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Methodenartikel
* These authors contributed equally
Hier stellen wir ein einfaches Protokoll vor, um die metabolisch aktiven Zellen im hepatozellulären Karzinomgewebe mittels MTT-basierter Kryosektionsbildgebung zu detektieren. Diese Methode kann auch verwendet werden, um aktive Zellen in situ in anderen Geweben oder Organen nachzuweisen.
Neue Erkenntnisse, einschließlich früherer Studien, deuten auf eine Subpopulation von Zellen im Gewebe des hepatozellulären Karzinoms (HCC) hin, die eine überlegene metabolische Aktivität und Stressresistenz aufweisen. Diese Zellen sind wichtige Treiber für das Fortschreiten des Tumors und die Therapieresistenz. Bestehende Methoden zum Nachweis lebensfähiger Zellen in situ beeinträchtigen jedoch häufig die Integrität des Gewebes, verändern die zelluläre Lebensfähigkeit oder sind technisch anspruchsvoll. In dieser Arbeit wird ein neuartiger, einfacher, zerstörungsfreier Ansatz für den in situ Nachweis von metabolisch aktiven Zellen in HCC-Geweben durch mitochondrienabhängige Reduktion von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) zu unlöslichen Formazankristallen vorgestellt. Durch die Optimierung der Gewebefragmentgröße (1 × 1 × 0,2 cm3), der Kulturbedingungen (20 % FBS, 1 mg/ml MTT und 3 h Inkubation mit intermittierender Verwirbelung) und der Kryosektionsparameter (20 μm Dicke, 4 % PFA-Fixierung und DAPI-Gegenfärbung) wurde eine räumliche Kartierung lebensfähiger HCC-Zellen innerhalb von 5 Stunden erreicht. Dieses kostengünstige Protokoll erfordert keine spezielle Ausrüstung und behält die Gewebearchitektur bei, was die räumliche Identifizierung von hochlebensfähigen und stressresistenten Zellclustern in Oberflächenregionen ermöglicht. Zu den Einschränkungen gehören ein fortschreitender Viabilitätsverlust über 6 h hinaus und eine Kristallverschiebung während des Schnitts, die durch FBS-Supplementierung und kontrolliertes Einfrieren gemildert werden kann. Diese Methode bietet eine praktische Plattform für die Einzelzellisolierung therapieresistenter Subpopulationen und bringt die Forschung an HCC-Mikroumgebungen voran.
Das hepatozelluläre Karzinom (HCC), die dritthäufigste krebsbedingte Todesursache weltweit, zeichnet sich durch eine hohe Heterogenität und Rezidivratenaus 1. Diese räumliche und zeitliche Heterogenität macht bestimmte Zellpopulationen innerhalb von Tumorgeweben aktiver als andere in Bezug auf Stoffwechsel, Proliferation, Progression, Stresstoleranz und Arzneimittelresistenz. Der In-situ-Nachweis lebensfähiger Zellen in HCC-Geweben ist von großer klinischer und biologischer Bedeutung, da diese Zellen proliferierende Subklone, therapieresistente Populationen und metastaseninitiierende Zellen umfassen. S....
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Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der Ethikkommission des ersten angeschlossenen Krankenhauses von Quanzhou (Nr. FJMU IACUC2021257). HCC-Gewebe wurde operativ entnommen und im Quanzhou First Hospital, das der Medizinischen Universität Fujian angegliedert ist, mit Einverständniserklärung der Patienten entnommen. Dieses Experiment erfordert standardmäßige Schutzmaßnahmen, einschließlich des Tragens eines Laborkittels, einer Einwegmaske und Handschuhe.
1. Vorbereitung des Gewebes
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In dieser Studie ist es gelungen, metabolisch aktive Zellen im HCC-Gewebe nachzuweisen, ohne die Gewebearchitektur zu stören. Zunächst zeigten die Hellfeldbilder (Abbildung 1A), dass die Gewebeoberfläche eine dichte zelluläre Abdeckung und eine mehrschichtige Stapelung von Zellen über den Objektträger aufwies, was die erhaltene architektonische Integrität des HCC-Gewebes während der gesamten Kultur und Verarbeitung bestätigte. Bemerkenswert ist, dass Zellcluster innerhalb oberflächlicher Reg.......
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Die derzeitigen Methoden zum Nachweis lebensfähiger Zellen in situ stoßen nach wie vor an vielschichtige Einschränkungen. IHC und Immunfluoreszenz (IF), die häufig zur Identifizierung von Proliferationsmarkern oder Apoptose-verwandten Proteinen verwendet werden, leiden unter einer Störung der Membranintegrität, die durch die Formaldehydfixierung induziert wird7. Darüber hinaus ist die Antikörperpenetration in dicken Gewebeschnitten suboptimal
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Diese Forschung wurde vom Science and Technology Bureau der Stadt Xiamen (Nr. 3502Z20227197) und dem Startup Fund for Scientific Research der Fujian Medical University (2021QH1240) finanziert. Wir danken Xianying Zhang, Jingjing Zhou und Shaocong Weng (Huaqiao Universität) für ihre technische Unterstützung.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| -80 & Grad; C-Gefrierschrank (aufrecht) | Thermo Fisher Scientific | TSX60086V | |
| Clean Bench (vertikale laminare Strömung) | AIRTECH | SW-CJ-1FD | |
| CO2 Inkubator (165 L) | Thermo Fisher Scientific | Heracell VIOS 160i (z. B. 51030400 / 51033559) | |
| Coverslip (24& Times; 50 mm, #1,5) | CITOGLAS (Citotest) | 0341-3610 | |
| Kulturpetrischale (90 mm) | NEST | 752001 (Beispiel) | |
| DAPI-enthaltendes Montagemedium | Beyotime | P0131 (5 mL/25 mL) | |
| DMEM (hoher Glukosespiegel mit Pyruvat) | Invitrogen (Gibco) | 11995-065 | |
| FBS (Qualifiziert, US-Herkunft) | Invitrogen (Gibco) | A3160501 | |
| Fluoreszenzmikroskop | Nikon | ECLIPSE Ti2-Serie | |
| Einfrieren des Mikrotoms (Kryostat) | Leica | CM1950 | |
| Mikroskop-Objektträger (einfach, 25& Times; 75 mm) | CITOGLAS (Citotest) | 0317-0001 | |
| MTT-Reagenz (Pulver) | Beyotime | ST316 | |
| Nagellack (klar) | Beyotime | — | |
| NBF (Neutral Puffer-Formalin) | Beyotime | — | |
| OCT-Verbindung | SAKURA (Sakura Finetek) | 4583 | |
| Optisches Mikroskop (aufrecht) | Nikon | ECLIPSE Ci-Reihe (z. B. Ci-L) | |
| PBS (500 mL) | Beyotime | C0221A | |
| PFA, 4 % in PBS (fixativ) | Beyotime | P0099 | |
| Pipettenspitze (1 ml, wenig bindend) | KIRGEN | KG1313-L | |
| Pipettenspitze (200 & Mikro; L) | Axygen (Corning) | T-200-Y (Bulk) / T-200-Y-R-S (gerackt, steril) | |
| Pipettor (Einkanal) | Thermo Fisher Scientific | Finnpipette F2 (bereichsspezifische Katze#) | |
| Skalpell | HYSTIC | Das Modell variiert (z. B. Lieferantenreferenz 100022208326) | |
| Pinzette | HYSTIC | Das Modell variiert |
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