0-ml-Röhrchen überführt.
  3. Fixieren Sie die Augäpfel 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 10% neutralem, gepuffertem Formalin. Montieren Sie die Netzhaut flach auf einen Zellulosenitrat-Membranfilter, wie unten beschrieben.
    1. Übertragen Sie die Augäpfel in 10 cm große Petrischalen mit 1x PBS. Halten Sie jegliches Muskelgewebe, das am Augapfel befestigt ist, mit einer Pinzette fest. Mit einer 30G-Injektionsnadel ein Loch am Limbus erzeugen. Die Spitze der Vanna-Schere in das Loch stecken und um die Ora serrata herum einschneiden. Entferne die Linse mit einer Pinzette von der Augenmuschel.
    2. Machen Sie 3-4 Schnitte an der Augenmuschel und verwenden Sie eine Pinzette, um das RPE zu halten und das RPE vorsichtig von der Netzhaut zu entfernen.
    3. Schneiden Sie ein kleines Stück Zellulosenitrat-Membranfilter ab und tränken Sie es in 1x PBS. Legen Sie die isolierte Netzhaut auf den Filter. Drücke mit der Spitze eines feinen Pinsels vorsichtig auf einen peripheren Bereich der Netzhaut, um den Rand der Netzhaut am Filter zu befestigen.
    4. Halten Sie den Rand des Filters fest und ziehen Sie ihn langsam aus dem 1x PBS heraus, wobei Sie sicherstellen, dass die Netzhaut haftet bleibt und auf dem Filter abflacht. Legen Sie die Netzhaut/den Filter 1 Minute lang auf ein Papiertuch, um die befestigte Netzhaut am Filter zu befestigen.
    5. Übertragen Sie die Netzhaut/den Filter mit 1x PBS zurück in eine Petrischale. Entferne vorsichtig alle Ablagerungen, Haare und Glaskörper von der Netzhaut mit einer Pinzette und/oder einem feinen Pinsel, so weit wie möglich. Um die injizierten und nicht injizierten Netzhäute zu unterscheiden, trimmen Sie Filter in unterschiedlichen Formen.
  4. Übertragen Sie die Netzhaut/den Filter zurück in eine Petrischale. Fixieren Sie die Netzhaut in 10% neutralem gepuffertem Formalin für 5 min bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren.
  5. Bereiten Sie ein 65 °C warmes Wasserbad vor. 30 mL 1x PBS in einem 50 mL Becherglas vorheizen. Übertragen Sie die Retina/Filter direkt in das vorgewärmte 1x PBS. Inkubieren Sie die Netzhaut 30 Minuten lang bei 65°C.
    HINWEIS: Durch die Wärmebehandlung wird die endogene AP-Aktivität inaktiviert, was zu Hintergrundflecken in der Netzhaut führt. Es ist entscheidend, die Netzhaut in der erhitzten Lösung zu behandeln, um diesen Hintergrund effektiv zu beseitigen.
  6. Nach der Wärmebehandlung werden die Netzhäute in eine 30-mm-Petrischale mit AP-Puffer (100 mM Tris, pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2) überführt.
  7. Inkubieren Sie die Netzhaut im AP-Puffer 5 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren.
    HINWEIS: In diesem Schritt wird der Puffer in der Netzhaut von 1x PBS gegen AP-Puffer ausgetauscht, um eine chemische Ausfällung während der Farbentwicklung zu verhindern.
  8. Ersetzen Sie den AP-Puffer durch Färbelösung (30 μl 10 mg/ml BCIP und 60 μl 10 mg/ml NBP in 10 ml AP-Puffer).
  9. Stellen Sie die Petrischale in eine lichtausschließende Box. Die AP-Reaktion wird 1 bis 2 Tage lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren entwickelt, bis die Intensität der AP-Färbung für die Bildgebung zufriedenstellend ist.
  10. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Netzhäute mit 1x PBS für 5 min, 2x, bei Raumtemperatur unter sanftem Rühren waschen.
  11. Postfixieren Sie die Netzhäute mit 10% neutralem gepuffertem Formalin für 10 min bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren.
  12. Waschen Sie die Netzhäute mit 1x PBS für 5 min, 3x, bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren. Dehydrieren Sie die Netzhaut, indem Sie sie in 30 % Ethanol inkubieren, gefolgt von 50 % Ethanol für jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur unter sanftem Rühren.
  13. Entferne mit einem feinen Pinsel vorsichtig die Netzhaut vom Filterpapier. Dehydrieren Sie die filterfreien Netzhäute 30 Minuten lang in 70 % Ethanol, gefolgt von zwei 30-minütigen Inkubationen in 100 % Ethanol bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren.
  14. Reinigen Sie die Netzhäute in einer Petrischale aus Glas mit einer Benzylbenzat/Benzylalkohol-Reinigungslösung (2:1, v/v) für 30 min bis 2 h bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren.
    HINWEIS: Dieses Reinigungsverfahren sollte nicht über Nacht durchgeführt werden, da eine längere Inkubation häufig zum Verlust der AP-Färbung führen kann. Die Reinigungslösung kann Kunststoff schmelzen, daher sollte der Vorgang in einem Glasbehälter durchgeführt werden.
  15. Um die Netzhaut auf einen Objektträger zu montieren, kleben Sie doppelseitiges Klebeband auf den Objektträger, um eine Plattform für das Deckglas und die Netzhaut zu schaffen. Legen Sie die Netzhaut auf den Objektträger, füllen Sie den Raum mit Reinigungslösung, bringen Sie das Deckglas an und versiegeln Sie das Objektträger mit Nagellack, um die Netzhaut und das Deckglas zu sichern.
  16. Bilden Sie die AP-gefärbten Netzhäute mit einem Zeiss Apotome Mikroskop ab.

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Ergebnisse

Die NMDA-Applikation im Glaskörper induziert den RGC-Tod, der konventionell durch histologische Färbung oder Immunfluoreszenz (IF)-Färbung mit RGC-Markern nachgewiesen wurde. In unserem experimentellen Setting bestätigten wir unter Verwendung der konventionellen IF-Strategie mit einem pan-RGC-Marker RBPMS, dass die Anzahl der RGCs 1 Woche nach der NMDA-Injektion um etwa 65% abnahm (Abbildung 2E-G). Frühere Studien haben herausgefunden, dass Tbr2-exprimierende RGCs tatsächlic...

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Diskussion

In dieser Studie verwendeten wir ein genetisch gesteuertes spärliches AP-Markierungssystem in Verbindung mit einer Reihe von genetisch manipulierten Mauslinien, um NMDA-induzierte degenerative Ereignisse in verschiedenen RGC- und AC-Subtypen zu untersuchen und entdeckten mehrere charakteristische Phänotypen 29,31,39. Der auffälligste Phänotyp ist die signifikante Reduktion von RGCs und ACs in de...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health-National Eye Institute an C.A.M. (EY024376) und teilweise durch die Vision Core Grants P30EY028102 des National Eye Institute (UTHealth) unterstützt. Wir danken auch für die finanzielle Unterstützung durch die Stephen Lasher Endowment (UTHealth) und die Raye White Endowment (UTHealth).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5% Erythromycin Augensalbe;Bausch+Lomb24208-910-55
0,5 % ProparacainhydrochloridBausch+Lomb24208-730-06
10% neutral gepuffertes Formalin VWR89370-094
10 cm PetrischaleCorning430167
10x PBSFisher ScientificNr. BP399In Wasser verdünnen, um 1x PBS zu erzeugen und autoklavieren.
2,0 ml TubeVWR525-1136
30 Gauge InjektionsnadelEXELINT Deutschland26437
30 mm PetrischaleFalke35208
BenzylalkoholAcros Organics447000010
BenzylbenzatAcros Organics105860010
Zellulosenitrat-MembranfilterCytiva7188-002
DeckglasElektronenmikroskopie72204-01
Doppelseitiges KlebebandScotch597020
EthanolDekon-Labore2716Fisher Bioreagents (Kat#: BP2818) zur Dehydtration nach AP-Färbung vermeiden. Dieses Reagenz verzerrt die Netzhaut.
ZangeTED PELLA505
HeizkissenTheratherm710298-001
Insulin-SpritzeBD329424
KetaminDechra17033010110
MikroskopZeissAxio Imager 2
NagellackElektronenmikroskopie72180
Nanofil-InjektorWelt PräzisionsinstrumenteNANOFIL
Nanofil-NadelWelt PräzisionsinstrumenteNF25BL
NBT/BICP-Reagenzien-KitInvitrogenNr. N6547
NMDASigma-AldrichNr. M3262
PinselKönig6650
SchiebeglasFisher Scientific12-550-15
StereomikroskopMoticNr. DM143
SonnenblumenkernölSigma-AldrichNr. S5007
TamoxifenSigma-AldrichNr. T5648Lagern Sie Tamoxifenlösung bei 4 °; C in einer lichtdichten Box. Verwenden Sie Tamoxifenlösung innerhalb einer Woche.
Vanna Schere Werkzeuge für die Feinwissenschaft15000-00
WasserbadLabor-Linie18052
XylazinDechra17033-0099-05Produktname: Rompun

Referenzen

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Untersuchung der anatomischen Merkmale retinaler Ganglienzellen unter N-Methyl-D-Asparaginsäure (NMDA)-induzierter Exzitotoxizität
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