Methodenartikel

Live-Imaging-Charakterisierung von Zentromerbewegungen während der männlichen meiotischen Prophase in Arabidopsis thaliana

DOI:

10.3791/68569

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24. Oktober 2025

 ,  ,  , 
1Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, Institute Jean-Pierre Bourgin for Plant Sciences (IJPB), 78000, Versailles, France

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Chromosomenbewegung während der meiotischen Prophase ist ein wenig verstandenes Phänomen, das für die Sporenbildung von grundlegender Bedeutung ist. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erfassung, Analyse und Quantifizierung von Zentromerbewegungen während der meiotischen Prophase in männlichen Meiozyten von Arabidopsis thaliana .

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meiose ist eine zelluläre Teilung, die für die sexuelle Fortpflanzung unerlässlich ist. Während der meiotischen Prophase erkennen sich homologe Chromosomen mütterlichen und väterlichen Ursprungs und assoziieren sich, ein Prozess, der durch ihre schnellen Bewegungen im Nukleoplasma erleichtert wird. Meiotische Prophasenbewegungen beruhen auf der Anheftung der Chromosomen an die Kernhülle und auf zytoplasmatischen Kräften, die durch die Kernhülle auf die Chromosomen übertragen werden. In Pflanzen machen die eingeschränkte Zugänglichkeit und Zerbrechlichkeit der männlichen Meiozyten im Inneren der Staubbeutel Live-Bildgebungsansätze und die Analyse der Chromosomenbewegung technisch schwierig. In der Tat sind diese Bewegungen sehr schnell, und ihre Analyse erfordert die Suche nach den optimalen Aufnahmebedingungen. Hier wird eine effiziente Methode zur Erfassung schneller Chromosomenbewegungen während der männlichen meiotischen Prophase in Arabidopsis thaliana in Zeitrafferfilmen beschrieben, indem die Bewegungen von fluoreszenzmarkierten Zentromeren verfolgt werden. Es basiert auf einer weiteren Dissektion und Bildaufnahme mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM), in 3D und über die Zeit. Die Erfassung meiotischer Z-Stacks alle 7 s ermöglicht eine ausreichende Auflösung, um die Trajektorien der markierten Zentromere zu rekonstruieren und zu analysieren. Die extrahierten Daten werden anschließend verarbeitet und ermöglichen die quantitative Analyse dieser Chromosomenbewegungen. Die Entwicklung von Modellen aus diesen Daten ist essentiell für das Verständnis des Mechanismus der schnellen Chromosomenbewegung, einschließlich der Art und Intensität der Kräfte, die diesen Prozess antreiben.

Einleitung

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Die Meiose ist ein grundlegender biologischer Prozess, der die getreue Weitergabe des genetischen Materials von einer Generation zur nächsten gewährleistet. Der Prozess der Meiose gliedert sich in zwei aufeinanderfolgende Runden der Zellteilung, Meiose I und Meiose II. Der Meiose I geht eine lange Prophase voraus, in der sich homologe Chromosomen gegenseitig erkennen und paaren. Während dieser ausgedehnten Prophase finden zahlreiche biologische Prozesse statt. Neben der Paarung homologer Chromosomen durchlaufen diese Chromosomen auch einen Prozess, der als Synapse bezeichnet wird. Bei der Synapse bildet sich ein Proteinkomplex, der als synaptonemaler Komplex bekannt ist und die homologen Chromosomen entlang ihrer Länge verbindet. Der synaptonemale Komplex fördert die homologe Rekombination, gefolgt vom Austausch von genetischem Material zwischen homologen Chromosomen und der Bildung von Crossovers. Diese stellen eine physikalische Verbindung zwischen homologen Chromosomen her, was ihre korrekte Ausrichtung und eine ausgewogene Segregation erleichtert 1,2.

Bei der homologen Chromosomenerkennung spielen schnelle Prophase-Chromosomenbewegungen (RPMs) eine entscheidende Rolle. Studien, die an mehreren Modellspezies durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass sich während der Leptotenbildung Chromosomen an die Kernhülle (NE) anlagern. Sie sind über den NO über den LINC-Proteinkomplex(Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton) 3 mit dem zytoplasmatischen Zytoskelett verbunden. Die im Zytoplasma erzeugten Kräfte werden über den LINC-Komplex auf die Chromosomen übertragen, wodurch die Chromosomenbewegung ermöglicht wird.

Die Untersuchung von RPMs ist essentiell für das Verständnis der grundlegenden Mechanismen der Meiose, insbesondere derjenigen, die an der Erkennung homologer Chromosomen beteiligt sind. Um diese Bewegungen zu untersuchen, sind jedoch spezielle Live-Imaging-Experimente erforderlich. Die meisten Live-Imaging-Studien bei A. thaliana konzentrieren sich auf somatische Gewebe und vegetative Organe. Diese Studien wurden durchgeführt, um festzustellen, wie Zellen Organe hervorbringen4. Solche Studien wurden an Meristemen5und Wurzeln6 durchgeführt. Vor kurzem haben einige Teams Techniken entwickelt, um die Blütenentwicklung, einschließlich der Meiose, in Echtzeit bei A. thaliana über einen Zeitraum von mehreren Tagen zu beobachten 7,8. Diese Protokolle können jedoch auch anspruchsvoll und schwierig für eine große Anzahl von Proben einzurichten sein.

In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll für die Bildgebung und Analyse der Chromosomendynamik während der Meiose bei A. thaliana vorgestellt. Durch den Einsatz der konfokalen Mikroskopie, einer einfachen Technik zur Probenvorbereitung, in Verbindung mit der Fluoreszenzmarkierung von Chromosomen wurde die Chromosomenbewegung mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung über kurze Zeiträume erfasst. Das Protokoll beschreibt die Vorbereitung von Pflanzengewebe für die Bildgebung, die Optimierung der Bildgebungsparameter zur Minimierung der Phototoxizität und zur Maximierung der Bildqualität sowie die Bildverarbeitung und Datenanalyse. Diese Methode ermöglicht eine präzise Quantifizierung der Zentromerdynamik während der Meiose, die für das Verständnis des Chromosomenverhaltens, das der erfolgreichen Gametenbildung zugrunde liegt, entscheidend ist. Dieses Wissen hat direkte Auswirkungen auf die Landwirtschaft, insbesondere auf die Verbesserung von Pflanzenzüchtungsprogrammen, indem es die Untersuchung von Chromosomenpaarungs- und Rekombinationsprozessen erleichtert, die sich auf die Fruchtbarkeit und genetische Vielfalt auswirken.

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Protokoll

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In diesem Protokoll werden transgene A. thaliana-Pflanzen verwendet, die die Transgene GFP-CENH3 und NUP54-RFP exprimieren 9,10. Der CENH3-Marker ermöglicht es, die Bewegung der Zentromere zu verfolgen. Der NUP54-Marker markiert die Kernporen und hilft so, den Kern zu unterscheiden. Es können auch andere Marker verwendet werden, die jedoch gegen Photobleiche beständig sein müssen, da die Probe kontinuierlich beleuchtet wird. Um sicherzustellen, dass der Marker keinem Photobleaching unterzogen wird, führen Sie das Experiment unter denselben Laserbedingungen und Erfassungsparametern durch und überprüfen Sie, ob das Signal über die Dauer der Bildaufnahme stabil bleibt. Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Pflanzenwachstum und -kultur

  1. Säen Sie die Samen direkt in Töpfe im Gewächshaus.
  2. Stellen Sie die Töpfe unter folgenden Bedingungen in ein Gewächshaus: 16 h Tag/8 h Nacht, 20 °C, 70% Luftfeuchtigkeit.
  3. Lassen Sie die Pflanzen etwa 4 Wochen lang im Gewächshaus wachsen. Die Pflanzen müssen ein Stadium erreichen, in dem sie 5/6 Blütenstiele haben (siehe Abbildung 1A).

2. Präparieren von Staubbeuteln und Vorbereitung des Objektträgers

  1. Bereiten Sie einen Objektträger vor, platzieren Sie einen Abstandshalter (doppelseitiger Kleber mit einer Perforation von 9 mm Durchmesser, 0,12 mm tief) in der Mitte und achten Sie darauf, die Schutzfolien auf jeder Seite zu entfernen. Dieser Abstandshalter hält die Probe und schafft Platz zwischen Objektträger und Deckglas.
  2. Geben Sie 8 μl Leitungswasser in die Mitte des Abstandshalters.
  3. Entnehmen Sie mit einer Pinzette einen Blütenstand von einem der Hauptstängel (siehe Abbildung 1B) (verwenden Sie keine kleinen Blütenstände von den austretenden Stängeln).
  4. Legen Sie den Blütenstand auf einen neuen Objektträger unter ein Stereomikroskop, das mit einem Lineal ausgestattet ist. Wählen Sie Blütenknospen mit einer Länge von etwa 0,5 mm aus (Abbildung 1C).
  5. Öffnen Sie die Knospen vorsichtig mit scharfen Nadeln und ziehen Sie die Kelchblätter und Blütenblätter auseinander, um nur die Staubbeutel zu behalten. Achten Sie darauf, die Staubbeutel nicht zu beschädigen oder trocknen zu lassen.
  6. Übertragen Sie die Antherenbüschel vorsichtig in das Wasser in den Abstandsraum. Um Austrocknung zu vermeiden, tun Sie dies sofort nach dem Entfernen der Kelchblätter und Blütenblätter.
  7. Legen Sie mehrere andere Bündel in den Abstandshohlraum.
  8. Decken Sie die Folie mit einem Deckglas ab, um Luftblasen zu vermeiden. Geben Sie dazu 8 μl Wasser auf ein Deckglas und drehen Sie das Deckglas vorsichtig mit dem Wassertropfen auf dem Abstandshalter um. Stellen Sie sicher, dass die anderen Bündel in insgesamt 16 μl Wasser getaucht sind und das Deckglas gut mit dem Abstandshalter verklebt ist (siehe Abbildung 1D; Abbildung 2).

3. Konfokalmikroskopische Zeitrafferbetrachtung – Aufbau der Bildgebung

HINWEIS: Die Art und Weise, wie die Bildgebungsparameter eingestellt werden, hängt vom verwendeten konfokalen System ab. Weitere Informationen zu den Bildgebungsparametern finden Sie im Abschnitt Diskussion . Die Bilder wurden mit CLSM und einer 20-fachen Wasserimmersionslinse aufgenommen. Die Verwendung eines Wasserimmersionsobjektivs bietet eine bessere Anpassung des Brechungsindex, da die biologische Probe in Wasser gelagert wird.

  1. Richten Sie das Mikroskop ein, indem Sie GFP bei 488 nm anregen und mit einem Hybriddetektor zwischen 494 nm und 547 nm detektieren.
    HINWEIS: Die Offset-Verstärkung des Hybriddetektors wurde auf 100 eingestellt. RFP wird bei 561 nm angeregt und mit einem Hybriddetektor zwischen 584 und 629 nm detektiert. Die Offset-Verstärkung des Hybriddetektors wurde auf 130 eingestellt. Die Scangeschwindigkeit beträgt 400 Hz und der Scan ist bidirektional. Es wird ein Liniendurchschnitt von 2 angewendet. Die beiden Kanäle wurden gleichzeitig erfasst, um die Erfassungszeit zu minimieren. Die Laserleistung wurde auf 15 % für den 488-nm-Laser und 30 % für den 561-nm-Laser eingestellt.
  2. Lokalisieren Sie die Antheren mit Hilfe von Hellfeldbeleuchtung.
  3. Bestimmen Sie mit Hilfe des Hellfeldkanals das meiotische Stadium anhand der Form der Zellen.
    HINWEIS: Zygoten- oder Pachytenstadien sind erforderlich, um die Drehzahl zu beobachten. Die Variation des Fokus entlang der Z-Achse ermöglicht die Abschätzung der 3D-Form der Zelle. Im Leptotenstadium weisen die Meiozyten eine deutlich quadratische Form auf, und der Nukleolus befindet sich in der Mitte des Zellkerns, wodurch sie leicht zu identifizieren sind. Während des Zygoten- und Pachytenstadiums beginnen die Meiozyten, eine trapezförmige Form anzunehmen, und der Nukleolus wandert in Richtung der Kernhülle. Im Diplotenstadium weisen Meiozyten eine vollständig abgerundete Morphologieauf 10.
  4. Visualisieren Sie die Antheren in der Software. Das RFP-Signal ist auch ein guter Indikator für das meiotische Stadium der Zellen.
    HINWEIS: Meiozyten im Zygoten/Pachyten-Stadium weisen eine NUP54-Markierung in einer Sichelform auf, was einer Anhäufung von Kernporen in einem begrenzten Bereich des NE in diesen Stadien entspricht (Abbildung 3A). Drehen Sie die Anthere, falls erforderlich, so, dass sie horizontal positioniert ist (siehe Abbildung 3).
  5. Definieren Sie eine Bildgröße von 400 px x 150 px mit einem Digitalzoom von 4, wobei die Antheren im Bild zentriert wird.
  6. Definieren Sie die Dicke der abzubildenden Probe, um so viele intakte Meiozyten wie möglich zu erhalten. Es ist jedoch wichtig, die Anzahl der Z-Slices zu begrenzen, um die Erfassungszeit zu minimieren. Für eine Dicke von 15 μm werden 16 Z-Scheiben hergestellt. Es wurden Z-Stacks mit einer Schrittweite von 1,04 μm erfasst.
  7. Um kontinuierliche Erfassungen durchzuführen, setzen Sie das Zeitintervall im Zeitabschnitt auf Null. Mit dem Mikroskop und den oben beschriebenen Parametern beträgt die Erfassungszeit für 16 Schichten ca. 6–8 s. Die Mindestaufnahmedauer beträgt 2 Minuten, kann aber bis zu 20 Minuten betragen.
  8. Starten Sie die Akquise.

4. Bildanalyse – Verfolgung der Zentromer-Bewegung

HINWEIS: Für die Rekonstruktion der Zentromerbewegungen ist eine Bildanalysesoftware erforderlich, die in der Lage ist, 3D-Bewegungen zu verfolgen. Die Software ordnet einem Fluoreszenzsignal zu jedem Erfassungszeitpunkt ein Objekt zu, basierend auf den definierten Parametern. Anschließend analysiert das Tracking-Tool automatisch sich bewegende Objekte und erstellt ein Abstammungsdiagramm.

  1. Bild-Vorverarbeitung
    1. Um die Analyse von Bewegungen zu erleichtern, führen Sie eine Bildverarbeitung nach der Aufnahme durch. So kann beispielsweise ein adaptives Informationsextraktionsverfahren (Dekonvolutionsalgorithmus) verwendet werden, um feine Strukturen und Details freizulegen und die Bildqualität zu verbessern.
  2. Globale Zentromer-Verfolgung
    1. Alle Zentromere des Bildes verfolgen: Verwenden Sie ein Spot-Modul, um Spots automatisch (im Zeitverlauf) zu verfolgen.
    2. Wählen Sie den Quellkanal aus, in diesem Fall grün. Geben Sie den XY-Durchmesser (1 μm) für das GFP-CENH3-markierte Zentromer an. Die Objekterkennung identifiziert alle Objekte im Bild (Abbildung 3B).
    3. Ändern Sie die Qualität der Erkennung basierend auf der Signalintensität mithilfe des Diagramms am unteren Rand des Steuerungsfensters.
    4. Verwenden Sie einen autoregressiven Bewegungsverfolgungsalgorithmus, um die Trajektorien zu verfolgen (Abbildung 3C). Die Visualisierung aller Trajektorien macht es einfach, Meiozyten aus somatischem Gewebe zu identifizieren (Video 1).
  3. Verfolgung von Zentromeren in einem einzigen Meiozyten
    HINWEIS: Überprüfen Sie mit einer 3D-Visualisierungssoftware die Kerne und die Trajektorien und analysieren Sie nur Kerne, die intakt sind und zu keinem Zeitpunkt während der Erfassung beschnitten wurden. Die Analyse eines getrimmten Meiozyten führt zu fehlerhaften Daten.
    1. Automatische Zentromer-Verfolgung
      HINWEIS: Bei der Analyse eines einzelnen Kerns wird der Prozess von Anfang an neu gestartet.
      1. Verwenden Sie das Spot-Modul, um Spots (über die Zeit) auf dem ausgewählten Kern zu verfolgen, indem Sie mit der Option Nur einen Bereich of Interest segmentieren und Spots (über die Zeit) verfolgen, einen entsprechenden Region of Interest (ROI) definieren.
      2. Wählen Sie einen ROI aus, der den Nukleus in allen drei Dimensionen und im Zeitverlauf ordnungsgemäß einbezieht. (Abbildung 4A).
      3. Für die Zentromererkennung (Abbildung 4B) und die Nachführung (Abbildung 4C) werden die gleichen Parameter wie für die gesamte Antheren verwendet.
      4. In einem Liniendiagramm (Abbildung 4F) sind alle Trajektorien dargestellt. Die Trajektorien außerhalb des analysierten Meiozyten können entfernt werden (Abbildung 4C). Wählen Sie die Spuren aus und löschen Sie sie mit der Entf-Taste auf der Tastatur. Diese lassen sich mit dem 3D-Viewer der Software leicht identifizieren.
    2. Manuelle Korrektur der Zentromerverfolgung
      HINWEIS: In den meisten Fällen müssen die Trajektorien manuell korrigiert werden, da die Tracking-Software nicht zwischen Zentroeren unterscheiden kann, die zu nahe beieinander liegen.
      1. Verwenden Sie den Bearbeitungsmodus, um ein Objekt zu löschen oder hinzuzufügen. Stellen Sie sicher, dass das Objekt in der richtigen Ebene hinzugefügt wird.
      2. Verbinden Sie die neuen Objekte manuell im Modus "Spuren bearbeiten" mithilfe des Liniendiagramms, nachdem Sie die Zelle sorgfältig und gründlich in 3D analysiert haben. Abbildung 4E,G zeigt die korrigierten Trajektorien auf dem Bild der Meiozyten bzw. auf dem linearen Diagramm. Video 2 zeigt die Trajektorien eines Meiozyten nach der Korrektur.
      3. Exportieren von Daten
        1. Exportieren Sie die Tracking-Daten in ein Tabellenkalkulationsprogrammformat, um die weitere Datenverarbeitung und -analyse zu erleichtern. Diese Dateien enthalten Messtabellen, die sich aus dem mit der Software durchgeführten Tracking ergeben.
        2. Stellen Sie sicher, dass die exportierte Tabellenkalkulationsdatei die folgenden Variablen enthält: Zeit, die den Zeitpunkt jeder Messung aufzeichnet; Track-ID, die jede Spur eindeutig identifiziert; Verschiebungsdelta X, Y, Z, das die Positionsänderung in drei Dimensionen zu jedem Zeitpunkt darstellt; und Position X, Y, Z, das die absolute Position jedes Objekts im Raum speichert.

5. Datenanalyse

HINWEIS: In diesem Teil wird der Arbeitsablauf für die Datenanalyse mit R11-Skripten beschrieben, die in RStudio12 ausgeführt werden. Sie können aus dem Data INRAE-Repository unter der folgenden Adresse abgerufen werden: 10.57745/V1NNFI. Alle Zahlen werden mit ggplot213 generiert, um die berechneten Metriken zu visualisieren. Die Skripte führen nacheinander die folgenden Schritte aus: Die meiomove-sub-config. Das R-Skript wird zuerst ausgeführt, um die R-Umgebung zu initialisieren, die erforderlichen Bibliotheken zu laden und globale Variablen zu definieren. Der Link zum Skript lautet: https://doi.org/10.57745/V1NNFI

  1. Lesen und Auswählen von Daten
    HINWEIS: Das zu verwendende Skript wird wie folgt gespeichert: meiomove-sub-loader.R.
    1. Sammeln Sie alle einzelnen Excel-Dateien mit Tracking-Daten, und führen Sie sie in einer einzigen konsolidierten Datei zusammen.
    2. Speichern Sie die zusammengeführte Datei im TSV-Format (tabulatorgetrennte Werte), um die Kompatibilität mit weiteren Datenverarbeitungsschritten sicherzustellen.
    3. Berechnen Sie die x-, y- und z-Positionen, indem Sie die Verschiebungswerte über die Zeit akkumulieren, um sicherzustellen, dass die räumliche Trajektorie jedes verfolgten Objekts genau rekonstruiert wird. Dies geschah, um einen Fehler in der Software zu kompensieren, der falsche XYZ-Positionen exportierte.
  2. Datenbereinigung
    HINWEIS: Das zu verwendende Skript wird wie folgt gespeichert: meiomove-sub-clean.R.
    1. Entfernen Sie kurze Spuren, die als Spuren mit einer Mindestdauer von 50 s definiert sind. Diese Tracks enthalten nicht genügend Datenpunkte für eine aussagekräftige Analyse, da sie zu Rauschen oder Ungenauigkeiten führen können.
    2. Identifizieren und löschen Sie Spuren, bei denen die Position (X, Y, Z) über die Zeit konstant bleibt, da diese entweder auf Artefakte oder statische Strukturen hinweisen, die für die Analyse nicht relevant sind.
    3. Filtern Sie fehlende Verschiebungswerte (NA-Einträge) heraus, um die Datenintegrität zu gewährleisten und Rechenfehler in späteren Schritten zu vermeiden.
    4. Erkennen und löschen Sie Spuren, bei denen sich die von der Bildanalysesoftware erhaltenen Verschiebungswerte erheblich von den neu berechneten unterscheiden, um Konsistenz und Zuverlässigkeit bei der Verfolgung von Daten zu gewährleisten.
  3. Korrektur der meiotischen Zelldrift
    HINWEIS: Das zu verwendende Skript wird auch als meiomove-sub-clean.R gespeichert.
    1. Berücksichtigen Sie eine mögliche Drift während der Erfassung, indem zwischen meiotischen und somatischen Zentromeren unterschieden wird. Dieser Schritt stellt sicher, dass die beobachteten Bewegungen biologischen Prozessen und nicht experimentellen Artefakten entsprechen.
    2. Wenden Sie die Driftkorrektur an, indem Sie die Positionen der meiotischen Zellen relativ zu den somatischen Zellen anpassen, die als stabile Referenz dienen.
  4. Erzeugung von Ausgaben
    HINWEIS: Das zu verwendende Skript wird wie folgt gespeichert: meiomove-sub-metrics.R.
    1. Berechnen Sie die momentane Geschwindigkeit in jedem Zeitschritt, um Schwankungen der Bewegungsgeschwindigkeit im Laufe der Zeit zu verfolgen.
    2. Berechnen Sie den Drehwinkel, der die Änderung der Bewegungsrichtung zwischen aufeinanderfolgenden Zeitschritten darstellt und Einblicke in Bahnmuster bietet. Das Ergebnis wird wie folgt gespeichert: results/dataframes/metrics-by-step.tsv (Ausgabe 1).
    3. Berechnen Sie das Reichweitenverhältnis mit celltrackR14, das quantifiziert, wie weit sich ein verfolgtes Objekt relativ zu seiner Startposition bewegt, was einen Hinweis auf das explorative Verhalten gibt. Das Ergebnis wird wie folgt gespeichert: results/dataframes/metrics-celltrackr.tsv (Ausgabe 2).
    4. Berechnen Sie die durchschnittliche Geschwindigkeit für jede einzelne Spur, um die Bewegungseigenschaften über den gesamten Betrachtungszeitraum zusammenzufassen. Berechnen Sie den durchschnittlichen Drehwinkel pro Spur, um die allgemeine Bewegungsrichtung und Verhaltensmuster zu analysieren. Das Ergebnis wird wie folgt gespeichert: results/dataframes/metrics-by-id.tsv (Ausgabe 3).
    5. Bestimmen Sie die Schwerpunktposition in jedem Zeitschritt für jede Zellenspur. Der Schwerpunkt ist der Durchschnitt der Zentromerpositionen in einem gegebenen Meiozyten.
    6. Berechnen Sie die Schwerpunktgröße in jedem Zeitschritt, die ein Maß für die räumliche Streuung der Zentromere um ihre durchschnittliche Position liefert. Variationen der Schwerpunktgröße im Laufe der Zeit geben Aufschluss über die globale Konsistenz zwischen den Zentromerspuren. Das Ergebnis wird wie folgt gespeichert: results/dataframes/metrics-by-cell.tsv (Ausgabe 4).
    7. Berechnen Sie die Geschwindigkeitskreuzkorrelation, um die Beziehungen zwischen der Bewegungsdynamik verschiedener verfolgter Objekte zu analysieren und potenziell koordinierte Verhaltensweisen aufzudecken. Das Ergebnis wird wie folgt gespeichert: results/dataframes/metrics-correlations.tsv (Ausgabe 5).
    8. Berechnen Sie die mittlere quadratische Verschiebung (MSD) für jede Spur, eine wichtige Metrik, die die durchschnittliche quadrierte Strecke quantifiziert, die von Zentroeren über bestimmte Zeitintervalle (Zeitverzögerungen) zurückgelegt wird, um den Bewegungstyp zu charakterisieren.
      HINWEIS: Durch die Untersuchung, wie sich die MSD mit zunehmender Zeitverzögerung entwickelt, kann man ableiten, ob die Bewegung überwiegend diffusiv oder begrenzt ist, und so einen Einblick in das zugrunde liegende dynamische Verhalten geben. Das Ergebnis wird wie folgt gespeichert: results/dataframes/metrics-msd.tsv (Ausgabe 6).

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es wurde ein schnelles Protokoll entwickelt, um die Chromosomenbewegungen während der Prophase der Meiose in Arabidopsis thaliana sichtbar zu machen, was mehrere Zeitrafferaufnahmen und damit die Analyse eines großen Datensatzes ermöglicht. Meiozyten, die einen GFP-Marker exprimieren, der die Visualisierung von Zentromeren ermöglicht, und einen RFP-Marker, der die Visualisierung des Zellkerns ermöglicht, werden für eine Dauer von 4 Minuten nach d...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das derzeitige Protokoll ermöglicht die in vivo Bildgebung und Analyse der Zentromerbewegung während der meiotischen Prophase in Arabidopsis thaliana. Dieses Protokoll kann entweder mit einem aufrechten oder einem inversen konfokalen Mikroskop implementiert werden, so dass es für die meisten Labore zugänglich ist, die mit konfokaler Technologie ausgestattet sind. Obwohl sich konfokale Systeme in Abtastgeschwindigkeit, Empfindlichkeit, Detektoren und der Fähigkeit, Welle...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von den technologischen Plattformen PO-Plants und PO-Cyto des Instituts Jean-Pierre Bourgin unterstützt. Diese Forschung wurde von der ANR (MeioMove ANR-21CE12-0042 : M.G., P.A., L.C., S.L. und DYSCORD ANR-23-CE20-0036-02, M.G., L.C.) finanziert. Das Institut Jean-Pierre Bourgin profitiert von der Unterstützung von Saclay Plant Sciences (ANR-17-EUR0007).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BrutgebietTREF (Jiffy)101820/02227861
KonfokalmikroskopLeicaTCS SP8 AOBS (Akusto-optischer Strahlspalter)
Konfokal-SoftwareLeicaLAS X 3.5.0.18371 Software
DeckzettelPaul Marienfeld GmbH10705222x22 Nr. 1,5H
PinzetteIdeal-Tek4.SA.0Hochpräzise Pinzetten
GFP:CENH3Ravi et al. 2010Hier verwendete Arabidopsis thaliana-Samen
ggplot2  ggplot2: Elegante Grafiken für Datenanalyse  Reference13https://ggplot2.tidyverse.org
Griff für NadelnHammacherGriff für Schlaufe, Länge 170 mm
ImarisOxford-InstrumenteImaris 9.7.2Bildanalyse – "Spot"-Modul
LinseLeicaHC PL APO CS2 20×/0.75 IMM
BlitzLeicaAdaptive DekonvolutionAutomatisierte intelligente Informationsextraktion aus konfokalen Daten
LichterVEGELEDApollo LL252-Gen2
NadelnWatkins& DoncasterE3-Pins 0,0124" (0,31 mm) x 25 mm
NUP54:RFPCromer et al. 2024Hier verwendete Arabidopsis thaliana-Samen
TöpfeTEKU (POPPELMANN)VDF 7x7x6,5 cm
RRCore-TeamR: Eine Sprache und Umgebung für statistical    Informatik. R Foundation for Statistical Computing, Wien, Österreich.  Reference11https://www.R-project.org/  
RstudioPosit-Team  RStudio: Integrierte Entwicklungsumgebung für R. Posit Software, PBC, Boston, MA. Reference12http://www.posit.co/
FolienSTRICKGLAS10000326x76x1,0mm
AbstandshalterThermofischerSecure-Seal-Abstandshalter, 8 Brunnen, 9 mm Durchmesser, 0,12 mm tiefSchneiden Sie jeden Abstandshalter einzeln
StereomikroskopeNikonSMZ800

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Schlagwörter

ChromosomenbewegungKonfokalmikroskopieAntherendissektionFluoreszenzmarkierungZeitraffer ImagingChromosomentrajektorien

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