Optimierter Arbeitsablauf für die Isolierung und Langzeitkultivierung von patienteneigenen Gliomzellen unter Beibehaltung der ursprünglichen Tumoreigenschaften

Zusammenfassung

Diese Studie stellt ein standardisiertes Protokoll für die Etablierung von patientenabgeleiteten Gliomzelllinien (PDGCs) vor, um deren genetische und phänotypische Treue zu gewährleisten. Das Basalmembranmatrix-Extrakt-unterstützte Adhärentenkultursystem verbessert das Zellwachstum und die Zellhomogenität, was diese Modelle für das Wirkstoffscreening und die GBM-Forschung wertvoll macht.

Zusammenfassung

Das Glioblastom (GBM) ist der aggressivste primäre Hirntumor, der sich durch eine hohe Heterogenität und Resistenz gegenüber Standardtherapien auszeichnet. Traditionelle Gliomzelllinien bewahren oft keine patientenspezifischen genetischen und phänotypischen Merkmale, was ihre translationale Relevanz einschränkt. Um dies zu beheben, hatten wir 50 von Patienten stammende Gliomzelllinien (PDGCs) unter Verwendung eines serumfreien neuralen Stammzellkultursystems etabliert. Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme, Verarbeitung und Langzeitkultur von Tumorproben von GBM-Patienten, um die Erhaltung wichtiger molekularer Merkmale zu gewährleisten. Unsere Methodik umfasst enzymatische Gewebedissoziation, Lyse roter Blutkörperchen und Basalmembranmatrix-Extrakt-unterstützte Adhärentenkultur, die die Lebensfähigkeit der Zellen verbessert und das Wirkstoffscreening mit hohem Durchsatz erleichtert. Die Charakterisierung von PDGCs durch Ganzgenom- und Transkriptomsequenzierung sowie Immunfluoreszenzfärbung bestätigt die Beibehaltung häufiger genetischer GBM-Veränderungen sowie neuraler Stammzell- und Vorläufermarker. Darüber hinaus weisen diese Zellen in Xenotransplantatmodellen ein tumorigenes Potenzial auf. Durch die Optimierung der Kulturbedingungen bietet dieses Protokoll einen standardisierten Rahmen für die Generierung biologisch relevanter GBM-Modelle zur Unterstützung therapeutischer Entdeckungen und mechanistischer Studien.

Einleitung

Das Gliom, der häufigste primäre intrakranielle Tumor, stammt von neuralen Stamm- oder Vorläuferzellen, die genetische Mutationen durchlaufen haben¹. Die Weltgesundheitsorganisation klassifiziert Gliome in die Grade 1 bis 4 auf der Grundlage pathologischer und molekularer Merkmale, die von niedriggradig bis^{hochgradig 2} reichen. Das Glioblastom (GBM), ein Gliom 4. Grades, macht etwa 57 % aller Gliome und 48 % aller primären malignen Tumoren des zentralen Nervensystems^{aus 3}. GBM-Patienten haben eine schlechte Prognose mit einer medianen Überlebenszeit von weniger als 2 Jahren und einer 5-Jahres-Überlebensrate von nur 5,4 %⁴. Die Standardbehandlung umfasst eine maximal sichere Resektion, gefolgt von einer Strahlentherapie und einer Temozolomid-Chemotherapie⁵. Trotz dieser Eingriffe bleibt GBM aufgrund seiner infiltrativen Natur und seiner inhärenten Resistenz gegen Therapien unheilbar, was einen dringenden Bedarf an neuen Behandlungsansätzen schafft.

Forscher verwenden häufig vom Menschen stammende Tumorzelllinien als Modelle für die Untersuchung der Krebsentstehung und der therapeutischen Mechanismen. Klassische Gliomzelllinien, die in serumhaltigem Medium aufbewahrt und in vitro ausgiebig passaget werden, weisen jedoch im Vergleich zu Patiententumoren signifikante Veränderungen in den phänotypischen Merkmalen und genetischen Profilen auf ^6,7,8. Folglich gelingt es präklinischen Screening-Modellen, die auf diesen Zelllinien basieren, oft nicht, therapeutische Ziele und Moleküle zu identifizieren, die sich effektiv in das klinische Umfeld übertragen lassen. Der Behandlungserfolg des GBM wird durch die Heterogenität und Plastizität des Tumors zusätzlich erschwert⁹. Diese Heterogenität manifestiert sich nicht nur in transkriptomischen Subtypen (z. B. proneural, mesenchymal), sondern auch in den verschiedenen Entwicklungszuständen der konstituierenden Zellen¹⁰. GBM nutzt neurologische Entwicklungsmechanismen und enthält Subpopulationen von Glioblastom-Stammzellen (GSC), die die Tumorproliferation vorantreiben und eine erhöhte Resistenz gegen Strahlen- und Chemotherapie aufweisen ^11,12. Die Kultivierung von patienteneigenen Gliomzellen in serumfreiem neuralem Stammzellmedium bewahrt effektiv das Mutationsspektrum und die Genexpressionsmuster des ursprünglichen Tumors, während teilweise GSC-Eigenschaften erhalten^{bleiben 8}.

Im Vergleich zu Neurosphärenkulturmodellen fördert die Basalmembranmatrix-Extrakt-unterstützte Adhärentkultur ein stabileres und schnelleres Zellwachstum, wodurch sie sich besser für chemisches und genetisches Screening eignet¹³. Mit diesem Ansatz etablierten wir 50 von Patienten stammende GBM-Zelllinien und charakterisierten sie durch Ganzgenomsequenzierung, transkriptomische Sequenzierung und FDA-Wirkstoffbibliotheksscreening, um potenzielle therapeutische Strategien zu erforschen. Diese Ressource bringt die Gliomforschung voran, mit detaillierten Ergebnissen, die in unseren früheren Studien veröffentlicht wurden¹⁴. Hier beschreiben wir die Methodik, die zur Entwicklung von patientenabgeleiteten Gliomzelllinien (PDGCs) verwendet wird.

Protokoll

Dieses Protokoll verwendet von Patienten stammendes Gliomgewebe und Blutproben, die durch Krankenhauskooperationen gewonnen wurden. Alle Probenahmeverfahren und Versuchsprotokolle wurden von der Ethikkommission des Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University, genehmigt (KY 2020-093-02 und KY 2014-021-02). Die Patienten geben vor der Operation eine unterschriebene Einverständniserklärung ab, und alle Identitätsinformationen werden anonymisiert, bevor die Proben an das Labor übergeben werden. Forscher müssen die Genehmigung ihrer institutionellen Ethikkommission einholen und die Zustimmung der Patientinnen und Patienten einholen, bevor sie dieses Protokoll umsetzen.

1. Vorbereitung vor der Probenverarbeitung

1. Sterilisieren Sie Scheren, Pinzetten und andere Instrumente durch Autoklavieren.
2. Bereiten Sie PDGC-Kulturmedium vor, indem Sie 47,5 ml DMEM/F12, 500 μl N2, 1 ml B27, 500 μl 100x Penicillin/Streptomycin, 250 μl 100x Glutaminersatz, 100 μl 2,5 M HEPES, 100 μl 30 % Glukose, 50 μl 50 mM β-Mercaptoethanol, 1,5 ml 1 μg/ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) kombinieren. und 1,5 ml 1 μg/ml basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF).
3. Bereiten Sie 1x Red Blood Cell Lysis Buffer (ACK) vor, indem Sie 8,29 g Ammoniumchlorid, 1 g Kaliumbicarbonat und 37 mg EDTA in Wasser auflösen und dann auf 1 l verdünnen.
4. Legen Sie sterilisierte Instrumente, PBS-Puffer, Abfallbehälter, Zentrifugenröhrchen und andere Verbrauchsmaterialien in eine Biosicherheitswerkbank und führen Sie eine UV-Desinfektion für 30 Minuten durch.
5. Geben Sie flüssigen Stickstoff in einen isolierten Behälter.

2. Entnahme von Patientenproben

HINWEIS: Führen Sie alle Gewebeentnahmeverfahren unter streng sterilen Bedingungen durch, um eine bakterielle Kontamination nachfolgender Zellkulturen zu verhindern. Behalten Sie die aseptische Technik während des gesamten Arbeitsablaufs bei.

1. Sammeln Sie präoperativ Blutproben und entfernen Sie Tumorgewebe aus dem Gehirn des Patienten. Bei großen, stark infiltrativen Tumoren, bei denen es schwierig ist, den Tumor vom umgebenden normalen Gewebe zu unterscheiden, maximieren Sie die peritumorale Geweberesektion unter Beibehaltung kritischer funktioneller Hirnbereiche. Trennen Sie etwa 500 bis 2.000 mm³ des Tumorkerngewebes ab und geben Sie es in 15 ml-Zentrifugenröhrchen mit 10 ml hypothermischem Konservierungsmedium.
2. Verschließen Sie die Probenröhrchen, legen Sie sie in eine Eisbox und transportieren Sie sie schnell zur Verarbeitung ins Labor.
   HINWEIS: Es ist sicherzustellen, dass das Intervall zwischen der Probenentnahme und der Verarbeitung 6 h bei 4 °C nicht überschreitet. Schließen Sie bei der Probenentnahme verbranntes Gewebe und Bereiche mit Tumornekrose sorgfältig aus. Die Oberfläche von Gewebeschnitten wird oft durch das elektrische Messer verbrannt, das während der Operation verwendet wird, was die Lebensfähigkeit der Zellen in Kultur beeinträchtigen kann.

3. Verarbeitung von Blutproben

1. Zentrifugieren Sie die Blutprobenröhrchen bei 1.000 × g für 10 min und entsorgen Sie die obere Plasmaschicht.
2. Übertragen Sie die restlichen weißen Blutkörperchen und die Schicht der roten Blutkörperchen in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 10 ml 1x ACK hinzu und inkubieren Sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die roten Blutkörperchen zu lysieren.
3. Fügen Sie 40 ml PBS hinzu, um die Lyse zu beenden, mischen Sie vorsichtig und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 1.000 × g .
4. Entsorgen Sie den Überstand, fügen Sie 3 ml 1x ACK hinzu und inkubieren Sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur für einen zweiten Lyseschritt der roten Blutkörperchen.
5. Fügen Sie 12 ml PBS hinzu, um die Lyse zu beenden, mischen Sie vorsichtig und zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei 1.000 × g .
6. Entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet der mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) in 1 ml PBS, geben Sie es in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei 510 × g .
7. Entsorgen Sie den Überstand, frieren Sie das PBMC-Pellet in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie es bei -80 °C.

4. Verarbeitung des Tumorgewebes

1. Entfernen Sie die Gewebekonservierungslösung aus dem Probenröhrchen und waschen Sie das Gewebe in PBS, um sichtbare Blutgerinnsel und nekrotisches Gewebe zu entfernen. Führen Sie eine zweite PBS-Wäsche für das restliche Gewebe durch.
2. Den am stärksten intakten Gewebeteil herausschneiden und über Nacht in 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C fixieren.
   HINWEIS: Die Größe des fixierten Gewebes beträgt ca. 10 mm. Überspringen Sie diesen Schritt, wenn die Stichprobe klein ist.
3. 2-4 kleine Gewebestücke schneiden, in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen umfüllen, in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.
   HINWEIS: Die Größe kleiner Gewebestücke liegt in der Regel zwischen 5 und 10 mm, abhängig von der Menge an DNA und RNA, die für die Sequenzierung erforderlich ist.
4. Das restliche Tumorgewebe in ein 1,5 mL Zentrifugenröhrchen geben und mit einer Schere auf Eis zu einer feinen Paste zerkleinern.
5. Geben Sie 1-3 ml Zellablösungslösung hinzu und geben Sie das zerkleinerte Gewebe in das Verdauungsröhrchen. Verdauen Sie das Gewebe mit einem Gewebedissoziator bei 37 °C für 16 Minuten.
6. Fügen Sie 3x Volumen PBS hinzu, um den Verdau zu stoppen, und geben Sie die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen mit einem 70 μm Zellsieb. Reiben Sie das Gewebe vorsichtig mit einem kleinen Stäbchen durch das Sieb, um die Zellentnahme zu maximieren. Bei 510 × g 10 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
7. Fügen Sie 1-3 ml 1x ACK hinzu und inkubieren Sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die roten Blutkörperchen zu lysieren. Fügen Sie 4x Volumen PBS hinzu, um die Lyse zu stoppen, mischen Sie vorsichtig und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 510 × g , um den Überstand zu entfernen.
8. Resuspendieren Sie die Zellen in PDGC-Medium und säen Sie einen Teil der Zellsuspension in Kulturplatten. Legen Sie die Platten in einen hypoxischen Inkubator mit 37 °C. Die restlichen Zellen werden in einem Kulturmedium mit 10 % DMSO eingefroren.
   HINWEIS: In der Regel säen wir bei Gewebeproben mit einer Größe von ca. 10-20 mm etwa 1/3 bis 1/10 der Zellsuspension in eine 6-cm-Schale mit 3 ml Kulturmedium aus, und die restlichen Zellen werden je nach Zellausbeute in 2-4 Fläschchen kryokonserviert.
9. Beschichten Sie die Platten durch Zugabe von Basalmembranmatrix-Extrakt zu eiskaltem PBS im Verhältnis 1:100 und inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur auf einem Schüttelinkubator für 2 h. Verwerfen Sie das PBS, bevor Sie PDGC-Kulturmedium hinzufügen.
   HINWEIS: Führen Sie alle nachfolgenden Zellpassagen und Kultivierungen mit Basalmembranmatrix-Extrakt-beschichteten Platten durch.
10. Übertragen Sie die kultivierten Zellen nach 2 Tagen auf mit Basalmembranmatrix-Extrakt beschichtete Platten, um die Zelladhäsion und das Zellwachstum zu ermöglichen.

5. Zellkultur und Passage

1. Sobald die Zellen an den Kulturplatten haften, entfernen Sie nicht adhärente Zellen und ersetzen oder ergänzen Sie das Kulturmedium alle 2-3 Tage.
   HINWEIS: Die Adhäsionskapazität variiert zwischen den verschiedenen Zellen. Selbst in Gegenwart von Basalmembranmatrix-Extrakt kann ein kleiner Teil der Zellen nicht adhäriert bleiben, wie z. B. BNI7-11, das eine kontinuierliche Suspensionskultur erfordert. Darüber hinaus weisen einige Zellen ein semi-adhärentes Wachstumsmuster auf, wie z. B. BNI20. Daher ist eine sorgfältige Beobachtung des Zellstatus unerlässlich. Bei nicht-adhärenten Zellen ist eine Zunahme der suspendierten Zellen zu beobachten. Erscheinen die Zellaggregate als dunkle, watteartige Strukturen und zeigen sich im Laufe der Zeit nicht signifikant, sind sie in der Regel nicht in der Lage, sich langfristig zu vermehren.
2. Wenn die Zellen die Konfluenz erreichen, fügen Sie Zelldissoziationslösung hinzu, um die Zellen zu lösen. Die Dissoziation mit 3x PBS beenden und bei 250 × g für 3 min zentrifugieren. Durchlaufen Sie die Zellen im Verhältnis 1:2 bis 1:4. Die restlichen Zellen werden in einem Kulturmedium mit 10 % DMSO eingefroren.
3. Setzen Sie die Passage für mindestens 10-20 Generationen fort, um eine stabile Zelllinie zu etablieren.
   1. Dokumentieren Sie die Zellmorphologie mit Bildern während jeder Passage und erfassen Sie die Passagenummern. Beschriften Sie das anfängliche Einfrieren der Zelle deutlich mit detaillierten Informationen (z. B. Durchgangsnummern).
   2. Sobald sich die Zelllinie stabilisiert hat, sammeln Sie 2-3 Röhrchen mit Zellpellets (300.000-1.000.000 Zellen/Röhrchen) und lagern Sie sie bei -80 °C.

6. Nachfolgende Versuchsvorgänge

1. Bei PFA-fixierten Proben werden die Proben nach der Fixierung über Nacht durch eine abgestufte Reihe von Ethanollösungen durch sequentielles Eintauchen in 60 % Ethanol, 70 % Ethanol, 80 % Ethanol, 90 % Ethanol, 95 % Ethanol und zwei Wechsel von 100 % Ethanol jeweils für 40 Minuten dehydriert. Anschließend werden die Proben in zwei Xylolwechseln für jeweils 40 min gereinigt und anschließend mit zwei Wechseln Paraffinlösung für jeweils 40 min infiltriert. Schließlich werden die dehydrierten und infiltrierten Proben in Paraffinblöcke eingebettet, um sie anschließend zu schneiden und zu färben¹⁵.
2. Für PBMC-Pellets, Tumorgewebe oder Tumorzellproben, die bei -80 °C gelagert werden, extrahieren Sie DNA und RNA für verschiedene Omics-Studien, einschließlich Ganzgenomsequenzierung, Exomsequenzierung, Bulk-RNA-Sequenzierung und Einzelzell-RNA-Sequenzierung.
3. Verwenden Sie stabile PDGC-Zelllinien für die Etablierung von Maus-Xenotransplantatmodellen, das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening, die Mechanismusforschung und andere verwandte Experimente.
   1. Um das intrakranielle orthotope Xenotransplantatmodell von PDGCs zu etablieren, dissoziieren und zählen Sie die Zellen, resuspendieren Sie sie dann in einer 1:1-Mischung aus Basalmembranmatrix-Extrakt und eiskaltem PBS auf eine Endkonzentration von 100.000 Zellen/μl. Injizieren Sie 5 μl der Zellsuspension stereotaktisch in das linke Striatum von 6-8 Wochen alten immundefizienten Mäusen mit einer Mikrospritze und einem stereotaktischen Standardinstrument. Stellen Sie die Injektionskoordinaten relativ zum Bregma wie folgt ein: +0,5 mm anterior-posterior (AP), -1,9 mm medial-lateral (ML) und -3,6 mm dorsal-ventral (DV).
   2. Generierung von Luciferase-exprimierenden PDGCs und Etablierung intrakranieller Xenotransplantate für die Biolumineszenz-Bildgebung des Tumorwachstums.
      1. Verpacken Sie das Luciferase-tdTomato-Reportergen in lentivirale Partikel und infizieren Sie dann PDGCs mit dem verpackten Lentivirus, um eine stabile Expression zu etablieren¹⁶.
      2. Nach der Infektion sortieren Sie td-Tomato-positive Zellen durch Durchflusszytometrie, um eine stabile Zellpopulation zu erhalten, die Luciferase exprimiert.
      3. Vor der Bildgebung ist D-Luciferin intraperitoneal in einer Dosis von 10 μl/g Körpergewicht mit einer 15 mg/ml D-Luciferin-Lösung zu injizieren. Betäuben Sie die Mäuse mit Isofluran und warten Sie 10 Minuten nach der D-Luciferin-Injektion. Platzieren Sie die Mäuse in das Biolumineszenz-Bildgebungssystem. Stellen Sie die Belichtungszeit während der Aufnahme auf den Automatikmodus¹⁷.

Ergebnisse

Abbildung 1 bietet einen umfassenden Überblick über den Workflow des Protokolls. Zu den Patientenproben gehören peripheres Blut und Tumorkerngewebe. Die Blutproben werden einer Zentrifugation unterzogen, um Plasma zu entfernen, gefolgt von zwei ACK-Lyserunden, um PBMCs zu erhalten, die als Kontrollen für Sequenzierungsanalysen dienen. Tumorproben werden PBS-gewaschen, um Blutgerinnsel und nekrotische Bereiche zu entfernen, bevor sie in kleine Fragmente verarbeitet werden. Mehrere Gewebefragm...

Diskussion

Die Heterogenität von GBM stellt eine große Herausforderung für die Behandlung dar. Konventionelle GBM-Zelllinien entwickeln oft einen homogenen genetischen Hintergrund und verlieren nach längerer Kultivierung in serumhaltigem Medium die Tumoreigenschaften des Patienten, was ihren translationalen Wert einschränkt. Die Optimierung der GBM-Kulturbedingungen und die Standardisierung der Arbeitsabläufe bei der Verarbeitung von Patientenproben sind unerlässlich, um die begrenzten klinischen R...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
70 μ m Zellsieb	Falcon	352350
Accutase-Zellablösungslösung	BioLegend	423201
Ammoniumchlorid	Aladdin	60-92-4
Anti-Sox2-Antikörper	Merckmillipore	AB5603
Antifade-Eindeckmedium mit DAPI	Beyotime	P0131
Anti-Nestin-Antikörper	NOVUS	NB100-1604
B27 ohne Vitaminpräparat	Gibco	12587010
BD FACSAria Fusion Durchflusszytometer	BD Biosciences	/
Zellkulturschale	NEST	705001
D-Luciferin, Kaliumsalz	Invitrogen	L2916
DMEM/F12	Gibco	C11330500BT
DMSO	Sinopharm	30072418
EDTA	BBI Life Sciences	A600107-0500
Glukose	Sangon Biotech	A50991-0500
GlutaMAX	Gibco	35050-061	Glutaminersatz
Hämatoxylin-Eosin-Färbekit	Solarbio	G1120
HEPES	Beyotime	ST090
Mensch bFGF	Origene	TP750002
humanes EGF	Novoprotein	C029-500μ g
HypoThermosol FRS	Biolife Solutions	101104	hypothermisches Konservierungsmedium
Isofluran	RWD Life Science	R510-22-10
IVIS Lumina XR III	PerkinElmer	/	Biolumineszenz-Bildgebungssystem
Matrigel	Corning	356231	Basalmembran-Matrix-Extrakt
Mikrospritze Hamilton		80300
N2 Supplement	Gibco	17502048
Nunclon Sphera 6-Well-Platte	Thermo Scientific	174932	Platten mit extrem niedrigem Aufsatz
Paraformaldehyd	Sangon Biotech	A500684-0500
PBS-Puffer	Solarbio	P1010-100*2L
Penicillin/Streptomycin	Solarbio	P8420/S8290
Kaliumbicarbonat	Sangon Biotech	A501195-0500
RWD-Gewebedissoziator	RWD Life Science	DSC-410
Stereotaktisches Standardinstrument	RWD Life Science	68801
Röhrchen für die Verarbeitung von Gewebeproben	RWD Life Science	SCT-100
β-Mercaptoethanol	Sigma	M3148-100mL