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Methodenartikel

Überexpression und Reinigung einer toxischen Nuklease aus Escherichia coli

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DOI:

10.3791/68577

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29. August 2025

 , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, College of Charleston

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird eine Methode zur Überexpression von rekombinantem Nsp15, einer toxischen Nuklease, in einem C41(DE3)-Expressionssystem beschrieben, gefolgt von der Aufreinigung des markierten Proteins mittels Affinitäts- und Größenausschlusschromatographie. Diese Protokolle können für andere anspruchsvolle toxische Proteine angepasst werden.

Zusammenfassung

Escherichia coli wird häufig als Expressionssystem zur Herstellung rekombinanter Proteine eingesetzt. Einige Arten von rekombinanten Proteinen, wie z. B. Nukleasen, können jedoch aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität auf zellulärer DNA oder RNA in E. coli nur schwer rekombinant überexprimiert werden. Solche toxischen Wirkungen können zu langsamem Wachstum und schlechten Proteinerträgen führen. Ein Beispiel dafür ist die Endoribonuklease Nsp15 aus Coronaviren: Die Ausbeute des Wildtyp-Gamma-Coronavirus Nsp15 ist viel geringer als die des katalytisch inaktiven Nsp15. Um dieses Problem zu lösen, haben wir die Verwendung von C41(DE3)-Zellen und Einzelkolonie-Starterkulturen am selben Tag eingesetzt, um die Toxizität zu reduzieren. Rekombinantes Nsp15, das einen N-terminalen 6xHis-Tag enthielt, wurde überexprimiert und mittels Kobalt-basierter Affinitätschromatographie aufgereinigt, gefolgt von einer Größenausschlusschromatographie (SEC). Die daraus resultierenden Ausbeuten an gereinigtem Protein sind ausreichend für biochemische Assays und Strukturstudien der Kryo-Elektronenmikroskopie. Dieser Ansatz hat sich als wirksam erwiesen, um die toxischen Wirkungen zu mildern und zufriedenstellende Proteinausbeuten für weitere Forschungsanalysen zu erzielen.

Einleitung

Escherichia coli (E. coli) ist ein Bakterium, das häufig zur Herstellung rekombinanter Proteine verwendet wird. Zahlreiche mutierte Stämme, darunter BL21(DE3) und seine Derivate, wurden entwickelt, um Zielproteine zu exprimieren1. Der Prozess wird typischerweise durch eine kodierte Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase angetrieben und mit Isopropyl ß-D1-thiopalactopyranosid (IPTG) induziert, einem Analogon von Laktose, das das lac-Operon aktiviert, indem es den lac-Repressor 1,2,3 freisetzt. Da es nicht hydrolysierbar ist, kommt es zu einer kontinuierlichen mRNA-Expression und einer höheren Proteinproduktion3.

Während diese Art von System für viele Proteine praktisch und konsistent ist, induzieren einige Arten von rekombinanten Proteinen Toxizität in E. coli, was zu schlechten Proteinausbeuten führt. Die Toxizität durch das Vorhandensein von rekombinantem Protein, das sich negativ auf die Bakterien auswirkt, kann auf eine undichte Expression vor der Induktion oder auf Stress für die Bakterien bei der Induktion zurückzuführensein 3,4. Das Ergebnis ist eine Abnahme der Wachstumsrate und Lebensfähigkeit von Bakterien5. Die Unterdrückung der undichten Expression kann eine wichtige Rolle bei der erfolgreichen Expression toxischer Proteine spielen. Expressionsstämme von E. coli mit pLysS-Plasmiden (d. h. BL21(DE3)pLysS, C41(DE3)pLysS usw.) unterdrücken die undichte Expression, indem sie ein T7-Lysozym exprimieren, das die T7-Polymerase vor der Induktion hemmt 6,7. Andere Stämme, wie z. B. C41(DE3)- und C43(DE3)-Stämme, enthalten Mutationen, die die Aktivität der T7-Polymerase reduzieren, indem sie ihre mRNA-Spiegel senken und die lon- und ompT-Proteasen 1,4,8,9,10 entfernen. Die Unterdrückung der undichten Expression oder die Verringerung der Rate der rekombinanten Proteinproduktion (durch T7-Polymerase-Regulation oder verringerte Temperaturen) trägt dazu bei, die Ausbeute an toxischen Proteinen zu erhöhen 1,9.

Nukleasen sind aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität gegenüber zellulärer DNA oder RNA1 oft toxische und schwer zu exprimierende Proteine, wenn ein E. coli-Expressionssystem verwendet wird. Zum Beispiel ist die Endoribonuklease Nsp15, die in Coronaviren und anderen Nidoviren vorkommt, giftig für die Bakterien, was zu einer langsameren Wachstumsrate und niedrigen Erträgen führt 11,12,13,14,15,16,17. Aufgrund seiner katalytischen Rolle, der Spaltung von 3'-Uridinen in viraler RNA, wird angenommen, dass Nsp15 sowohl auf seine eigene als auch auf zelluläre mRNA wirkt, wenn es rekombinant exprimiert wird, was zu einer Dysregulation des Stoffwechsels und der rekombinanten Proteinexpression führt11,14. Für Nsp15 ist die Oligomerisierung für die enzymatische Aktivität notwendig. Frühere Studien mit dem Beta-Coronavirus (wie SARS und SARS-CoV-2) Nsp15 zeigten, dass das Enzym in Lösung hauptsächlich zu einem Homohexamer oligomerisiert, wobei die monomere Form inaktiv ist 16,18,19,20. Bei der Mutation, um nur Monomere zu bilden, wurden signifikante Ertragssteigerungen beobachtet14. Darüber hinaus wurde bei der Mutation eines der katalytischen Reste innerhalb der katalytischen Triade zu einem Alanin eine verbesserte Expression unter den gleichen Bedingungen wie bei der WT beobachtet, was weiter unterstützt, dass die Toxizität von Nsp15 gegenüber E. coli durch seine Nukleaseaktivität bestimmt wird 13,16,17. In diesem Protokoll zeigen wir den Unterschied in der Ausbeute zwischen dem WT-Gamma-Coronavirus (Infectious Bronchitis Virus) Nsp15 und einer katalytisch-toten Version, die durch Mutation eines der katalytischen Histidinreste (H223A) erreicht wurde.

Hier beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Überexpression von rekombinantem Nsp15 in einem C41(DE3)-Expressionssystem, gefolgt von einer Proteinaufreinigung durch Affinitäts- und Größenausschlusschromatographie. Zur Isolierung des Proteins wird ein N-terminaler 6x His-Tag mit kobaltbasierter immobilisierter Metallaffinitätschromatographie (IMAC) eingesetzt. Eine weitere Aufreinigung wird mittels SEC durchgeführt, um Nsp15 nach oligomerem Zustand zu trennen und die aktiven hexameren Spezies zu isolieren. Dieser Ansatz bietet eine Methode zur Überexprimation und Reinigung toxischer Nukleasen für biochemische und strukturelle Studien.

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Protokoll

1. Vorbereitung für Puffer und Reagenzien

  1. Reagenzien für Überexpression
    1. Bereiten Sie 1 l 2xTY-Medium vor, indem Sie 16 g Trypton, 10 g Hefeextrakt, 5 g Natriumchlorid (NaCl) und 900 ml deionisiertes Wasser in einem 2-Liter-Isolierkolben kombinieren. Autoklavieren Sie den Kolben mindestens 30 Minuten lang im Flüssigkeitskreislauf.
      HINWEIS: Pro Reinigung werden mindestens 2 l 2xTY-Medien benötigt.
    2. Bereiten Sie geeignete Antibiotika-Vorräte für das Plasmid vor. Für Nsp15-pET-14b stellen Sie 15 ml 100 mg/ml Ampicillin her, indem Sie 1,5 g Ampicillin mit deionisiertem Wasser in einem konischen 15-ml-Röhrchen auflösen. Lagern Sie die Antibiotika-Vorräte bis zur Verwendung bei -20 °C.
    3. Bereiten Sie 250 ml Lysogeny Broth (LB)-Agarmedium vor, indem Sie 2,5 g Trypton, 1,25 g Hefeextrakt, 2,5 g NaCl, 3,75 g Agarose und 250 ml deionisiertes Wasser in einer 500 ml-Glasflasche kombinieren. Sterilisieren Sie die Lösung, indem Sie sie mindestens 30 Minuten lang im Flüssigkeitszyklus autoklavieren und abkühlen lassen, bis sie sich warm anfühlt.
    4. Bereiten Sie LB-Agarplatten vor, die mit Ampicillin ergänzt werden, indem Sie 25 ml des warmen LB-Agar-Mediums in einen sterilisierten 250-ml-Erlenmeyerkolben (25 ml pro herzustellender Platte) überführen. Fügen Sie 25 μl 100 mg/ml Ampicillin pro 25 ml Medium hinzu und schwenken Sie, um den Inhalt zu kombinieren. Geben Sie mit einer serologischen Pipette 25 ml Medienmischung in eine sterile Petrischale aus Kunststoff. Vermeiden Sie die Einführung von Blasen.
      1. Verhindern Sie eine Kontamination, indem Sie den Labortisch mit 20 % Ethanol abwischen und einen Bunsenbrenner anzünden, um die Sterilität beim Ausgießen der Platten aufrechtzuerhalten.
      2. Lassen Sie die Platten abkühlen, bevor Sie sie bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C lagern.
    5. Bereiten Sie 15 ml 1 M IPTG vor, indem Sie 3,574 g IPTG mit deionisiertem Wasser in einem konischen 15-ml-Röhrchen auflösen. Bis zur Verwendung bei -20 °C lagern. Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-/Auftauzyklen, indem Sie in drei 5-ml-Aliquote aliquotieren.
  2. Reagenzien zur Reinigung
    HINWEIS: Alle Reagenzien sollten mindestens einen Tag vor der Reinigung hergestellt werden
    1. Bereiten Sie 250 mL Lysepuffer (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 5 % Glycerin, 5 mM Imidazol) vor und lagern Sie es bei 4 °C.
    2. Bereiten Sie 15 mL Elutionspuffer (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 5% Glycerin, 250 mM Imidazol) vor und lagern Sie ihn bis zur Verwendung bei 4 °C.
    3. Bereiten Sie 250 mL Spaltpuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 % Glycerin) vor und lagern Sie es bis zur Verwendung bei 4 °C.
    4. Bereiten Sie 1 l SEC-Puffer (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM MnCl2) vor und filtrieren Sie durch einen 0,22 μm PES-Filter mittels Vakuumfiltration. Mit FPLC bei 4 °C lagern.
    5. Bereiten Sie 15 ml 1 M 4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluoridhydrochlorid (AEBSF) vor, indem Sie 3,595 g AEBSF mit deionisiertem Wasser in einem konischen 15-ml-Röhrchen auflösen. Stellen Sie 1 ml-Aliquote in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen her und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei -20 °C.
    6. Optional: Bereiten Sie den Mastermix für Natriumdodecylsulfat (SDS)-Gelladepuffer vor, indem Sie 200 μl Stammlösung (250 mM Tris pH 6,8, 8 % SDS, 0,1 % Bromphenolblau, 40 % Glycerin, 100 mM DTT) in 400 μl deionisiertem Wasser verdünnen.
    7. Bereiten Sie Gelprobenröhrchen vor, um die Aufreinigung zu verfolgen. Übertragen Sie 30 μl 1x Ladepuffer in jedes Röhrchen.
    8. Bereiten Sie 1 l 10x Tris-Glycin-Laufpuffer vor, indem Sie 30 g Trisbase, 144 g Glycin und 20 g SDS in 1000 ml entionisiertem Wasser auflösen. Für eine 1x-Lösung verdünnen Sie 100 mL der 10x-Lösung in 900 mL entionisiertem Wasser in einer 1-Liter-Flasche. Lagern Sie beide Reagenzien bis zur weiteren Verwendung bei Raumtemperatur.

2. Nsp15-Überexpression

HINWEIS: Alle Reagenzien und Materialien sollten so steril wie möglich aufbewahrt werden, um das Risiko einer Kontamination zu vermeiden.

  1. Transformation
    1. C41(DE3) E. coli-Zellen bei -80 °C entfernen und 10 min auf Eis auftauen. Pipettieren Sie 1 μl Plasmid-DNA in ein Röhrchen, das die C41-Zellen enthält. Lassen Sie es 30 Minuten auf Eis inkubieren.
      HINWEIS: Obwohl die Konzentrationen von Plasmiden variieren können, wurden für die hier beschriebenen Daten 10-20 ng DNA pro Transformation hinzugefügt. Das kommerzielle Protokoll für C41(DE3)-Zellen empfiehlt 10-50 ng DNA pro Transformation. Dieses Protokoll ist auf jedes Plasmid anwendbar, das das T7-Promotorsystem verwendet. hier wurde jedoch ein zuvor veröffentlichtes pET14b-Plasmid, das für Codon-optimiertes Nsp15 kodiert, mit einer TEV-Stelle, die der N-terminalen 6xHis-Tag- und Thrombin-Spaltstelle folgt, modifiziert, indem SARS-CoV-2 Nsp15 durch die IBV-Nsp15-Sequenz ersetzt wurde (GENBANK: WIL95322.1, 5989-6324)19.
    2. Legen Sie das Rohr für 45 s bei 42 °C in einen Wärmeblock, um die Zellen mit einem Hitzeschock zu schocken und die Plasmide aufzunehmen. Inkubieren Sie das Röhrchen 2 Minuten lang auf Eis.
    3. Pipettieren Sie 200 μl Rückgewinnungsmedium (SOC oder andere Rich Media) in das Röhrchen, das die C41(DE3)-Zellen und Plasmide enthält. Bei 210 U/min 1 h bei 37 °C schütteln.
    4. Mit Ampicillin versetzte LB-Agarplatten aus 4 °C herausnehmen und in einen auf 37 °C eingestellten, schüttelfreien Inkubator stellen.
    5. Pipettieren Sie Bakterien auf der Agarplatte. Verteilen Sie die Zellen mit einem sterilen Spreizer auf der Agarplatte. Stellen Sie die Platte in einen wackelfreien Inkubator, der auf 37 °C eingestellt ist, um 14-16 Stunden lang zu wachsen.

3. Wachstum

  1. Kommissionierung einzelner Völker
    HINWEIS: Zur Inokulation der Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden am selben Tag Einzelkolonie-Starter anstelle einer Starterkultur über Nacht verwendet. Bei Übernachtkulturen befinden sich die Zellen typischerweise in der stationären oder todbringenden Phase, insbesondere bei toxischen Proteinen. Darüber hinaus können bei längeren Kulturzeiten Kontaminanten oder Mutanten die toxische Nuklease verdrängen.
    1. Verwenden Sie einen sterilisierten 50-ml-Erlenmeyerkolben für jeden l Kultur plus 2-3 zusätzliche Starter. Einer der Kolben ist mit einem Stern für die Überprüfung der optischen Dichte (OD) zu beschriften. Der aus diesem Kolben gesammelte OD stellt das gesamte Wachstum dar, es sei denn, es besteht ein visueller Unterschied zwischen den Kolben.
      HINWEIS: Es wurde festgestellt, dass Erlenmeyerkolben eine bessere Belüftung bieten als 15-ml-Startröhrchen.
    2. Erstellen Sie einen Mastermix aus 2xTY plus geeigneten Antibiotika mit einem Volumen von 10 mL x N Anzahl von Startern. Für ein Wachstum von 4 L machen Sie 6 Starterkulturen. Der Mastermix besteht aus 60 μl Ampicillin-Stamm (aufgetaut von -20 °C) und 60 mL 2xTY (1:1000 Verdünnung). Zum Mischen schwenken und 10 mL in jeden Erlenmeyer aliquotieren.
    3. Nehmen Sie die transformierte Platte aus dem Inkubator. Zupfen Sie eine einzelne, isolierte Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher oder einer Pipettenspitze von der Platte. Den Zahnstocher mit der Kolonie in einen Kolben mit Medium geben. Wiederholen Sie den Vorgang, bis jeder Kolben einen Zahnstocher enthält.
    4. Die inokulierten Starterkolben werden bei 210 U/min und 37 °C in den Schüttelinkubator gestellt. Lassen Sie die Starterkolben ~5-7 h wachsen.
  2. Kultur-Impfung
    1. Nach 5 Stunden wird der OD bei 600 nm (OD600) des mit einem Stern markierten Kolbens mit einer Mikroküvette und einem Spektrometer überprüft. 1 ml der Kultur aus dem Kolben entnehmen und in eine Mikroküvette überführen. Wiederholen Sie die Messungen regelmäßig, bis der OD600 0,8-1,0 erreicht.
    2. 30 min bis 1 h vor der Inokulation (wenn OD600 0,4 erreicht) die 2 L 2xTY Kolben auf 37 °C erwärmen. Warme Medien reduzieren die Verzögerungszeit nach der Inokulation mit der Starterkultur.
    3. Tauen Sie eine Ampicillin-Brühe von 100 mg/ml bei -20 °C auf. Sobald der Ziel-OD600 erreicht ist, bereiten Sie vier 2-Liter-Kolben mit 1 l 2xTY-Medium vor, indem Sie 1 ml 100 mg/ml Ampicillin (1:1000-Verdünnung) hinzufügen.
    4. Zum Beimpfen wird der Inhalt eines Startkolbens in einen 2-Liter-Kolben gegossen. Wiederholen, bis jeder 2-Liter-Kolben geimpft ist. Vermeiden Sie es, den Zahnstocher in den Kolben zu gießen, um die Zellernte zu erleichtern.
    5. Legen Sie die inokulierten 2-Liter-Kolben bei 210 U/min und 37 °C für 3 h in den Schüttelinkubator, bevor Sie den ersten OD600 überprüfen.
  3. Induktion mit IPTG
    1. Überprüfen Sie den OD600 , indem Sie 1 ml des Mediums mit einer serologischen Pipette aus einem Kolben entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der OD600 0,8-1,0 erreicht.
    2. Sobald der Zielwert OD600 erreicht ist, fügen Sie 1 ml 1 M IPTG für eine Endkonzentration von 1 mM (aufgetaut von -20 °C) hinzu, um eine Überexpression zu induzieren.
    3. Die 2-l-Kolben werden bei 210 U/min und 16 °C in einen Schüttelbrutkasten überführt, um sie über Nacht (14-16 h) zu induzieren.
      HINWEIS: Die kältere Temperatur verlangsamt das Wachstum der E. coli-Zellen und verringert die Toxizität, indem die Proteinproduktion und die Nukleaseaktivität verlangsamt werden.
  4. Ernte
    1. Nehmen Sie die induzierten Kolben aus dem Schüttelinkulator und gießen Sie den Inhalt in separate 1-l-Zentrifugenflaschen. Balancieren Sie die Flaschen mit entionisiertem Wasser. Schleudern Sie die Zellen bei 4500 x g für 10 min bei 4 °C herunter.
    2. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie das Pellet mit einem Spatel in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Kombinieren Sie die Pellets in einem einzigen konischen Rohr. Bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C lagern.

4. Nsp15-Reinigung

HINWEIS: Alle Puffer und Röhren sollten auf Eis aufbewahrt werden. Alle Zentrifugationsschritte sollten bei 4 °C durchgeführt werden. Das folgende Protokoll geht von einem His-markierten Protein aus.

OPTIONAL: Nach jedem Schritt können Gelproben entnommen werden, um den Reinigungsfortschritt zu verfolgen.

  1. Zelllyse und Lysatklärung
    1. Resuspendieren Sie das Bakterienpellet, indem Sie 2 ml Lysepuffer pro 1,2 g Pellet hinzufügen. 100 μl 1 M AEBSF pro 10 ml Lysepuffer als Proteaseinhibitor zugeben. Wenn Sie ein kombiniertes Pellet aus 4 l verwenden, fügen Sie 100 μl DNase I für eine Endkonzentration von 200 U hinzu.
      HINWEIS: Eine EDTA-freie Proteasehemmer-Cocktailtablette pro l kann als Proteasehemmer substituiert werden.
    2. Den Inhalt des Rohres 30 s lang kurz vortexen, damit sich das Pellet und der Puffer vermischen können. Übertragen Sie das verwirbelte Pellet in eine Dounce Tissue-Mühle. Mit einem losen Stößel den Inhalt homogenisieren (~10 Hübe).
    3. Übertragen Sie die homogenisierte Probe zur Beschallung in ein Metallbecherglas.
      1. Um sicherzustellen, dass die maximale Probe erhalten wird, spülen Sie das Röhrchen mit dem ursprünglichen Pellet mit 5 mL Lysepuffer und wirbeln Sie das Röhrchen kurz ein. Gießen Sie den Inhalt in den Dounce Homogenisator, wenden Sie ~5 Hübe an und geben Sie ihn dann in das Ultraschallbecherglas.
    4. Geben Sie 75 μl Triton X-100 in das Metallbecherglas, um die Membranlyse und Solubilisierung zu unterstützen. Stellen Sie das Metallbecherglas in ein Eisbad, um sicherzustellen, dass die Probe während der Beschallung kalt bleibt.
    5. Setzen Sie die Beschallungssonde in das Metallbecherglas ein und beschallen Sie die Probe 6 Minuten und 30 s lang mit Impulsen alle 2 s und einer Amplifikation bei 70 %.
      ACHTUNG: Verwenden Sie einen Gehörschutz, wenn die Ultraschallsonde nicht eingeschlossen ist.
    6. Übertragen Sie das Lysat mit einer serologischen Pipette in ein Zentrifugenröhrchen. In dasselbe Röhrchen wird 1 M AEBSF in einer Verdünnung von 1:100 als frischer Proteaseinhibitor gegeben. Das Lysat durch Zentrifugation bei 26.915 x g für 50 min klären.
  2. Affinitätschromatographie durch Schwerkraftfiltration
    HINWEIS: Kobaltharz verringert die unspezifischen Metallbindemittel im Vergleich zu Nickelharz21 erheblich.
    1. Während der Beschallung werden 2 ml Kobaltharzaufschlämmung gewonnen und mit 25 ml Lysepuffer in einem neuen konischen Röhrchen resuspendiert. Zentrifugieren Sie das resuspendierte Harz für 5 min bei 500 x g. Gießen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand ab und achten Sie darauf, dass kein Harz verloren geht.
    2. Wiederholen Sie den Vorgang mit zwei separaten 25-ml-Lysepufferwaschungen, gefolgt von einer Zentrifugation. Gießen Sie den Überstand der letzten Wäsche nicht ab, bis Sie bereit sind, die Charge zu binden. Wenn Sie fertig sind, gießen Sie den Lysepuffer aus der letzten Harzwäsche aus und resuspendieren Sie das Harz mit 10 mL frischem Lysepuffer (10 mL Puffer pro 1 mL Harz).
    3. Geben Sie die lösliche Fraktion in das Röhrchen und lassen Sie das 6x His-markierte Protein 45 Minuten lang bei 4 °C auf einer Wippe an das Harz binden.
      HINWEIS: Wenn das Batch-Bindevolumen 50 mL überschreitet, führen Sie diesen Schritt in einem 250-ml-Becherglas mit einem Rührstab bei sehr langsamer Geschwindigkeit bei 4 °C durch. Übertragen Sie das gesamte Harz in das Becherglas, wenn Sie diesen Schritt mit Lysepuffer durchführen.
    4. Nach der Chargenbindung wird der Inhalt in eine Schwerkraftfiltrationssäule gegossen und der Durchfluss in einem 125-ml-Erlenmeyerkolben aufgefangen. Der Inhalt des Kolbens sollte aus Proteinen bestehen, die nicht an das Harz gebunden sind. Das mit His-Tag versehene Nsp15 wird an das Harz gebunden. Waschen Sie das Harz mit einem separaten Kolben für die Entnahme mit 8 x 25 mL Puffer für insgesamt mindestens 200 mL (~5x das ursprüngliche Volumen) mit einer serologischen Pipette.
      HINWEIS: Geben Sie den Puffer langsam an der Seite der Säule und nicht direkt in der Mitte, um eine Störung des Harzbetts zu vermeiden, die zu einer ineffizienten oder ungleichmäßigen Reinigung führen kann.
  3. Protein-Elution
    1. Eluieren Sie das His-markierte Nsp15 in drei Elutionen mit Elutionspuffer. Die Elutionen 1 und 2 sind 2-ml-Elutionen, und Elution 3 ist eine 1-ml-Elution.
    2. Führen Sie einen "schnellen und schmutzigen" Bradford-Assay durch, indem Sie eine 1:1-Verdünnung des Bradford-Reagenzes in Wasser vornehmen. Übertragen Sie 10 μl jeder Elution in Röhrchen und invertieren Sie sie, um sie zu mischen. Die Lösung sollte in Gegenwart von Protein blau werden. Bewerten Sie die Farbänderung, um zu bestimmen, wie Elutionen kombiniert werden sollen.
      HINWEIS: Wenn die Elutionen 1 und 2 stark und die Elution 3 schwach sind, kombinieren Sie die Elutionen 1 und 2 und fahren Sie fort. Wenn alle schwach sind, kombinieren Sie alle drei Röhren.
  4. Proteinkonzentration und Tag-Spaltung
    1. Übertragen Sie die kombinierte Elutionsprobe in einen 30 kD MWCO-Konzentrator (oder eine geeignete Größe für das gewünschte Protein). Konzentrieren Sie das Protein auf ≤2 mL, indem Sie 10 Minuten lang bei 3.000 x g zentrifugieren. Übertragen Sie die konzentrierte Probe in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Das endgültige Probenvolumen wird bei Bedarf mit Spaltpuffer auf 2 mL erhöht.
    2. Bereiten Sie eine Einweg-Entsalzungssäule (z. B. PD-10-Säule) gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Geben Sie die 2-ml-Probe in die Säule. Legen Sie die Säule in ein sauberes konisches 50-ml-Röhrchen und eluieren Sie sie durch Zentrifugation bei 1.000 x g für 2 Minuten.
      HINWEIS: Dieser Schritt entfernt schnell das Imidazol, das die Thrombinspaltung beeinträchtigt und gleichzeitig eine konzentrationsinduzierte Aggregation vermeidet, wenn MWCO-Konzentratoren zum Pufferaustausch verwendet werden.
    3. Fügen Sie dem Eluat β-Me und CaCl2 bis zu einer Endkonzentration von jeweils 2 mM hinzu. 50 μl eines Thrombinstocks von 1 U/μl zugeben. Nachdem alle Komponenten hinzugefügt wurden, stellen Sie das Röhrchen aufrecht auf einen Schüttler und lassen Sie die Reaktion 4 Stunden lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren.
      HINWEIS: Eine Spaltung über Nacht bei 4 °C kann für einige Proteine funktionieren; Verbesserte Erträge von Nsp15 wurden bei einer Spaltung von 4 Stunden bei RT im Vergleich zu einer Teilung über Nacht von 4 °C beobachtet.
    4. Die Schwerkraftfiltrationssäule im Spaltpuffer wieder ins Gleichgewicht bringen (3x mit 25 mL Spaltpuffer waschen). Stellen Sie sicher, dass der Absperrhahn geschlossen ist, und fügen Sie 5 ml Spaltpuffer hinzu, um ein Austrocknen des Harzes zu verhindern. Lagern Sie die Säule während der Spaltzeit bei 4 °C.
  5. Trennung von gespaltenem Protein von gespaltenem His-Tag und ungespaltenem Protein
    1. Pipettieren Sie die Spaltreaktion mit einer serologischen Pipette vorsichtig direkt auf das Harz und sammeln Sie das Eluat in einem konischen 15-ml-Röhrchen.
    2. Waschen Sie das Harz mit 2 mL Spaltpuffer und sammeln Sie es in derselben 15 mL Tube. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt zwei Wäschen. Wenn Sie fertig sind, fügen Sie AEBSF zum Röhrchen hinzu, um das Thrombin abzuschrecken und eine Endkonzentration von 10 mM zu erreichen.
    3. Überführen Sie die Repass-Probe in einen neuen 30 kD MWCO-Konzentrator. Konzentrieren Sie das Protein durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 10 min auf ≤500 μL. Übertragen Sie die konzentrierte Probe in ein 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  6. Größenausschluss-Chromatographie
    1. Führen Sie eine analytische S200-Säule (oder eine andere geeignete Dimensionierungssäule für das gewünschte Protein) gemäß den Herstellerspezifikationen durch. Äquilibrieren Sie in einem SEC-Puffer und stellen Sie die Größe der FPLC-Fraktion auf 500 μl ein.
    2. Übertragen Sie ausgewählte Fraktionsröhrchen von den Peaks in neue 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie jeder Fraktion 2,5 μl 1 M DTT (Endkonzentration 5 mM) hinzu, um das gereinigte Nsp15 zu reduzieren.
    3. Messen Sie die A280-Werte jeder Fraktion mit einem Nano-Spektralphotometer. Leeren Sie das Gerät mit einem SEC-Puffer, bevor Sie Messungen durchführen. Lagern Sie die gereinigten Nsp15-Proben bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.
  7. Optional: Reinigungskontrolle
    1. Erhitzen Sie die Gel-Probenröhrchen auf einem 95 °C heißen Heizblock für 10 min. Zentrifugieren Sie die Röhrchen nach dem Erhitzen kurz, um eventuelles Kondenswasser zu reduzieren. Laden Sie die Proben auf 4-20% fleckenfreies Mini-Protean TGX Gel/s und lassen Sie sie 17 Minuten lang bei 300 V laufen. Bilden Sie das/die Gel(e) ab, um die Reinheit zu überprüfen.

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Ergebnisse

Aufgrund der Toxizität von Nsp15 als Nuklease wurden in der Regel insgesamt ~7 h benötigt, bis die Starterkulturen einen OD600 von 0,8-1,0 erreichten. Nach der Inokulation waren in der Regel insgesamt ~3-5 h für den gleichen optimalen OD600 von 0,8-1,0 für die Induktion erforderlich. In diesem Fall schien die Verdopplungszeit ~1 h zu betragen. Wenn eine katalytisch-tote Mutante von Nsp15 exprimiert wurde, schien die Verdopplung für die E. coli-Zellen normal zu sein (~20 min), ein weiterer B...

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Diskussion

Wir haben ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das zur erfolgreichen Überexpression einer toxischen Nuklease in E. coli und zur Aufreinigung mittels Affinitäts- und Größenausschlusschromatographie führt. Die Implementierung von 10-ml-Starterkulturen mit einer Kolonie am selben Tag anstelle von Starterkulturen über Nacht erhöhte die Konsistenz der Wachstumszeiten und der Proteinerträge über die Wachstumszyklen hinweg. Wir haben uns für die Verwendung von C41(DE3)-Zellen entsc...

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Offenlegungen

Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch die Anschubfinanzierung der College of Charleston School of Natural and Environmental Sciences, das College of Charleston Undergraduate Research and Creative Activities Summer Undergraduate Research with Faculty Grant und den SC INBRE DRP Sub-Award von P20GM103499 finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,22 &Mikro; m PES, Sterilisierend, Geringe Proteinbindung, Filtersystem, 1 LCorning431098
AEBSF Serin-Protease-InhibitorGoldbio30827-99-7
Agar, bakteriologischAmrescoNr. J637
Ä KTA go ReinigungssystemCytiva29383015
Amicon Ultra 15 mL, 30 kDa MWCO-KonzentratorMilliporeUFC903024
Ampicillin-NatriumGoldbioNr. A-301-25
Schüttelkolben mit LeitwändenNalgene Nr. F0527
Tisch-ZentrifugeEppendorf 5920R
BioPhotometer plusEppendorfE-BP6132
Thrombin vom RindBioPharm91-030
Bradford-Farbstoff-ReagenzBoston BioProductsBPA-200
BromphenolblauSigma-Aldrich114931
CalciumchloridSigma-AldrichNr. C4901
Digitales TrockenbadBio Rad1660562
Einweg-Streuer, L-förmigMedSupply Partner62-1014-1
DithiothreitolGoldbio27565-41-9
DNaseI aus der Bauchspeicheldrüse des RindesSigma-AldrichNr. D4527
Douce Tissue-Schleifmaschine, 40 mLWheaton357546
Econo-Säulen-Chromagtographie-SäulenBio-Rad737-1532
Enduro Minimix NutmischerLabnetNr. S0600
EthanolSigma-Aldrich459844
Excella E25R Inc/Ref SchüttlerEppendorfNB-E25R
FastPette V2LabnetP2000
Fiberlite F10-4x1000 LEX FestwinkelrotorThermo Fisher Scientific096-041075
Fiberlite F21-8x50y Bremsscheibe mit festem WinkelThermo Fisher Scientific096-084275
Gel Doc EZ ImagerBio-Rad1708270
GlycerinSigma-AlrichNr. G5516
GlycinBio-Rad161-0718
HEPESSigma-AldrichNr. H3375
Rührer mit HeizplatteVWR12365-346
SalzsäureVWRBDH3028
ImidazolGoldbioI-902-25
Isopropyl-ß-D-Thiogalactiosid (IPTG)GoldbioArtikel-Nr.: 12481C25
Lemo21(DE3) kompetente E. coli-ZellenNeuengland BiolaboreNr. C2528J
Mangan(II)-chlorid-TetrahydratSigma-AldrichNr. M3634
Mikrozentrifugenröhrchen, 0,5 mLVWR87003-290
Mikrozentrifugenröhrchen, 1,7 mLMedSupply Partner15-1151
Mikrozentrifugenröhrchen, 2 mLAxygenMCT-200-C
Mini-PROTEAN Tetra vertikale ElektrophoresezelleBio-Rad10025025
Mini-Protean Tris-Glycin-Gele, 4-20%Bio-Rad4568094
MyFuge Mini-ZentrugeMedSupply PartnerNr. C1008-B
Nalgene 1 L Super-Speed-ZentrifugenflascheThermo Fisher Scientific3141-1006
Nalgene Zentrifugenröhrchen aus EichenkammThermo Fisher Scientific31139-0050
NanophotometerImplen3769
Wackelfreier InkubatorLabnetI 5110 
Overexpress C41(DE3) chemisch kompetente ZellenBiosearch-Technologien60442-1
Overexpress C41(DE3) chemisch kompetente ZellenSigma-AldrichCMC0017Unterbrochen; Biosearch C41(DE3)-Zellen oder NEB Lemo21-Zellen sind eine Alternative
PetrischalenMedSupply Partner62-1077-3
Plasmide (pET-14b-Rückgrat)Genscript (Englisch)Sonderanfertigung
Mikroküvetten aus KunststoffFisher Scientific14955127
PowerPacuniversal NetzteilBio-Rad1645070
Präzisions-GleitnadelBecton Dixon305198
Präzision plus proteinungefärbte StandardsBio-Rad1610363
Rückgewinnungsmedium für die ÄußerungSigma-AldrichCMR0001K
S-4x1000 schwingender SchaufelrotorEppendorfEP-S4X1
Serologische Pipette, 10 mLFaclon357551
Serologische Pipette, 25 mLFaclon35725
Serologische Pipette, 5 mLFaclon35743
Serologische Pipette, 50 mLPr1maPR-Sero-50
NatriumchloridSigma-AldrichNr. S9888
NatriumdodecylsulfatSigma-AldrichNr. L3771
NatriumhydroxidSigma-Aldrich567530
Schall-DismembratorFisher ScientificFB505
Sorvall Lynx 4000 ZentrifugeThermo Fisher Scientific75006580
Spephadex G-25 M PD-10 SäuleCytiva17085101
ß-MercaptoethanolMillipore444203
Griffin-Becher aus EdelstahlPolar WareArtikel-Nr.: 13977-010-EA
Sterile Falcon Röhrchen, 15 mLFalke352097
Sterile Falcon Röhrchen, 50 mLFalke352098
Superdex 200 10/300 GL SäuleCytiva28990944
Spritzen, 1 mLLuft-Tite A1
Spritzen, 3 mLBecton Dixon309657
TALON Metall-AffinitätsharzTakara635503
ZahnstocherStraße der KreativitätPAC3690-01
Tris-BasisGoldbioT-400-1
Triton X-100MP Biomedizin807423
TryptonForschungsprodukte InternationalNr. T60065
VornadoBenchmarkBV101-G
HefeextraktForschungsprodukte InternationalJahr20025

Referenzen

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