Verwendung von LEXY- und LINuS-Optogenetik-Tools und automatisierter Bildanalyse zur Quantifizierung der nukleozytoplasmatischen Transportdynamik in lebenden Zellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie automatisierte Analysen von Lebendzell-Bildgebungsdaten, die durch die Verfolgung des nukleozytoplasmatischen Transports mit optogenetischen Werkzeugen gewonnen werden, effizient eingerichtet und durchgeführt werden können.

Zusammenfassung

Der nukleozytoplasmatische Transport (NCT) ist für die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase unerlässlich, und seine Störung ist an verschiedenen Krankheiten beteiligt, darunter neurodegenerative Erkrankungen und amyotrophe Lateralsklerose. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, Instrumente zur Überwachung und Quantifizierung der NCT zu entwickeln. Zu diesen Werkzeugen gehören die schnellen und reversiblen Optogenetik-Sonden LEXY (light-inducible nuclear export system) und LINuS (light-inducible nuclear localization signal), die die Messung der NCT-Dynamik in lebenden Zellen ermöglichen.

Die Originalpublikationen beschreiben die manuelle Segmentierung und Quantifizierung des Fluoreszenzsondensignals im Zellkern und Zytosol nach der Transfektion von LEXY- und LINuS-Konstrukten in der Lebendzellbildgebung. Sowohl die Transfektion als auch die manuelle Segmentierung begrenzen jedoch die Anzahl der Zellen, die analysiert werden können, und unterliegen aufgrund möglicher benutzerabhängiger Fehler Ungenauigkeiten. Während die hohe Geschwindigkeit und Reversibilität der Optogenetik prinzipiell eine hohe Sensitivität bei der Detektion von Veränderungen in der NCT-Dynamik ermöglichen sollte, hängt dies von den Erfassungsparametern und der Analyse einer ausreichenden Anzahl von Zellen ab.

Wir haben daher lentivirale Vektoren etabliert, die LEXY und LINuS exprimieren, um stabile Zelllinien zu erzeugen, Live-Imaging-Marker und Kontrollbedingungen getestet und eine halbautomatische Bildanalyse-Pipeline implementiert, die die Analyse von Hunderten von Zellen ermöglicht. Diese Analysemethode nutzt die Open-Access-Software FIJI, ist für Einsteiger in die Bioinformatik zugänglich und erfordert keine fortgeschrittenen Computer-Setups. Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Verfügung, um LEXY als Beispiel für diese optogenetischen Werkzeuge zur Überwachung des Kernexports einzurichten, von der Vorbereitung der Proben über die Erfassung von Lebendzellbildern bis hin zur automatisierten Analyse, und zeigen, wie das Protokoll für andere Bedingungen, Kontrollen oder Modelle in jedem Labor angepasst werden kann. Alle in diesem Protokoll verwendeten Plasmide und Zelllinien werden der wissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung gestellt, wodurch die Zugänglichkeit der Methode weiter verbessert wird.

Einleitung

Die Bedeutung des nukleozytoplasmatischen Transports (NCT) für die Regulierung wichtiger zellulärer Signalwege und die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase wurde in den letzten Jahren gut untersucht¹. In der Folge wurden mehrere Werkzeuge entwickelt, um die Dynamik des NCT zu untersuchen ^2,3,4. Zu diesen Instrumenten gehören die optogenetischen Sonden LINuS⁵ und LEXY⁶, die 2014 bzw. 2016 veröffentlicht wurden, eine leistungsstarke Möglichkeit, NCT in lebenden Zellen zu überwachen. Diese Werkzeuge, die so konzipiert sind, dass sie entweder den induzierbaren Export (LEXY) oder den Import (LINuS) eines fluoreszierenden Reporters verfolgen, sind durch Einwirkung von blauem Licht induzierbar und reversibel.

Kurz gesagt nutzen diese beiden kleinen Sonden die Eigenschaften der LOV2-Domäne aus dem Protein Phototropin-1 der Pflanze Avena sativa⁷. In Abwesenheit von blauem Licht wird die Jα-Helix aus der LOV2-Domäne photokäfigiert und in den Proteinkern eingebettet. Da die Jα-Helix auf Lichtreize reagieren kann, induziert die Beleuchtung durch blaues Licht eine Konformationsänderung und das anschließende Abkoppeln der Jα-Helix von der LOV2-Domäne. Die Autoren von LEXY und LINuS nutzten diese Lichtempfindlichkeit, um entweder ein nukleares Lokalisierungssignal (NLS) oder ein nukleares Exportsignal (NES) mit der Jα-Helix für LINuS bzw. LEXY zu fusionieren (Abbildung 1). Das resultierende Werkzeug ist eine Sonde, die bei Blaulichtbeleuchtung in den Zellkern (LINuS) oder das Zytosol (LEXY) transloziert.

Um die Sonden mit Fluoreszenzbildgebung zu verfolgen, wurde den Konstrukten auch ein mCherry-Fluoreszenzreporter hinzugefügt. Schließlich wurde dem System ein schwaches NES (für LINuS) oder NLS (für LEXY) hinzugefügt, um sicherzustellen, dass sich die Sonden nicht in ihrer endgültigen Lokalisation vor der Blaulichtbeleuchtung befanden, was die Beobachtung von LEXY- oder LINuS-Translokationen zwischen dem Zellkern und dem Zytosol verhindern würde.

Abbildung 1: Darstellung von LEXY- und LINuS-Sonden. Beide Sonden bestehen aus einem mCherry-Protein, das mit der lichtempfindlichen LOV2-Domäne fusioniert ist. Der Unterschied zwischen den beiden Werkzeugen liegt in der Signalsequenz, die von der Jα-Helix verdeckt wird: ein NES für LEXY und ein NLS für LINuS. Beide Sonden verfügen außerdem über eine schwache Signalsequenz, um ihre anfängliche Lokalisierung zu steuern: ein schwaches NLS für LEXY und ein schwaches NES für LINuS. Die Aktivierung der Systeme durch Blaulichtbeleuchtung bewirkt daher entweder ihren Export für LEXY oder ihren Import für LINuS, so dass die Benutzer den nuklearen Export oder Import überwachen können. Abkürzungen: LEXY = lichtinduzierbares nukleares Exportsystem; LINuS = lichtinduzierbares nukleares Lokalisierungssignal; NLS = nukleares Lokalisierungssignal; NES = nukleares Exportsignal. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Lokalisierung der mCherry-Fluoreszenz zeigt das Shuttle von LEXY- und LINuS-Sonden zwischen Zellkernen und Zytosol und kann daher in der Lebendzellbildgebung verfolgt werden, was es dem Benutzer ermöglicht, NCT zu überwachen. LEXY und LINuS können nicht nur als einfache Sonden verwendet werden, sondern auch zur Kontrolle der Lokalisierung und zur Untersuchung von Proteinen von Interesse, in vitro 5,6,8,9 oder in vivo ^10,11.

Die in den Publikationen LEXY und LINuS vorgeschlagene Quantifizierungsmethode zeigt die relative Kernintensität der Sonden. Die vorgeschlagene Analyse wird manuell durchgeführt und beruht auf der Messung einer Region of Interest (ROI) im Zellkern und im Zytosol. Obwohl diese Methode eine gute Darstellung des Signals der Sonde im Laufe der Zeit liefert, ist sie sehr langwierig und mühsam, insbesondere wenn Experimente und Bedingungen wiederholt werden. Wichtig ist, dass es dieser Methode auch an Genauigkeit mangelt, da nur ein kleiner Teil des entworfenen Fachs dargestellt wird.

Hier schlagen wir ein neues Protokoll für die Quantifizierung von LEXY- und LINuS-Fluoreszenzsignalen vor. Wir haben automatisierte Techniken implementiert, die die Analysen erleichtern und eine höhere Genauigkeit bieten. Dies erleichtert neuen Benutzern dieser Tools den Prozess und trägt dazu bei, den Durchsatz zu erhöhen. Unser Quantifizierungsprotokoll verwendet nur eine Schnittstelle, das Open-Source-Plugin TrackMate¹² von FIJI. Um die Zuverlässigkeit der Quantifizierungen zu verbessern, haben wir einen Live-Imaging-kompatiblen dunkelroten DNA-Marker verwendet, um die Segmentierung des gesamten Zellkerns mit StarDist¹³, einem trainierten Convolutional Neural Network, durchzuführen, kombiniert mit der Verfolgung und Messung des Fluoreszenzsignals der Sonde mit TrackMate¹².

Die erhaltenen Daten können dann einfach in die bereitgestellte und gebrauchsfertige Tabelle (Ergänzende Tabelle S1) exportiert werden, um die relative Kernintensität jedes identifizierten Kerns zu erhalten. Dieses Protokoll erklärt auch, wie man die erhaltenen Werte in einem Diagramm zusammenfasst, indem man die erhaltene Zeitverlaufskurve an ein monoexponentielles Modell anpasst, wie in Yoo und Mitchison¹⁴ , und wie man die Transportrate für die verschiedenen getesteten Bedingungen berechnet. Mit diesem Protokoll und der bereitgestellten Tabelle für die Analyse werden Benutzer in der Lage sein, Bildgebungsdaten von lebenden Zellen auch mit begrenzten Bioinformatikkenntnissen einfach zu quantifizieren.

Protokoll

HINWEIS: Das folgende Protokoll wird für die Überwachung des nuklearen Exports mit der LEXY-Sonde beschrieben. Details zu den Einstellungen zum Anpassen von LINuS finden Sie in Abschnitt 5.

1. Zellkultur

HINWEIS: Das Verfahren in diesem Abschnitt sollte in einer Haube in Gewebekulturqualität durchgeführt werden. Die unten beschriebenen Schritte wurden für die NIH/3T3-Maus-Fibroblasten-15-Zelllinie optimiert, wobei DMEM (oder phenolrotfreies DMEM, falls indiziert) verwendet wurde, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin als Medium (siehe Materialtabelle). Der Anwender kann das Verfahren jedoch auch für andere Zelltypen anpassen. Das Protokoll eignet sich für transfizierte Zellen oder stabile Zelllinien. Wir empfehlen jedoch, stabile Zelllinien zu erstellen, wie im Diskussionsabschnitt erwähnt.

1. Bereiten Sie die Beschichtungslösung mit 23 μg/mL Kollagen und 2 μg/mL Fibronektin in sterilem 1x PBS vor. Geben Sie 800 μl der Beschichtungslösung in jede Live-Imaging-Schale (siehe Materialtabelle) und bewahren Sie sie 90 Minuten lang im Inkubator auf.
2. Waschen Sie die Beschichtungsmischung mit sterilem 1x PBS und säen Sie 60.000 Zellen auf den Live-Imaging-Schalen in Medien, um sie am nächsten Tag aufzunehmen.
3. Bei Bedarf transfizieren Sie die Zellen mit dem LEXY-Plasmid nach der Transfektionsmethode, die am besten zum verwendeten Zelltyp passt. Um diesem Protokoll zu folgen, führen Sie eine Co-Transfektion der Sonde mit einem leeren Vektor durch, um den Wirkungsgrad zu erhöhen, in einem Verhältnis von 1:5 für den LEXY:leeren Vektor. Schützen Sie die Zellen in einer dunklen Box oder mit Alufolie vor Licht und lassen Sie sie einen Tag lang wachsen.
4. Färben Sie die Zellen vor der Entnahme mit einem dunkelroten DNA-Marker, der mit der Lebendzellbildgebung kompatibel ist, in einem phenolrotfreien Medium und stellen Sie sicher, dass sie bis zur Aufnahme vollständig vor Licht geschützt sind.
   HINWEIS: In unserem Fall verwenden wir SiR-DNA¹⁶ in 1 μM, das vor der Akquisition mindestens 1 h inkubiert wurde.
5. Zur Exportkontrolle wird der nukleäre Exporthemmer Leptomycin B¹⁷ in einer Dosis von 0,5 nM (milde Exporthemmung) und 1 nM (starke Exporthemmung) verwendet, der 1 h vor dem Erwerb auf die Zellen aufgetragen wird.

2. Bildgebung

HINWEIS: Die Aufnahmen können mit einem Live-Imaging-kompatiblen Konfokalmikroskop durchgeführt werden, das in der Lage ist, ein Muster ausgewählter Aufnahmen und eine pulsierende 458-nm-Laserbeleuchtung zu erstellen. Unsere Bildgebung wurde im Dunkeln in einer 37 °C Kammer (mit 5% CO₂) eines konfokalen Mikroskops mit resonanter Abtastung durchgeführt. Der Aufbau ist mit dem 20-fach-Objektiv optimiert und ermöglicht somit die gleichzeitige Bildgebung mehrerer Zellen im selben Sichtfeld. Die Bildgebungssequenz besteht aus drei Phasen, wie in Abbildung 2 dargestellt.

1. Stabile Phase
   1. Führen Sie alle 15 s eine Erfassung von mCherry- (LEXY, 561 nm Laser) und dunkelroten (SiR-DNA, 633 nm Laser) Signalen durch und wiederholen Sie sie 10x für eine Gesamtdauer von 150 s. Stellen Sie sicher, dass zu diesem Zeitpunkt weder ein Bleichen noch eine Translokation von LEXY in das Zytosol beobachtet werden.
      ACHTUNG: Eine Beleuchtung des Systems mit blauem Licht zu diesem Zeitpunkt würde LEXY aktivieren, was sofort seinen Export in das Zytosol induzieren würde.
2. Beleuchtungsphase
   HINWEIS: Diese Phase besteht aus drei Schritten, die 15x wiederholt werden.
   1. Führen Sie eine pulsierende Beleuchtung mit blauem Licht (458 nm Laser) durch, wobei 36 ms Pulse 150x wiederholt werden, für eine Gesamtdauer von ~5 s.
   2. Führen Sie eine Erfassung von mCherry (LEXY, 561 nm Laser) und dunkelroten (SiR-DNA, 633 nm Laser) Fluoreszenzsignalen durch.
   3. Pause für 15 Sekunden.
3. Erholungsphase
   1. Führen Sie alle 15 s eine Erfassung von mCherry- (LEXY, 561 nm Laser) und dunkelroten (SiR-DNA, 633 nm Laser) Signalen durch, wiederholen Sie diese 25x für eine Gesamtdauer von 375 s.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist optional und kann entfernt werden, wenn Benutzer nur den Export der Sonde und nicht die Wiederherstellung beobachten möchten.

Abbildung 2: Aufbau der drei Phasen von LEXY. Um den nuklearen Export mit LEXY zu überwachen, müssen drei Phasen in der Mikroskopsoftware eingerichtet werden. Der obere Teil zeigt die Konfiguration an, die für die Aufnahmen von lebenden Zellen von LEXY verwendet werden soll. Diese Konfiguration besteht aus einer stabilen Phase, um sicherzustellen, dass das Signal im Zellkern stabil ist, einer Beleuchtungsphase, um die Translokation von LEXY vom Zellkern zum Zytosol zu induzieren, und einer Erholungsphase, um zu beobachten, wie LEXY in den Zellkern zurückkehrt. Der untere Teil der Abbildung zeigt die zu erwartenden Ergebnisse bei der Lebendzellbildgebung. In Rot zeigt die mCherry die Lokalisation von LEXY an. In Grau färbt die SiR-DNA den Zellkern. Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Analyse für LEXY

HINWEIS: Die gesamte Segmentierungs- und Tracking-Analyse erfolgt unter Verwendung von FIJI mit TrackMate¹², einem Open-Source-Plugin für Fidschi (erforderliche Version ist in der Materialtabelle aufgeführt).

1. Installieren Sie FIJI und laden Sie dann die Plugins StarDist¹³ und TrackMate herunter. Um die Plugins zu installieren, gehen Sie zu Hilfe | Aktualisieren ... | Manage Update Sites (Update-Sites verwalten ) und aktivieren Sie CSBDeep, StarDist und Trackmate-StarDist und klicken Sie dann auf Änderungen übernehmen. Starten Sie Fidschi neu.
2. Während einige Mikroskope jede Aufnahmephase (Stable-Illumination-Recovery) zusammen nehmen können, speichern andere (z.B. das referenzierte konfokale Mikroskop) sie separat. Daher besteht ein zusätzlicher Schritt bei Verwendung dieser Konfiguration darin, die Phasen miteinander zu verketten: Öffnen Sie die Bilder der drei Sequenzen, führen Sie die Funktion Verketten aus, um die drei Zeitrafferphasen in einer einzigen Datei zusammenzustellen: Klicken Sie auf Bild | Stapel | Werkzeuge | Verketten....
3. Wählen Sie die stabile Phase als Image1, die Beleuchtungsphase als Image2 und die Wiederherstellungsphase als Image3 aus. Das resultierende Bild ist ein einzelnes Bild für den Zeitraffer der drei Phasen, wobei die Kanäle mCherry (Kanal 1) und SiR-DNA (Kanal 2) miteinander verschmolzen sind.
4. Bewahren Sie das erhaltene Bild für den späteren Segmentierungsschritt auf und speichern Sie es: Gehen Sie zu Datei | Speichern unter | Tiff....
5. Teilen Sie den mCherry-Kanal allein für die folgenden Analysen: Gehen Sie zu Bild | Farbe | Kanäle teilen und speichern: Gehen Sie zu Datei | Speichern unter | Tiff....
6. Um zu überprüfen, ob es während der Aufnahme zu einem eventuellen Ausbleichen gekommen ist, führen Sie den Befehl Z-Achsen-Profil plotten auf dem mCherry-Kanal aus: Gehen Sie zu Bild | Stapel | Plotten Sie das Z-Achsen-Profil. Klicken Sie in der generierten Tabelle auf Daten | Kopieren Sie den 1. Datensatz und fügen Sie ihn in die gebrauchsfertige Tabelle ein, die mit diesem Protokoll bereitgestellt wird (Ergänzende Tabelle S1), unterhalb der Profilzelle der Z-Achse.
7. Zeichnen Sie einen kreisförmigen Interessenbereich (ROI) der durchschnittlichen Größe eines Kerns, und speichern Sie ihn: Gehen Sie zu Analysieren | Werkzeuge | ROI-Manager.... Fügen Sie den ROI hinzu und speichern Sie ihn: Gehen Sie zu Mehr | Retten...
   HINWEIS: Derselbe ROI sollte verwendet werden, um den Hintergrund für alle analysierten Bedingungen zu messen.
8. Platzieren Sie den gespeicherten ROI während des gesamten Zeitraffers in einem Bereich ohne Zellen und messen Sie die durchschnittliche Intensität innerhalb dieses ROI mit der ROI-Interface-Funktion. Stellen Sie zunächst sicher, dass der mittlere Grauwert angekreuzt ist, indem Sie auf Analysieren | Legen Sie Messungen fest. Klicken Sie dann auf Mehr | Multi Messen. Markieren Sie Alle 50 Scheiben messen und eine rohe Scheibe pro Scheibe und klicken Sie auf OK.
9. Kopieren Sie alle Werte, die in der bereitgestellten Tabelle (Ergänzende Tabelle S1) angezeigt werden, und fügen Sie sie unter der Zelle "ROI-Hintergrund" ein.
10. Schließen Sie in Fidschi das Bild nur mit dem mCherry-Kanal und wählen Sie das zuvor gespeicherte Bild mit den zusammengeführten mCherry- und SiR-DNA-Kanälen aus.
11. Öffnen Sie das TrackMate-Plugin: Gehen Sie zu Plugins | Sendungsverfolgung | TrackMate.
12. Überprüfen Sie, ob die Anzahl der Zeitpunkte korrekt ist (0 bis 49 , wenn die vorgeschlagenen Phasen eingehalten wurden) und klicken Sie auf Weiter.
13. Wählen Sie den StarDist-Detektor aus und klicken Sie auf Weiter.
14. Wählen Sie Kanal 2 (SiR-DNA), um die Zellkerne zu segmentieren, und klicken Sie auf Weiter. Warten Sie einige Sekunden, bis der Segmentierungsprozess abgeschlossen ist. Überprüfen Sie visuell, ob die erhaltene Segmentierung dem Rand der Kerne entspricht, und klicken Sie auf Weiter (Abbildung 3). Im Falle einer ungenauen Segmentierung ist der entsprechende Nucleus Identifier (SpotID) zu notieren, um ihn von der weiteren Analyse in Schritt 3.26 auszuschließen.
15. Behalten Sie die Standardparameter bei und klicken Sie im Fenster mit den anfänglichen Schwellenwerteinstellungen auf Weiter. Dieses Fenster gibt die Anzahl der segmentierten Punkte (Kerne) unter den 50 Zeitpunkten an.
16. Filter auf Spots setzen: Filter erstellen und setzen:
    1. Erstellen Sie zwei Filter mit der mittleren Intensität ch1 als Parameter, um Kerne mit zu intensivem oder zu schwachem Signal zu entfernen, die die Analysen verzerren könnten: einen Filter zur Auswahl von Werten über dem definierten Schwellenwert und einen Filter zur Auswahl von Werten unterhalb des Schwellenwerts. Definieren Sie den Wert, um nur das sehr tiefe oder gesättigte Signal zu entfernen.
       HINWEIS: Diese Filter werden möglicherweise nicht benötigt, wenn stabile Zelllinien verwendet werden. Notieren Sie sich diese Werte, da sie für alle Bedingungen erneut angewendet werden müssen.
    2. Erstellen Sie zwei Filter Fläche , um unerwünschte Objekte (Ablagerungen, absterbende oder teilende Zellen) aus Analysen zu entfernen: einen Filter zur Auswahl von Werten über dem definierten Schwellenwert und einen Filter zur Auswahl von Werten unterhalb des Schwellenwerts. Klicken Sie auf Weiter.
       HINWEIS: Wenden Sie diese Werte für alle Bedingungen erneut an.
17. Wählen Sie einen Tracker aus: Wählen Sie Einfacher LAP-Tracker und klicken Sie auf Weiter.
18. Wählen Sie die Parameter für das Tracking aus. Passen Sie den maximalen Verknüpfungsabstand (hier 30 μm) an – den maximalen Abstand, der für die Verknüpfung mit Objekten zwischen Frames zulässig ist. Mit dem maximalen Abstand zum Lückenschluss (hier 15 μm) und dem maximalen Rahmenabstand zum Lückenschluss (hier 3) legen Sie fest, wie viele Punkte einer einzelnen Spur weggelassen werden können, ohne diese Spur auszuschließen. Klicken Sie auf Weiter (Abbildung 3).
    HINWEIS: Diese vorgeschlagenen Parameter wurden für unseren Aufbau und unser zelluläres Modell unter Verwendung eines Trial-and-Error-Ansatzes optimiert und müssen möglicherweise experimentell angepasst werden.
    Der maximale Abstand der Verknüpfung muss angepasst werden, um eine Fehlverfolgung von einem Zellkern zum anderen zu verhindern, insbesondere wenn sich die Zellen viel bewegen.
19. Klicken Sie nach der Berechnung auf Weiter und setzen Sie Filter auf Spuren. Um nur Kerne auszuwählen, die während des gesamten Zeitverlaufs (50 Zeitpunkte mit der vorgeschlagenen Sequenz) verfolgt wurden, wählen Sie die höchste Anzahl von Punkten in der Spur aus (platzieren Sie den Cursor auf mehr als 49 für die vorgeschlagene Sequenz). Klicken Sie auf Weiter.
    HINWEIS: Dies erleichtert die Analyse, ist aber nur möglich, wenn genügend Kerne über den gesamten Zeitverlauf verfolgt wurden, wenn nicht: siehe Diskussion.
20. Anzeigeoptionen: Markieren Sie Spotnamen anzeigen , um jeden Zellkern in weiteren Analysen nachvollziehen zu können. Passen Sie die angezeigten Funktionen an die Vorlieben des Benutzers an.
21. Klicken Sie unten auf der Seite auf Tracks | Exportieren Sie in CSV , um die Tabelle mit allen Messungen zu speichern. Schließen Sie die Tabelle und klicken Sie auf Weiter.
22. Optional können Sie die Spur-Features mit T (Zeit) als X-Achse und der mittleren Intensität von ch1 für die Y-Achse darstellen. Klicken Sie auf Features plotten. Schließen Sie das Diagramm und klicken Sie auf Weiter.
    HINWEIS: Dies gibt den Benutzern eine Vorstellung von der allgemeinen Tendenz des Exports. Zu diesem Zeitpunkt ist es nicht auf den Hintergrund und die anfängliche Intensität normalisiert.
23. Klicken Sie auf Overlay als Aktion erfassen und dann auf Ausführen | In Ordnung. Das erzeugte Bild wird verwendet, um die quantifizierten Kerne zu identifizieren. Speichern: Gehen Sie zu Datei | Speichern unter | Tiff....
24. Importieren Sie in einer Tabellenkalkulationsdatei die mit TrackMate erhaltene CSV-Datei: Klicken Sie auf der Registerkarte Daten in der Gruppe Daten abrufen und transformieren auf Aus Text/CSV und Importieren.
25. Wählen Sie die ganzen vier folgenden Spalten aus, indem Sie auf den entsprechenden Buchstaben klicken und kopieren Sie sie und fügen Sie sie oben in der bereitgestellten Tabelle (Ergänzungstabelle S1), Spalten A bis D, mit dem Hintergrund ein: Spot-ID (B), Spur-ID (C), Frame (I), Mittlere Intensität ch1 (M).
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Anfang der eingefügten Messgrößen in Zeile 6 der ergänzenden Tabelle S1 beginnt. Ist dies nicht der Fall, könnten die Messungen von einer oder mehreren Zellen verschoben werden und somit falsch sein. In der Tabelle der Zusatztabelle S2 finden Sie ein Beispiel für die erwartete Disposition.
26. Sortieren Sie die Ergebnisse alphabetisch, zuerst nach TrackID (einzelner Kern), indem Sie auf den Pfeil in Zelle B5 klicken, und Frame (Zeitpunkt), indem Sie auf den Pfeil in Zelle C5 klicken.
27. Um Hintergrundgeräusche zu entfernen, subtrahieren Sie die in Schritt 3.8 erhaltenen Werte von jedem Wert, der in der mittleren Intensität ch1 erhalten wurde (vorberechnet in der bereitgestellten Tabelle, siehe Ergänzende Tabelle S1).
28. Um das LEXY-Signal zu normalisieren, berechnen Sie die mittlere Intensität des mCherry-Fluoreszenzsignals in der stabilen Phase (Frames 0 bis 9). Teilen Sie dann alle Ergebnisse, die in der mittleren Intensität ch1 erhalten wurden, durch die mittlere Intensität der stabilen Phase (in der bereitgestellten Tabelle vorberechnet, siehe Ergänzende Tabelle S1).
    HINWEIS: Die erhaltene Zahl ist die mittlere nukleare Fluoreszenzintensität von LEXY. Alle Maße werden bereits nach Kernen aus Spalte L dargestellt und können in einem Diagramm dargestellt werden.

Abbildung 3: TrackMate-Analyse mit FIJI. Oben schematische Darstellung der TrackMate-Analysen, unten Bilder aus den FIJI-Analysen. Die erste Darstellung links zeigt die unsegmentierte SiR-DNA-Färbung, einen Marker des Zellkerns, in grau. Das zweite Feld stellt die automatische Segmentierung dar, die von Stardist mit dem SiR-DNA-Kanal durchgeführt wird. Die Kerne werden entsprechend der Intensität des mCherry-Kanals eingefärbt, um die Visualisierung und den letzten Schritt zu erleichtern. Das dritte Panel zeigt die Spuren, die durch die Verfolgung der SiR-DNA-Färbung zu den Zeitpunkten der gesamten Lebendzell-Bildgebungssequenz erhalten wurden. Das letzte Feld auf der rechten Seite zeigt das Fluoreszenzsignal von LEXY in Rot in dem durch die Segmentierung definierten Bereich, der für jeden Zeitpunkt gemessen wird. Maßstabsleiste = 50 μm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Transportkosten, Statistiken und Zahlen

1. Zeichne das Diagramm der relativen Kernintensität.
   1. Öffnen Sie GraphPadPrism und erstellen Sie ein Blatt: Klicken Sie auf Daten eingeben oder in eine neue Tabelle importieren und wählen Sie in den Optionen die verstrichenen Zeiten für X und die maximale Anzahl segmentierter Kerne für die Replikationswerte in nebeneinander liegenden Unterspalten für Y aus. Klicken Sie auf Erstellen und fügen Sie die erhaltenen Daten in die Tabelle ein.
   2. Wenn die Parameter der Erfassungen für die X-Werte (Zeit) wie vorgeschlagen beibehalten wurden, kopieren Sie die Spalte unter "Zeit" in der bereitgestellten Tabelle und fügen Sie sie ein. Andernfalls passen Sie die Werte entsprechend den verwendeten Parametern an.
   3. Um das Diagramm der relativen Kernintensität zu erstellen, gehen Sie zum Abschnitt Diagramme. Wählen Sie XY als Diagrammfamilie und Punkte & Verbindungslinie mit Fehlerbalken als Diagrammtyp aus.
   4. Wählen Sie im Abschnitt Diagramm die Optionen Mittelwert, Fehler und SEM aus und klicken Sie auf OK , um die Diagramme anzuzeigen. Ändern Sie die Maßstäbe und Visualisierungen entsprechend den gewählten Parametern.
2. Passen Sie die relative Kernintensität an ein monoexponentielles Modell an.
   1. Klicken Sie im Abschnitt Datentabelle auf Neue Datentabelle.
      1. Wählen Sie X-Werte als X eingeben und Geben Sie einen einzelnen Y-Wert für jeden Punkt als Y ein und klicken Sie auf Erstellen.
      2. Geben Sie in der Spalte X die Zeiten nur für die Stabil- und Beleuchtungsphasen in Dezimalstellen an. Wenn die vorgeschlagenen Parameter für Erfassungen beibehalten wurden, kopieren Sie die Spalte und fügen Sie sie unter "Dezimalzeit" in die bereitgestellte Tabelle, Ergänzende Tabelle S1, ein.
      3. Fügen Sie die als relative Kernintensität erhaltenen Werte in die Tabelle ein, nur für die Stabil- und die Beleuchtungsphase.
      4. Wählen Sie im Abschnitt Ergebnisse die folgende Analyse aus: XY-Analysen | Exponentiell | Nichtlineare Regression (Curve Fit) und klicken Sie auf OK.
      5. Wählen Sie in den Parametern Plateau gefolgt von einem Phasenzerfall als Modell aus, und wählen Sie in den Constrain-Parametern eine Konstante gleich 2,25 als X0 (die Startzeit der Beleuchtung), eine Konstante gleich 1 als Y0 (relative Kernintensität zu Beginn der Beleuchtung), eine Konstante gleich 0 für das Plateau (die Werte, auf die sich die relative Kernintensität stützen soll), und geben an, dass K (die Ausfuhrrate) größer als 0 sein soll. Lassen Sie die anderen Parameter auf Standard. Klicken Sie auf OK.
      6. Im Abschnitt Ergebnisse zeigt die Zeile K alle Exportraten für die Kerne der getesteten Bedingung an.
      7. Wiederholen Sie bei Bedarf die Schritte 4.2.1 bis 4.2.1.5 für die anderen Bedingungen.
3. Erstellen Sie das Diagramm für die Exportrate.
   1. Erstellen Sie eine neue Tabelle: Wählen Sie X-Werte eingeben als X und Enter und zeichnen Sie für jeden Punkt einen einzelnen Y-Wert als Y und klicken Sie auf Erstellen.
   2. Fügen Sie für jede Bedingung (in Spalten) die K-Werte ein, die Sie im vorherigen Schritt erhalten haben, und transponieren Sie sie.
   3. Um das Diagramm der Exportrate zu erstellen, gehen Sie zum Abschnitt Diagramme , wählen Sie Spalte als Diagrammfamilie aus, und wählen Sie im Abschnitt Box und Violine die Option Violindiagramm als Diagrammtyp mit Violindiagramm aus. Alle Punkte als Diagramm anzeigen. Klicken Sie auf OK , um die Grafik zu sehen. Passen Sie bei Bedarf die Art und Weise der Darstellung der Daten an.
   4. Um einen statistischen Test für die Exportrate durchzuführen, führen Sie einen zweiseitigen Welch-t-Test durch, wie in Yoo und Mitchison¹⁴ beschrieben, indem Sie die folgenden Schritte ausführen:
      1. Klicken Sie in der Tabelle mit den Exportraten aller Bedingungen auf Analysieren | Gruppenvergleich | T-Test (und nichtparametrische Tests), wählen Sie die zu testenden Bedingungen aus und klicken Sie auf OK. Markieren Sie Unpaired, Yes use parametric test und Unpaired t test with Welch's correction. Gehen Sie nicht von gleichen SDs aus und klicken Sie auf OK.
   5. Beobachten Sie die Ergebnisse der Analyse in der Tabelle im Abschnitt Ergebnisse und berichten Sie bei Bedarf im Diagramm der Exportrate.

5. Anpassungen für LINuS

HINWEIS: Das oben beschriebene Protokoll kann leicht angepasst werden, um den nuklearen Import mit LINuS zu überwachen, indem die folgenden Änderungen vorgenommen werden.

1. Zellkultur
   1. Anstelle von Leptomycin B in Schritt 1.5 ist Importazol¹⁸ als nukleärer Inhibitor in einer Konzentration von 10 μM für 1 h vor der Einnahme zu verwenden.
2. Bildgebung
   1. Um einen optimalen Import des Systems zu erhalten, ersetzen Sie die 150 Wiederholungen à 36 ms Beleuchtungsimpulse durch den 458 nm Laser in Schritt 2.2.1 durch 250 Wiederholungen für eine Gesamtdauer von ~9 s.
      HINWEIS: Das Sequenztiming kann vom Zelltyp abhängen, und die Parameter für beide Sonden müssen möglicherweise angepasst werden, um optimal zu sein, da die Systeme von der Erkennung von NLS und NES abhängen, die zelltypspezifisch sind ^19,20.
3. Transportrate, Statistiken und Zahlen
   1. Anstatt in Schritt 4.2.1.5 eine Kurve an ein Plateau mit anschließendem Phasenzerfall anzupassen, wählen Sie das Plateau gefolgt von einer Phasenassoziationsanalyse aus.
   2. Beschränken Sie X0 auf 2,25, Y0 auf 1 und K (die Importrate im Fall von LINuS) größer als 0.
      HINWEIS: Die Analysen von LINuS mit TrackMate sind identisch mit denen von LEXY. Die relative Kernintensität ist immer noch der gemessene und analysierte Wert, aber anstatt eine Abnahme aufgrund des Exports der Sonde zu beobachten, sollte eine Anreicherung des Fluoreszenzsignals im Zellkern nach Blaulichtbeleuchtung beobachtet werden.

Ergebnisse

Das oben erwähnte Protokoll sollte es den Anwendern ermöglichen, die Lokalisierung und Translokation der Sonde während der Aufnahme in der Lebendzellbildgebung zu visualisieren. Ein Beispiel für die erwarteten Bilder, die zur Visualisierung des Kernexports mit LEXY aufgenommen wurden, ist in Abbildung 4 dargestellt. Eine rasche Abnahme des Signals aus dem Zellkern und eine Anreicherung im Zytosol sollte nach einigen Runden blauer Lichtbeleuchtung beobachtet werden. Eine progressive Wiederherstellung des Signals der Sonde kann nach dem Stoppen der Beleuchtungszyklen sichtbar sein. Zur Steuerung des Systems bescheinigt Leptomycin B, ein Exporthemmer, dass eine Änderung des Exports mit den Analysen sichtbar gemacht werden kann, da es verhindert, dass LEXY bei Blaulichtbeleuchtung exportiert wird (Abbildung 4).

Abbildung 4: Visualisierung des LEXY-Signals über die Zeit. Erfassung repräsentativer Zeitpunkte der Stabil-, Beleuchtungs- und Erholungsphase, die mit Lebendzell-Imaging erfasst wurden. Die Methanolbedingung stellt die Kontrollbedingung dar. Bei pulsierender Beleuchtung mit blauem Licht in roter Farbe wird das mCherry-Fluoreszenzsignal, das den Standort von LEXY anzeigt, vom Zellkern in das Zytosol transloziert. Nach dem Stoppen der Beleuchtung wird das Signal im Zellkern wiederhergestellt. Die Behandlung mit dem Exportinhibitor Leptomycin B bei 1 nM oder 0,5 nM zeigt das Fehlen oder die Abnahme des LEXY-Exports, wenn der Export blockiert wird. Maßstabsleiste = 30 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Während die Werte der relativen Kernintensitätskurve während der stabilen Phase bei etwa 1 liegen sollten, sollten sie nach der Aktivierung von blauem Licht einen langsamen Abfall aufweisen, bis sie am Ende der Beleuchtungsphase ein Plateau erreichen (Abbildung 5A). Ist der Abfall zu schnell oder zu langsam, können die Erfassungsparameter optimiert werden (siehe Diskussion). Die Behandlung mit Leptomycin B in ausreichenden Konzentrationen kann auch bestätigen, dass die Analysen und die Technik empfindlich genug sind, um zu zeigen, dass der Kernexport vollständig blockiert ist, wobei die relativen Kernintensitätswerte während des gesamten Experiments stabil bei etwa 1 liegen. Mittlere Leptomycin-B-Konzentrationen sollten jedoch einen milden nuklearen Export aufweisen (Abbildung 5A). Diese visuellen Beobachtungen sollten quantitativ durch die Ermittlung der Ausfuhrquote bestätigt werden (Abbildung 5B).

Abbildung 5: Erwartete relative Kernintensität von LEXY und Transportrate. (A) Die Grafik zeigt die relative Kernintensität des Fluoreszenzsignals von LEXY über die Zeit, normiert auf die mittlere mCherry-Intensität der stabilen Phase. Die relative Kernintensität des Methanolzustands (Kontrolle, rot) nimmt nach der Beleuchtung um die Hälfte ab, im Gegensatz zu den mit dem Exportinhibitor Leptomycin B behandelten Zellen bei einer Konzentration von 0,5 nM (hellblau) bzw. 1 nM (dunkelblau). Fehlerbalken: SEM. (B) Exportrate der Kontroll- und Leptomycin-B-Bedingungen, erhalten durch Anpassung der Kurve an ein monoexponentielles Modell. Die Werte, die erhalten werden, wenn die Ausfuhr durch Leptomycin B blockiert wird, sind signifikant niedriger als die Kontrollbedingung. N = 18 Zellen für Methanol (rot), 19 Zellen für Leptomycin B 0,5 nM (hellblau) und 15 Zellen für Leptomycin B 1 nM (dunkelblau). Die P-Werte wurden durch einen zweiseitigen Welch-t-Test berechnet. : P < 1×10⁻⁴, ****: P < 1×10⁻⁵. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Tabelle S1: Tabelle mit vordefinierten Berechnungen. Diese Tabelle wird zur Verfügung gestellt, um die Analyse zu erleichtern. Die mit TrackMate erhaltenen Intensitätswerte können direkt kopiert und in die Tabelle eingefügt werden, um die normalisierten relativen Kernintensitätswerte zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle S2: Beispiel für die erwarteten Ergebnisse für eine Kontrollbedingung der LEXY-Analyse. Die Tabelle stellt ein Beispiel für die erhaltenen Werte für eine Kontrollbedingung der stabilen Zelllinie von LEXY dar. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Wie im Protokoll erwähnt, verbessert die Erstellung stabiler Zelllinien die Qualität der Analysen erheblich. Erstens, wenn 100 % der Zellen die Sonden exprimieren, erhöht sich die Anzahl der verfolgten und analysierten Kerne, was die Robustheit der Analysen stärkt. Zweitens reduziert es den Zelltod, der durch die Überexpression der Sonden und die Toxizität der verwendeten Transfektionsreagenzien induziert wird. Und schließlich reduziert es die starke Heterogenität der Fluoreszenzsignale zwischen den Zellen. Dieser Parameter ist von Bedeutung, da ein gesättigtes Signal es nicht ermöglicht, die Intensitätsänderung nach der Beleuchtung richtig zu erkennen. Die gleiche Schlussfolgerung gilt für schwache Signale, die ausbleichen oder die Quantifizierung von Unterschieden nicht zulassen können. Daher empfehlen wir, die Sonden zunächst durch Transfektion zu testen, um sicherzustellen, dass sie ordnungsgemäß funktionieren, die Erfassungsparameter einzustellen und dann schnell stabile Zelllinien zu erstellen. Wir haben Lentivirus-Vektoren sowohl für LEXY- als auch für LINuS-Sonden entwickelt, die auf Anfrage zur Verfügung stehen, sowie für die stabilen NIH/3T3-LEXY- oder LINuS-Linien, die mit diesen Lentiviren erstellt wurden.

Wenn die Sonden transfiziert werden oder wenn die Zellen dünn gesät sind, verringern die vorgeschlagenen Parameter wahrscheinlich die Anzahl der erkannten Spuren, und die Analysen sind weniger robust. Wenn dies der Fall ist, können die Benutzer mit den im Tracking ausgelassenen Spots freizügiger umgehen, indem sie den Filter Anzahl der Spots in Tracks verringern (wir empfehlen, mindestens 45 von 50 Spots zu behalten). Achtung: Wenn dieser Filter verringert wird, sollte die bereitgestellte Excel-Datei (Ergänzende Tabelle S1) manuell angepasst werden: In der Tat berücksichtigen die Werte, die aus der importierten CSV-Datei eingefügt werden, die Lücken nicht. Der Benutzer muss herausfinden, wo sich die fehlenden Stellen mit der TrackID-Nummer befinden, und sie mit der Nukleusnummer korrelieren, was in der Regel einige Copy-Paste-Runden erfordert.

Ein kritischer Parameter, um den Erfolg des Experiments zu garantieren, besteht darin, die Zellen im Dunkeln zu halten. Da die Sonden auf blaues Licht reagieren, müssen die Benutzer den Transport der Zellen im Dunkeln für mindestens 30 Minuten sicherstellen, bevor sie aufgenommen werden. Eine kleine geschlossene Schachtel oder die Verwendung von Aluminium zum Abdecken der Schale ist ausreichend. Ebenso ist es notwendig, sehr vorsichtig zu sein, das mCherry-Licht nur für die Suche nach den Zellen am Mikroskop zu verwenden, da die Beleuchtung mit blauem Licht die Zellen aktiviert. Wenn es unter dem Mikroskop zu einer eventuellen Beleuchtung kommt, suchen Sie nach einem anderen entfernten Feld für die Erfassung. Das Plotten des Z-Achsen-Profils in Schritt 3.6 hilft zu erkennen, ob die Zellen von einer Beleuchtung beeinflusst wurden und ob die Kurve abnimmt und kein Plateau darstellt.

Die Bildgebungssequenz ist so aufgebaut, dass sie aus drei Phasen besteht. Erstens, die stabile Phase, um ein mögliches Bleaching zu beurteilen, aber auch, um sicherzustellen, dass die Lokalisation von LEXY ohne Aktivierung stabil ist (1). Zweitens die Aktivierungsphase, bestehend aus Runden pulsierender Blaulichtbeleuchtung, um die Translokation von LEXY vom Zellkern zum Zytosol zu induzieren (2). Schließlich die optionale Erholungsphase, in der das Signal schrittweise an seinen ursprünglichen Ort im Zellkern zurückkehrt (3).

Die für die Akquisitionen beschriebene Sequenz kann zelltypspezifisch sein^19,20. Für das erste Experiment sollte der Benutzer die Laserleistung und das Timing testen und modifizieren, um zu sehen, wie das System schrittweise zwischen Zellkern und Zytosol transloziert. Von Bedeutung ist, dass eine zu starke Laserleistung, wie eine zu kurze Pause, eine progressive Translokation verhindern kann, sondern stattdessen einen brutalen Abfall/eine Anreicherung (je nach verwendeter Sonde) der mCherry-Intensität nach der Beleuchtung.

Wenn die Optimierung der Sequenz das Problem nicht löst, ist es wahrscheinlich, dass das NES und/oder NLS nicht für den verwendeten Zelltyp geeignet sind. Benutzer können sich auf den Artikel⁸ der LINuS-Methode beziehen, um die Sonden zu entwickeln und zu modifizieren. Benutzer können diesen Artikel auch für die Bildgebung von LINuS mit einem Epifluoreszenzmikroskop konsultieren.

Die Segmentierung der Kerne ist ein kritischer Schritt der Analyse. Für die Bildgebung der Sonden in lebenden Zellen sollte ein robuster und zuverlässiger nukleärer Marker verwendet werden. Da die Beleuchtung mit blauem Licht die Translokation der Sonde aktiviert und die Sonden mit dem fluoreszierenden Protein mCherry überwacht werden, muss dieser Marker im fernroten Spektrum oder in der Nähe sichtbar sein. In unserem Fall verwenden wir SiR-DNA, die die Zellen während 1 bis ~24 Stunden Inkubation färbt, aber die Verwendung von SPY-DNA 650 ist auch eine Option (siehe Materialtabelle für Referenzen).

Wenn schließlich die Segmentierung mit StarDist in Kombination mit dem gefilterten Tracking von TrackMate ihre Effizienz beweist, ist es wichtig zu beachten, dass der Benutzer die Ergebnisse der Segmentierung und der Quantifizierung immer visuell überprüfen sollte. Eine sich teilende oder sterbende Zelle kann in die Quantifizierung einbezogen werden, sollte dies aber nicht. Um die Risiken der Analyse solcher Ereignisse zu verringern, wird in der bereitgestellten Excel-Tabelle der relativen Kernintensität ein Farbcode zugewiesen (blau = niedrige Werte, rot = hohe Werte). Durch die Überprüfung der Farben vor dem Zeichnen der Werte in GraphPad Prism sollte der Benutzer in der Lage sein, ungewöhnliche Werte zu bemerken. Zum Beispiel sollten die relativen Kernintensitäten von LEXY von hoch (rot, starke Mengen der Sonde in den Kernen) während der stabilen Phase bis zu niedrig (blau, reduzierte Mengen der Sonde in den Kernen) am Ende der Beleuchtungsphase variieren, bevor sie in der Erholungsphase wieder auf hohe Werte (rot) zurückkehren (wie in der ergänzenden Tabelle S2 angezeigt).

Dieses Protokoll bietet verschiedene Vorteile gegenüber den zuvor vorgeschlagenen Methoden ^5,6. Die halbautomatische Pipeline erleichtert die Analyse des nukleozytoplasmatischen Transports von LEXY und LINuS und bietet eine höhere Genauigkeit als die bisher vorgeschlagene manuelle Quantifizierung ^5,6. Die Verwendung unseres Protokolls ermöglicht es Anfängern auf diesem Gebiet, effiziente Analysen durchzuführen, bietet aber auch ein neues Werkzeug für erfahrene Anwender, die nur eine frei zugängliche Schnittstelle benötigen, um halbautomatische Analysen des nukleozytoplasmatischen Transports durchzuführen.

Diese Methode kann für weitere Anwendungen als die Untersuchung der globalen nukleozytoplasmatischen Transportrate in NIH3T3-Zelllinien verwendet werden. Mit wenigen Optimierungsschritten kann es nämlich angepasst werden, um die Transportrate der Sonde in verschiedenen Zelltypen oder lebenden Tieren zu untersuchen⁸. Darüber hinaus ist es durch die Fusion eines Proteins, das für LEXY oder LINuS von Interesse ist, auch möglich, seine Transportrate oder die nachgeschalteten Effekte seiner lichtinduzierten Translokation in oder aus dem Zellkern zu untersuchen. So ist es beispielsweise möglich, mit LEXY ein Protein im Zytoplasma zu sequestrieren, oder mit LINuS 5,6,21,22,23 seine Lokalisierung in den Zellkern zu erzwingen. Schließlich können die beschriebenen Analysen auch auf mehr Anwendungen als LEXY und LINuS ausgeweitet werden, um jedes Signal zu verfolgen, das zwischen subzellulären Kompartimenten transloziert wird, die segmentiert werden können.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kollagen	Sigma-Aldrich	08-115
Konfokales Mikroskop	LEICA	SP8
DMEM	Gibco	31966021
Ausstechen	Microsoft
FBS	Sigma-Aldrich	Nr. F7524
Fibronektin	Sigma-Aldrich	Nr. F1141
Software für Fidschi	FIDSCHI		BildJ 2.16.0/1,54p; Java1.8.0_322
Fluoroschalen	Dutscher	Nr. FD3510-100	Alternativ: Attofluor-Kammer (Invitrogen #A7816)
GraphPad Prism 10.4.1	GraphPad Software, Inc.
Importazol	Sigma-Aldrich	SML0341
Leptomycin B	Sigma-Aldrich	Nr. L2913
LEXY Plasmid	Addgene	72655	pDN122
LINuS-Plasmid	Addgene	61347	pDN77
Bleistift-Streptomycin	Gibco	15140-122
Phenolrotfreies DMEM	Gibco	21063-029
SiR-DNA	Spirochrom	Nr. SC007	Alternativ: SPY-DNA650 (Spirochrom #SC501)
Stardist 2D-Plugin	StarDist		StarDist_0.3.0
TrackMate-Plugin	TrackMate (Englisch)		TrackMate-7.14.0