Method Article

Methodik zur Untersuchung des Lernens und des Gedächtnisses bei juvenilen Ratten unter Verwendung von Sevofluran-Anästhesie zur Beurteilung der hippokampalen p-CREB- und c-fos-Expression

DOI:

10.3791/68591

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September 19th, 2025

 ,  , 
1Department of Anesthesiology and SICU, Xinhua Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dieser Studie wird untersucht, wie Sevofluran die Gedächtniserhaltung beeinträchtigt und die p-CREB- und c-fos-Expression in hippokampalen Neuronen über den NMDAR/p-CREB/c-fos-Signalweg bei juvenilen Ratten reduziert. Die Ergebnisse zeigen, dass Sevofluran Defizite des Kurzzeitgedächtnisses verursacht und synaptische Plastizitätsmarker herunterreguliert, wobei die Wirkung nach 3 Tagen reversibel ist, unabhängig von der Dosierungshäufigkeit.

Abstract

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Die Untersuchung kognitiver Beeinträchtigungen während der Gehirnentwicklung steht aufgrund der dynamischen Natur der Neuroentwicklung, methodischer Einschränkungen und kontextueller Barrieren vor Herausforderungen. In dieser Studie wurde ein integrierter methodischer Ansatz zur Untersuchung kognitiver Beeinträchtigungen im sich entwickelnden Gehirn untersucht, die durch Sevofluran verursacht werden, basierend auf dem Gedächtnis und der p-CREB- und c-fos-Expression in Hippocampus-Neuronen über den NMDAR/p-CREB/c-fos-Signalweg bei juvenilen Ratten. Vierundsechzig 21 Tage alte männliche SD-Ratten (Körpergewicht <80 g) wurden in fünf Gruppen eingeteilt: normal (n=8), 60% O2 (n=16), Scheintraining (n=8), Einzeldosis Sevofluran (n=16) und Mehrfachdosis Sevofluran (n=16). Die beiden Sevofluran-Gruppen wurden in 1 Tag (Gruppen sev1a und sev1b) und 30 Tage (Gruppen sev30a und sev30b) nach dem Training unterteilt (n=8/Untergruppe); Alle anderen Ratten wurden 1 h nach dem Training getötet. Der Y-Labyrinth-Test wurde verwendet, um das Lernen und die Gedächtnisleistung zu bewerten. Immunhistochemie wurde verwendet, um die Anzahl der p-CREB- und c-fos-positiven Neuronen in den Hippocampus-Proben zu bestimmen. Im Vergleich zur 60%-O2-Gruppe (Gedächtniserhaltung von 86,33% ± 17,52%) zeigte das Gedächtnis der Ratten in der sev1a- und sev1b-Gruppe eine signifikante Abnahme (sev1a: 44,29% ± 11,26%; sev1b: 62,42% ± 7,27%; alle P<0,05), während die sev1b- und sev30b-Gruppen keine signifikanten Unterschiede aufwiesen (sev30a: 84,41% ± 14,15%; sev30b: 85,21% ± 11,61%; alle P>0,05). Im Vergleich zur 60%- O2-Gruppe (c-fos: 92,83 ± 7,88; p-CREB: 72,22 ± 8,89) nahm die Expression von p-CREB und c-fos in hippokampalen Neuronen in der sev1a-Gruppe (c-fos: 23,13 ± 3,28; p-CREB: 22,88 ± 5,18) und der sev30-Gruppe (c-fos: 23,22 ± 3,13; p-CREB: 25,58 ± 2,26) ab (alle P<0,05), während die sev30a- und sev30b-Gruppen keine signifikanten Unterschiede zeigten (alle P>0,05). Sevofluran hat eine kurzfristige negative stimulierende Wirkung auf die Fähigkeit zur Aufrechterhaltung des Gedächtnisses von juvenilen Ratten, ohne dass dies Auswirkungen auf die Dosierungshäufigkeit hat. Sevofluran verringert die Expression von p-CREB und c-fos in hippokampalen Neuronen juveniler Ratten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Untersuchung kognitiver Beeinträchtigungen während der Gehirnentwicklung steht aufgrund der dynamischen Natur der Neuroentwicklung, methodischer Einschränkungen und kontextueller Barrieren vor erheblichen Herausforderungen. Die Entwicklung des Gehirns beinhaltet schnelle, nichtlineare Veränderungen, die die Identifizierung von Beeinträchtigungen während kritischer Zeitfenster erschweren 1,2. In ressourcenarmen Umgebungen behindern Barrieren wie die Lese- und Schreibfähigkeit der Pflegekräfte, die sprachliche Vielfalt und der eingeschränkte Zugang zu spezialisierten Instrumenten (z. B. MRT) ein frühzeitiges Screening1. Die individuelle Variabilität der Hirnreifung erschwert die Unterscheidung pathologischer Abweichungen von der typischen Entwicklung 2,3. Erkrankungen wie das Down-Syndrom weisen eine veränderte kortikale Entwicklung auf, aber kleine Stichprobengrößen und spärliche histologische Daten schränken mechanistische Erkenntnisseein 4. Neurologische Entwicklungsstörungen (z. B. ASD, ADHS) treten oft zusammen mit Angstzuständen oder Depressionen auf, was die kognitiven Bewertungen verwirrt5. Schwerwiegende Kommunikationsdefizite in einigen Populationen schränken die Verwendung standardisierter Tests ein6. Diese Merkmale führen zu mehreren Fragen des Forschungsdesigns. In der Tat verwenden die meisten Studien Querschnittsdesigns und versäumen es, die Veränderung innerhalb der Person im Laufe der Zeit zu modellieren. Es besteht eine übermäßige Abhängigkeit von westlichen, gebildeten Bevölkerungen ("WEIRD"-Stichproben)7. Die Down-Syndrom-Forschung leidet unter kleinen postmortalen Hirnproben und unzureichenden altersangepassten Kontrollen4. Ökologische momentane Bewertungsinstrumente haben Schwierigkeiten, kontextuelle Variablen zu berücksichtigen, die die tägliche kognitive Leistung beeinflussen5.

Zu den wichtigsten Funktionen im tierischen und menschlichen Gehirn gehören Lernen und Gedächtnis, die für die menschliche Entwicklung und das Leben im Allgemeinen von zentraler Bedeutung sind8. Das Gehirn von Säuglingen befindet sich im Entwicklungsstadium und ist anfällig für äußere Faktoren wie Medikamente und Anästhesie 9,10. Die durch Anästhetika verursachte Schädigung der Gedächtnisfunktion von Säuglingen ist ein wichtiges klinisches Forschungsthema und kann sogar optimale Behandlungen für pädiatrische Patienten verzögern, da keine Anästhesie durchgeführt werden kann11. Anästhesiebedingte kognitive Dysfunktionen (oder postoperative kognitive Dysfunktion, POCD) können bei Säuglingen langfristige Folgen haben12. Die Inhalation von Sevofluran kann die Gedächtnisfunktionen bei Säuglingen beeinträchtigen13,14, aber die traditionelle Anästhesiologie geht davon aus, dass Hirnschäden bei Säuglingen hauptsächlich durch eine Hirnhypoxie während der Anästhesie verursacht werden, insbesondere in der Vollnarkose10. Solange es keine kurz- oder langfristige Hypoxie im Gehirn gibt, sollte daher das Risiko einer Schädigung des Zentralnervensystems bei Säuglingen verringert werden11. Dennoch ist das Verständnis von POCD nach wie vor suboptimal. Säuglinge, die operiert werden müssen, benötigen eine Anästhesie, und eine bessere Kenntnis der beteiligten Signalwege könnte dazu beitragen, Anästhesiestrategien zu entwickeln, die das Risiko von POCD minimieren würden.

Eine Studie mit älteren erwachsenen Patienten, die sich einer nicht-kardialen Operation unterzogen hatten, zeigte, dass fast 25 % der Patienten innerhalb von 1 Woche nach der Operation eine POCD erlitten und der Anteil nach 3 Monaten auf unter 10 % sank, während die Kontrollgruppe POCD-Raten von 3,4 % und 2,8 % aufwies15. Die Studie zeigte auch, dass die meisten POCD-Fälle reversibel waren, wobei nur eine kleine Anzahl von Patienten eine anhaltende oder dauerhafte POCD aufwies15. Im zentralen Nervensystem ist Glutamat die häufigste exzitatorische Aminosäure16. Der N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor (NMDAR) ist entscheidend für die Induktion und Aufrechterhaltung der Langzeitpotenzierung (LTP) und der Langzeitdepression (LTD)17. Untersuchungen an Mäusen zeigten, dass die exzitatorische synaptische Plastizität die Entwicklung der Gehirnfunktion direkt beeinflusst18, wobei die NMDAR-Aktivierung und der Kalziumeinstrom besonders wichtig sind19,20. Eine erhöhte NMDAR-Aktivität hat signifikante Auswirkungen auf die Induktion des synaptischen Wachstums und der Plastizität19,20. Daher sollte ein höherer Grad der NMDAR-Blockade durch NMDAR-Antagonisten (z. B. Sevofluran) zu geringeren Lern- und Gedächtnisfähigkeiten führen21. Während die Auswirkungen von Sevofluran auf das Lernen und das Gedächtnis im Gehirn von Erwachsenen noch nicht eindeutig geklärt sind22,23, wird Sevofluran häufig für die Anästhesie in pädiatrischen Operationen eingesetzt14. Als nicht-kompetitiver Antagonist von NMDAR kann Sevofluran die Lern- und Gedächtnisfunktionen des Gehirns signifikant beeinflussen 11,13,14,23,24. Nichtsdestotrotz sind neben NMDAR auch andere Signalwege und Proteine am Lernen und Gedächtnis beteiligt, und die Mechanismen der Gedächtnisregulation, an denen das phosphorylierte cAMP-Response-Element-bindende Protein (p-CREB) und das unmittelbare frühe Gen c-fos beteiligt sind, werden immer klarer 25,26,27, erfordern aber immer noch ein besseres Verständnis für eine optimale Anästhesieverabreichung bei Säuglingen und Kindern.

Basierend auf diesen theoretischen Rahmenbedingungen wurde in der vorliegenden Studie ein integrierter methodischer Ansatz untersucht, der zur Untersuchung kognitiver Beeinträchtigungen im sich entwickelnden Gehirn verwendet werden könnte, die durch Sevofluran verursacht werden, basierend auf dem Gedächtnis und der p-CREB- und c-fos-Expression in hippokampalen Neuronen über den NMDAR/p-CREB/c-fos-Signalweg bei juvenilen Ratten. Die Ergebnisse könnten dazu beitragen, unser Verständnis von POCD und Gedächtnisstörungen nach Vollnarkose zu verbessern. In dieser Studie wurden 21 Tage alte Ratten verwendet, da sie gerade entwöhnt worden waren und ein sehr einheitliches Körpergewicht und einen physiologischen Status aufwiesen, der der frühen Adoleszenz beim Menschen entspricht. Aufgrund ihrer erhöhten Neuroplastizität und Vulnerabilität während dieser kritischen Entwicklungsphase können sie die kognitiven Beeinträchtigungen, die durch Operation oder Anästhesie am unreifen Gehirn verursacht werden, effizient modellieren28,29. Damit eignen sie sich besonders gut, um die neurokognitiven Risiken der Kinderchirurgie zu untersuchen und mögliche Interventionsstrategien zu erforschen. Das Y-Labyrinth ist eine häufig verwendete Methode zur Bewertung von Lernen und Gedächtnis30. Die Immunhistochemie wird häufig zur Untersuchung von Neuronen und verschiedenen neuronalen Proteinen eingesetzt.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Protokolle in dieser Studie wurden von der Ethikkommission des Xinhua-Krankenhauses der Shanghai Jiao Tong University School of Medicine überprüft und genehmigt (Zulassungs-Nr. XHEC-C-2016-023-2).

1. Experimenteller Überblick über Tiere und Gruppierungen

  1. Es werden 64 21 Tage alte männliche SD-Ratten (Körpergewicht unter 80 g) erhalten.
  2. Teilen Sie die Ratten in fünf Gruppen ein: Normalgruppe (n = 8), 60% O2-Gruppe (n = 16), Scheintrainingsgruppe (n = 8), Einzeldosis-Sevofluran-Gruppe (n = 16) und Mehrfachdosis-Sevofluran-Gruppe (n = 16) (siehe Tabelle 1).
  3. Halten Sie die Ratten in einer Tieranlage bei 20-24 °C mit 50%-60% Luftfeuchtigkeit und natürlichem Licht.
  4. Sorgen Sie für ausreichend Futter und Wasser.
  5. Stellen Sie sicher, dass alle Protokolle von der Ethikkommission überprüft und genehmigt werden.
  6. Die Inhalationskammer ist vorzubereiten (siehe Ergänzende Abbildung S1 in Abschnitt 2.1).
  7. Gruppe Normal
    1. Die Ratten 2 Stunden lang 60 % Luft aussetzen (siehe Abschnitt 2.2).
    2. Führen Sie den Y-Labyrinth-Test 1 Tag nach der Exposition durch (siehe Abschnitt 4).
    3. Entnehmen Sie Gewebe nach Verhaltenstests (siehe Abschnitt 5).
  8. 60% O2 Gruppe
    1. Die Ratten 2 Stunden lang 60 % Luft aussetzen (siehe Abschnitt 2.2).
    2. Führen Sie 30 Tage nach der Exposition einen Y-Labyrinth-Test durch (siehe Abschnitt 4).
    3. Entnehmen Sie Gewebe nach Verhaltenstests (siehe Abschnitt 5).
  9. Schein-Trainingsgruppe
    1. Die Ratten 2 Stunden lang 60 % Luft aussetzen (siehe Abschnitt 2.2).
    2. Führen Sie 1 Tag nach der Exposition einen Y-Labyrinth-Test ohne strukturiertes Training durch (Lichter und Schockzonen variierten zufällig), um die Auswirkungen von Licht und elektrischen Reizen auf Lernen und Gedächtnis zu kontrollieren (siehe Abschnitt 4).
    3. Entnehmen Sie Gewebe nach Verhaltenstests (siehe Abschnitt 5).
  10. Einzeldosis-Sevofluran-Gruppe (sev1a-Gruppe)
    1. Die Ratten sind 2 Stunden lang 60 % Luft + 3 % Sevofluran auszusetzen (siehe Abschnitt 2.2).
    2. Führen Sie den Y-Labyrinth-Test 1 Tag nach der Exposition durch (siehe Abschnitt 4).
    3. Entnehmen Sie Gewebe nach Verhaltenstests (siehe Abschnitt 5).
  11. Einzeldosis-Sevofluran-Gruppe (sev30a-Gruppe)
    1. Die Ratten sind 2 Stunden lang 60 % Luft + 3 % Sevofluran auszusetzen (siehe Abschnitt 2.2).
    2. Führen Sie 30 Tage nach der Exposition einen Y-Labyrinth-Test durch (siehe Abschnitt 4).
    3. Entnehmen Sie Gewebe nach Verhaltenstests (siehe Abschnitt 5).
  12. Sevofluran-Gruppe mit wiederholter Gabe (sev1b-Gruppe)
    1. Die Ratten sind an 7 aufeinanderfolgenden Tagen 2 Stunden pro Tag 2 Stunden lang 60 % Luft + 3 % Sevofluran auszusetzen (siehe Abschnitt 2.2).
    2. Führen Sie den Y-Labyrinth-Test 1 Tag nach der Exposition durch (siehe Abschnitt 4).
    3. Entnehmen Sie Gewebe nach Verhaltenstests (siehe Abschnitt 5).
  13. Sevofluran-Gruppe mit wiederholter Gabe (sev30b-Gruppe)
    1. Die Ratten sind an 7 aufeinanderfolgenden Tagen 2 Stunden pro Tag 2 Stunden lang 60 % Luft + 3 % Sevofluran auszusetzen (siehe Abschnitt 2.2).
    2. Führen Sie 30 Tage nach der Exposition einen Y-Labyrinth-Test durch (siehe Abschnitt 4).
    3. Entnehmen Sie Gewebe nach Verhaltenstests (siehe Abschnitt 5).

2. Inhalation von Sevofluran

  1. Vorbereitung der Kammer (siehe Zusatzbild S1)
    1. Verbinden Sie das Loch auf der linken Seite der Box mit 60 % Ø2/40 % N2.
    2. Schließen Sie die Sauerstoffversorgung an den Sevofluran-Verdampfer an.
    3. Verbinden Sie das Loch auf der rechten Seite der Box mit dem Gasanalysator eines Anästhesiegeräts.
    4. Verbinden Sie das Loch oben in der Kammer mit dem Gasablauf.
    5. Lege Limette unter das Netz am Boden der Kammer und füge Watte hinzu.
    6. Platzieren Sie das Setup in einem Abzug.
    7. Lege ein Heizkissen unter die Kammer.
  2. Inhalation
    1. Schalten Sie die Sauerstoffzufuhr und den Sevofluran-Verdampfer ein.
    2. Stellen Sie den Sauerstofffluss auf 2 L/min ein.
    3. Wenn die Sevoflurankonzentration 3,0 % erreicht, halten Sie den Durchfluss 30 Minuten lang aufrecht, um die Atmosphäre in der Kammer zu stabilisieren.
    4. Lege eine Ratte auf die Baumwollseite der Kammer.
    5. Halten Sie die Ratte dort nach Gruppierung (siehe Schritt 1.2).
    6. Überwachen Sie Hautfarbe, Atemfrequenz, Herzfrequenz und Pulsoximetrie.
    7. Entferne die Ratte.
    8. Lass die Ratte auf natürliche Weise erwachen.
    9. Setze die Ratte in ihren Käfig zurück.

3. Experimentelle Reagenzien und Instrumente

  1. Vorbereitung der Reagenzien
    1. Bereiten Sie 250 ml kommerziell erhältliches Sevofluran für die Anästhesieverabreichung vor.
    2. Bereiten Sie die p-CREB-Antikörper-Arbeitslösung vor, indem Sie den Stammantikörper 1:350 verdünnen.
    3. Bereiten Sie die c-fos-Antikörper-Arbeitslösung vor, indem Sie den Stammantikörper 1:200 verdünnen.
    4. Stellen Sie das Kit für die immunhistochemische Färbung zusammen.
    5. Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd vor.
      1. 40 g lösliches Paraformaldehyd (PFA) in einem Glasbehälter mit 500 mL hochreinem Wasser auflösen, kontinuierlich erhitzen und magnetisch auf 60-65 °C rühren, bis eine milchige Suspension entsteht.
      2. Tropfen von 1,0 mol/L NaOH zugeben, bis die Lösung klar wird (pH = 7,0).
      3. Fügen Sie ca. 500 ml PBS hinzu und mischen Sie es gründlich in ein Eisbad oder kaltes Wasserbad.
      4. Überprüfen Sie den pH-Wert erneut, filtern Sie und stellen Sie ein Volumen von bis zu 1000 mL her.
      5. Für die zukünftige Verwendung bei 4 °C lagern.
  2. Einrichtung der Ausrüstung
    1. Positionieren Sie das Y-Labyrinth im Bereich der Verhaltenstests (siehe ergänzende Abbildung S2).
    2. Kalibrieren Sie das Mikroskop mit einem integrierten Bildgebungssystem für die histologische Analyse.
  3. Platzieren Sie das Mikrotom mit frischen Klingen für die Gewebeschnitte.
  4. Programmieren Sie die Dehydrationsmaschine mit dem Standardprotokoll für die Gewebeverarbeitung.
  5. Bereiten Sie die Färbemaschine mit den sequentiellen Färbebädern gemäß den Anweisungen des Maschinenherstellers vor.
  6. Richten Sie das Perfusionsgerät ein.
    1. Verwenden Sie zwei in Plastik verpackte Kochsalzflaschen, lassen Sie die Kochsalzlösung aus der unteren Öffnung ab und füllen Sie sie mit PBS und 4 % Paraformaldehyd-Fixiermittel.
    2. Hängen Sie die Flaschen auf, verbinden Sie sie mit Infusionssets und befestigen Sie einen Dreiwege-Absperrhahn an dem dicken Nadelende des Infusionssets.

4. Y-Labyrinth und Lernen/Gedächtnistest

  1. Baue das Y-Labyrinth zusammen
    1. Richten Sie das Y-Labyrinth mit drei rechteckigen Armen ein, die mit I, II und III beschriftet sind und durch eine dreieckige Verbindung verbunden sind (siehe ergänzende Abbildung S2).
    2. Platzieren Sie ein elektrisches Gitter mit einem Abstand von 1 cm auf dem Boden des Labyrinths.
    3. Befestigen Sie dünne 2 cm dicke Kupferstreifen an den Wänden des Labyrinths, um gefährliche Bereiche zu simulieren und Stimulussignalleuchten zu installieren.
  2. Definieren Sie gefährliche und sichere Bereiche
    1. Elektrifizieren Sie die Bereiche I, II und III mit 16.000 V/m, um Gefahrenbereiche anzuzeigen (die Signalleuchte leuchtet auf, wenn sie elektrifiziert ist).
    2. Markieren Sie nicht elektrifizierte Bereiche mit einem roten Licht, um sichere Bereiche anzuzeigen.
    3. Definieren Sie die Verbindungsstelle zwischen den Armen als einen nicht sicheren Bereich, in dem die Ratte einen elektrischen Schlag erhalten kann.
  3. Ablauf der Schulung
    1. Betrachten Sie zu Beginn des Experiments den Bereich, in dem sich die Ratte befindet, als sicheren Bereich.
    2. Wenden Sie nach 2-4 Minuten Strom an den sicheren Bereich und ermutigen Sie die Ratte, sich in Richtung der sicheren Zone zu bewegen.
    3. Wenn sich die Ratte aus dem sicheren Bereich in einen gefährlichen Bereich bewegt, kehrt sie unter Elektroschock in den sicheren Bereich zurück und zeigt eine passive Ausweichreaktion.
  4. Entwicklung der aktiven Vermeidungsreaktion
    1. Schalten Sie nach mehreren Trainingseinheiten das Licht im sicheren Bereich ein, ohne Stromschläge anzuwenden.
    2. Beobachten Sie, wie sich die Ratte in Richtung des beleuchteten sicheren Bereichs bewegt und einen Hell-Dunkel-Unterscheidungsreflex (aktive Vermeidungsreaktion) bildet.
  5. Platzieren Sie das Y-Labyrinth in einem schwach beleuchteten und ruhigen Bereich, um Ablenkungen von außen zu minimieren.
  6. Führen Sie täglich zwischen 9:00 und 11:00 Uhr und 14:00 bis 16:00 Uhr Schulungen durch.
  7. Lassen Sie die Ratten sich vor dem Experiment 5 Minuten lang frei im Labyrinth bewegen, um ihnen zu helfen, sich an die Umgebung des Labyrinths anzupassen.
  8. Stimulus-Parameter anpassen
    1. Die Stimulusspannung (16.000 V/m) während des Tests ist so einzustellen, dass Ratten innerhalb von 10 s nach einem elektrischen Schlag entkommen.
    2. Lassen Sie die Signalleuchte für den sicheren Bereich 15 s lang eingeschaltet und schalten Sie sie dann aus.
    3. Starten Sie die nächste Runde von Schockexperimenten nach einem Intervall von 45 s.
  9. Signallichtsequenz und korrektes Ansprechverhalten
    1. Stellen Sie die Reihenfolge des Einschaltens der Signalleuchte als I → II → III → I in einem Zyklus ein.
    2. Definieren Sie eine korrekte Reaktion, d. h. die Ratte flieht innerhalb von 10 s nach Erhalt eines elektrischen Schlags direkt aus dem Startbereich in die beleuchtete sichere Zone.
  10. Angenommen, die Ratte hat den Lernstandard erreicht, wenn sie in 8 von 10 aufeinanderfolgenden Versuchen die richtige Fluchtreaktion zeigt.
  11. Notieren Sie jede Flucht zu einem Arm ohne Licht als falsche Reaktion.
  12. Mehrere Trainings- und Testsitzungen
    1. Führen Sie mehrere Trainings- und Testsitzungen durch, um das Lernen und das Gedächtnis zu bewerten.
    2. Erfassen Sie die Anzahl der richtigen und falschen Antworten während einer festgelegten Anzahl von Versuchen.
    3. Ändern Sie den Startbereich, um die Komplexität der Aufgabe zu erhöhen.
  13. Beurteilen Sie die Gedächtnisleistung in Intervallen (z. B. 24 oder 48 Stunden nach dem Training), um die Gedächtniskapazität der Ratten zu bewerten.

5. Immunhistochemie

  1. Betäuben Sie die Ratten
    1. Verabreichen Sie 1 h nach dem Training eine intraperitoneale Injektion von 10% Chloralhydrat (0,4 ml/100 g), um die Ratten zu betäuben. Entsorgen Sie die Chloralhydratlösung gemäß den örtlichen Vorschriften.
    2. Führen Sie eine Thorakotomie durch, um das Herz vollständig freizulegen31.
  2. Perfundierte anästhesierte Ratten mit physiologischer Lösung
    1. Führen Sie eine PBS-haltige Nadel in den linken Ventrikel in Richtung Aorta ein, sichern Sie die Nadel mit einer hämostatischen Pinzette und schneiden Sie sofort die rechte Ohrmuschel der Maus auf, um venöses Blut freizusetzen.
    2. Injizieren Sie PBS schnell, bis das Abwasser klar ist und Leber und Lunge weiß erscheinen.
    3. Anschließend wird eine schnelle und dann langsame Infusion von 500 ml 10%iger Formalinlösung durchgeführt, bis der Körper des Tieres steif wird und eine Formalinfixierung erreicht wird.
    4. Entsorgen Sie die Formalinlösung gemäß den örtlichen Vorschriften.
  3. Entfernen Sie das Gehirn
    1. Öffne schnell den Schädel32.
    2. Entfernen Sie das gesamte Gehirn, indem Sie es vorsichtig vom Schädel abheben und die Blutgefäße und das Rückenmark an der Basis durchtrennen, ohne die Hemisphären zu beschädigen (wie in der ergänzenden Abbildung S3 gezeigt).
  4. Sezieren Sie die Hippocampi
    1. Sezieren Sie die bilateralen Hippocampi.
      1. Am Foramen occipitalis der Maus wird das gesamte Gehirn mit einer Schere durchtrennt.
      2. Führen Sie eine Schere vorsichtig diagonal in das Foramen magnum ein, um den Scheitelknochen zu durchtrennen.
      3. Hebeln Sie beide Seiten des Scheitelknochens mit einer hämostatischen Pinzette auseinander.
      4. Schneide mit einer Schere den Sehnerv auf einer Seite ab und sondiere bis zur Schädelbasis.
    2. Legen Sie die Hippocampi für 12 h in 10%ige Formalinlösung.
    3. Tauchen Sie die Probe in Formalin, das einen Gradienten von Saccharose (10 %, 20 %, 30 %) enthält.
    4. Über Nacht bei 4 °C aufbewahren, bis das Probengewebe auf den Boden sinkt.
  5. Einbetten und Schneiden der Probe
    1. Betten Sie die Probe in Paraffin ein. Entsorgen Sie die Formalinlösung gemäß den örtlichen Vorschriften.
    2. Die eingebettete Probe wird auf 4 μm geschnitten.
  6. Entparaffinisieren und rehydrieren Sie die Schnitte
    1. Weichen Sie die Schnitte dreimal in 50 mL Xylol zur Entparaffinierung ein, jeweils 15 Minuten lang.
    2. Sequentiell jeweils 10 Minuten lang in 50 ml 100 %, 90 %, 70 % und 50 % Ethanol eintauchen.
    3. Spülen Sie dreimal mit 50 mL 0,01 mM PBS für jeweils 3 Minuten.
  7. Antigen-Rückgewinnung
    1. Legen Sie die Schnitte in 50 mL Citratpuffer (PBS, pH 6,0).
    2. Die Abschnitte in einem Schnellkochtopf aus Edelstahl auf 120 °C erhitzen. Legen Sie die Abschnitte auf ein Gestell und tauchen Sie vollständig in den Puffer ein. Den Kocher verschließen, erhitzen und 3 Minuten lang unter hohem Druck halten.
    3. Nehmen Sie den Herd vom Herd und lassen Sie ihn natürlich bei Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie den Deckel öffnen.
    4. Spülen Sie die Schnitte 2 Minuten lang in PBS (pH 7,2) und wiederholen Sie dies 3 Mal.
    5. Etwa 100-200 μl 3% H2O2 auf den Objektträger auftragen und 5-10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die endogene Peroxidaseaktivität zu eliminieren.
    6. 3 Mal 2 Minuten lang mit PBS spülen.
  8. Inkubation von Primärantikörpern
    1. Geben Sie 200 μl Primärantikörper (verdünnt 1:150 in 0,01 mol/l PBS) in die Schnitte.
    2. Über Nacht bei 4°C inkubieren.
  9. Inkubation von sekundären Antikörpern
    1. Spülen Sie die Abschnitte 3 Mal 3 Minuten lang in PBS aus.
    2. Inkubieren Sie die Abschnitte mit ca. 100-200 μl Polymer Helper, um den Abschnitt auf dem Objektträger abzudecken, und inkubieren Sie bei 37 °C für 20 Minuten.
    3. Spülen Sie die Abschnitte 3 Mal lang in 0,1 mol/L PBS für 2 min.
    4. Geben Sie ca. 100-200 μl Polyperoxidase-Anti-Maus-/Kaninchen-IgG hinzu und inkubieren Sie es 20 Minuten lang bei 37 °C.
    5. Spülen Sie die Abschnitte 3 Mal 3 Minuten lang in PBS aus.
  10. Farbentwicklung
    1. Fügen Sie etwa 100-200 μl der Diaminobenzidin (DAB)-Lösung hinzu (genug, um den Abschnitt auf dem Objektträger abzudecken) für die Farbentwicklung.
    2. Lassen Sie es ca. 3 min einwirken.
  11. Gegenfärbung und Montage
    1. Führen Sie eine Gegenfärbung durch, indem Sie tropfenweise etwa 100-200 μl Hämatoxylin hinzufügen, um den Abschnitt auf jedem Objektträger vollständig zu bedecken.
  12. Dörren Sie die Abschnitte und montieren Sie sie
    1. Dehydrieren Sie die Abschnitte in 50 mL mit 50 %, 70 %, 90 % und 100 % Ethanol für jeweils 10 Minuten, gefolgt von 50 ml Xylol für 10 Minuten.
    2. Räumen und montieren Sie die Abschnitte mit Standardverfahren.
  13. Mikroskopische Untersuchung
    1. Zählen Sie die Anzahl der p-CREB- und c-fos-positiven Neuronen im Hippocampus jeder Gruppe33,34.
    2. Untersuchen Sie die Schnitte unter einem Mikroskop bei 400-facher Vergrößerung.
    3. Notieren Sie die durchschnittliche Anzahl positiver Neuronen in jeder Schnitte, basierend auf Zählungen aus drei Schnitten pro Tier ohne Überlappung.
      HINWEIS: Alle Daten wurden in einer Computertabelle zusammengestellt. Alle Analysen wurden mit Hilfe einer Statistiksoftware durchgeführt. Die Ergebnisse wurden als Mittelwerte ± Standardfehlers des Mittelwerts (SEM) dargestellt und mittels Einweg-ANOVA mit den Post-hoc-Tests SNK-q und Dunnett T3 analysiert35. Der SNK-q-Test wird häufig für explorative Studien verwendet und eignet sich für paarweise Vergleiche zwischen mehreren Stichprobenmittelwerten. Es stützt sich nicht auf vordefinierte Hypothesen, was es ideal für den Vergleich aller Gruppenmittelwerte36 macht. Der Dunnett T3-Test wird typischerweise für Bestätigungsstudien mit vordefinierten Hypothesen verwendet. Es eignet sich zum Vergleich mehrerer Behandlungsgruppen mit einer Kontrollgruppe oder zum Vergleich von Mitteln mit besonderer fachlicher Bedeutung35,37. Wenn der P-Wert des ANOVA-Tests ≤ 0,05 betrug, wurden die paarweisen Post-hoc-Tests durchgeführt, um festzustellen, welche Gruppen sich signifikant von den anderen unterschieden. Beidseitige P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anhand von Daten aus dieser Studie als illustrative Beispiele haben wir die Arten von Ergebnissen vorgestellt, die mit diesem methodischen Rahmen generiert werden können, einschließlich repräsentativer Immunfärbebilder sowie Verhaltens- und molekularer Daten aus verschiedenen Gruppen. Der Schwerpunkt liegt auf der Darstellung typischer oder erwarteter Ergebnisse, die durch diesen Ansatz erzielt werden, und nicht auf einer Interpretation ihrer biologischen Bedeutung.

Lern- und Gedächtni...

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Discussion

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In dieser Studie wurde untersucht, wie Sevofluran das Gedächtnis beeinflusst und die p-CREB- und c-fos-Expression in hippokampalen Neuronen über den NMDAR/p-CREB/c-fos-Signalweg bei juvenilen Ratten moduliert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Sevofluran eine kurzfristige (1 h nach dem Training, nicht nach 3 Tagen) negative stimulierende Wirkung auf die Gedächtniserhaltungsfähigkeit von juvenilen Ratten hatte, ohne Auswirkungen auf die Dosierungshäufigkeit (Einzeldosis oder sieben D...

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Disclosures

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Die Autoren berichten, dass es keine konkurrierenden Interessen zu deklarieren gibt.

Acknowledgements

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Ye Jiang und Guohui Li entwarfen die Studie. Ye Jiang und Lai Jiang sammelten und analysierten die Daten und entwarfen das Manuskript. Ye Jiang und Guohui Li überarbeiteten das Manuskript. Alle Autorinnen und Autoren haben die endgültige Fassung des Manuskripts zur Einreichung geprüft und freigegeben. Diese Arbeit wird durch Zuschüsse an Guohui Li aus dem Shanghai Pujiang Programm (Fördernummer 23PJD057) unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Versuchstiere
Sprague-Dawley (SD) RattenCharles River Laboratories (Peking, China)N/A21 Tage alt, Rüde
Standard-RattenfutterKeao Xieli Feed (Peking, China)N/AStandard-Futter für Versuchstiere
Chemikalien und Reagenzien
ChloralhydratSinopharm Chemisches Reagenz (Shanghai, China)80113818Anästhetikum für die terminale Perfusion
Citrat-Puffer (10x)ZSGB-BIO (Peking, China)ZLI-9064Antigen-Rückgewinnungslösung, pH 6,0
Ethanol (100%)Sinopharm Chemisches Reagenz (Shanghai, China)100092683Dehydratisierungsmittel für die Histologie
Hämatoxylin-FärbelösungBaso Diagnostics Inc. (Zhuhai, China)BA-4041Gegenbeize für IHC
Wasserstoffperoxid (H2O2)Sinopharm Chemisches Reagenz (Shanghai, China)100112183%ige Lösung zur Blockierung der endogenen Peroxidase
Neutraler BalsamSolarbio (Peking, China)Nr. G8590Montagemedium für Dias
Stickstoff (N2)Shanghai Medical Gas Co. (Shanghai, China)N/AHohe Reinheit, für Gasgemische
Sauerstoff (O2)Shanghai Medical Gas Co. (Shanghai, China)N/AMedizinische Qualität, für Gasgemische
ParaffinLeica Biosystems (Nussloch, Deutschland)39601006Einbettungsmedium für Gewebe
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)158127Fixiermittel für die Gewebeperfusion und -fixierung
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Gibco (Waltham, MA, USA)7001104410x Stammlösung, pH 7,4
SevofluranAbbVie Inc. (North Chicago, IL, USA)N/AAnästhetikum zur Inhalation
Limetten-NatronW. R. Grace und Co. (Columbia, MD, USA)22-01-0010CO2 Absorptionsmittel für die Inhalationskammer
Natriumhydroxid (NaOH)Sinopharm Chemisches Reagenz (Shanghai, China)10019818Wird zur pH-Einstellung der PFA-Lösung verwendet
SaccharoseSangon Biotech (Shanghai, China)A502693Wird zur Kryoprotektion von Hirngewebe verwendet
XylolSinopharm Chemisches Reagenz (Shanghai, China)10023418Clearingstelle für die Histologie
Antikörper und Kits
c-Fos AntikörperAbcam (Cambridge, Vereinigtes Königreich)Artikel-Nr.: ab190289Kaninchen Anti-Maus, primärer Antikörper
DAB-Chromogen-KitZSGB-BIO (Peking, China)ZLI-9018Substrat für die HRP-Farbentwicklung
p-CREB (Ser133) AntikörperZellsignaltechnologie (Danvers, MA, USA)9198Kaninchen Anti-Maus, primärer Antikörper
Polymer-HRP-DetektionskitZSGB-BIO (Peking, China)PV-9000Sekundärantikörper und Nachweissystem für IHC
Ausrüstung
AnästhesiegerätRWD Life Science (Shenzhen, China)R500Für die kontrollierte Förderung von Gasgemischen
Automatisierter GewebeprozessorLeica Biosystems (Nussloch, Deutschland)ASP6025Für die automatisierte Entwässerung und Klärung
Kryostat/MikrotomLeica Biosystems (Nussloch, Deutschland)CM1950Zum Schneiden von gefrorenem/eingebettetem Hirngewebe
Mikroskop-SystemOlympus (Tokio, Japan)BX53Zur Bildgebung von IHC-Objektträgern
PerfusionspumpeLonger Precision Pump Co. (Baoding, China)BT100-2JPeristaltische Pumpe für die transkardiale Perfusion
Sevofluran-VerdampferRWD Life Science (Shenzhen, China)R510PSFür eine präzise Kontrolle der Sevofluran-Konzentration
Y-Labyrinth-ApparaturMed Associates Inc. (St. Albans, VT, USA)MED-VFC-S-YMit elektrischem Stromnetz und Beleuchtung zur aktiven Vermeidung
Software
GraphPad PrismaGraphPad Software (San Diego, CA, USA)Variante 9Statistische Analyse und Datenvisualisierung
BildJNationale Institute für Gesundheit (Bethesda, MD, USA)Version 1.53Bildanalysesoftware für die Zellzählung
Microsoft ExcelMicrosoft Corporation (Redmond, WA, USA)Büro 365Tabellenkalkulationssoftware für die Datenzusammenstellung

References

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