Methodenartikel

Extraktion von Histonen aus klinischen Proben für epigenetische Profilierung mittels Massenspektrometrie

DOI:

10.3791/68584

⸱

21. November 2025

 ,  , 
1Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS, 2Department of Oncology and Hematology-Oncology (DIPO), University of Milan

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll ermöglicht eine effiziente Histonextraktion aus verschiedenen klinischen Proben für eine anschließende posttranslationale Modifikationsanalyse mittels LC-MS/MS. Durch die robuste Erkennung wichtiger Histonmodifikationen dient sie als wertvolles Werkzeug für umfassende epigenetische Profilierung in großen klinischen Kohorten.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Umfangreiche experimentelle Evidenz stützt die Rolle epigenetischer Mechanismen beim Auftreten, Fortschreiten und Wiederauftreten von Krebs. Unter diesen regulieren Histonvarianten und ihre posttranslationalen Modifikationen (PTMs) die Organisation und Dynamik des Chromatins sowie die Zugänglichkeit des Genoms und beeinflussen so wichtige DNA-basierte Prozesse wie Transkription, Replikation und DNA-Schadensreparatur durch den sogenannten Histoncode. Dysregulierte Histon-PTM-Muster werden häufig bei Krebsarten beobachtet, wobei einige Marker als diagnostische und prognostische Biomarker dienen. Daher sind neuartige Methoden, die eine unvoreingenommene und umfassende Histon-PTM-Profilierung in klinischen Proben ermöglichen, von großem Wert zur Charakterisierung der epigenetischen Landschaften von Tumoren. Hier stellen wir ein Protokoll zur effizienten Gewinnung von Histonen aus klinischen Proben vor, einschließlich Snap Frozen, Optimal-Cutting Temperature (OCT) gefrorenen und formalinfixierten paraffin-eingebetteten (FFPE) Biopsien. Dieser Ansatz liefert Histonproteine von ausreichender Menge und Qualität für die anschließende Bottom-up-Analyse mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS). Dieser Workflow ermöglicht die robuste Erkennung und Quantifizierung wichtiger Histonmodifikationen, insbesondere Lysinacetylierungen und Methylierungen, in primären Tumorproben und bietet so eine zusätzliche Molekularschicht für die Krebscharakterisierung.

Einleitung

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Im Zellkern eukaryotischer Zellen setzen sich Histone mit der DNA zusammen und bilden die Nukleosomen, die grundlegenden strukturellen Einheiten des Chromatins. Jedes Nukleosom besteht aus etwa 146 bp DNA, die um ein Oktam gewickelt ist, das aus zwei Kopien der Kernhistone H2A und H2B sowie zwei Dimeren der Histone H3 und H4 besteht. Zusätzlich ist auch ein Linker-Histon H1 vorhanden und erleichtert die höherordnungige Chromatinorganisation, indem es sowohl das Nukleosom- als auch das Linker-DNA-Stretch zwischen Nukleosomen1 bindet. Histone sind mit einer Vielzahl posttranslationaler Modifikationen (PTMs) verziert, die hauptsächlich an ihren N-terminalen Schwänzen vorhanden sind. Zu diesen Modifikationen gehören Methylierung, verschiedene Arten von Acylation (Acetylierung, Propionylierung, Butyrylierung usw.), Phosphorylierung, SUMOylierung, Ubiquitylierung, ADP-Ribosylierung und Crotonylierung, wobei Lysin- und Argininmethylierung sowie Lysinacetylierung amhäufigsten charakterisiert sind. Die spezifischen Typen, Standorte und Kombinationen von Histonmodifikationen ergeben den sogenannten Histoncode. Dieser Code besteht aus verschiedenen posttranslationalen Modifikationen (PTMs) an den N-terminalen Enden der Histone, die von bestimmten histonmodifizierenden Enzymen hinzugefügt und entfernt werden. Diese Modifikationen werden dann von Effektorproteinen erkannt, was zu Veränderungen der Chromatinstruktur führt, wie Verdichtung oder Dekondensation, was letztlich mehrere biologische Prozesse beeinflusst, darunter DNA-Schadensreparatur, Replikation und insbesondere Gentranskription 3,4.

DNA-Methylierung und Histon-PTMs gehören zu den am häufigsten untersuchten epigenetischen Merkmalen bei Krebs3. Jüngste experimentelle Erkenntnisse haben Veränderungen in den Spiegeln verschiedener Histon-PTMs bei mehreren Krebsarten gezeigt. Bemerkenswert ist, dass der Verlust von H4K20me3 und H4K16ac als Symptome von Krebs berichtet wurde, da ihr Wert in nahezu allen Tumoren im Vergleich zu normalen Gewebengesunken war. Unsere Gruppe identifizierte den Verlust von H3K14ac als mögliches Kennzeichen von Krebs, indem sie die Reduktion mehrerer Krebsarten im Vergleich zu normalen Krebsarten mittels massenspektrometriebasierter (MS)-basierterAnsätze quantifizierte. Darüber hinaus haben zahlreiche Studien den prognostischen Wert von Histon-PTMs hervorgehoben und gezeigt, dass Veränderungen ihrer globalen Werte, die hauptsächlich durch Immunhistochemie in Patientenbiopsien bewertet werden, mit dem Krebsfortschreiten, der histologischen Bewertung und der therapeutischen Ansprache 6,7,8 korrelieren. Daher ist die Histon-PTM-Analyse in Krebsproben wichtig für die Identifizierung neuartiger diagnostischer und prognostischer Biomarker sowie potenzieller Ziele der sogenanntenEpi-Medikamente 8.

Sehr gängige Methoden zur Analyse von Histon-PTMs in Zelllinien und klinischen Proben basieren auf antikörperbasierten Techniken wie Immunoblotting, Immunhistochemie und enzymgebundenem Immunsorbent-Assay (ELISA)9. Antikörperbasierte Methoden haben jedoch verschiedene Einschränkungen, darunter Kreuzreaktivität oder umgekehrt Epitope-Maskierung10. Kreuzreaktivität tritt auf, wenn Antikörper an unbeabsichtigte Ziele mit ähnlichen Epitopen binden, was zu potenziellen Fehlpositiven führt, während Epitope-Maskierung die verpasste Detektion eines bestimmten Epitops (in diesem Fall ein Histon-PTM oder eine Variante) aufgrund des Vorhandenseins anderer Modifikationen an den benachbarten Resten bezeichnet. Außerdem ist die für die Histonmodifikationsanalyse mit Antikörpern erforderliche Gewebemenge oft hoch, da nur eine begrenzte Anzahl von PTMs gleichzeitig nachgewiesen werden kann, sodass mehrere Gewebeschnitte für multiplexierte Analysen11 verarbeitet werden müssen. Massenspektrometrie (MS) hat sich als bevorzugte Methode zur Profilierung von Histon-PTMs und -Varianten etabliert und überwindet damit die Einschränkungen antikörperbasierter Ansätze 5,8. MS basiert auf dem Nachweis eines Massenunterschieds (Δm, Delta-Masse) zwischen den theoretischen und experimentell gemessenen Massen von Peptiden und Proteinen. Es ist unvoreingenommen, umfassend und quantitativ, da es die Identifikation und Quantifizierung von PTMs und Varianten ermöglicht, ohne vorausständiges Wissen über deren Standort zu benötigen. Dies macht MS besonders wertvoll für die sensible und genaue Analyse der Veränderungen von Histon-PTMs bei Krebs und anderen pathologischen Erkrankungen8.

Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur Histonextraktion aus klinischen Proben, kombiniert mit MS-basierter Profilierung von Histon-PTMs, das später als Epi-Proteomik-Workflow bezeichnet wird. Patientenbiopsien werden hauptsächlich als frisch gefrorene (FF) Proben, optimale Schnitttemperatur (OCT) gefrorene Proben und formalinfixierte paraffin-eingebettete (FFPE) Proben12 gelagert. Während frische Biopsien in flüssigem Stickstoff oder vorgekühltem Isopentan ohne Zugabe eines Konservierungsmediums13 gefroren werden, enthalten OCT-gefrorene Biopsien ein wasserlösliches kryoprotektives Einbettungsmedium, das hauptsächlich aus Polyvinylalkohol und Polyethylenglykol besteht und das Gewebeschneiden14 erleichtert. FFPE-Proben hingegen, die in Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet sind, stellen die gebräuchlichste Lagermethode für klinische Proben dar, da sie mehrere Jahre bei Raumtemperatur gelagert werden können und so kostspielige Wartungen bei niedrigen oder ultraniedrigenTemperaturen 15 vermeiden. Da sie frei von Konservierungszusätzen sind, können Snap-Froren-Biopsien direkt zur Histonextraktion verarbeitet werden, während OCT-gefrorene und FFPE-Biopsien erste Schritte zur Einbettung des Mediums bzw. der Fixierungsentfernung erfordern. FFPE-Proben benötigen außerdem umfangreiche Protein-Decrosslinking und Antigenentnahme.

Dieses Protokoll beschreibt detaillierte Methoden zur Extraktion von Histonen aus frisch gefrorenen, OCT-eingebetteten und FFPE-klinischen Proben und stellt so eine ausreichende Menge und Qualität für die nachgelagerte MS-Analyse sicher, indem die spezifischen Herausforderungen jeder Art der Probenkonservierung berücksichtigt werden (Schritt 1). Histone, die aus klinischen Proben gereinigt werden, werden durch Proteingelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen (SDS-PAGE) getrennt, gefolgt von einem Derivatisierungsschritt und enzymatisch verdaut, um Peptide geeigneter Länge (4–15 Aminosäuren) für die Bottom-up-Massenspektrometrieanalyse16 (Schritt 2) zu erzeugen. Genauer gesagt werden Histone mit einer ArgC-ähnlichen Strategie verdaut, bei der Trypsin, das üblicherweise am C-Terminus von unveränderten Lysinen (K) und Argininen (R) schneidet, aufgrund einer vorherigen chemischen Acylierung unveränderter und monomethylierter Lysine mit Propionanhydrid (PRO) nur am C-Terminus von Argininen durchschneidet. Anschließend werden Arg-C-ähnliche verdaute Histonpeptide an ihren N-terminalen Schwänzen durch Zugabe von Phenylisocyanat (PIC) acylatiert. Diese weitere Derivatierung erhöht die Peptidhydrophobiität und ermöglicht eine bessere Trennung kurzer Histonpeptide durch Reversphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC), wodurch die Identifizierung und Quantifizierung isobarischer Peptidoformen17,18 (Schritt 3) verbessert wird. Insgesamt heben die hier beschriebenen Methoden die Kraft des MS-basierten Histonprofils in Krebsepigenetikstudien hervor.

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Protokoll

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Frisch gefrorene und OCT-gefrorene Gewebebiopsien wurden mit informierter Zustimmung von Patienten entnommen, die sich am Europäischen Institut für Onkologie (Mailand) operieren ließen, während FFPE-Biopsien von Patienten entnommen wurden, die sich am Istituto Neurologico Carlo Besta (Mailand) operierten. Diese Studie wurde vom Ethischen Ausschuss des Europäischen Instituts für Onkologie (Studie UID 2550) und des Istituto Neurologico Carlo Besta (Studie CET 39/24) genehmigt.

1. Histonextraktion aus patientenabgeleiteten Geweben (Abbildung 1A)

HINWEIS: Um Histone aus repräsentativen Tumorzellpopulationen zu analysieren und die Variabilität zwischen den Proben zu verringern, ist es ratsam, klinische Biopsien mit einer Tumorzellularität von mindestens 50 % und ohne nekrotische Bereiche und/oder umfangreiche Immuninfiltration zu verwenden.

  1. Histonanreicherung aus frisch gefrorenem Gewebe (geschätzte Dauer: 60 Min)
    HINWEIS: Alle Schritte müssen auf Eis ausgeführt werden.
    1. Tauen Sie das Gewebe auf Eis auf und schneiden Sie ein Stück von etwa 20-30 mg, was üblicherweise etwa 2 mm3 Gewebe entspricht.
    2. Übertragen Sie die Probe in ein 1,5-ml-Rohr und zerkleinern Sie das Gewebe mit einer Schere in kleine Stücke (Materialtabelle).
    3. Fügen Sie 1 ml Nuclei Isolation Buffer (Tabelle 1) hinzu, frisch ergänzt mit den Proteaseinhibitoren, die in der Materialtabelle aufgeführt sind. Danach gut mischen.
    4. Übertragen Sie die Probe in einen Dounce-Homogenisator (Materialtabelle).
      HINWEIS: Bei großen Gewebestücken verwenden Sie eine P1000-Spitze (beim Schneiden der Spitze mit der Schere), um die Probe besser zu sammeln.
    5. Homogenisiere das Gewebe, indem du zuerst den LOCKEREN und dann den TIGHT Stößel (Materialtabelle) verwendest, bis die Gewebestücke mit bloßem Auge unsichtbar sind.
    6. Filtern Sie die homogenisierte Probe durch einen 100-μm-Zellsieb (Materialtabelle), um Gewebereste zu entfernen.
    7. Pipetten Sie kräftig mit einem p200 auf und ab, um die Plasmamembran aufzulösen und die Probe in ein neues 1,5-mL-Rohr zu übertragen.
    8. Pelletieren Sie die Zellkerne durch Zentrifugation bei 2.300 x g für 15 Minuten bei 4 °C mit einer Werkplattenzentrifuge (Materialtabelle).
    9. Entsorgen Sie das Supernatant und suspendieren Sie die Kernpellets in 50–100 μL Nuclei Isolation Buffer, ergänzt mit 0,1 % SDS, um die Kernmembran aufzulösen (Materialtabelle).
    10. Fügen Sie 250 U Benzonase-Nuklease zur Verdauung von Nukleinsäuren hinzu, mischen Sie gut und inkubieren Sie 2 Minuten bei 37 °C (Materialtabelle).
      HINWEIS: Wenn die Probe noch viskos ist, kann die Sonikation auch in einem Wasserbad durchgeführt werden (Einstellung: 10 Minuten 30s AN/30s AUS; Leistung: hoch; Temperatur: 4 °C). Nach diesem Schritt können die Proben bei -20 °C gelagert werden.
  2. Histonanreicherung aus OCT-Proben (geschätzte Dauer: 90 Min)
    HINWEIS: Dieses Protokoll wurde für vier/fünf 10 μm dicke OCT-Schnitte optimiert, die 20–60 mg Gewebe entsprechen. Die Anzahl der Gewebeschnitte hängt jedoch von der Art der klinischen Biopsie und der Gesamtfläche des Gewebes ab. Angesichts der Knappheit klinischer Proben kann eine Extraktion aus einer geringeren Menge Ausgangsgewebe durchgeführt werden, auch wenn dies zu einer geringeren Detektion von Histonmodifikationen führen könnte.
    1. Setzen Sie vier/fünf 10 μm dicke Gewebeschnitte, die etwa 20–60 mg Gewebe entsprechen, in ein 1,5 ml großes Rohr.
    2. Waschen Sie die Abschnitte mit 1 ml eiskalten 70% EtOH (Tabelle 1) für 2 Minuten auf einem rotierenden Rad (Materialtisch) bei 4 °C.
    3. Zentrifugiere mit 16.000 x g für 2 Minuten bei 4 °C in einer Werkbankzentrifuge.
    4. Wiederhole die Schritte 1.2.2 und 1.2.3 insgesamt dreimal.
    5. Rehydrieren Sie die Proben in 1 ml doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) mit Rotation (Materialtabelle) für 2 Minuten bei 4 °C.
    6. Zentrifugiere mit 16.000 x g für 2 Minuten bei 4 °C in einer Werkstattzentrifuge (Werkstofftabelle).
    7. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.5 und 1.2.6 zweimal mit 1x PBS (Materialtabelle).
    8. Fahren Sie mit Schritt 1.1.2 des Anreicherungsprotokolls aus frisch gefrorenen Proben fort.
  3. Histonextraktion aus FFPE-Proben (geschätzte Dauer: 8 st.)
    HINWEIS: Das beschriebene Protokoll wurde für vier 10 μm dicke FFPE-Schnitte entwickelt, die ungefähr 20–60 mg Gewebe entsprechen. Bei den meisten MS-Analysen von Histonmodifikationen ist diese Menge überschüssig und stellt einen sicheren Ausgangspunkt dar, wenn das Material nicht limitierend ist. Allerdings kann auch weniger Ausgangsmaterial verwendet werden, was besonders relevant ist, da bei der Analyse klinischer Proben oft nur eine geringe Menge an Gewebe zur Verfügung steht. Der Einsatz weniger Ausgangsmaterials verringert zwar machbar, verringert typischerweise die Quantifizierungsrobustheit für Histonmodifikationen mit geringer Häufigkeit (z. B. H3K27ac oder multimethylierte H3K27/K36-Peptide), und dieser Effekt kann je nach Gewebetyp sowie von Probe zu Probe variieren. Dennoch hat unser Labor bereits gezeigt, dass MS-basierte Histon-PTM-Profilierung erfolgreich an laser-mikrodissektionierten Gewebeflächen von Brustkrebs-FFPE-Proben mit bis zu 1.000 Zellen durchgeführt werden kann18.
    1. Setzen Sie vier 10 μm dicke FFPE-Abschnitte, die etwa 20–60 mg Gewebe entsprechen, in ein 1,5 mL Rohr.
    2. Fügen Sie 1 ml Paraffinlösungsmittel zur Probe und zum Vortex (Materialtabelle) mit maximaler Geschwindigkeit für 30 Sekunden hinzu, bis das Paraffin vollständig gelöst ist.
      VORSICHT: Paraffinlösende Reagenzien sind mutagen, krebserregend und entzündlich, daher müssen sie unter einer chemischen Haube verwendet werden.
      HINWEIS: Paraffinlösung wird erreicht, wenn Paraffinstücke mit bloßem Auge nicht mehr sichtbar sind und das Paraffinlösemittel eine weißliche, homogene Farbe besitzt.
    3. Zentrifugieren Sie 16.000 x g für 3 Minuten bei RT in einer Werkplattenzentrifuge und entsorgen Sie das Überstandsmittel. Um unerwünschte Probenaspiration während der Entfernung von Überlagerungsmitteln zu vermeiden, können Vakuumpumpen/Pipetten mit einer kleineren Spitze (z. B. P200, P10-Spitzen) verschlossen werden.
    4. Wiederholen Sie Schritt 1.3.2 und 1.3.3 noch dreimal (insgesamt viermal), um eine vollständige Paraffinentfernung sicherzustellen. Alternativ kann die vollständig entparaffinisierte Probe gewiegt werden, um eine indikative Anzeige der verarbeiteten Gewebemenge zu erhalten.
    5. Fügen Sie 1 ml 95 % EtOH-Lösung hinzu (Tabelle 1) und wirbeln Sie mit maximaler Geschwindigkeit für 30 Sekunden vor, um eine vollständige Geweberesuspension sicherzustellen.
    6. Zentrifugieren Sie 16.000 x g für 3 Minuten bei RT in einer Werkplattenzentrifuge und entsorgen Sie das Überstandsmittel. Alternativ kann die dehydrierte Probe so gewiegt werden, dass eine indikative Menge an verarbeitetem Trockengewebe ermittelt wird.
    7. Wiederholen Sie Schritt 1.3.5 und 1.3.6 mit 70 %, 50 % und 20 % EtOH (Tabelle 1) sowie ddH2O, um die Probe zu rehydrieren.
    8. Fügen Sie 200 μL Extraktionspuffer hinzu (Tabelle 1).
      HINWEIS: Wenn größere Gewebestücke vorhanden sind, schneiden Sie sie mit einer Schere in kleinere Stücke. Je nach Gewebemenge können kleinere oder größere Mengen an Extraktionspuffer hinzugefügt werden, um eine ordnungsgemäße Probenlyse sicherzustellen. Für besonders kleine Pellets, die in einem Volumen des Extraktionspuffers unter 100 μL wieder aufgehängt werden, kann die Sonikation mit einem Sonikationsgerät (Materialtabelle) durchgeführt werden (30 s ON/30 s OFF Power: hoch, 10 Zyklen).
    9. Homogenisieren Sie das Gewebe im Extraktionspuffer durch Sonikation mit einem digitalen Sonifier (Materialtabelle) mit einem 3-mm-Mikrotip (>15 Zyklen, 5 Sekunden AN/2 Minuten AUS, Strom: 15-30%).
      HINWEIS: Proben können als richtig homogenisiert betrachtet werden, wenn keine sichtbaren Gewebepartikel in der Lösung sichtbar sind und der Extraktionspuffer eine einheitliche, nicht-trübe Farbe aufweist. Bewahren Sie während der Sonikationszyklen die Proben auf RT auf. Eis kann eine Ausfällung von SDS im Extraktionspuffer verursachen und so die Gewebehomogenisierung beeinträchtigen. Eine richtige Sonikation ist entscheidend, um eine vollständige Gewebelyse und Proteinextraktion zu erreichen. Platzieren Sie die Mikrospitze in der richtigen Höhe im Probenröhrchen (sie darf den Boden des Röhrchens nicht berühren, wodurch Plastikpartikel freigesetzt werden, und sie darf nicht an der Luftabsaugungspufferoberfläche sein, wodurch Schaum und Blasen entstehen).
    10. Nach der Homogenisierung werden Proben bei 95 °C für 45 Minuten in einem Thermomixer inkubiert. Alle 15 Minuten den Deckel der Tuben öffnen, damit das Formaldehyd verdampfen kann.
    11. Proben bei 65 °C 4 Stunden lang in einem Thermomixer inkubieren. Öffnen Sie den Deckel alle 20-60 Minuten, damit das Formaldehyd verdampfen kann.
    12. Zentrifugieren Sie 16.000 x g für 1 Minute bei RT in einer Arbeitstischzentrifuge und übertragen Sie das Überlagerungsmittel in ein neues Rohr.
      HINWEIS: Proben können zu diesem Zeitpunkt bei -20 °C gelagert werden.

Tabelle 1: Pufferzusammensetzung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

2. Histonauflösung durch SDS-PAGE und In-Gel-Verdauung

  1. SDS-PAGE (Abbildung 1B; geschätzte Dauer: 2 H)
    1. Um die Histonreinheit zu beurteilen und die Menge zu schätzen, wird 1/10 der Histonextrakte auf ein 17%iges Polyacrylamid-Gel (SDS-PAGE; Tabelle 1) neben bekannten Mengen an rekombinanten Histonen, wie in Abbildung 1B dargestellt.
      HINWEIS: Anstatt 1/10 der Histonextrakte zu laden, können 15–50 μg Proteine, gemessen durch Assays, die hohe Reinigungskonzentrationen tolerieren, wie der Protein-Test19 mit Biinchoninsäure (BCA), geladen werden. Bitte beachten Sie jedoch, dass die Histonanreicherung über Gesamtproteine zwischen frisch gefrorenen, OCT-gefrorenen und FFPE-Proben erheblich variieren kann und die Quantifizierung der Histonmenge nur auf SDS-PAGE basieren kann. 1, 0,5 und 0,25 μg rekombinanter Histon H3.1 (Materialtabelle) können als Referenz geladen werden, um die Histonmenge präziser zu quantifizieren.
    2. Mischen Sie die Proben mit Lithiumdodecylsulfat (LDS) Ladepuffer oder mit entsprechenden Ladepuffern für SDS-PAGE (z. B. Laemmli-Puffer) mit Zugabe von Dithiothreitol (DTT; Materialtabelle) mit einer Endkonzentration von 10 mM.
    3. Entnaturieren Sie 5 Minuten lang bei 95°C in einem Thermomixer.
    4. Nach der Proteintrennung auf der SDS-PAGE wird das Gel mit Coomassie-Färbung gefärbt (Materialtabelle).
    5. Schätzung der Histonausbeute durch visuelle oder softwareunterstützte 20-Quantifizierung der Histonbänder in klinischen Proben im Vergleich zu rekombinantem Histon-H3 bei bekannten Mengen.
  2. Histon-In-Gel-Verdauung (Abbildung 2; geschätzte Dauer: 2 Tage)
    HINWEIS: Für die MS-Analyse von Histon-PTMs wird eine ArgC-ähnliche Verdauung verwendet, da die Standardverdauung von Trypsin aufgrund der hohen Frequenz von Lysin- und Arginin-Aminosäuren in deren Sequenz zu kurze Peptide erzeugt, was die LC-MS-Detektion von Peptiden und die PTM-Identifikation erschwert. Durch chemische Modifikation von Lysinen wird die tryptische Spaltung an diesen Stellen verhindert, was zur Spaltung am C-Terminus nur der Arginine führt, wodurch längere Peptide (4–15 Aminosäuren) entstehen, die modifizierte Lysine innerhalb der Sequenz enthalten; Insgesamt erleichtert dieses Protokoll den Nachweis und die Messung modifizierter Histonpeptide von MS und wurde in zahlreichen Publikationen ausführlich beschrieben8,17,21.
    OPTIONAL: Ein interner Standard (z. B. stark beschriftete, synthetisch markierte Peptide mit Spike-in)22) kann mit Histonproben im Verhältnis 1:1 gemischt werden, um eine genauere Peptidquantifizierung in MS zu erreichen (Abbildung 2B).
    1. Laden Sie 3–5 μg Histonprobe auf ein 17%iges Polyacrylamid-Gel, basierend auf der geschätzten Histonquantifizierung aus Schritt 2.1.5 (Abbildung 2B).
    2. Nach SDS-PAGE visualisieren Sie Proteine, indem Sie das Gel mit Coomassie-Färbung färben.
      HINWEIS: Um eine Kontamination zu vermeiden, die die LC-MS/MS-Analyse beeinträchtigen könnte, ist es ratsam, die folgenden Schritte in einer keratinfreien Umgebung durchzuführen, wie z. B. einer speziellen Haube, da Keratin ein starker MS-Schadstoff ist.
    3. Entfernen Sie Gelbänder, die dem Molekulargewicht von Kernhistonproteinen entsprechen (Gelband zwischen 10 und 18 kDa, unter Berücksichtigung des folgenden Molekulargewichts für jede Kernhistone: H3 etwa 17 kDa, H2A-H2B etwa 14 kDa, H4 etwa 11 kDa) mit einem Skalpell (Materialtabelle) und Schnittbänder in Stücken von jeweils etwa 1 mm3 .
    4. Mit Hilfe des Skalpells werden die Gelstücke in ein 1,5-mL-Rohr übertragen.
      HINWEIS: Um die Gelstücke vollständig zu bedecken, können die unten angegebenen Volumina erhöht werden, wobei die Reagenz-Stöchiometrie erhalten bleibt.
    5. Entfärben Sie die Gelstücke, indem Sie eine Lösung aus 50 % Acetonitril (ACN) in ddH2O hinzufügen (Tabelle 1). In einen Thermomixer mit 1.400 U/min für 10 Minuten RT geben und anschließend den Supernatant entsorgen.
    6. Wiederhole Schritt 2.2.5, bis die Gelstücke vollständig entverfärbt sind.
    7. Dehydrieren Sie die Gelstücke, indem Sie 100 % ACN hinzufügen (Materialtabelle). Inkubiere mit Mischen bei 1.400 U/min für 10 Minuten RT und entsorge danach das Supernatant.
    8. Wiederhole Schritt 2.2.7, bis die Gelstücke weiß und hart erscheinen und somit vollständig ausgetrocknet sind.
    9. Trocknen Sie die Gelstücke 5 Minuten lang in einer Vakuumzentrifuge in einer Vakuumzentrifuge (Materialtabelle).
      HINWEIS: Histone sind arm an Cysteinen (nur zwei Cysteine werden in Histon H3 an den Positionen 96 und 110 gefunden (UniprotKB ID P68431), und nur ein Cystein findet sich in Histon H2B auf Position 154 (UniprotKB ID B4DR52)). Zusätzlich befinden sich diese Cysteine in Peptiden, die bei der ArgC-ähnlichen Verdauung bei Bottom-up-MS nicht nachweisbar sind, sodass chemische Addukte der Thiolgruppe23 in der MS-Analyse von Histonen kein Artefakt sind und im beschriebenen Protokoll keine Cysteinreduktions- und Alkylationsschritte durchgeführt werden.
    10. Fügen Sie 15 μL 7,7 m Propionanhydrid (PRO)-Lösung (Werkstofftabelle) und 26 μL 1 M Ammoniumbicarbonat (AmBic) (Materialtabelle) zu jedem Rohr hinzu und inkubieren Sie die Proben in einem Thermomixer mit 350 U/min für 10 Minuten bei 37 °C.
      HINWEIS: Da Anhydride, die in einem reaktiven Puffer gelöst sind, dazu neigen zu verdunsten, bereiten Sie keine Hauptmischung aus PRO und AmBic vor, sondern geben Sie sie einzeln zu jeder Probe, um die richtige PRO-Konzentration in jedem Röhrchen konstant zu halten.
    11. Decke Gelstücke vollständig ab, indem du 1 M AmBic (empfohlenes Volumen: 80 μL) hinzufügst, und inkubiere Proben durch Mischen bei 1.400 U/min für 4 Stunden bei 37°C in einem Thermomixer. Entferne danach die gesamte Flüssigkeit.
      HINWEIS: 1 M AmBic wird hinzugefügt, um einen basischen pH-Wert aufrechtzuerhalten, ideal zur Katalysierung der Propionylierung unveränderter und monomethylierter Lysine durch PRO.
    12. Dreimal mit ddH2O waschen, Proben 10 Minuten lang im RT inkubieren, während man in einem Thermomixer bei 1.400 U/min mischt. Nach jedem Waschen die Flüssigkeit entsorgen.
    13. Füge 50 % ACN hinzu und inkubiere es in einem Thermomixer bei 1.400 U/min für 15 Minuten bei RT. Danach entsorge ich die Flüssigkeit.
    14. Trockne die Gelstücke komplett durch 100 % ACN und inkubiere bei 1.400 U/min 15 Minuten bei RT in einem Thermomixer. Entsorge die Flüssigkeit danach.
    15. Wiederhole Schritt 2.2.14, bis die Gelstücke weiß und trocken erscheinen.
    16. Trockene Gelstücke 5 Minuten bei RT in einer Vakuumzentrifuge.
    17. Fügen Sie jeder Probe 4 μL Trypsinlösung (Tabelle 1) und 20 μL Verdauungspuffer (Tabelle 1) hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten auf Eis, um die Trypsinaufnahme in Gelstücke zu ermöglichen.
      HINWEIS: Diese Inkubation – durchgeführt mit konzentrierter Trypsinlösung und Verdauungspuffer (50 mM AmBic bei ddH2O, wodurch ein basischer pH-Wert ideal für die Trypsinspaltung entsteht) – ermöglicht es, dass das Enzym vor seiner Aktivierung bei 37 °C von den Gelstücken aufgenommen wird.
    18. Wenn konzentriertes Trypsin vollständig absorbiert ist, decken Sie die Gelstücke gründlich mit einem zusätzlichen Verdauungspuffer (indikatives Volumen: 80 μL) ab und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C in einem Thermomixer.
    19. Um verdaute Peptide aus den Gelstücken zu extrahieren, gib 100 μL 100 % ACN hinzu und inkubiere bei 1.400 U/min für 20 Minuten bei RT in einem Thermomixer.
    20. Sammeln Sie das Supernatant ein und übertragen Sie es in ein neues 1,5-ml-Rohr.
    21. Fügen Sie 80 μL 100% ACN zu Gelstücken hinzu und inkubieren Sie bei 1.400 U/min für 10 Minuten RT in einem Thermomixer.
    22. Sammeln Sie Supernatant und kombinieren Sie es mit dem in Schritt 2.2.20 gesammelten Mittel, dann konzentrieren Sie die Peptide in einer Vakuumzentrifuge auf ein Volumen zwischen 1 und 5 μL.
      HINWEIS: Die Verwendung einer Vakuumzentrifuge ermöglicht die Verdampfung des organischen Lösungsmittels (ACN). Es wird jedoch empfohlen, die Probe in diesem Stadium nicht vollständig zu trocknen, da dies den folgenden Derivationsschritt negativ beeinflussen kann. Wenn die Probe austrocknet, suspendiere sie erneut in ddH2O Wasser und sonikiere sie 5 Minuten lang in einem Wasserbad.
    23. Fügen Sie jeder Probe ddH2O zu einem Endvolumen von 15 μL hinzu, dann 2 μL 1 M Triethylammoniumbicarbonat (Materialtabelle) und 3 μL Phenylisocyanat (PIC)-Lösung (Tabelle 1) und inkubieren Sie bei 350 U/min 90 Minuten bei 37 °C in einem Thermomixer.
      VORSICHT: PIC ist mutagen und krebserregend, daher wird empfohlen, es unter einer chemischen Haube zu behandeln. Da PIC hochreaktiv und flüchtig ist, wird empfohlen, keine Hauptmischung aus Triethylammoniumbicarbonat und PIC herzustellen, aber es ist ratsam, jedes Reagenz einzeln hinzuzufügen, um die genaue PIC-Konzentration sicherzustellen.
    24. Geben Sie jedem Tube 8 μL 1 % Trifluoressigsäure (TFA; Materialtabelle) um die Derivatisierung mit PIC zu stoppen.
    25. Verdünnen Sie jede Probe mit 100 μL Puffer A (Tabelle 1) und laden Sie sie auf C18-Stufenspitzen (wie in24 beschrieben vorbereitet oder bei verschiedenen Anbietern gekauft).
    26. Drehen Sie die Proben bei 2.100 x g für 10 Minuten bei 4 °C in einer Schwenkrotorzentrifuge, damit Histonpeptide an das C18-Harz binden können.
      HINWEIS: Proben können mehrere Monate auf Bühnentipps bei 4 °C gelagert werden.
    27. Füge 30 μL Elutionspuffer (Tabelle 1) zu C18-Stufenspitzen hinzu und setze die Spitzen in ein neues 1,5-mL-Rohr. Proben bei 1.000 x g für 10 Minuten in einer Werkszentrifuge bei 4 °C drehen, um Histonpeptide zu elutieren.
    28. Konzentrieren Sie die Proben mit einer Vakuumzentrifuge auf ein Volumen zwischen 1 und 3 μL und fügen Sie dann 1 % TFA hinzu, um ein Endvolumen von 6 μL zu erreichen.
    29. Laden Sie 5 μL Peptidlösung in eine 96-Well-Mikroplatte für die MS-Analyse (Materialtabelle) und versiegeln Sie sie mit einer Dichtungsmatte (Materialtabelle).

3. HPLC-MS/MS und Datenanalyse (Abbildung 3)

HINWEIS: Die hier beschriebenen Parameter sind für ein ESAY-nLC 1200 Flüssigkeitschromatographiesystem geeignet, das über eine EASY-Spray-Säule mit einem Q Exactive Plus Orbitrap-Massenspektrometer (Materialtabelle) verbunden ist, aber es können auch ähnliche/äquivalente Instrumente mit Ad-hoc-Parametern verwendet werden.

  1. HPLC-MS/MS (geschätzte Dauer: 90 Minuten pro Probe)
    1. Injizieren Sie 3 μL der 5 μL Histonpeptide aus Schritt 2.2.29 (entsprechend etwa 0,25–0,8 μg, basierend auf Histonquantifizierung durch SDS-PAGE) auf eine C18-Nanosäule (Materialtabelle) bei einem konstanten Durchfluss von 500 nl/min im Puffer A.
    2. Wenden Sie einen 55-minütigen linearen Gradienten von 10%-45% Puffer B bei einer Durchflussrate von 250 nL/min an, um Peptide zu trennen.
    3. Erfassen Sie die MS/MS-Daten im datenabhängigen Modus (DDA), um automatisch zwischen MS1 und MS2 mithilfe der dedizierten Softwarepakete (Materialtabelle) zu wechseln.
      HINWEIS: Für die Erwerbung und allgemeine Einstellungen siehe Tabelle 2.
  2. RAW-MS-Datenanalyse
    HINWEIS: In diesem Protokoll erfolgt die Quantifizierung von Histon-PTMs mit EpiProfile, einem offenen Skript (https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family), benutzerfreundlich und geeignet für Standardanalysen wie die beschriebenen für H3- und H4-Lysinmethylierungen und Acetylierungen. EpiProfile kann jedoch angepasst werden, um Analysen weniger standardisierter Modifikationen und verschiedener Probenvorbereitungsprotokolle durch erfahrenere Nutzer durchzuführen. Bitte beachten Sie, dass EpiProfile eine MATLAB-Lizenz erfordert, um25 laufen zu können.
    1. Analysieren Sie die gesammelten RAW-Daten mit der EpiProfile 2.0-Software (PRO-PIC-Version)25 (Materialtabelle) und quantifizieren Sie Histonpeptide, indem Sie die Optionen auswählen, histone_normal, wenn die Analyse in Label-Free durchgeführt wird, und histone_SILAC, wenn Sie den SUPER-SILAC-Spike-in verwenden. Setze ndebug = 0.
    2. Für jedes Histonpeptid (z. B. H3_3-8) berechnet man die relative Häufigkeit (%RA) jedes modifizierten Peptidoforms (z. B. H3_3-8 unmod, me1, me2, me3), indem man das von EpiProfile berechnete extrahierte Ionenchromatogramm (XIC) durch die Summe aller für dieses Peptid berechneten XICs teilt.
      HINWEIS: Optional können XICs, die mit EpiProfile berechnet werden, durch Inspektion von MS-Spektren und manuelle Quantifizierung von Histonpeptiden unter Verwendung eines dedizierten Spektrenlayouts, wie in18,26 beschrieben, validiert werden.
    3. Für jede Peptidoform wird das Verhältnis von Licht zu Schwergewicht (L/H) berechnet, indem man die %RA jedes nativen, leichten Peptids durch die %RA des entsprechenden schweren Peptids teilt, das aus der SUPER-SILAC-Mischung abgeleitet wird und in jede Probe gespitzt wird.
    4. Wandeln Sie die L/H-Verhältnisse in eine logarithmische Skala um. Um signifikante Unterschiede in der Peptidoform-Häufigkeit zwischen den Proben hervorzuheben, kann eine statistische Analyse durchgeführt werden, und die L/H-Verhältnisse aller Proben können visuell als Heatmaps und Streudiagramme dargestellt werden, wie in Abbildung 4.

Tabelle 2: Liste der Erwerbseinstellungen und der allgemeinen Einstellungen, die für LC-MS/MS mit dem in diesem Protokoll verwendeten System verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir haben Histonextraktionen aus frisch gefrorenen und OCT-gefrorenen Brustkrebsproben sowie aus FFPE-Meningeomproben nach dem oben genannten Protokoll durchgeführt. Wie in Abbildung 1A dargestellt, haben wir bei gefrorenen Proben OCT entfernt, sofern vorhanden, und Proben im Nuclei-Isolationspuffer homogenisiert, der ein mildes Detergent enthält (0,1 % Triton-Schritt 1.1), was eine Kernisolierung ermöglicht. Anschließend extrahierten wir Histone mit der Zug...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die hier beschriebene Methode bietet einen einfachen und robusten Arbeitsablauf, um Histone effizient aus klinischen Proben zu isolieren, die als frisch gefrorene, OCT-gefrorene und FFPE-Biopsien gelagert sind, um ihre Modifikationslandschaften mittels MS-Analyse zu profilieren. Das anschließende Probenvorbereitungsprotokoll mittels SDS-PAGE-Trennung und PRO-PIC-In-Gel-Verdauung mit Trypsin gewährleistet eine effektive Entfernung von Reinigungsmitteln, Salzen und anderen MS-Schadstoffen<...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir würdigen Chirurgen und Kliniker des Europäischen Instituts für Onkologie und des Istituto Neurologico Carlo Besta für die Bereitstellung von FF-, OCT-gefrorenen und FFPE-Gewebebiopsien. Wir danken Roberta Noberini für die wissenschaftliche und methodische Diskussion während der Manuskriptvorbereitung sowie für unsere Finanzierung: PRIN2022 (CUPG53D23001530006), AIRC (Fördernummer IG-2023-28767) und Fondazione IEO-Monzino (FIEORDT-2023-BONALDI).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Chemikalien
Histolemon RS für HistologieCarlo Erba4549122,5 L
Acetonitril (ACN)Carlo Erba4123411L
Ammoniumbicarbonat (AmBic)Sigma AldrichA6141500 g
Ammoniumpersulphat (APS)WDR1.012.010.500500 g
Aprotinin-ProteaseinhibitorSigma Aldrich A11535 mg
Benzonase-NukleaseMerkE101425 KU
Bisacrylamid 30 % 37,5 mAppliChemAPA362610001 L
Puffer A 0,1 % Ameisensäure in ddH2OThermo Fisher Scientific10229884500 mL 
Puffer B 0,1 % Ameisensäure /80 % Acetonitril in ddH2OThermo Fisher Scientific15431423500 mL
C18-HarzMerck66883-U47 mm Durchmesser
Coomassie Instant BlueAbcamab1192111 L
Dithiotreitol (DTT) WDR441496P25 g
EthanolCarlo Erba4146082,5 L
Leupeptin  ProteaseinhibitorSigma-Aldrich L85115 mg
N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin (TEMED)Sigma Aldrich1.107.320100100 mL
NuPAGE LDS-SamplepufferInvitrogenNP00074x
PBS – Phosphatgepufferte Kochsalzlösung  MicroGemTL1006500 mL
Phenil-Isocyanat (PIC)Sigma Aldrich185353100 g
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)-ProteaseinhibitorSigma Aldrich P76261 g
Propionanhydrid (PRO)Sigma Aldrich24031150 g
Rekombinanter Histon H3.1 MenschNew England BiolabsM25031 & Mikro; g/µ L
Sequencing-Grade TrypsinPromegaV5113100 μg
Natriumbutyrat (NaBut) Histondeacetlyase-InhibitorMerckB58875 g
Natriumdodecylsulfat (SDS)Sigma AldrichL3771100 g
TriethylammoniumbicarbonatSigma AldrichT7408100 mL
Trifluoressigsäure (TFA)Thermo Fisher Scientific289041x10mL
Tris-HClSigma AldrichT3253100 g
Triton X-100 WaschmittelSigma-Aldrich X100RS5 g
Kits/ Ausrüstung/Software
96-Bohrloch-MikroplattenCorningPCR-96-FS-CNicht-pyrogen, frei von Rnase/Dnase
GleichgewichtKern19024
TischzentrifugeHareus Biofuge LaborPico, 23396
Bioruptor-SonikationsgerätDiagenode
Branson Digital Sonifier 250Emerson
Zellsieb 100 & Mikro; mFalke352360
Konzentrator PlusEppendorf5305000509
Dounce-Homogenisator (z.B.   Dounce, Wheaton...)Spring, Wheaton1 mL Tissue Grinder
EASY-nLC 1200 FlüssigchromatographieThermo Fisher Scientific
EASY-Spray HPLC C18 SäuleThermo Fisher ScientificES9022 & Mikro; m, 100  Å, 75 &Micro; m x 25 cm
EpiProfile2.0-Skripthttps://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family
Fidschi-Softwarehttps://imagej.net/software/fiji/downloads
MATLABhttps://www.mathworks.com
MaxQuant-Suchmaschinehttps://maxquant.net/maxquant/
Pestel A (locker)Spring, Wheaton
Pestel B (eng)Spring, Wheaton
Q Exactive Plus Orbitrap LC-MS/MS SystemThermo Fisher Scientific
Rotierendes RadThermo Fisher Scientific11496548
SkalpellKiato13010
SchereThermo Fisher Scientific15207266
VersiegelungsmatteCorningAM-96-PCR-RDAutomatisierungskompatibel
Ausschwenkrotor-ZentrifugeBeckman CoulterAllegra X-15R
Thermomixer-KompaktEppendorf5350
WirbelPBIVibromix
Xcalibur-SoftwareThermo Fisher ScientificOPTON-30965

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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HistonextraktionHistonmodifikationenposttranslationalen ModifikationenChromatinorganisationBiomarker EntdeckungFl ssigchromatographieFFPE Gewebe

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