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Methodenartikel

Patientenspezifische iPSC-abgeleitete Cornea-Organoide zur Untersuchung aniridienassoziierter Hornhauterkrankungen

137 Ansichten

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DOI:

10.3791/68556

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28. Juli 2026

 ,  ,  ,  , 
1Izmir Biomedicine and Genome Center, 2Izmir International Biomedicine and Genome Institute, Dokuz Eylül University, 3Department of Medical Biology and Genetics, Faculty of Medicine, Dokuz Eylül University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll zur Erzeugung von Hornhautorganoiden aus iPSCs, die von Aniridienpatienten gewonnen wurden, und erstellen ein patientenspezifisches Modell zur Untersuchung von Hornhauterkrankungen. Diese Organoide ahmen wichtige strukturelle und funktionale Merkmale nach und bieten eine zuverlässige In-vitro-Plattform zur Untersuchung von Krankheitsmechanismen, zur Erprobung möglicher Behandlungen und zur Weiterentwicklung personalisierter regenerativer Ansätze für vordere Augenerkrankungen.

Zusammenfassung

Aniridie ist eine seltene angeborene Augenerkrankung, die durch das teilweise oder vollständige Fehlen der Iris gekennzeichnet ist und oft mit hornhautopacifikation und limbalem Stammzellmangel in Verbindung gebracht wird. Die zugrunde liegenden genetischen Mutationen, die hauptsächlich das PAX6-Gen betreffen, stören sowohl die Entwicklung als auch die Funktion der Hornhaut. Die häufigsten Augenmerkmale neben Irisdefekten sind Nystagmus, foveale Hypoplasie, Katarakt, Glaukom und aniridienassoziierte Keratopathie (AAK). Obwohl In-vivo-Modelle wertvolle Einblicke in die Pathologie von Anaridien bieten, sind patientenbasierte In-vitro-Modelle entscheidend, um Krankheitsmechanismen zu untersuchen und potenzielle Therapien zu bewerten. In dieser Studie präsentieren wir ein in-vitro-AAK-Modell unter Verwendung von Patienten abgeleiteten induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs). Unser Protokoll beinhaltet die schrittweise Differenzierung von iPSCs in hornhautepithelähnliche Zellen innerhalb selbstassembiliierter dreidimensionaler Organoide, die das native hornhautmikroumfeld nachahmen. Durch die Optimierung der Differenzierungskulturbedingungen haben wir erfolgreich hornhautorganoide erzeugt, die unterschiedliche Hornhautzellpopulationen beherbergen und so die wichtigsten strukturellen und funktionellen Eigenschaften der menschlichen Hornhaut rekapitulieren.

Einleitung

Die Hornhaut ist ein avaskuläres, transparentes Gewebe, das die äußerste Schicht des Auges bildet und hauptsächlich aus drei Schichten besteht: einer epithelialen äußeren Schicht, einer Stromschicht mit einer kollagenreichen extrazellulären Matrix, die von Keratozyten bevölkert ist, und einer Endothelzellschicht1. Die Hornhaut spielt eine wesentliche Rolle beim Sehvermögen, indem sie die inneren Augenstrukturen schützt und das Licht bricht.

Aniridia ist eine seltene, angeborene panokulare Erkrankung, die hauptsächlich durch heterozygote Mutationen im gepaarten Box-Gen 6 (PAX6), einem Hauptregulator der Augenentwicklung, verursacht wird und durch das teilweise oder vollständige Fehlen der Iris2 gekennzeichnet ist. Neben Iris-Hypoplasie oder -abwesenheit entwickeln die meisten Patienten progressive Hornhautauffälligkeiten, die zusammenfassend als aniridienassoziierte Keratopathie (AAK) bezeichnet werden, welche Epitheldefekte, limbale Stammzelldysfunktion, stromale Veränderungen und fortschreitende Hornhautopacifikation umfassen, was letztlich zu Sehbeeinträchtigungen führt. AAK betrifft etwa 78–90 % der Ananiridienpatienten, mit zunehmender Schwere über die Zeit3. Wir hatten das Ziel, ein detailliertes und reproduzierbares Protokoll zur Erzeugung von Hornhautorganoiden aus aniridien patientenabgeleiteten induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) zu entwickeln, um krankheitsrelevante hornhautVeränderungen in vitro zu modellieren. Obwohl Tiermodelle und ex-vivo-Studien wertvolle Einblicke in die Pathogenese der Ananidien geliefert haben, schränken artspezifische Unterschiede und begrenzter Zugang zum Patientengewebe ihre translationale Relevanz ein.

Humane iPSC-abgeleitete Organoide haben sich als leistungsstarke In-vitro-Systeme zur Modellierung der menschlichen Entwicklung und Krankheiterwiesen 4,5. Hornhautorganoide ermöglichen insbesondere die Bildung dreidimensionaler, gewebeähnlicher Strukturen, die eher der natürlichen Hornhautarchitektur ähneln, einschließlich geschichteter Epithelorganisation, stromal-epithelialen Wechselwirkungen und extrazellulärer Matrixablagerung, im Vergleich zu herkömmlichen zweidimensionalen Monoschichtkulturen, denen räumliche Organisation, physiologische Zell-Zell-Interaktionen und mikroökologische Komplexität fehlen 4,5. Mehrere Differenzierungsstrategien, darunter SEAM-basierte und okuläre Progenitor-gesteuerte Ansätze, wurden berichtet, dass sie hornhautähnliches Gewebe aus iPSCs6 erzeugen. Diese Ansätze beinhalten typischerweise eine Anfangsphase der Induktion der Augenlinien, gefolgt von fortschreitender Gewebespezifikation und -selektion aus heterogenen okulären Vorläuferpopulationen. Die Herstellung von Hornhautorganoiden bietet die Möglichkeit, verschiedene Zelltypen zu untersuchen, die im Hornhautgewebevorkommen. Darüber hinaus ermöglichen die iPSC-abgeleiteten Hornhautorganoide von Aniridia-Patienten die Untersuchung des genetischen Hintergrunds der Krankheit und bieten eine einzigartige Gelegenheit, Aniridien zu untersuchen.

Im vorliegenden Protokoll werden sowohl Wildtyp- als auch Aniridien-abgeleitete iPSC-Linien einer identischen, mehrstufigen Differenzierungsstrategie unterzogen, die sequentielle Exposition gegenüber Differenzierung (DM), retinaler Differenzierung (RDM) und hornhautdifferenzierungsmedien (CDM) über einen längeren, wochenlangen Kulturzeitraum umfasst. Ein entscheidender experimenteller Schritt ist der Übergang von der adhärenten Kultur zu den Suspensionsbedingungen, während der ausgewählte hornhautähnliche Regionen erhalten bleiben, um die epitheliale Selbstorganisation zu fördern.

Obwohl dieser Ansatz die reproduzierbare Erzeugung hornhautähnlicher epithelialer Strukturen unterstützt, die für vergleichende Krankheitsmodellierungen geeignet sind, rekapituliert er komplexe in vivo Merkmale wie neuronale Innervation oder vollständige limbale Nischenorganisation, die bei der Bewertung der Anwendbarkeit der Methode berücksichtigt werden sollten.

In diesem Zusammenhang beschreiben wir ein standardisiertes Protokoll zur Erzeugung von Hornhaut-Organoiden aus patientenabgeleiteten iPSCs, die PAX6-Mutationen mit Anaridien in Verbindung bringen. Wichtig ist, dass die Differenzierungsstrategie selbst nicht zwischen Wildtyp- und Aniridien-abgeleiteten Linien modifiziert ist; stattdessen entstehen krankheitsspezifische Phänotypen aus dem patientenspezifischen genetischen Hintergrund innerhalb eines ansonsten einheitlichen experimentellen Rahmens.

Insgesamt bietet diese Methode eine robuste und reproduzierbare Grundlage zur Untersuchung der Hornhautentwicklung und aniridienassoziierter Krankheitsmechanismen und könnte als Grundlage für zukünftige mechanistische und translationale Studien dienen.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden gemäß den Richtlinien des Ethikausschusses durchgeführt. Die Studie wurde in der Datenbank Human Pluripotent Stem Cell Registry (hPSCreg) registriert, und die ethischen Genehmigungen wurden unter dem französischen Ministère de l'Enseignement Supérieur, de la Recherche et de l'Innovation (MESRI; IE-2018-967)9. Die iPSCs werden mit den Codes AAKIPSi001-A (AAK1), AAKIPSi002-A (AAK2), AAKIPSi003-A (AAK3) und WT (von Gesundheitsspendern) bezeichnet. Darüber hinaus hat das Ethikkomitee der Universität Hacettepe die Nutzung dieser Forschung genehmigt, wie die Referenznummer 16969557-1213 zeigt. Die in dieser Studie verwendeten menschlichen Zelllinien benötigten zum Zeitpunkt der Erwerbung eine nationale regulatorische Genehmigung. Die Genehmigung wurde im Rahmen eines Konsortiumsrahmens erteilt, an dem einer der Autoren beteiligt war. Obwohl das vorliegende Manuskript nicht direkt mit diesem Konsortiumsprojekt in Verbindung steht, wurden die verwendeten biologischen Materialien innerhalb dieses ethischen Rahmens bezogen und genehmigt. Daher wurde die Genehmigung dieser Universität angemessen zitiert, um vollständige regulatorische Transparenz zu gewährleisten. Alle Details zu den Materialien, Reagenzien und Ausrüstungen, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Alle experimentellen Verfahren wurden in einem laminaren Flusskabinett (BSL-2) durchgeführt, um eine sterile Umgebung aufrechtzuerhalten. Dieses Setup stellt sicher, dass alle in der Studie verwendeten Materialien und Geräte ausreichend sterilisiert sind, wodurch das Kontaminationsrisiko minimiert und die Integrität der experimentellen Ergebnisse gewährleistet wird.

1. Erzeugung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) abgeleiteten Hornhautorganoiden

  1. Erhaltung und Erstkultivierung von von Aniridienpatienten abgeleiteten menschlich induzierten pluripotenten Stammzellen (AAK1, AAK2, AAK3)10 unter feederfreien, konditionierten Medien (Abbildung 1)
    1. Bereiten Sie Folgendes im Voraus vor: Beschichten Sie einen Brunnen in einer 6-Well-Platte mit 1 ml einer eiskalten extrazellulären Matrixlösung (ECM) bei einer Konzentration von 0,1 mg/mL. Dieses Beschichtungsverfahren muss auf Eis durchgeführt werden, um das ECM nicht zu verhärten, und es muss mindestens 30 Minuten bei 37 °C inkubieren dürfen, wobei die Anweisungen des Herstellers entsprechen, um eine ordnungsgemäße Substratpräparation sicherzustellen.
    2. Taue ein kryokonserviertes Aliquot von 1 x 106 hiPSC (WT, AAK1, AAK2, AAK3) auf. Die eingefrorenen Zellen nicht vollständig auftauen; Stattdessen lassen Sie die gefrorene Zellsuspension im Kryovial auftauen, bis etwa die Hälfte des Volumens gefroren bleibt.
    3. Übertragen Sie die teilweise aufgetaute Suspension sofort in 1 ml vollständiges Wartungsmedium bei Raumtemperatur (RT), das 10 μM Rho-assoziierten Protein-Kinase-(ROCK)-Inhibitor enthält, voraliquotiert in einem 15-mL-Röhrchen. Verwenden Sie während des Transfers keine Pipetten.
    4. Zentrifugiere bei 300 x g für 5 Minuten und entsorge das Überlagermittel.
    5. Anschließend werden die Zellen in 1 ml Complete Maintenance Medium mit einem 10 μM ROCK-Inhibitor wieder suspendiert.
    6. Bestimmen Sie die Zelldichte unter Verwendung von Trypan-Blau-Ausschluss. Zähle die Zellen mit einem Hämozytometer nach der Viabilitätsfärbung mit Trypanblau. Kurz gesagt: Mische 20 μL Zellsuspension 1:1 mit 20 μL 0,4 % Trypanblau, gefolgt von der Zugabe von 60 μL PBS, was zu einer endgültigen 1:5-Verdünnung der ursprünglichen Zellsuspension führt. Aus dieser Mischung werden 10 μL in die Hämozytometerkammer geladen. Zähle lebensfähige (Trypanblau–negative) Zellen in vier große Quadrate. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl von Zellen pro Quadrat und multiplizieren Sie mit 5 (Zellsuspensionsverdünnungsfaktor) und 10.000, um die endgültige Zellkonzentration (Zellen/mL) zu bestimmen.
      Zellen/mL = (Durchschnittliche Zellanzahl pro Quadrat) x 5 x 104
    7. Säen Sie die Zellen auf einen vorbeschichteten ECM-Brunnen in einer 6-Well-Platte, um eine Zelldichte von 2 x 104 Zellen /cm2 pro Bohrloch zu gewährleisten.
    8. Beobachten Sie die Zellmorphologie und -bindung mit einer Phasenkontrastmikroskopie bei 10-facher Vergrößerung. Anschließend werden die 6-Well-Platten bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert, um optimale Wachstumsbedingungen zu gewährleisten.
      HINWEIS: Der ROCK-Inhibitor darf nur über Nacht verwendet werden, während die Zellen gelassen oder aufgetaut werden. Während des täglichen Mediumwechsels geben Sie das Medium vorsichtig entlang der Wand des Brunnens auf. Vermeiden Sie es, das vollständige Wartungsmedium in einem Wasserbad zu erwärmen; Stattdessen sollte man das Medium 15 Minuten vor der Verwendung bei Raumtemperatur ausgleichen.
  2. Spontane Differenzierungsphase (Tag 0 – 2)
    1. Bereiten Sie das Differenzierungsmedium (DM) vor, indem Sie Folgendes mischen: 8 % KnockOut Serum Replacement (KSR), 1x nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA), 1x Glutamax, 1x Penicillin-Streptomycin und Dulbeccos Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F-12).
    2. Sobald die HiPSC-Kulturen etwa 70–80% Konfluenz erreichen, um spontane Differenzierung8 zu induzieren, aspirieren Sie das Medium sanft und entsorgen das Medium vollständig, ersetzen Sie es dann täglich durch 1 ml frisches DM pro Brunnen bis Tag 3, wenn die Netzhautdifferenzierungsphase gemäß dem experimentellen Zeitplan eingeleitet wird.
  3. Netzhautdifferenzierungsphase (Tag 3 – 47)
    HINWEIS: Das retinale Differenzierungsmedium wird über längere Zeiträume verwendet, um die Bildung heterogener okulärer Vorläuferpopulationen zu ermöglichen.
    1. Bereiten Sie das Netzhautdifferenzierungsmedium (RDM) vor, indem Sie Folgendes mischen: 8 % KSR, 1x NEAA, 1x Glutamax, 2 % B27, 1 x Penicillin-Streptomycin und DMEM/F-12.
    2. Nach zwei Tagen spontaner Differenzierung erneuere das Kulturmedium täglich, indem du das DM-Medium sorgfältig aspiriert und durch 1 ml frisches RDM-Medium pro Bohrloch ersetzt. Mach das insgesamt 30 Tage lang.
      HINWEIS: Während dieses 30-tägigen Zeitraums wird ein signifikanter Anstieg der Zelldichte erwartet. Es ist unerlässlich, mikroskopische Beobachtungen der Zelldichte in verschiedenen Bereichen jedes Brunnens durchzuführen. Um das Zellheben zu verhindern, muss das Waschen vermieden und bei Mediumwechsel Vorsicht geboten werden. Fügen Sie das Medium durch die Wand des Brunnens hinzu. Gleichgewicht des Mediums bei RT für 15 Minuten vor der Anwendung aus.
    3. Am 32. Tag erreichen die Zellen einen scheinbaren Zusammenfluss und bilden mehrschichtige 2,5D-Aggregate. In dieser Phase wird der Übergang zur Suspensionskultur eingeleitet, indem man das gesamte Bohrloch vorsichtig mit einer 1000-μL-Pipettenspitze abschabt. Während dieses Prozesses fragmentiert man die Zellschicht in kleine Cluster.
      HINWEIS: Obwohl alle Zellen von der Kulturoberfläche freigesetzt werden, werden mehrschichtige 2,5D-Aggregate bevorzugt gesammelt und in die Suspensionskultur übertragen (ergänzende Abbildung 1), da ihre Anreicherung eine schnellere Selbstassemblage und die Bildung größerer Organoide im Vergleich zu einzelnen Zellen oder Monoschichtfragmenten fördert.
    4. Unmittelbar nach dem Abkratzen werden die entstehenden Zellcluster gesammelt und in 6-Well-Kulturplatten mit niedriger Befestigung mit RDM übertragen, um Suspensionskulturbedingungen zu etablieren.
    5. Zellen werden weitere 15 Tage in Suspensionskultur gelassen, wobei täglich ein Medium mit 2 ml frischem RDM pro Bohrloch ersetzt wird. Während der ersten zwei Tage der Suspension Kultur vermeiden Sie eine Mittelveränderung, um den Verlust von Kleinzellclustern zu verhindern. Während der Suspensionskultur organisieren sich die Zellen allmählich selbst und bilden 3D-transparente, hornhautähnliche Strukturen, die regelmäßig mittels Phasenkontrastmikroskopie bei 4- und 10-facher Vergrößerung überwacht werden.
  4. Hornhautdifferenzierungsphase (Tag 48 – 90)
    1. Bereiten Sie das Hornhautdifferenzierungsmedium (CDM) vor, indem Sie Folgendes mischen: 8 % KOSR, 1x NEAA, 1x Glutamax, 1x N2-MAX, 1x Insulin-Transferrin-Selen, 5 ng/mL FGF2, 10 ng/mL EGF und DMEM/F-12.
    2. Nach den ersten 15 Tagen (von Tag 32 bis Tag 47) der Aufhängungskultur in Platten mit niedriger Befestigung (37 °C, 5 % CO₂) ersetzen Sie RDM durch CDM, während die Aggregate unter Aufhängungsbedingungen am Tag 47 erhalten bleiben. CDM alle zwei Tage mit 2 ml pro Bohrloch aktualisieren, damit die Organoide stets vollständig im Kulturmedium untertaucht sind. In dieser Zeit treten nach und nach transparente, blasenartige hornhautprimordiale (CP) Strukturen hervor.
    3. Suspension Culture in CDM wird bis Tag 90 fortgesetzt, um eine weitere Reifung und räumliche Abtrennung transparenter CP-Regionen aus undurchsichtigeren Gewebekompartimenten zu ermöglichen.
    4. Am Tag 90 werden transparente CP-Bereiche mechanisch von undurchsichtigeren Gewebekompartimenten mit sterilisierter Pinzette und Pinzette getrennt, wenn CP-spezifische Downstream-Analysen vorgesehen sind.
      HINWEIS: Die mechanische Isolierung von CP-Regionen wird durchgeführt, wenn Analysen speziell CP-angereicherte Strukturen erfordern. Wenn andere Gewebekompartimente oder die gesamte Organoidarchitektur von Interesse sind, können Organoide erhalten bleiben, um die strukturelle Heterogenität zu erhalten.
    5. Setzen Sie die Suspensionskultur in CDM fort, abhängig vom experimentellen Ziel, entweder für isolierte CP-Strukturen oder intakte Organoide.

2. Charakterisierung von Hornhautorganoiden

  1. Morphologische und strukturelle Bewertung von Organoiden
    1. Überwachen Sie Hornhautorganoide regelmäßig mit einer Brightfield-Mikroskopie bei 4- und 10-facher Vergrößerung. Bewerten Sie Größe, Transparenz und Gesamtmorphologie zu definierten Zeitpunkten und dokumentieren Sie strukturelle Veränderungen durch Bildaufnahme.
  2. Immunfluoreszenzbasierte Charakterisierung
    1. Organoidfixierung der Hornhaut
      1. Bereiten Sie vor der Fixierung 4 % PFA und 30 % Saccharoselösung vor. Nimm das Hornhaut-Organoid aus der Kultur mit einem autoklavierten Schöpfer. Übertragen Sie das Organoid in die 4%-PFA in einem 1,5-ml-Röhrchen und inkubieren Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur.
      2. Nach der Inkubation entsorgen Sie das PFA vorsichtig aus dem Schlauch, ohne das organoide Hornhaut zu beschädigen. Gib 1 ml 30%ige Saccharoselösung in die Tube und gib sie bei 4 °C auf. Nach 24 Stunden bereiten und beschriften Sie 5-ml-Röhrchen und flüssigen Stickstoff für die OCT-Fixierung.
      3. Entsorge die Saccharoselösung vorsichtig aus der Tube. Übertragen Sie das Organoid in den sterilen Schaufel. Mit einer 20-μL-Pipette entfernen Sie die überschüssige Saccharoselösung vorsichtig aus dem Organoid.
      4. Gieße OCT in die 5-mL-Röhrenkappe und setze das Organoid in das OCT. Verwende einen weiteren sterilen Schaufel, um das Organoid in die OCT-enthaltende Kappe zu übertragen.
      5. Fügen Sie OCT hinzu, um die Oberfläche des organoiden Hornhauts zu bedecken. Platzen Sie die Ballons im OCT mit einer Nadel, um klare Schnitte des Organoids zu bekommen.
      6. Schließen Sie den Deckel der 5-ml-Röhrchen und tauchen Sie mit einer Pinzette in den flüssigen Stickstoff. Lagern Sie die Proben bei -20 °C bis zur Sektionierung.
      7. Schneide sie mit einer Kryostat in 5 μm Dicke und lagere sie außerdem bei -20 °C bis zur Färbung. Halten Sie eine gleichmäßige Schnittdicke und Gewebeausrichtung aufrecht, um eine reproduzierbare Färbung zu gewährleisten.
    2. IF-Färbung
      1. Um Hornhaut-Organoidabschnitte für die IF-Färbung vorzubereiten, waschen Sie die Objektträger dreimal mit PBS-T (0,3 % Triton X-100) bei RT für 10 Minuten.
      2. Reinigen Sie den Objektträger mit Seidenpapier und machen Sie mit dem PAP-Stift einen Rand. Fügen Sie eine angemessene Menge Blocklösung hinzu, um den Gewebeschnitt vollständig zu bedecken (typischerweise 100–200 μL pro Objektträger, abhängig von der PAP-Federgrenze), und inkubieren Sie ihn 1 Stunde lang bei RT.
      3. Sauge die Blockierungslösung ab und mache eine Grenze mit dem PAP-Stift. Fügen Sie die 150 μl primären Ab (PAX6, p63, OCT3/4, NANOG, Na+/K+-ATPase, AQP1, CK3, CK5, CK14, CK19, N-cad, KERA, COLIV, die Verdünnungsraten sind in der Materialtabelle aufgeführt) auf den Objektträger und inkubieren Sie sie 1 Stunde lang in RT.
      4. Waschen Sie 2x mit PBS-T (0,3 % Triton X-100) bei RT für 10 Minuten. Mach den Rand erneut mit einem PAP-Stift.
      5. Fügen Sie die 150 μl sekundäre Ab-Lösung (Anti Rabbit-488, Anti Mouse-594, die Verdünnungsraten sind in der Materialtabelle aufgeführt) auf den Objektträger und inkubieren Sie ihn bei RT unter dunklen Bedingungen für 2 Stunden. Wasche 2x mit PBS-T (0,3 % Triton-X) bei RT für 10 Minuten. Reinige die Schlitten und montiere sie mit DAPI-Lösung.
      6. Bei undifferenzierten iPSCs führen Sie nach der Fixierung Blockierung und Permeabilisierung durch und fahren Sie mit der Färbung nach demselben Protokoll fort. Visualisieren Sie gefärbte Proben mittels Fluoreszenz oder Konfokalmikroskopie mit 4- und 10-facher Vergrößerung.

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Ergebnisse

Stammfestigkeit menschlicher induzierter pluripotenter Stammzellen (HiPSCs)

Um die Stämmigkeit der in den Experimenten verwendeten menschlichen iPSCs zu bewerten, führten wir Brightfield-Bildgebung, Immunfärbung und qRT-PCR-Analysen durch. Wir bewerteten die Expression wichtiger Pluripotenzmarker, darunter OCT3/4, SOX2 und NANOG, die zentrale Transkriptionsfaktoren sind, die für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz und Selbsterneueru...

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Diskussion

Vergleichende Analysen zwischen Kontrollorganoiden und denen von Aniridienpatienten abgeleiteten Organoiden zeigen Defekte in der Epithelschichtung, abnormer extrazellulärer Matrixablagerung und dysregulierter Expression des PAX6-Gens 9.

Die Wachstumsrate von iPSCs, die aus verschiedenen Proben von Aniridienpatienten, insbesondere AAK1-, AAK2- und AAK3-Linien, abgeleitet wurden, zeigt Variabilität und spiegelt möglicherweise di...

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Offenlegungen

Die Autoren haben dies nicht offengelegt.

Danksagungen

Diese Studie wird von TÜBİTAK 121N276 und dem Europäischen Gemeinschaftsprogramm für seltene Krankheiten finanziert und teilweise von der Europäischen Union unterstützt (Horizon 2020 ERA Chair Program, RareBoost Project Grant Nr.: 952346). A.C.K. wird durch das YÖK 100/2000 PhD-Stipendium und TÜBİTAK-BİDEB 2211A-Stipendien unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 mL serologische PipettenZA BioteknoLabselect SP-003-10
15 mL Konische Röhrchen Labselect CT-002-15A
2 mL serologische PipettenLabselect Labselect SP-003-2
5 mL serologische PipettenCleanteksBiofil GSP010005
50 mL Konische RöhrchenGolden Gate CT-002-50
50 mL serologische PipettenBIOFILLGSP020050
Anti Maus 594Jackson Immuno715-585-150Verdünnungsbereich: 1:100 - 1:800
Anti Kaninchen 488 Jackson Immuno711-545-152Verdünnungsbereich: 1:100 - 1:800
Autoklav VAPOUR-Line liteVWR ChemicalsVAPOUR-Lineeco 25
B27-SupplementGIBCO12587010mit Vitamin A
TischzentrifugeEppendorf5702
Tischmikroskop DMI1OlympusCKX41
Biologische Sicherheitsschränke Klasse IIThermoSafe 2020
Bovines Serumalbumin (BSA)Sigma-AldrichA8806
CellBanker 1Worthington IndustriesLABS-20K
Deckgläser 24 mm x 50 mmISOLAB280
Cryomatrix, OCTFisher Healthcare30226281
CryovialBioSigmaN403522
DAPINEOFROXX 1322
DAPINEOFROXX 15390,5 µg/ml
DMEM/F12-MediumGIBCO 31330-038
Dulbecco's Phosphat-gepufferter Saline (DPBS)Gibco141901441X
EGFGIBCOPHG0311
Ethanol 100%Sigma64-17-5
Ethanol 70%Sigma64-17-5Ethanol-Verdünnungen
Extrazelluläre Matrix (ECM)Corning354277LDEV-frei
FGF2GIBCOPHG0024
GlutaMaxGIBCO35050061
GoTaq Master MixPromegaM7123
InkubatorMemmert INCO 153 med44043
Insulin-Selen-TransferrinGIBCO41400045
KnockOut-Serum (KOSR)GIBCO10828028
Mikrotom RM2235LeicaRM2235
Einbettungsmediumabcamab104135
mTSER-MediumSTEMCELL85850
Multiwell-Kulturplatten (6-Well)CORNING   3516
N2-SupplementR&DAR003
Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA)LONZABE13-114E
P20, P200 und P1000 PipettenGilsonF167350
ParaffinVWR Chemicals10048502
Paraformaldehyd Sigma-AldrichF8775
Primärantikörper Aquaporin mAbabcamab9566Verdünnungsbereich: 1:50-1:200
Primärantikörper CK14Santa Cruz Biotechnology sc-53253Verdünnungsbereich: 1:50-1:500
Primärantikörper CK19ProteinTech14965-1-APVerdünnungsbereich: 1:150-1:600
Primärantikörper CK3NOVUSNBP2-91997 0,1 MLVerdünnungsbereich: 1:50-1:200
Primärantikörper CK5Thermo MA517057Verdünnungsbereich: 1:200-1:1000
Primärantikörper Kollagen Typ IVabcamab6586Verdünnungsbereich: 1:100-1:500
Primärantikörper KeratocanBiossbs-11054RVerdünnungsbereich: 1:50-1:200
Primärantikörper Na/K - ATPaseSanta Cruz Biotechnologysc-21712Verdünnungsbereich: 1:50-1:500
Primärantikörper N-Cadherinabcamab76011Verdünnungsbereich: 1:50-1:500
Primärantikörper p63SANTACRUZ   sc-25268Verdünnungsbereich: 1:50-1:500
Primärantikörper Pax6NovusNBP2-44576Verdünnungsbereich: 1:50-1:200
RNA-IsolierungskitMacherey–Nagel 740984.50
Rock-Inhibitor (Y-27632)TOCRIS1254
ObjektträgerStarFrostMBB-0302-55AKlebend, geschliffen
Edelstahl-Pinzette Nr. 5Sigma F6521-1EA
Edelstahl-Skalpell Steril N 21Swann-Morton1033060
The OneScript Plus cDNA-Synthese-Kit Applied Biological MaterialsG236
Triton-X100NEOFROXX 8500
TRIzol-ReagenzThermo15596026
TrypanblauGIBCO15250061
Ultra-Low-Attachment (ULA) 6-Well  Platte Corning3471
WasserbadNüveNb9

Referenzen

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