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Analyse der 13-C-Anreicherung von Vitamin A in biologischen Proben mittels Gaschromatographie-Verbrennungs-Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie

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DOI:

10.3791/68571

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14. November 2025

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1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird die Analyse von Serum-, Muttermilch- und Leberproben auf eine 13-C-Anreicherung von Retinol und Retinylestern für Traceranwendungen beschrieben. Zur Aufreinigung und Quantifizierung der Retinolkonzentrationen wird die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie eingesetzt, zur Analyse der gereinigten Extrakte wird die Gaschromatographie-Verbrennungsisotopenverhältnis-Massenspektrometrie (GC-C-IRMS) eingesetzt.

Zusammenfassung

Vitamin A ist entscheidend für die Gesundheit, aber die Beurteilung des Vitamin-A-Status ist eine Herausforderung. Vitamin A, das im Blut zirkuliert, wird homöostatisch kontrolliert und spiegelt oft keinen Vitamin-A-Mangel oder -Überschuss wider. Die Verwendung von 13C-Vitamin A ermöglicht die Verfolgung und Quantifizierung der gesamten Vitamin-A-Speicher des Körpers sowie zusätzliche Informationen zur Pharmakokinetik und zum Stoffwechsel. Dieses Protokoll beschreibt die Extraktion, Reinigung und Bestimmung der 13-C-Isotopenanreicherung von Vitamin A in Serum-, Muttermilch- und Gewebeproben mittels Gaschromatographie-Verbrennungs-Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (GC-C-IRMS). Die Analyse mit GC-C-IRMS liefert empfindliche und präzise Anreicherungswerte, insbesondere für Proben mit 13C-Anreicherungen nahe dem natürlichen Häufigkeitsniveau. Dies ermöglicht Flexibilität bei der Studienplanung, um kleinere Tracerdosen und längerfristige pharmakokinetische Probenahmen zu verwenden. Kurz gesagt, zu 0,4 bis 1 ml Serum wird Ethanol zugesetzt, um Proteine zu fällen, C-23 β-Apo-Carotinol wird als interner Standard hinzugefügt und Hexan wird zur Extraktion von Retinoiden verwendet. Der Extrakt wird anschließend in Methanol resuspendiert und mittels HPLC gereinigt. Die Retinolfraktion wird dann in Hexan resuspendiert und in das GC-C-IRMS-System injiziert. Atom % (At%) wird direkt in Bezug auf Kohlendioxid berechnet, das mit Hilfe eines Elementaranalysators gegen ein Saccharosenormal kalibriert wird. Andere Gewebetypen, die mit GC-C-IRMS analysiert wurden, sind Muttermilch und Leber nach der Verseifung. Festphasenextraktionstechniken können verwendet werden, um die Reinigung dieser oder anderer komplexer Matrices zu unterstützen. Darüber hinaus kann ein Elementaranalysator an das IRMS angeschlossen werden, um Lebensmittelproben auf einen Gesamtgehalt von 13 °C zu analysieren.

Einleitung

Vitamin A (VA) ist ein essentieller Mikronährstoff, der für das Sehvermögen, die Immunfunktion, die zelluläre Differenzierung und die Stoffwechselregulation benötigt wird. Die Optimierung des VA-Status bleibt eine globale Herausforderung für die Gesundheit, da ein Mangel oder Überschuss die Gesundheitsergebnisse beeinträchtigen kann. Eine genaue Beurteilung des VA-Status ist entscheidend für klinische oder Populationsstudien, die geeignete Interventionen leiten. Die Retinolkonzentration im Serum allein ist jedoch ein schlechter Biomarker und ein schlechtes diagnostisches Instrument, da sie über ein breites Spektrum von Gesamtkörperspeichern (TBSs) homöostatisch reguliert wird und von Entzündungen und anderen Nährstoffmängeln beeinflusst wird 1,2.

Isotopenmarkierte Tracer haben die VA-Forschung dramatisch verändert, indem sie die quantitative Bewertung von TBS mit dem Retinol-Isotopenverdünnungstest (RID) ermöglichen 3,4,5. Bei der RID wird ein VA-Tracer verabreicht, der entweder mit 13C oder 2H angereichert ist, der sich mit den Körperspeichern ausgleicht, und das Retinol-Tracer-zu-Tracee-Verhältnis (TTR) im Serum (oder Plasma) wird mittels MS gemessen. Zur Berechnung der TBSwird eine Isotopenverdünnungsgleichung mit spezifischen Annahmen in Bezug auf den VA-Metabolismus angewendet.

Zur Bestimmung des Serum-Retinol-TTR können zahlreiche chromatographische und MS-Kombinationen verwendet werden (z.B. GC-MS, LC-MS, LC-MS/MS). Die analytische Präzision ist für genaue RID-Schätzungen von entscheidender Bedeutung, da TBS umgekehrt proportional zur TTR sind. LC-MS/MS eignet sich gut für Anwendungen mit hohem Durchsatz, wenn stark markierte Tracer und relativ hohe Tracerdosen verwendet werden. Typische LC-MS/MS-Methoden berichten über relative Standardabweichungen (RSDs) von 3-6 % für den Intra-Assay und <8 % für den Inter-Assay7, aber es gibt nur begrenzte Daten über die Genauigkeit und Präzision der TTRs. Im Gegensatz dazu bietet die Gaschromatographie-Verbrennungs-Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (GCCIRMS) eine außergewöhnliche Präzision für die 13-C-Retinol-Anreicherung mit typischen 13C/12C-Isotopenhäufigkeiten RSDs von ~0,02-0,05 8,9. Dies ermöglicht eine präzise Bestimmung der Tracer-Konzentrationen in Proben mit geringen Anreicherungen. Die Verwendung von IRMS für RID-Anwendungen ermöglicht ein adäquates analytisches Signal mit weniger Tracermasse und weniger markierten Atomen im Tracer, was beides die mit den Tracerdosen verbundenen Kosten spart.

Dieses Manuskript beschreibt eine Analyse auf 13C-Retinol aus Blut, Muttermilch und Gewebe mittels GC-C-IRMS. Abhängig von der zu testenden biologischen Probe beginnt die Analyse von 13C-markiertem Retinol mit GC-C-IRMS mit einer von mehreren möglichen Extraktionsmethoden, um die unpolaren Verbindungen zu isolieren, zu denen auch das markierte Retinol gehört. Bei Serumproben handelt es sich dabei um eine Flüssig-Flüssig-Extraktion durch Zugabe von Ethanol und Hexan und Auffangen der Hexanfraktion. Bei der Untersuchung von Muttermilch werden die Proben zunächst mit Kaliumhydroxid verseift, gefolgt von einer ähnlichen Flüssig-Flüssig-Extraktion wie im Serum. Diese Muttermilchproben werden ebenfalls mit Festphasen-Extraktionskartuschen gereinigt, um die Menge der verbleibenden Lipide zu reduzieren. Bei der Extraktion aus einem Gewebe (z. B. Leber) wird die Probe mit wasserfreiem Natriumsulfat gemahlen, um Wasser zu entfernen, mit Methylenchlorid extrahiert und zur Rotationsverdampfung in einen Messkolben oder einen Rundkolben filtriert. Ein Aliquot wird getrocknet, in Ethanol resuspendiert, verseift und mit der gleichen Methode wie Muttermilch extrahiert. Diese unpolaren Lösungen aus jeder Probe werden unter Stickstoff getrocknet und in Methanol rekonstituiert, um sie auf der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) zu reinigen und zu quantifizieren.

Die Empfindlichkeit von IRMS ermöglicht die Bestimmung der Anreicherung in Proben mit geringer Probenanreicherung, wie z. B. pharmakokinetische Proben für langfristige mathematische Modellierungsanwendungen oder extrahepatische Gewebeproben für die präzise Verfolgung des VA-Metabolismus. Es wurde vorgeschlagen, gepaarte RID-Tests in Einzeldosen durchzuführen, um den VA-Status vor und nach der Intervention zu bewerten, um die Wirksamkeit bei theoretischen Probandenzu bestimmen 10, was ein vielversprechender Ansatz sein könnte, wenn er am Menschen validiert wird. IRMS ist in der Lage, VA-Tracer in der Nähe von natürlichen Anreicherungswerten zu detektieren, was lange Nachverfolgungsfenster und Flexibilität bei den Probenahmeprotokollen ermöglichen würde.

Es hat sich gezeigt, dass Muttermilch ein weniger invasiver alternativer Probenahmeansatz für die Beurteilung des VA-Statusist 1. Muttermilch-Retinol kann als Probenahmequelle für den RID-Test verwendet werden und hat bei Frauen in Sambia mit niedrigen VA-Speichern eine starke Korrelation mit serumabgeleiteten RID-Werten gezeigt11. Bei Gewebe- und Muttermilchproben können Festphasenextraktionstechniken bei der Aufreinigung dieser Proben in komplexen Matrices helfen. IRMS wurde auch verwendet, um Nahrungsquellen von VA zu unterscheiden und den relativen Beitrag der Nahrung anhand von Veränderungen in der natürlichen 13C-Häufigkeitvon Serumretinol 9,12,13 zu bestimmen. Ein Elementaranalysator kann auch mit IRMS verwendet werden, um Lebensmittelproben auf ihren Gesamtgehalt von 13 °C zu analysieren und mit der VA-Anreicherung zu vergleichen.

Bei der Verwendung von 13-C-Markierungenist es wichtig, die Ausgangsanreicherung von 13C Retinol aufgrund des natürlich vorkommenden 13C (~1,1 % des Gesamtkohlenstoffs) zu verstehen, die je nach den Quellen der VA, die sowohl von Einzelpersonen als auch von Populationen konsumiert werden, variieren kann. Für die beste Genauigkeit auf individueller Ebene wird daher eine Blutprobe zu Beginn empfohlen. Für Populationsauswertungen kann eine populationsbasierte Schätzung unter Verwendung einer zufällig ausgewählten Untergruppe oder separater Individuen aus derselben Populationsgruppe erstellt werden14.

Protokoll

1. Extraktion von Retinol aus biologischen Proben

HINWEIS: Alle Verfahren zur Probenhandhabung und -extraktion werden unter gelbem oder UV-gefiltertem Licht durchgeführt, um die Degradation zu minimieren.

  1. Extraktion aus Serum
    1. Pipettieren Sie 1 ml Serum (oder so viel wie verfügbar) in ein 13 x 100 mm (oder ähnlich großes) Glasreagenzglas. Notieren Sie das verwendete Serumvolumen.
      HINWEIS: Die Verwendung einer Verdrängerpipette wird empfohlen.
    2. Fügen Sie das 1,5-fache Volumen von 200 Proof Ethanol hinzu.
    3. Fügen Sie 25 μl des internen Standards hinzu, z. B. C-23 β-Apo-Carotinol (synthetisiert aus all-trans-Retinal, abs = 0,9)9. Verschließen Sie die Probe und mischen Sie sie 15 s lang mit einem Wirbel.
    4. 1 ml Hexan hinzufügen, 15 s lang durch Wirbeln mischen und 2 min (~1.300 × g) bei Raumtemperatur zentrifugieren.
    5. Pipettieren Sie mit einer Pasteur-Pipette die oberste Hexanschicht vorsichtig in ein neues Reagenzglas aus Glas (12 x 75 mm oder 13 x 100 mm).
    6. Die Schritte 1.1.4 und 1.1.5 2x wiederholen, wobei die drei Hexanextrakte im zweiten Röhrchen zusammengefasst werden. Legen Sie den gepoolten Hexanextrakt unter einen sanften Stickstoffstrahl, bis er trocken ist.
    7. Geben Sie 100 μl Methanol in die getrocknete Probe und verschließen Sie sie sofort. Schwenken Sie die Lösung an den Seiten des Röhrchens auf und ab und mischen Sie die Probe dann 15 s lang durch Wirbel.
    8. Legen Sie die Proben für mindestens 5 Minuten in einen -80 °C-Gefrierschrank.
      HINWEIS: Die Proben können in diesem Schritt bis zum nächsten Tag bei -80 °C gelagert werden.
  2. Entnahme von Muttermilchproben
    1. Tauen Sie die Milchproben vollständig auf und invertieren Sie sie mehrmals vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Proben gleichmäßig sind. Messen Sie in ein 10-ml-Zentrifugenröhrchen aus Glas mit Schraubverschluss ein aliquotes Milch von 0,5 bis 1,5 ml (Standard 1,0 ml) und notieren Sie das verwendete Volumen.
    2. Das 1,5-fache Volumen von 200 Proof Ethanol (mit 0,1 % butyliertem Hydroxytoluol (w:v)) zugeben und mit einem Wirbel 15 s lang mischen.
    3. Fügen Sie 25 μl des internen Standards hinzu, z. B. C-23 β-Apo-Carotinol (synthetisiert aus all-trans Retinal, abs = 0,9)15. Verschließen Sie die Probe und mischen Sie sie durch Vortex.
    4. Das 0,8-fache des Milchprobenvolumens von 50:50 Kaliumhydroxid in Wasser geben (hergestellt als w:v, z. B. 50 g KOH gelöst in 50 mL Wasser), 15 s lang durch Wirbel mischen.
      HINWEIS: KOH:Wasser sollte in Plastikbehältern (z. B. HDPE) aufgefüllt werden.
    5. Die Proben 1 h in einem 45 °C warmen Wasserbad verseifen und alle 15 min kurz mit einem Wirbel mischen.
    6. Fügen Sie kaltes, entionisiertes oder Umkehrosmosewasser mit dem gleichen Volumen wie das Ausgangsmilchvolumen hinzu.
    7. 1 ml Hexan hinzufügen, 15 s lang durch Wirbeln mischen und 2 min (~1.300 × g) bei Raumtemperatur zentrifugieren.
    8. Pipettieren Sie die oberste Hexanschicht mit einer Pasteurpipette vorsichtig in ein neues Reagenzglas aus Glas (12 x 75 mm oder 13 x 100 mm).
    9. Die Schritte 1.2.7 und 1.2.8 noch zweimal wiederholen, wobei das Hexan im zweiten Röhrchen gesammelt wird.
    10. Jede Probe wird durch Festphasenextraktion (SPE) entnommen; Beginnen Sie mit dem Anschluss der benötigten SPE-Kartuschen (PE 500 mg/3 mL -NH2) an den Vakuumverteiler.
    11. Konditionieren Sie jede Kartusche, indem Sie 3 x 2 mL Hexan durch jede Kartusche laufen lassen, wobei der Lösungsmittelstand niemals unter die Oberseite des Verpackungsmaterials fällt. Hexan in ein 16 x 75 mm Glasröhrchen füllen und fachgerecht entsorgen.
    12. Laden Sie die Proben in Kartuschen und ziehen Sie sie mit dem Vakuum durch, bis sich das Lösungsmittel knapp über dem Niveau des Verpackungsmaterials befindet. Jede Patrone wird mit 3 x 2 mL Hexan auf die gleiche Weise wie in Schritt 1.2.11 gespült. Entsorgen Sie den Lösungsmittelabfall und ersetzen Sie die Glassammelröhrchen durch neue gleich große Röhrchen, die mit der Proben-ID gekennzeichnet sind.
    13. Waschen Sie Retinol mit 3 x 2 mL Methylenchlorid durch und sammeln Sie diese Fraktion.
    14. Das Eluat unter Stickstoff trocknen und in 100 μl Methanol (MS-Qualität) rekonstituieren. Mischen Sie die Probe durch einen Wirbel und schwenken Sie das Lösungsmittel über alle Seiten des Röhrchens. Zentrifugieren für 20-30 s.
    15. Legen Sie die Proben für mindestens 5 Minuten in einen -80 °C-Gefrierschrank.
      HINWEIS: Die Proben können in diesem Schritt bis zum nächsten Tag bei -80 °C gelagert werden.
  3. Entnahme von Leberproben
    1. Falten Sie ein 15 cm langes Whatman #1 Filterpapier in einen Glastrichter mit 8 cm Durchmesser und legen Sie es in eine Kegelform. Stellen Sie einen 50-ml-Messkolben unter den Trichter.
    2. Tauen Sie das Gewebe auf und wiegen Sie 0,5 g oder so viel Probe, wie verfügbar ist. Notieren Sie das verwendete Taschentuchgewicht.
    3. Die Proben werden in einen Mörser und Stößel gegeben und mit ca. 5 g Natriumsulfat gemahlen.
    4. Fügen Sie 250 μl eines internen Standards wie C-2315 hinzu.
      HINWEIS: Veresterte Formen von Vitamin A (d. h. Retinylacetat, Retinylbutyrat) sollten nicht verwendet werden, da die Probe schließlich verseift wird, wodurch der Standard nicht von endogenem Retinol zu unterscheiden ist.
    5. Gießen Sie in einem Abzug 10-15 ml Methylenchlorid mit der gemahlenen Leberprobe in den Mörser und mischen Sie es vorsichtig mit dem Stößel.
    6. Methylenchlorid wird durch das Filterpapier in den Messkolben gegossen.
    7. Die Schritte 1.3.5 und 1.3.6 werden noch zweimal wiederholt, wobei darauf zu achten ist, dass das Gesamtlösungsmittel im Messkolben unter der Linie bleibt.
    8. Spülen Sie mit einer Pasteur-Pipette den restlichen Inhalt des Mörtels mit Methylenchlorid in den Trichter. Mit der Pasteurpipette wird weiterhin Methylenchlorid in den Trichter gegeben, bis das Lösungsmittel im Messkolben die Leitung erreicht. Setzen Sie den Deckel des Messkolbens auf und drehen Sie den Kolben mehrmals um, während Sie den Deckel fest halten.
    9. Gießen Sie ca. 10 mL des Methylenchlorid-Extrakts in einen 25 mL Erlenmeyerkolben. Übertragen Sie 5 mL der Lösung in ein 10 mL Glaszentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss. Trocknen Sie die Probe unter einem sanften Strom von Stickstoffgas.
    10. Rekonstituieren Sie die Probe in 2 ml Ethanol + 0,1 % butyliertem Hydroxytoluol und wirbeln Sie sie auf, um die Probe zu mischen.
    11. Geben Sie 0,8 ml 50:50 (w:v) Kaliumhydroxid in Wasser und mischen Sie es 15 s lang durch Wirbel.
    12. Die Proben 1 h in einem 45 °C warmen Wasserbad verseifen und alle 15 min kurz mit einem Wirbel mischen.
    13. Fügen Sie 0,1 ml kaltes, entionisiertes oder Umkehrosmosewasser hinzu.
    14. 1 mL Hexan zugeben, 15 s lang durch Wirbel mischen und 2 min (~1.300 × g) zentrifugieren.
    15. Pipettieren Sie die oberste Hexanschicht mit einer Pasteurpipette vorsichtig in ein neues Reagenzglas aus Glas (12 x 75 mm oder 13 x 100 mm).
    16. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.14 und 1.3.15 noch zweimal, wobei Sie Hexan im zweiten Rohr sammeln.
    17. Das gepoolte Hexan wird unter Stickstoff getrocknet und in 100 μl Methanol (MS-Qualität) rekonstituiert. Mischen Sie die Probe mit einem Vortex und schwenken Sie das Lösungsmittel über alle Seiten des Röhrchens. Zentrifugieren Sie für 20-30 s und legen Sie die Proben für mindestens 5 min in einen -80 °C Gefrierschrank.
      HINWEIS: Die Proben können in diesem Schritt bis zum nächsten Tag bei -80 °C gelagert werden.

2. Probenreinigung und -quantifizierung mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

  1. Bereiten Sie HPLC-System 1 mit einer C18-Säule (5 μm, 4,6 x 250 mm) und einem UV-Vis-Detektor auf 325 nm vor.
  2. Bereiten Sie die mobile Phase von 92:8 Acetonitril:Wasser vor, indem Sie die Volumina von Acetonitril und Wasser getrennt messen und dann das Wasser in das Acetonitril gießen. Vakuumfiltern Sie die gemischte Lösung, um gelöstes Gas zu entfernen.
  3. Schalten Sie das HPLC-System 1 ein, führen Sie bei Bedarf eine Lösungsmittelspülung auf der HPLC durch und stellen Sie dann die Flussrate für mindestens 15 Minuten auf 1 mL/min ein, um das System vollständig auszugleichen.
  4. Injizieren Sie Standards in das HPLC-System.
    1. Zur Quantifizierung der Retinolkonzentrationen injizieren Sie 25 μl der internen C-23-Standardlösung und notieren Sie das Ergebnis 3x, um es mit den Proben zu vergleichen.
    2. Injizieren Sie einen Retinol-Standard, um die genaue Retentionszeit für das System zu bestimmen, das zur Fraktionssammlung und Retinol-Quantifizierung verwendet wird.
  5. Bereiten Sie HPLC System 2 vor (die Komponenten sind die gleichen wie bei System 1). Wenn Sie ein HPLC-System für beide Schritte verwenden, ersetzen Sie die für die Primärreinigung verwendete Säule durch eine zweite identische Säule, um eine mögliche Verschleppung von Verbindungen aus den Proben zu minimieren.
  6. Für System 2 wird Methanol vakuumfiltriert, die mobile HPLC-Phase gespült und dann 20 Minuten lang mit 0,7 ml/min durchgelassen, um sich auszugleichen.
  7. Die Proben nacheinander aus dem -80 °C-Gefrierschrank nehmen und bei 1.300 × g für 30 s bei Raumtemperatur zentrifugieren.
  8. Injizieren Sie die gesamte Probe auf die HPLC und vermeiden Sie dabei jegliches pelletierte Material. Starten Sie die Aufnahme, wenn Sie Retinol quantifizieren.
  9. Sammeln Sie den Retinol-Peak in einem kleinen Glasröhrchen (12 x 75 mm oder 13 x 100 mm), während das Lösungsmittel den Detektor passiert. Sammeln Sie den mittleren Teil des Peaks, um die Reinheit zu maximieren, typischerweise Absorptionswerte von mehr als 0,1 Absorptionseinheiten (Abbildung 1), die je nach Retinolkonzentration der Probe angepasst werden können. Warten Sie, bis der C-23-Peak eluiert ist, und stoppen Sie die Aufnahme.
  10. Trocknen Sie die Probe unter einem sanften Stickstoffstrahl.
  11. Geben Sie 100 μl Methanol (MS-Qualität) sofort in die getrocknete Probe und verschließen Sie sie. Schwenken Sie die Lösung an den Seiten des Röhrchens auf und ab und mischen Sie die Probe dann 15 s lang durch Wirbel. Legen Sie die Proben für mindestens 5 Minuten in einen -80 °C-Gefrierschrank.
    HINWEIS: Die Proben können in diesem Schritt bis zum nächsten Tag bei -80 °C gelagert werden.
  12. Nehmen Sie die Proben nacheinander aus dem -80 °C Gefrierschrank. Zentrifugieren Sie bei 1.300 × g für 30 s.
  13. Injizieren Sie die gesamte Probe in das HPLC-System 2, wobei jegliches pelletierte Material vermieden wird.
  14. Während der Retinol-Peak eluiert, sammeln Sie das Lösungsmittel, während es durch den Detektor in ein kleines Glasfläschchen (<1 ml) mit konischem Boden gelangt, und schieben Sie das Probenfläschchen vorsichtig in ein 12 x 75 mm großes Reagenzglas.
  15. Schalten Sie den Vakuumkonzentrator ein und lassen Sie den Kondensator 20 Minuten lang abkühlen.
  16. Legen Sie die Proben in einer ausgewogenen Formation in das Karussell, stellen Sie die Heizstufe auf keine und das Vakuum auf 05,1, schließen Sie den Deckel und drücken Sie auf Lauf.
    HINWEIS: Die Proben brauchen in der Regel 10-20 Minuten, um zu trocknen. Für den Gaschromatographen ist es wichtig, dass das gesamte Methanol aus den Proben entfernt wurde.
  17. Nach dem Trocknen wird das HPLC-Fläschchen in ein braunes 4-ml-Fläschchen mit Schraubverschluss umgefüllt und die Probe mit 4-7 μl Hexan rekonstituiert.
    HINWEIS: Dieser beträgt in der Regel 7 μl, wird jedoch reduziert, wenn bei der Aufreinigung eine niedrige Konzentration der Probe festgestellt wird. Leberproben können viel konzentrierter sein, so dass sie in einem größeren Volumen rekonstituiert werden können. Streben Sie einen Wert zwischen 75 ng/μl und 400 ng/μl an.
  18. Injizieren Sie 1-5 μl auf das GC-C-IRMS, um ein adäquates Signal zu erhalten, basierend auf der Konzentration der Probe, die für die Injektion von etwa 75 ng Retinol erforderlich ist.

3. Probenanalyse mit GC-C-IRMS

  1. Bereiten Sie die GC mit einer Säule (100 % Dimethylpolysiloxan, unpolar, 15 m, 0,25 mm ID, 0,25 μm Film) und einer Heliumflussrate von 1,2 mL/min vor.
  2. Führen Sie Systemprüfungen durch, um sicherzustellen, dass keine Lecks vorhanden sind und die IRMS-Quelle ordnungsgemäß auf die Massen 44, 45 und 46 fokussiert ist.
    Injizieren Sie täglich 2 μl eines mit 75 ng/μl 13C angereicherten Retinol-Standards als erste Injektion, um die Retentionszeit zu bestimmen und die Systemleistung zu überprüfen.
  3. Laden Sie in der Erfassungssoftware die Gerätemethode, geben Sie den Namen für die Probe ein und drücken Sie Probe ausführen. Das GC-C-IRMS-System führt eine Setup-Routine vor der Injektion durch. Sobald die grüne Bereitschaftsleuchte an der Vorderseite des GC aufleuchtet, injizieren Sie das vorgegebene Probenvolumen in den programmierbaren Temperaturverdampfungs-PTV-Injektor, entfernen Sie die Spritze und drücken Sie die Starttaste .
  4. Betreiben Sie den PTV-Injektor im PTV Splitless-Modus, wobei die Vorsäule oben auf dem Injektoreinsatz sitzt, um eine simulierte Einspritzung auf der Säule zu ermöglichen. Stellen Sie das Injektorprogramm so ein, dass es mit einer Anfangstemperatur von 50 °C beginnt, 1,05 Minuten lang hält, auf 200 °C bei einer Geschwindigkeit von 14,5 °C/s erhöht, 1 Minute lang bei 200 °C hält, auf 300 °C bei 14,5 °C/s übergeht und dann 4 Minuten lang den Injektor mit einem Helium-Split-Fluss von 50 mL/min spült, bevor es für die nächste Injektion auf 50 °C zurückkehrt.
  5. Die Temperatur des GC-Ofens auf eine Anfangstemperatur von 50 °C programmieren, 1 min halten, von 30 °C/min auf 150 °C hochfahren, dann von 15 °C/min auf 265 °C, dann auf 295 °C bei 40 °C/min hoch, dann 2,50 min halten, bevor sie für die nächste Injektion auf 50 °C abgekühlt werden.
  6. Stellen Sie sicher, dass jedes Chromatogramm mit drei Impulsen CO2 (99,999 % Reinheit) beginnt, die gegen Saccharose (IAEA-CH-6) kalibriert sind. Greifen Sie auf die Ergebnisse in der Erfassungssoftware zu.
  7. Überprüfen Sie nach jeder Injektion jedes Chromatogramm, um sicherzustellen, dass der Retinol-Peak vorhanden ist und ob die Integration angemessen ist. Verwenden Sie die Software, um die Retinol-Peaks so weit wie möglich automatisch zu integrieren, um mögliche Verzerrungen durch manuelle Integrationen zu minimieren. Verwenden Sie die Standardeinstellungen für die Start- und Endneigungserkennung von 20 mV/s.
    HINWEIS: Eine Spitzenamplitude von 200 mV oder weniger ist zu klein, um eine genaue Messung des 13-C-Verhältnisses zu ermöglichen.
  8. Exportieren Sie Chromatogrammdaten in ein Tabellenkalkulationsprogramm. Fügen Sie die folgenden wesentlichen Datenkategorien hinzu: Probenname, Peak-Retentionszeit, Peak-Amplitude bei Masse 45 und AT%.
    HINWEIS: Die Daten, die exportiert werden, können mit einer definierten Exportmethode angegeben werden. Der Wert δ ist für eine einfachere Interpretation von Vorteil, aber für Berechnungen nicht erforderlich.

4. Berechnung der Vitamin-A-Gesamtkörperspeicher und der Leberkonzentrationen

  1. Retinol-Isotopenverdünnungsgleichungen.
    HINWEIS: Die bevorzugte Isotopenbilanzgleichung und die entsprechende Schreibweise, die von einigen Forschern verwendet wird, basieren auf Empfehlungen der International Union of Pure and Applied Chemistry16. Wir stellen fest, dass einige Forschungsgruppen eine Notation verwenden, die versucht, die historische Verwendung von Faktoren, die in RID-Gleichungen verwendet werden, beizubehalten. Wir stellen auch fest, dass sich Faktoren und unterstützende Literatur darin unterscheiden können, ob sie je nach Studiendesign, experimentellem Modell und analytischen Ergebnissen direkter auf Berechnungen für TBS oder Leber-VA-Konzentrationen anwendbar sind.
    1. Bestimmen Sie die Serum-Retinol-TTR anhand der Isotopenhäufigkeit von 13°CCO 2 nach der Verbrennung gemäß der folgenden Gleichung:
       figure-protocol-1    
      Dabei ist F die Isotopenhäufigkeit (auch bekannt als Isotopenmengenfraktion, abgekürzt "x") der Tracerdosis (Fa), des Serumretinols zu Studienbeginn (Fb) und des Serumretinols nach der Dosierung und dem Mischen mit dem Körperpool (Fc). Die verwendeten Mischzeiträume betragen in der Regel etwa 14-21 Tage für den Menschen, können aber je nach Studiendesign kürzer oder länger sein.
    2. Verwenden Sie RID-Gleichungen, um VA TBS gemäß der folgenden Basisgleichung zu berechnen.
      figure-protocol-2
      Wo
      figure-protocol-3
      HINWEIS: Zu den Faktoren, die für die Absorption und Lagerung verwendet werden, gehören i) die Dosislagerung zum Zeitpunkt der Äquilibrierung (Dosisabsorption), die bei gesunden Personen typischerweise zwischen 75 % und 90 % geschätzt wird. Die Schätzung kann reduziert werden, wenn eine Entzündung vorliegt. ii) Beibehaltung der Dosis; Konstante: e-kt; k = ln(2)/Halbwertszeit von Retinol; 32 bis 136 Tage für Kinder; 140 Tage für Erwachsene); t = Tage seit der Dosierung (normalerweise 14-21 Tage); Serum/Leber-Tracer-Partitionierung: TTRserum / TTRleber; 0,65-0,9 mit VA-Aufnahme während der Mischperiode; 0,9-,1 bei Verwendung einer niedrigen Tracerdosis, einer kontrollierten VA-Aufnahme und einer nüchternen Probenahme.
      figure-protocol-4
    3. Berechnen Sie die VA-Konzentrationen in der Leber mit zusätzlichen Annahmen für das Lebergewicht und den Anteil der VA-TBS in der Leber.
      figure-protocol-5
      Wo
      figure-protocol-6
      Das Verhältnis von Leber zu Körpergewicht wird üblicherweise als altersspezifische Konstante geschätzt: Säuglinge: 4-4,2 %; Kinder: 3%; Erwachsene: 2,4 %; Die TBS-Fraktion in der Leber variiert mit dem Vitamin-A-Status. Zuvor verwendete Schätzungen sind marginaler oder niedriger VA-Status: 0,5; Angemessener VA-Status: 0,8-0,9.

Ergebnisse

Ein Beispiel für ein Serumprobenchromatogramm, das bei 325 nm überwacht wurde, ist für Protokollabschnitt 2 bereitgestellt (Abbildung 1). Abhängig vom verwendeten System und der verwendeten Säule beträgt die typische Retentionszeit für Retinol 4-6 min und für den internen Standard 6-8 min. Der grün schattierte Bereich zeigt den Zielsammelbereich für die Retinolfraktion, um Verunreinigungen zu minimieren. Die Extraktionseffizienz von Retinol aus Serum liegt in der Regel bei ≥ 85 %, während verseifte Muttermilch- und Gewebeproben tendenziell eine geringere Effizienz aufweisen und durchschnittlich ~70-80 % betragen. Während der HPLC-Aufreinigung können geringe Mengen an Retinol-cis-Isomeren beobachtet werden, die kurz vor oder nach dem Haupt-all-trans-Peak eluieren. In der in Abbildung 1 dargestellten Probe wurde kein nennenswertes cis-Isomer beobachtet, ist aber in der ergänzenden Abbildung 1 von Referenz17 zu sehen. Häufig wird während der zweiten HPLC-Aufreinigung (nicht gezeigt) oder während der GC-Trennung (Abbildung 2) ein zusätzliches Isomer getrennt.

Beispiele für GC-C-IRMS-Chromatogramme für eine Standard-, Serum- und Leerprobe sind für Protokollabschnitt 3 dargestellt (Abbildung 2)9. Jede Probe enthält Referenz-CO2 - Peaks mit einer 13°C-Anreicherung, die nach einem IAEO-Saccharosestandard (IAEA-CH-6) kalibriert ist.

Die experimentelle IRMS-Genauigkeit (CV%) für eine Isotopenhäufigkeit von 13°C/Gesamt-C für: 1) Referenz-CO2 betrug 0,012 für die Stabilität und 0,031 für die Linearität (jeweils n = 10); 2) Der Retinol-Standard betrug 0,036 für die Stabilität zwischen den Tagen und 0,022 für die Intraday-Linearität (jeweils n = 4); und 3) experimentell war 0,073 ± 0,061 in allen Ausgangs- und acht diätetischen Behandlungsgruppen bei Rennmäusen (n = 46 in 9 Gruppen)9.

Im Folgenden finden Sie ein Beispiel dafür, wie die resultierenden GC-C-IRMS-Serumdaten zur Berechnung der TBS- und Leber-VA-Konzentrationen verwendet werden, die 14 Tage nach der Dosisverabreichung unter Verwendung der RID-Gleichung für Methode 4 bestimmt wurden:

Eigenschaften der Studienteilnehmer:

Alter:4 Jahre
Körpergewicht:16,0 kg
Fa (2 markierte Kohlenstoffe plus natürliche Häufigkeit):0.11
Fb:0.010757
FC:0.011057
Angewendete Tracer-Dosis:1,0 μmol
Zeit seit der Dosierung:14 Tage
VA-Halbwertszeit:32 Tage
Absorption:0.8
Verhältnis von TTR im Serum/Leber (Diät nicht kontrolliert):0.9
TBS-Fraktion in der Leber:0.8

Berechnung:

TTR = (Fc-F b)/(Fa-F c)
TTR = (0,0110568 - 0,010757) / (0,11 - 0,0110568) = 0,0030300213
1/TTR = 1 / 0,0030300213 = 330,03

Dosisretention = e-kt mit einer Halbwertszeit von 32 Tagen und einer Probenahmezeit von 14 Tagen
k= ln(2)/36 = 0,693147181 / 36 = 0,021660849
t = 14
e-kt = e-0,02166 x 14 = 0,738413073

figure-results-1

TBS = 1 × 330,03 x 0,8 x 0,738413073 × 0,9 = 175 μmol

Zur Berechnung der VA-Konzentrationen in der Leber:
Lebergewicht (g) = 1.000 × Körpergewicht (kg) × 3 % (Schätzung für Kinder)
Lebergewicht = 1.000 x 16,0 x 0,03 = 480 g
figure-results-2
VA-Konzentration in der Leber = (175 / 480) x 0,8 = 0,29 μmol/g

figure-results-3
Abbildung 1: HPLC-Chromatogramm einer humanen Serumprobe. HPLC System 1 mit isokratischer mobiler Phase 90:10 MeOH:H2O und Detektion bei 325 nm. Der Retinol-Peak wird für Absorptionswerte über ~0,1 (grün schattierter Bereich) erhoben. Der interne Standard C-23 β-Apo-Carotinol wird verwendet, um die Serum-Retinol-Konzentration (falls gewünscht) während dieses Schritts zu quantifizieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-4
Abbildung 2: GC-C-IRMS-Chromatogramme, die die Bestimmung von Retinol 13 C/12 C zeigen. GC-C-IRMS-Chromatogramm von (A) Retinol-Standard, (B) Retinol, das aus Serum gereinigt wurde, und (C) Blindinjektion, adaptiert von Gannon et al.9. Drei Kurven sind für die Masse 44 (entspricht 12C16O2), 45 (entspricht 13C16O2 oder 12C16O17O) und 46 (entspricht hauptsächlich 12C16O18O, die zur Korrektur der Masse 45 für 17O Beitrag verwendet wird). Drei breite Peaks vor 200 s sind CO2 -Referenzpeaks, die auf ein Saccharose 13C Referenzmaterial kalibriert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die beschriebenen Methoden zur Messung der 13-C-Anreicherung von Retinol mit GC-C-IRMS können wertvolle Daten für die Bewertung von Ernährungsinterventionen,18 die Modellierung der Vitamin-A-Kinetik,19,20,21 klinische Forschung oder Populationsstudien mit RID für verbesserte Schätzungen des VA-Status liefern 22.

Bei diesem Test wird Retinol, das aus einer biologischen Probe gereinigt wurde, durch Helium in Forschungsqualität (>99,999999 % Reinheit) mit einem Temperaturgradienten durch die GC-Säule geleitet, wodurch es von den verbleibenden Verunreinigungen in der Probe getrennt wird. Das Retinol wird zu CO2 und Wasser verbrannt und das Wasser wird entfernt. Das CO2 wird zum IRMS transportiert, wo die Massen 44, 45 und 46 gemessen werden, und die δ und AT% werden relativ zu einer CO2 -Gasreferenz bestimmt, die zusätzlich gegen den Saccharosestandard (IAEA-CH-6) kalibriert ist.

Bei der Vorbereitung des Retinols für die Injektion muss das extrahierte Retinol von höchster Reinheit sein, um reproduzierbare Isotopenverhältnisse zu erreichen und die Langlebigkeit der Analyseplattform zwischen den gründlichen Reinigungen zu maximieren. Lösungsmittel, die für die Extraktion verwendet werden, sollten den höchsten verfügbaren Reinheitsgrad aufweisen, der in der Regel MS-Qualität ist. Alle Glaswaren, wie z. B. Extraktionsröhrchen, Pasteurpipetten und HPLC-Injektionsfläschchen, sollten neu sein, da sie für die MS-Analyse schwer ausreichend zu reinigen sind. Es ist wichtig, Glasröhrchen und Pipetten anstelle von Kunststoff zu verwenden, um die Weichmacher in den Extrakten zu minimieren, die sich auf dem GC und den Verbrennungssäulen ablagern.

Änderungen an diesem Arbeitsablauf für die Probenanalyse können je nach Studiendesign und Probenahmequelle vorgenommen werden. Zum Beispiel könnte ein HPLC-System wahrscheinlich für die Retinol-Aufreinigung optimiert werden. Unserer Erfahrung nach würde dies Wasser in der mobilen Phase erfordern und entweder einen Gradienten der mobilen Phase oder eine längere Trocknungszeit der Probe vor der Injektion auf dem GC-C-IRMS erfordern. Wir fanden heraus, dass die Verwendung von zwei HPLC-Systemen mit kurzen isokratischen Methoden die analytischen Anforderungen in Einklang bringt und gleichzeitig klare Signale auf dem GC-C-IRMS erhält (Abbildung 2). Die Verwendung von LC-MS/MS könnte einen optimierten analytischen Arbeitsablauf für RID-Proben ermöglichen7. Die Empfindlichkeit von GC-C-IRMS hat jedoch deutliche Vorteile, da niedrigere Dosis- und Isotopenmarkierungsmengen verwendet werden können, Tracer zu längeren Zeitpunkten quantifiziert und Proben mit geringer Probenanreicherung analysiert werden können.

Zu den Einschränkungen dieser Methode gehören die Notwendigkeit mehrerer Instrumente, eine qualifizierte technische Handhabung und Einschränkungen des Probendurchsatzes aufgrund längerer Probenvorbereitungszeiten. Der Zeitaufwand für die Vorbereitung jeder Probe könnte durch die Implementierung einer HPLC mit automatisierten Fraktionssammelfunktionen verbessert werden, da bei den HPLC-Aufreinigungsschritten isokratische Methoden verwendet werden, was zu konsistenten Retentionszeiten der Analyten führt. Die Methode konnte so optimiert werden, dass nur eine HPLC-Aufreinigung verwendet werden kann. Wir verwenden zwei Systeme parallel, um den Durchsatz zu erhöhen und die Probentrocknung vor der Rekonstitution in Hexan und der Injektion auf dem GC-C-IRMS zu erleichtern.

Während GC-C-IRMS für die Bestimmung von Isotopenverhältnissen extrem empfindlich ist, erfordert es für ein adäquates Retinolsignal eine höhere Gesamtretinolmasse der Probe. Die Anforderungen an die Probe hängen sowohl von der Probenmenge als auch von der VA-Konzentration der Probe ab. In der Regel werden 75 ng Retinol für einen starken Peak angestrebt, was Schwankungen des GC-Transfers und der Verbrennungseffizienz ermöglicht. In der Praxis haben wir unter optimalen Betriebsbedingungen ein adäquates Signal mit Proben erhalten, was zu GC-C-IRMS-Injektionen von nur 25 ng führte. Dies entspricht einer Serumprobe mit geringerem Volumen (~0,4 mL), niedriger Retinolkonzentration (~0,5 μmol/L) und geringen Verlusten bei den Extraktions- und Aufreinigungsverfahren. Bei der analytischen Entwicklung des RID-Verfahrens war die Umstellung auf einen PTV-Injektor eine wesentliche Verbesserung. Die niedrige Starttemperatur verhindert, dass sich das Hexan, das die Probe transportiert, zu schnell ausdehnt, und ermöglicht simulierte Injektionen von Proben auf der Säule. Die direkte Injektion in die Säule maximiert das Signal des Retinols mit dem Nachteil einer etwas schlechteren Peakform und einer konstanteren Wartung.

Muttermilch wurde als Ersatz für Serumproben im RID-Test vorgeschlagen. Dies wurde bei sambischen stillenden Frauen bestätigt, die weitgehend niedrige Speicher an VA11 hatten. Es muss noch bei Frauen validiert werden, die eine höhere Aufnahme von vorgeformter VA haben, wie man sie in Ländern mit hohem Einkommen oder in Bevölkerungsgruppen finden würde, die mehrere Quellen von VA konsumieren, einschließlich Nahrungsaufnahme, Anreicherung von Lebensmitteln und Nahrungsergänzung.

Die Beurteilung des VA in der Muttermilch hat mehrere Vorteile gegenüber anderen biochemischen Indikatoren für den VA-Status. Die Entnahme von Muttermilch ist oft einfacher als die von Blut, da Phlebotomisten nicht benötigt werden, und die Entnahme von Muttermilch wird bei Probanden in der Regel als weniger invasiv angesehen23. Die Verwendung von gelegentlichen Muttermilchproben ist bequem und erfordert nur 5 ml Milch. Darüber hinaus müssen die Proben nicht sofort verarbeitet werden, was die Probenhandhabungszeit verkürzt, insbesondere im Feld. Die Standardisierung der Probenentnahme für vollständige Muttermilchproben ist jedoch von entscheidender Bedeutung, da die Konzentrationen von Fett und Retinol in der Hintermilch höher sind als in der Vormilch und die Milchfett- und Retinolkonzentrationen tendenziell mit der Tageszeit und dem Intervall seit der letzten Fütterung variieren 1,24. Bei gelegentlichen Proben wird die Retinolkonzentration am besten pro g Milchfett ausgedrückt. Das Milchfett sollte idealerweise direkt nach der Entnahme mit der Creamatokrit-Methodebestimmt werden 25. Die Proben sollten vor Licht geschützt werden. Aliquots (in der Regel 1 bis 5 ml) für die HPLC-Analyse müssen zum Zeitpunkt der Entnahme vorbereitet werden, da die Milch nach dem Einfrieren und Auftauen nicht homogen ist.

Es gibt zwei Hauptumstände, unter denen die Messung der 13C-Anreicherung der VA in der Leber möglich und von Interesse sein kann. Die häufigste Situation ist die Verwendung von 13C-markiertem Retinol in Tierversuchen, wenn die Leber entnommen wird. Die berechneten TBSs der VA werden mit der durch HPLC/UPLC bestimmten VA-Konzentration in der Leber verglichen, aber die 13-C-Anreicherung der Leberspeicher ist auch nützlich, um zu bestimmen, wie der Tracer im Umlauf im Vergleich zu den Langzeitspeichern verteilt ist. Darüber hinaus ist es unter bestimmten Umständen möglich, Leberbiopsieproben von Menschen zu erhalten, die ihre Zustimmung gegeben und auch eine markierte Dosis von Vitamin A26,27 eingenommen haben. Diese Proben sind auch nützlich für die Validierung und Prüfung der 13-C-Retinol-Mischung. Die Verarbeitung von Leberproben beginnt mit dem Mahlen einer gemessenen Probe mit wasserfreiem Natriumsulfat, um Wasser einzuschließen und das Gewebe aufzuspalten. Dieses wird dann mit 50 mL Methylenchlorid durch Filterpapier extrahiert. Eine Fraktion wird unter Stickstoff getrocknet und in Ethanol rekonstituiert, wobei 0,1 % butyliertes Hydroxytoluol als Konservierungsmittel zugesetzt wird. Die Probe wird verseift und mit dem gleichen Verfahren extrahiert, das auch für Muttermilch verwendet wird.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch NIH-R01 DC019357 und das IAEO Coordinated Research Project E43035 finanziert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
13C-Referenzmaterial, das auf die VPDB-LSVEC-Skala (Sucrose) zurückgeführt werden kannInternationale AtomenergieorganisationIAEA-CH-6 Name des Nationalen Instituts für Standards und Technologie: RM 8542
Acetonitril (HPLC-Qualität)Fischer ScientificUN1648
Ethanol (reines 200 Proof, wasserfrei, ≥ 99.5%)Sigma459836
Glaspasteur-PipettenJegliche
GlasreagenzgläserJegliche
Helium (Forschungsgenade, (>99,9995 % Reinheit))Jegliche
HexaneSigma178918
Methanol (MS-Qualität)VWRMSPP-A-456
Mörtel und Pestel, KeramikJegliche
Verdrängungspipette 3-25 & Micro; LGilsonFD10002
Verdrängungspipette 10-100 & Mikro; LGilsonFD10004
Verdrängungspipette 50-250 & Mikro; LGilsonFD10005
Verdrängungspipette 100-1000 & Mikro; LGilsonFD10006
KaliumhydroxidFisher ScientificUN1813
Qualitatives Filterpapier #1 150 mmWhatman1001-150
TrenntrichterJegliche
Natriumsulfat, wasserfreiFischer ScientificS415-212
Volumetrische Kolben (50 ml)Jegliche

Referenzen

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