In situ Nachweis von metabolisch aktiven Zellen im hepatozellulären Karzinomgewebe mittels MTT-basierter Kryosektionsbildgebung

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein einfaches Protokoll vor, um die metabolisch aktiven Zellen im hepatozellulären Karzinomgewebe mittels MTT-basierter Kryosektionsbildgebung zu detektieren. Diese Methode kann auch verwendet werden, um aktive Zellen in situ in anderen Geweben oder Organen nachzuweisen.

Zusammenfassung

Neue Erkenntnisse, einschließlich früherer Studien, deuten auf eine Subpopulation von Zellen im Gewebe des hepatozellulären Karzinoms (HCC) hin, die eine überlegene metabolische Aktivität und Stressresistenz aufweisen. Diese Zellen sind wichtige Treiber für das Fortschreiten des Tumors und die Therapieresistenz. Bestehende Methoden zum Nachweis lebensfähiger Zellen in situ beeinträchtigen jedoch häufig die Integrität des Gewebes, verändern die zelluläre Lebensfähigkeit oder sind technisch anspruchsvoll. In dieser Arbeit wird ein neuartiger, einfacher, zerstörungsfreier Ansatz für den in situ Nachweis von metabolisch aktiven Zellen in HCC-Geweben durch mitochondrienabhängige Reduktion von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) zu unlöslichen Formazankristallen vorgestellt. Durch die Optimierung der Gewebefragmentgröße (1 × 1 × 0,2 cm³), der Kulturbedingungen (20 % FBS, 1 mg/ml MTT und 3 h Inkubation mit intermittierender Verwirbelung) und der Kryosektionsparameter (20 μm Dicke, 4 % PFA-Fixierung und DAPI-Gegenfärbung) wurde eine räumliche Kartierung lebensfähiger HCC-Zellen innerhalb von 5 Stunden erreicht. Dieses kostengünstige Protokoll erfordert keine spezielle Ausrüstung und behält die Gewebearchitektur bei, was die räumliche Identifizierung von hochlebensfähigen und stressresistenten Zellclustern in Oberflächenregionen ermöglicht. Zu den Einschränkungen gehören ein fortschreitender Viabilitätsverlust über 6 h hinaus und eine Kristallverschiebung während des Schnitts, die durch FBS-Supplementierung und kontrolliertes Einfrieren gemildert werden kann. Diese Methode bietet eine praktische Plattform für die Einzelzellisolierung therapieresistenter Subpopulationen und bringt die Forschung an HCC-Mikroumgebungen voran.

Einleitung

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC), die dritthäufigste krebsbedingte Todesursache weltweit, zeichnet sich durch eine hohe Heterogenität und Rezidivraten^{aus 1}. Diese räumliche und zeitliche Heterogenität macht bestimmte Zellpopulationen innerhalb von Tumorgeweben aktiver als andere in Bezug auf Stoffwechsel, Proliferation, Progression, Stresstoleranz und Arzneimittelresistenz. Der In-situ-Nachweis lebensfähiger Zellen in HCC-Geweben ist von großer klinischer und biologischer Bedeutung, da diese Zellen proliferierende Subklone, therapieresistente Populationen und metastaseninitiierende Zellen umfassen. Solche lebensfähigen Zellen könnten als kritische Treiber für das Wiederauftreten von Tumoren, Immunevasion und therapeutisches Versagen dienen².

Aktuelle Technologien zur Erstellung von räumlichen Profilen (z. B. räumliche Transkriptomik) erfordern jedoch spezielle Instrumente und sind mit hohen Kosten verbunden, während traditionelle Massenanalysen oft die räumliche Heterogenität lebensfähiger Zellen und ihre dynamischen Wechselwirkungen mit stromalen Komponenten übersehen³. Zum Beispiel weisen verbleibende lebensfähige HCC-Zellen nach der Resektion unterschiedliche metabolische Profile auf, die in dissoziierten Zellsystemen nicht getreu rekapituliert werden^{können 4}. Daher ist die Weiterentwicklung ortsaufgelöster Detektionstechnologien unerlässlich, um die funktionelle Wechselwirkung zwischen lebensfähigen Tumorzellen und ihrer Mikroumgebung zu entschlüsseln und letztendlich präzise therapeutische Strategien zu entwickeln. Obwohl konventionelle Methoden wie Durchflusszytometrie oder Immunhistochemie (IHC) von unserer Gruppe verwendet wurden, um die lebensfähigen Zellen im HCC nachzuweisen, erfordern sie eine Dissoziation oder Fixierung des Gewebes, wodurch der räumliche Kontext verloren geht und die Analyse von Zell-Zell-Interaktionen behindert^{wird 5,6}. Daher ist die Entwicklung zerstörungsfreier, hochauflösender Technologien für den In-situ-Nachweis lebensfähiger Zellen von entscheidender Bedeutung für die Aufklärung von HCC-Resistenzmechanismen und die Steuerung von Präzisionstherapien.

Um die lebensfähigen Zellen in HCC-Geweben in situ ohne destruktive Behandlung schnell und ohne destruktive Behandlung nachweisen und darstellen zu können, wurde eine einfache 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-basierte Gewebekulturmethode entwickelt. Kurz gesagt, die frischen, dünnen HCC-Gewebe (ca. 1 × 1 × 0,2 cm³) wurden zunächst 3 h lang in DMEM-Medium kultiviert, das 20 % fötales Rinderserum (FBS) und MTT (1 mg/ml) enthielt. Nach einer 4%igen Paraformaldehyd (PFA)-Fixierung und DAPI-haltiger Einbettung wurden OCT-eingebettete gefrorene Gewebeobjektträger (20 μm Dicke) einer mikroskopischen Beobachtung unter hellem oder UV-Licht unterzogen. Die lebensfähigen Zellen zeigen eine violette, violett-rote oder violett-schwarze Färbung. Mit Hilfe dieses Protokolls konnten wir die lebensfähigen Zellen in HCC-Geweben innerhalb von 5 Stunden erfolgreich nachweisen. Gleichzeitig behält diese Methode die 3D-Mikroarchitektur bei, ist kompatibel mit nachgelagerten Multi-Omics-Analysen und ist einfach sowie zeit- und kostensparend. Diese Methode weist jedoch gewisse Einschränkungen auf. Die mehrstufigen Prozesse des Waschens, Schneidens und Kultivierens können strukturelle Verformung und Apoptose in Geweben induzieren, insbesondere in Proben mit hohem Stoffwechsel, wie z. B. HCC-Gewebe in dieser Studie. Darüber hinaus beeinträchtigt die erhöhte Dicke der Kryosektionsscheiben die Klarheit und Ebenheit der mikroskopischen Beobachtungen.

Protokoll

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der Ethikkommission des ersten angeschlossenen Krankenhauses von Quanzhou (Nr. FJMU IACUC2021257). HCC-Gewebe wurde operativ entnommen und im Quanzhou First Hospital, das der Medizinischen Universität Fujian angegliedert ist, mit Einverständniserklärung der Patienten entnommen. Dieses Experiment erfordert standardmäßige Schutzmaßnahmen, einschließlich des Tragens eines Laborkittels, einer Einwegmaske und Handschuhe.

1. Vorbereitung des Gewebes

1. Stellen Sie eine sterile 9 cm Petrischale auf Eis. Fügen Sie 30 ml eiskalte Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) hinzu.
2. Übertragen Sie das chirurgisch resezierte humane HCC-Gewebe sofort in das PBS.
3. Schwenken Sie die Schale vorsichtig 5 s lang, um Blutverunreinigungen zu entfernen. Aspirieren Sie PBS mit einer sterilen Pipette.
   HINWEIS: Wiederholen Sie den Vorgang dreimal.
4. Übertragen Sie das Gewebe auf den Deckel der Petrischale.
   HINWEIS: Die Taschentücher haften leicht am unbenetzten Deckel der Petrischale für eine spätere bessere Handhabung.
5. Schneiden Sie das Gewebe mit einer sterilen chirurgischen Klinge (Nr. 11) in ca. 1 × 1 × 0,2 cm³ Fragmente.
   HINWEIS: Die Länge und Breite der Fragmente kann geändert werden, aber die Tiefe sollte weniger als 0,2 cm betragen.
6. Geben Sie die Fragmente in eine frische 9-cm-Schale, die mit 30 ml eiskaltem PBS gefüllt ist.
7. Schwenken Sie die Schale vorsichtig 5 s lang, um Blutverunreinigungen zu entfernen. Aspirieren Sie PBS mit einer sterilen Pipette.
   HINWEIS: Wiederholen Sie Schritt 1.7 dreimal. Ein in PBS (95 °C, 10 min) gekochtes Gewebefragment wurde als Negativkontrolle eingestellt. Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen durch.

2. Gewebekultur

1. Geben Sie 1,8 ml vollständiges Kulturmedium DMEM (vorgewärmt auf 37 °C), das Glukose (Endkonzentration = 4,5 g/l) und L-Glutamin (Endkonzentration = 2 mM) enthält, in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Geben Sie dann 0,6 mL FBS (Endkonzentration = 20 % v/v) und 0,6 mL MTT-Stamm (Endkonzentration = 1 mg/ml) in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte.
2. Übertragen Sie die Gewebefragmente mit einer sterilen Pinzette in die Vertiefungen.
3. Legen Sie die 6-Well-Platte in den Inkubator. 3 h bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.
   HINWEIS: Den Teller alle 30 Minuten 3 s vorsichtig schwenken. Die Inkubation könnte beendet werden, sobald sich die Oberfläche der Gewebefragmente violett oder violett-schwarz färbt.

3. Beendigung und Fixierung

1. Saugen Sie das MTT-Medium an. Waschen Sie die Gewebefragmente mit eiskalter Kochsalzlösung.
   HINWEIS: Fünfmal wiederholen.
2. Geben Sie 2 ml 4 % neutral gepuffertes Formalin (NBF) in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte.
3. Die Platte für 1 h bei 4 °C in den Kühlschrank stellen.

4. Kryosektion

1. Tupfen Sie die Fragmente vorsichtig auf sauberem, saugfähigem Papier ab.
2. Legen Sie das Gewebe in einen Kryomold, der mit OCT-Verbindung gefüllt ist.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig mit OCT-Verbindung bedeckt ist.
3. Frieren Sie das Taschentuch im Niedertemperaturkühlschrank bei -80 °C für 20 min ein.
4. Montieren Sie den gefrorenen Block auf ein Kryostatfutter bei -20 °C.
5. Schneiden Sie 100 μm lange Schnitte bei -20 °C, bis die Gewebeoberfläche freiliegt.
   HINWEIS: Die Gewebeoberfläche weist eine violette Färbung auf.
6. Sammeln Sie 20 μm-Scheiben mit klebstoffbeschichteten Objektträgern.
   HINWEIS: Die Gewebescheiben sollten in einem violetten, violett-roten oder violett-schwarzen Farbton dargestellt werden.
7. Fixieren Sie die Scheiben in 4% Paraformaldehyd (PFA) bei Raumtemperatur für 2 min.
8. Spülen Sie die Objektträger 1 Minute lang vorsichtig mit PBS aus.
   HINWEIS: Wiederholen Sie den Vorgang dreimal.

5. Montage

1. 1 Tropfen DAPI-haltiges Eindeckmedium (Endkonzentration: 1 μg/ml) auftragen.
2. Abdeckung mit Deckglas.
3. Versiegeln Sie die Ränder mit Nagellack.
   HINWEIS: Objektträger mit versiegelten Kanten können bei 4 °C im Dunkeln gelagert werden, wenn die Mikroskopie nicht sofort durchgeführt wird.

6. Mikroskopie

1. Visualisieren Sie violette, purpurrote oder violett-dunkle Formazanablagerungen (lebensfähige Zellen) bei 20× Vergrößerung unter Hellfeld mit Hilfe der Hellfeldmikroskopie.
2. Detektion von blauem DAPI (Zellkernen) unter UV-Beleuchtung mittels Fluoreszenzmikroskopie.
3. Führen Sie Hellfeld- und Fluoreszenzkanäle für eine räumliche Korrelation zusammen.
   HINWEIS: Die hier verwendete Software ist NIS Element F (Version 4.00.06).

Ergebnisse

In dieser Studie ist es gelungen, metabolisch aktive Zellen im HCC-Gewebe nachzuweisen, ohne die Gewebearchitektur zu stören. Zunächst zeigten die Hellfeldbilder (Abbildung 1A), dass die Gewebeoberfläche eine dichte zelluläre Abdeckung und eine mehrschichtige Stapelung von Zellen über den Objektträger aufwies, was die erhaltene architektonische Integrität des HCC-Gewebes während der gesamten Kultur und Verarbeitung bestätigte. Bemerkenswert ist, dass Zellcluster innerhalb oberflächlicher Reg...

Diskussion

Die derzeitigen Methoden zum Nachweis lebensfähiger Zellen in situ stoßen nach wie vor an vielschichtige Einschränkungen. IHC und Immunfluoreszenz (IF), die häufig zur Identifizierung von Proliferationsmarkern oder Apoptose-verwandten Proteinen verwendet werden, leiden unter einer Störung der Membranintegrität, die durch die Formaldehydfixierung induziert wird⁷. Darüber hinaus ist die Antikörperpenetration in dicken Gewebeschnitten suboptimal

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
-80 & Grad; C-Gefrierschrank (aufrecht)	Thermo Fisher Scientific	TSX60086V
Clean Bench (vertikale laminare Strömung)	AIRTECH	SW-CJ-1FD
CO2 Inkubator (165 L)	Thermo Fisher Scientific	Heracell VIOS 160i (z. B. 51030400 / 51033559)
Coverslip (24& Times; 50 mm, #1,5)	CITOGLAS (Citotest)	0341-3610
Kulturpetrischale (90 mm)	NEST	752001 (Beispiel)
DAPI-enthaltendes Montagemedium	Beyotime	P0131 (5 mL/25 mL)
DMEM (hoher Glukosespiegel mit Pyruvat)	Invitrogen (Gibco)	11995-065
FBS (Qualifiziert, US-Herkunft)	Invitrogen (Gibco)	A3160501
Fluoreszenzmikroskop	Nikon	ECLIPSE Ti2-Serie
Einfrieren des Mikrotoms (Kryostat)	Leica	CM1950
Mikroskop-Objektträger (einfach, 25& Times; 75 mm)	CITOGLAS (Citotest)	0317-0001
MTT-Reagenz (Pulver)	Beyotime	ST316
Nagellack (klar)	Beyotime	—
NBF (Neutral Puffer-Formalin)	Beyotime	—
OCT-Verbindung	SAKURA (Sakura Finetek)	4583
Optisches Mikroskop (aufrecht)	Nikon	ECLIPSE Ci-Reihe (z. B. Ci-L)
PBS (500 mL)	Beyotime	C0221A
PFA, 4 % in PBS (fixativ)	Beyotime	P0099
Pipettenspitze (1 ml, wenig bindend)	KIRGEN	KG1313-L
Pipettenspitze (200 & Mikro; L)	Axygen (Corning)	T-200-Y (Bulk) / T-200-Y-R-S (gerackt, steril)
Pipettor (Einkanal)	Thermo Fisher Scientific	Finnpipette F2 (bereichsspezifische Katze#)
Skalpell	HYSTIC	Das Modell variiert (z. B. Lieferantenreferenz 100022208326)
Pinzette	HYSTIC	Das Modell variiert