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Methodenartikel

In situ Nachweis von metabolisch aktiven Zellen im hepatozellulären Karzinomgewebe mittels MTT-basierter Kryosektionsbildgebung

320 Ansichten

DOI:

10.3791/68575

31. Oktober 2025

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein einfaches Protokoll vor, um die metabolisch aktiven Zellen im hepatozellulären Karzinomgewebe mittels MTT-basierter Kryosektionsbildgebung zu detektieren. Diese Methode kann auch verwendet werden, um aktive Zellen in situ in anderen Geweben oder Organen nachzuweisen.

Zusammenfassung

Neue Erkenntnisse, einschließlich früherer Studien, deuten auf eine Subpopulation von Zellen im Gewebe des hepatozellulären Karzinoms (HCC) hin, die eine überlegene metabolische Aktivität und Stressresistenz aufweisen. Diese Zellen sind wichtige Treiber für das Fortschreiten des Tumors und die Therapieresistenz. Bestehende Methoden zum Nachweis lebensfähiger Zellen in situ beeinträchtigen jedoch häufig die Integrität des Gewebes, verändern die zelluläre Lebensfähigkeit oder sind technisch anspruchsvoll. In dieser Arbeit wird ein neuartiger, einfacher, zerstörungsfreier Ansatz für den in situ Nachweis von metabolisch aktiven Zellen in HCC-Geweben durch mitochondrienabhängige Reduktion von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) zu unlöslichen Formazankristallen vorgestellt. Durch die Optimierung der Gewebefragmentgröße (1 × 1 × 0,2 cm3), der Kulturbedingungen (20 % FBS, 1 mg/ml MTT und 3 h Inkubation mit intermittierender Verwirbelung) und der Kryosektionsparameter (20 μm Dicke, 4 % PFA-Fixierung und DAPI-Gegenfärbung) wurde eine räumliche Kartierung lebensfähiger HCC-Zellen innerhalb von 5 Stunden erreicht. Dieses kostengünstige Protokoll erfordert keine spezielle Ausrüstung und behält die Gewebearchitektur bei, was die räumliche Identifizierung von hochlebensfähigen und stressresistenten Zellclustern in Oberflächenregionen ermöglicht. Zu den Einschränkungen gehören ein fortschreitender Viabilitätsverlust über 6 h hinaus und eine Kristallverschiebung während des Schnitts, die durch FBS-Supplementierung und kontrolliertes Einfrieren gemildert werden kann. Diese Methode bietet eine praktische Plattform für die Einzelzellisolierung therapieresistenter Subpopulationen und bringt die Forschung an HCC-Mikroumgebungen voran.

Einleitung

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC), die dritthäufigste krebsbedingte Todesursache weltweit, zeichnet sich durch eine hohe Heterogenität und Rezidivratenaus 1. Diese räumliche und zeitliche Heterogenität macht bestimmte Zellpopulationen innerhalb von Tumorgeweben aktiver als andere in Bezug auf Stoffwechsel, Proliferation, Progression, Stresstoleranz und Arzneimittelresistenz. Der In-situ-Nachweis lebensfähiger Zellen in HCC-Geweben ist von großer klinischer und biologischer Bedeutung, da diese Zellen proliferierende Subklone, therapieresistente Populationen und metastaseninitiierende Zellen umfassen. S....

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Protokoll

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der Ethikkommission des ersten angeschlossenen Krankenhauses von Quanzhou (Nr. FJMU IACUC2021257). HCC-Gewebe wurde operativ entnommen und im Quanzhou First Hospital, das der Medizinischen Universität Fujian angegliedert ist, mit Einverständniserklärung der Patienten entnommen. Dieses Experiment erfordert standardmäßige Schutzmaßnahmen, einschließlich des Tragens eines Laborkittels, einer Einwegmaske und Handschuhe.

1. Vorbereitung des Gewebes

  1. Stellen Sie eine sterile 9 cm Petrischal....

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Ergebnisse

In dieser Studie ist es gelungen, metabolisch aktive Zellen im HCC-Gewebe nachzuweisen, ohne die Gewebearchitektur zu stören. Zunächst zeigten die Hellfeldbilder (Abbildung 1A), dass die Gewebeoberfläche eine dichte zelluläre Abdeckung und eine mehrschichtige Stapelung von Zellen über den Objektträger aufwies, was die erhaltene architektonische Integrität des HCC-Gewebes während der gesamten Kultur und Verarbeitung bestätigte. Bemerkenswert ist, dass Zellcluster innerhalb oberflächlicher Reg.......

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Diskussion

Die derzeitigen Methoden zum Nachweis lebensfähiger Zellen in situ stoßen nach wie vor an vielschichtige Einschränkungen. IHC und Immunfluoreszenz (IF), die häufig zur Identifizierung von Proliferationsmarkern oder Apoptose-verwandten Proteinen verwendet werden, leiden unter einer Störung der Membranintegrität, die durch die Formaldehydfixierung induziert wird7. Darüber hinaus ist die Antikörperpenetration in dicken Gewebeschnitten suboptimal

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde vom Science and Technology Bureau der Stadt Xiamen (Nr. 3502Z20227197) und dem Startup Fund for Scientific Research der Fujian Medical University (2021QH1240) finanziert. Wir danken Xianying Zhang, Jingjing Zhou und Shaocong Weng (Huaqiao Universität) für ihre technische Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
-80 & Grad; C-Gefrierschrank (aufrecht)Thermo Fisher ScientificTSX60086V
Clean Bench (vertikale laminare Strömung)AIRTECHSW-CJ-1FD
CO2 Inkubator (165 L)Thermo Fisher ScientificHeracell VIOS 160i (z. B. 51030400 / 51033559)
Coverslip (24& Times; 50 mm, #1,5)CITOGLAS (Citotest)0341-3610
Kulturpetrischale (90 mm)NEST752001 (Beispiel)
DAPI-enthaltendes MontagemediumBeyotimeP0131 (5 mL/25 mL)
DMEM (hoher Glukosespiegel mit Pyruvat)Invitrogen (Gibco)11995-065
FBS (Qualifiziert, US-Herkunft)Invitrogen (Gibco)A3160501
FluoreszenzmikroskopNikonECLIPSE Ti2-Serie
Einfrieren des Mikrotoms (Kryostat)LeicaCM1950
Mikroskop-Objektträger (einfach, 25& Times; 75 mm)CITOGLAS (Citotest)0317-0001
MTT-Reagenz (Pulver)BeyotimeST316
Nagellack (klar)Beyotime
NBF (Neutral Puffer-Formalin)Beyotime
OCT-VerbindungSAKURA (Sakura Finetek)4583
Optisches Mikroskop (aufrecht)NikonECLIPSE Ci-Reihe (z. B. Ci-L)
PBS (500 mL)BeyotimeC0221A
PFA, 4 % in PBS (fixativ)BeyotimeP0099
Pipettenspitze (1 ml, wenig bindend)KIRGENKG1313-L
Pipettenspitze (200 & Mikro; L)Axygen (Corning)T-200-Y (Bulk) / T-200-Y-R-S (gerackt, steril)
Pipettor (Einkanal)Thermo Fisher ScientificFinnpipette F2 (bereichsspezifische Katze#)
SkalpellHYSTICDas Modell variiert (z. B. Lieferantenreferenz 100022208326)
PinzetteHYSTICDas Modell variiert

Referenzen

  1. Forner, A., Reig, M., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 391 (10127), 1301-1314 (2018).
  2. Sun, Y. F., et al. Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of CTCs by single-cell RNA-seq in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. <....

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

MTT BildgebungMapping lebensf higer ZellenTumormikroumgebungTherapieresistenzFormazan KristalleEinzelzellisolation