Methodenartikel

Expansionsmikroskopie: Hochauflösende fluoreszierende Bildgebung mit einem herkömmlichen Mikroskop

DOI:

10.3791/68595

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19. Dezember 2025

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1University of Bordeaux, CNRS, MFP, iMet UMR 5234, 2Université Claude Bernard Lyon 1, MeLiS-UCBL-CNRS UMR 5284-INSERM U1314, 3University of Bordeaux, CNRS, MFP, ProParaCyto UMR 5234

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll, das Kryofixations- und Expansionsmikroskopiemethoden (Cryo-ExM) kombiniert und eine hochauflösende Bildgebung mit struktureller Erhaltung ermöglicht, die an verschiedene biologische Proben angepasst ist. Biologische Proben werden eingefroren, in ein schwellbares Polymer eingebettet, denaturiert, erweitert und immunmarkiert, was Super-Resolution-Bildgebung mit Standardlichtmikroskopen ermöglicht.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Expansionsmikroskopie (ExM) ist eine innovative Superauflösungs-Fluoreszenzmikroskopietechnik, die biologische Proben physisch vergrößert und so Bildgebung jenseits der Beugungsgrenze mit herkömmlichen Systemen wie konfokalen Mikroskopen ermöglicht. Durch das Einbetten von Proben in eine schwellbare Hydrogelmatrix ermöglicht ExM eine isotrope Expansion der Probe und verbessert die räumliche Auflösung, ohne dass spezielle Nanoskopie-Geräte erforderlich sind. Fortschrittliche Varianten wie die Ultrastruktur-Expansionsmikroskopie (U-ExM) bewahren feine zelluläre Details, einschließlich Organellen und makromolekularen Assemblierungen.

Die Beobachtung spezifischer zellulärer Strukturen oder Organellen hängt maßgeblich von der Fixierungsmethode ab, insbesondere durch den Einsatz von aldehydbasierten chemischen Quervernetzern und Proteinausfällung mit kaltem Methanol. Kürzlich hat die Integration der Kryofixierung – einer Goldstandard-Fixierungstechnik – mit der U-ExM-Methode nanoskalige Beobachtungen einer Vielzahl biologischer Proben ermöglicht, von kultivierten Säugetierzellen bis zu ganzen Organismen in ihrem nahen natürlichen Zustand. Die Expansionsmikroskopie ist ein leistungsstarkes Werkzeug zur Untersuchung biologischer Strukturen auf verschiedenen Skalen, von isolierten Organellen bis zu ganzen Geweben. In Kombination mit der Kryofixierung liefert es beispiellose Einblicke in die zelluläre Architektur und dynamische Prozesse, während Artefakte traditioneller Fixationsmethoden minimiert werden. Diese Entwicklungen positionieren ExM als vielseitiges Framework für hochauflösende, nahezu native biologische Bildgebung.

Die vorliegende Studie beschreibt ein detailliertes Protokoll für die Kryofixierung in Verbindung mit einer Expansionsmikroskopie von Proben aus verschiedenen Ursprüngen. Dieses Protokoll hebt kritische Schritte hervor, darunter Probenfixierung, Polymerbildung, Expansion, Immunfärbung und Bildgebung, und bietet die notwendige Anleitung für die Anwendung dieser Methode in jedem Labor.

Einleitung

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Die Mikroskopie spielt eine entscheidende Rolle in der biologischen Forschung und ermöglicht es uns, die Ultrastruktur und Organisation über lebende Systeme hinweg in beispiellosen Maßstäben zu visualisieren, von ganzen Organismen bis hin zu einzelnen Molekülen. Das Mikroskopiefeld umfasst zwei unterschiedliche Systeme: die Elektronenmikroskopie (EM), hochresolutiv, aber mit begrenzter Kapazität für spezifische Markierung, und Lichtmikroskopie, die eine präzise und spezifische Visualisierung der subzellulären Struktur ermöglicht, jedoch mit begrenzter Auflösung aufgrund der Beugungsgrenze des Lichts. Obwohl sich die Superauflösungs-Fluoreszenzmikroskopie (SRM) als leistungsstarke Methode zur subdiffraktionsauflösenden Fluoreszenzbildgebung von Zellen entwickelt hat, bleibt die Visualisierung der ultrastrukturellen Details makromolekularer Assemblierungen, wie ganzer Organismen, eine Herausforderung1. Darüber hinaus basieren SRM-Techniken, die Auflösungen von 10 bis 120 nm erreichen, auf fortschrittlichen Mikroskopen und Bildrekonstruktionsalgorithmen und erfordern Fachwissen sowie spezialisierte Mikroskope, was ihre Zugänglichkeit für viele biologische Labore einschränkt. Eine aufkommende Superauflösungsmethode, die Expansionsmikroskopie (ExM), hat diese Einschränkungen überwunden. ExM wurde vor einem Jahrzehnt im Labor von Edward S. Boyden entwickelt und ist eine innovative photonische Mikroskopietechnik, die heute als Superauflösungsmikroskopie gilt und Bildgebung ohne spezielleMikroskope ermöglicht. Anstatt auf hochentwickelte Bildgebungstechnologien zu setzen, beinhaltet ExM die Einbettung biologischer Proben in ein schwellbares Polymer, das sich isotrop ausdehnt. Diese physikalische Erweiterung erhöht die Stichprobengröße um den Faktor vier oder mehr, verbessert die Auflösung und ermöglicht die Beobachtung mit herkömmlichen Lichtmikroskopen. Ursprünglich in Gehirnschnitten entwickelt, haben sich ExM-Protokolle weiterentwickelt, um die Auflösung zu verbessern und Verfahren zu vereinfachen. Diese Technik wurde erfolgreich für verschiedene biologische Proben adaptiert, darunter eukaryotische Zellen, einzellige Organismen, Parasiten, Gewebe und ganze Organismen, und demonstriert ihre Vielseitigkeit 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15.

Derzeit existieren zwei Hauptklassen von Protokollen: Pre-Expansion 2,16 und Post-Expansion17,18, die sich auf den Zeitpunkt der biologischen Probe-Färbung beziehen, entweder vor oder nach dem Expansionsverfahren. Dieser Artikel konzentriert sich speziell auf das Post-Expansion-Protokoll, bei dem die Immunkennzeichnung nach der Denaturierung und Expansion der Probe durchgeführt wird.

In diesem Protokoll werden biologische Proben kryo- oder chemisch fixiert und mit chemischen Agenten inkubiert, was eine Proteinverankerung an das zukünftige Polymer ermöglicht. Die Proben werden anschließend in ein schwellbares Polymer eingebettet, das aus Acrylamid/Bis-Acrylamid (häufig in Elektrophorese-Gelen verwendet) und Natriumacrylat (ermöglicht die Expansion) besteht. Das Zufügen von Wasser löst die Gelexpansion aus, wodurch der Abstand zwischen den Proteinen proportional zur Gelausdehnung steigt. Die interessanten Proteine werden dann direkt im Gel mit spezifischen Antikörpern markiert (Abbildung 1).

Alle genannten Bildgebungstechniken, einschließlich Elektronenmikroskopie, photonische Mikroskopie, Superauflösungsmikroskopie und ExM, erfordern eine biologische Probenfixierung. Die aldehydbasierte Fixierung erzeugt Querverbindungen zwischen Proteinen und erhält die zelluläre Organisation während der für photonischen oder elektronenmikroskopischen Behandlungen erforderlichen Behandlungen. Allerdings kann die Fixierung auch zu Artefakten und morphologischen Veränderungen in der Zelle führen, die in der klassischen Lichtmikroskopie subtil sein mögen, aber mit dem Fortschritt und der Entwicklung der SRM immer deutlicher geworden sind, was Wissenschaftler dazu bringt, die Folgen der Fixierungsmethodenzu überdenken. Eine Möglichkeit, fixationsbezogene Artefakte zu umgehen, ist die Verwendung von Live-Mikroskopie, die die dynamische Visualisierung zellulärer Strukturen in ihrem nahezu natürlichen Zustand ermöglicht. Allerdings hat die Lebendmikroskopie mehrere Nachteile, insbesondere die Notwendigkeit der Transgenexpression, die potenziell die Zellphysiologie beeinflussen und das Verhalten der Proteine im Vergleich zu endogenen Gegenstücken verändern kann. Außerdem bietet die Live-Mikroskopie in der Regel eine geringere Auflösung als die feste Mikroskopie und verfügt über begrenzte Kennzeichnungsmöglichkeiten, da fluoreszierende Etiketten ungiftig und unter lebenden Bedingungen stabil sein müssen, was die verfügbaren Marker einschränkt. Das Fachgebiet der Elektronenmikroskopie hat aufgrund seiner hohen Auflösung maßgeblich zur Entwicklung optimaler Methoden zur Fixierung subzellulärer oder makromolekularer Strukturen beigetragen und dabei ihren natürlichen Zustand erhalten. Vor Jahrzehnten wurde die Kryofixierung von den Dubochet-, Frank- und Henderson-Laboratories entwickelt, bei der die schnelle Fixierung der Zelle in glasartigem Wasser durchgeführt wurde und gezeigt wurde, dass dies der einzige Ansatz zur Erhaltung der nativen Ultrastruktur20,21 war. Während gereinigte Moleküle direkt im Glaskörpereis mittels Kryo-Elektronenmikroskopie beobachtet werden können, müssen die Zellen vor der Beobachtung in Harz eingebettet und geschnitten werden. Um die Proben im möglichst nativen Zustand weiter zu stabilisieren, werden die Proben einer Gefriersubstitution unterzogen. In diesem Prozess werden Eismoleküle, wenn sie in einen flüssigen Zustand zurückkehren, sofort durch Aceton ersetzt, das einen höheren Diffusionskoeffizienten als Wasser hat. Während der Wasserentfernung können sich interessierende Moleküle aggregieren und kollabieren, ähnlich wie bei chemischer Querbindungsfixierung. Um diese Aggregation zu begrenzen, wird bei niedrigen Temperaturen die Frostsubstitution durchgeführt, wodurch die Aggregation durch Erhöhung der intrazellulären Viskosität22 reduziert wird. Dieser kontrollierte Ansatz begrenzt die Bildung großer Aggregate und bewahrt die zelluläre Ultrastruktur näher an ihrem natürlichen Zustand.

Im Jahr 2022 führten zunehmende Belege dafür, dass chemische Fixierung Artefakte einführt, kombiniert mit Fortschritten in der Expansionsmikroskopie, dass das Labor Guichard/Hamel eine Methode entwickelte, die Kryofixierung mit Expansionsmikroskopie integriert, bekannt als 'Cryo-ExM'23'. Dieser Ansatz nutzt die Stärken beider Techniken, indem biologische Strukturen mit minimaler Verzerrung erhalten bleiben. Die Proben werden kryogefroren, entweder durch Hochdruckeinfrieren oder manuelles Eintauchen, wobei beide spezielle Geräte erfordern, die üblicherweise in Elektronenmikroskopielaboren oder Kernanlagen zu finden sind.

Dieses Papier beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Durchführung einer Kryofixierung gefolgt von einer Expansionsmikroskopie und präsentiert repräsentative Ergebnisse aus zwei experimentellen Modellen: menschliche kultivierte Zellen und den einzelligen Parasiten Trypanosoma brucei, den Auslöser der Schlafkrankheit. Wir werden die Verbesserungen der Kryofixierung gegenüber herkömmlichen Fixierungsmethoden hervorheben und die häufigsten Fallstricke und Fixationsartefakte im Zusammenhang mit der Technik hervorheben.

Protokoll

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HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt. Dieses Protokoll wird mit geringfügigen Änderungen für die Beobachtung verschiedener zellulärer Prozesse in verschiedenen biologischen Proben angepasst (darunter Hefe24,25, Toxoplasma gondii26, nahe verwandte Tierarten27, Grünalgen28,29, mikrobielle Eukaryoten30 sowie Maus23 und menschliche Proben23,31,32,33). Modifikationen zur Anpassung des Protokolls an diese verschiedenen Proben werden in diesem Artikel nicht erwähnt, da sie aus den Originalveröffentlichungen abgerufen werden können. Hier werden RPE1-Zellen und Trypanosoma brucei als Stellvertreter für Säugetierzellen und Parasiten verwendet. Dieses Protokoll betont die Fixierungs- und Expansionsschritte der biologischen Proben; Daher werden Informationen zur Probenkultur in diesem Artikel nicht präsentiert.

1. Vorbereitung von Lagerlösung

  1. Polylysin-Lösung
    1. Poly-L- oder Poly-D-Lysinhydrobromid (Materialtabelle) in Wasser neu suspendieren, um eine Standardlösung von Polylysin mit 1 mg/mL zu erhalten. Lagern Sie diese Lagerlösung bei -20 °C und verdünnen Sie sie weiter in Wasser mit 0,2 mg/mL zur Beschichtung der Überdeckungen (Tabelle 1, Materialtabelle).
  2. Verankerungslösung
    1. Frische Acrylamid/Formaldehyd-Lösung (unter der chemischen Haube) durch das Mischen von 38 μL Formaldehyd (36,5%–38%) herzustellen; Materialtabelle) und 50 μL Acrylamid (40 %, Materialtabelle) in 912 μL PBS, um 1 ml Lösung zu erhalten.
  3. Gelationslösung ohne APS (Initiator)
    1. Bereiten Sie eine Mischlösung vor, indem Sie 500 μL 38 % Natriumacrylat (19 % final), 250 μL 40 % Acrylamid (10 % final), 50 μL 2 % Bisacrylamid (0,1 % final), 50 μL TEMED (0,5 % final) und 100 μL 10x PBS (1x final) hinzufügen. Aliquot in einem Volumen geeignet, maximal 2 Gele (80–90 μL) und mindestens 12 Stunden vor der Verwendung bei -20 °C zu lagern (siehe Tabelle 1 zur Langzeitkonservierung).
      HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass das für die Herstellung der Gelationslösung angegebene Volumen berechnet wird, um ein Endvolumen von 1 ml zu erhalten, das tatsächliche Volumen der Lösung jedoch 950 μL beträgt, da APS, das jeweils 1/20 des Gesamtvolumens entspricht, spontan hinzugefügt wird. Die ursprüngliche Speicherzeit der Gelationslösung17 wurde verlängert, nachdem wir beobachtet hatten, dass sie bis zu einem Monat bei -20 °C erhalten werden konnte, ohne die Gelfestigkeit oder Expansionseffizienz zu beeinträchtigen.
  4. TEMED und APS
    1. APS 10 % mit Alkohol: APS-Pulver in Wasser verdünnen, aliquot und bei -20 °C lagern.
    2. TEMED 10% v/v: TEMED in Wasser verdünnen, aliquot und bei -20 °C lagern.
  5. Natriumacrylat (SA) 38 %
    1. Bereite 38 % SA aus gereinigtem SA (AK Scientific oder Sigma; Materialtabelle)
      1. Suspendieren Sie 38 g Natriumacrylat in 100 ml Wasser unter ständigem Rühren (wichtig). Verwenden Sie SA schrittweise, um Zuschlagstoffe zu vermeiden, und rühren Sie über Nacht bei 4 °C um, um eine vollständige Wiederaufsetzung sicherzustellen. Stellen Sie sicher, dass die Lösung durchscheinend und farblos oder leicht gelb ist. Aliquot und bis zu einem Jahr bei 4 °C einlagern.
    2. Bereite 38 % SA aus Acrylsäure (Sigma; Materialtabelle)
      1. Bereiten Sie 90 ml 38 % Natriumacrylat vor, indem Sie Acrylsäure mit NaOH unter einer chemischen Haube neutralisieren.
      2. Mische 29 ml Wasser mit 25 ml Acrylsäure beim Rühren.
        HINWEIS: Ab diesem Schritt muss die Reaktion auf Eis mit konstanter Kontrolle von pH und Temperatur durchgeführt werden, da die Reaktion exotherm ist.
      3. Gib 10 N NaOH Tropfen für Tropfen mit einer Pasteur-Pipette hinzu.
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Temperatur 25 °C nicht überschreitet (falls doch, hören Sie auf, NaOH hinzuzufügen und warten Sie, bis die Temperatur abkühlt).
      4. Neutralisieren Sie weiter, bis der pH-Wert 7-8 erreicht hat, und bewegen Sie 1 Stunde auf Eis.
        HINWEIS: Wenn der pH-Wert plötzlich auf über 10 steigt, fügen Sie Acrylsäure hinzu, bis der pH-Wert auf 7-8 fällt.
      5. Lagere die Lösung über Nacht in einem geschlossenen Behälter. Wenn die Lösung ausgefällt ist, zentrifugieren Sie bei 1.000 × g für 10 Minuten. Sammle das Supernatant, aliquot, und lagere es bei -20 °C.
  6. Denaturierungslösung
    1. TrisBase 1 M: 121,14 g TrisBase in 1 L Wasser verdünnen, den pH-Wert mit HCl auf 9 anpassen und bei RT lagern.
    2. Denaturierungspuffer: Mischen Sie 200 mM Natriumdodecylsulfat (SDS), 200 mM NaCl, 50 mM TrisBase in Wasser. Für eine 200 mL Lösung geben Sie beim Rühren 10 ml Tris-BASE 1 M (pH 9) in 124,9 mL ddH2O, 57,1 mL SDS (20 %/700 mM Lager) und 8 ml NaCl (5 Mio. Lager) beim Rühren. Lagern Sie bei RT (Tisch 1).

2. Kryofixierungs- und Expansionsverfahren

  1. Probenvorbereitung und Kryofixierung
    HINWEIS: Dieses Protokoll ist für Proben optimiert, die auf 12-mm-Coverslips gezüchtet oder geladen wurden. Bitte überarbeite die Lautstärke der Lösung für andere Unterstützungen.
    1. Probenvorbereitung
      1. Wachsen Sie die Probe in einem Zustand auf, der an die biologische Probe angepasst ist, entweder direkt auf 12-mm-Deckfolien (säugetieradhärente Zellen) oder in Suspension (T. brucei).
      2. Füllen Sie die Probe auf den Deckmantel (T. brucei), vorbeschichtet mit Polylysin, wie folgt: Kurz 12 mm Deckschichten in Polylysin (0,2 mg/mL) für 1 Stunde bei 37 °C inkubieren, schnell waschen und an der Luft trocknen.
      3. Zentrifugiere die Parasiten bei 300 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Resuspendieren Sie in PBS, ergänzt mit 10 % Kulturmedium, und legen Sie 5-10 Minuten vor der Kryofixierung auf Deckdecken.
    2. Tauchaufbau (Abbildung 2A-C)
      VORSICHT: Arbeiten Sie unter einer chemischen Haube mit Handschuhen und einem Laborkittel, wenn Sie Aceton manipulieren. Benutze beim Umgang mit flüssigem Stickstoff und flüssigem Ethan einen Kittel und eine Schutzbrille.
      1. Unter einer chemischen Haube füllen Sie 5 ml Röhrchen (1 Deckmantel/Tube) mit 1 ml extra trockenem Aceton mit einer Spritze und einer Nadel, um Luftverunreinigungen zu vermeiden.
        HINWEIS: Für eine bessere biologische Membranerhaltung ist die Zugabe von Paraformaldehyd (PFA)/Glutaraldehyd (GA) (0,1/0,02 %) erforderlich. Passen Sie das Rohr an den Durchmesser des Deckels an (Abdeckungsschläuche > 12 mm passen nicht in 5-mL-Röhren).
      2. Kühlen Sie die Röhren in flüssigem Stickstoff mit einem Kunststoff- oder Metallgitter, das kältebeständig ist, um sie aufrecht zu halten.
      3. Fülle die Hälfte einer Polystyrolbox (30 cm x 30 cm / dicke Wände) mit Trockeneis.
      4. Fülle den Vitrobot-ähnlichen Dewar mit flüssigem Stickstoff, bis er nicht mehr verdampft, und warte 10–15 Minuten auf die Stabilisierung der Temperatur. Der Einsatz der Spinne ist notwendig, um die Abkühlung des Systems zu erleichtern (Abbildung 2B, Sternchen). Nachfüllen, falls nötig.
      5. Entfernen Sie die Spinne und füllen Sie die metallische Tauchkammer mit flüssigem Ethan.
      6. Warte 10 Minuten, bis das Ethan ausgeglichen ist.
        HINWEIS: Füllen Sie das Tauchsystem während des Experiments bei Bedarf mit flüssigem Ethan auf (verwenden Sie die Spinne zu diesem Zeitpunkt nicht mehr). Der Übergang von gasförmigem zu flüssigem Ethan ist schwierig. Der geeignete Druck ist entscheidend für die Bildung von flüssigem Ethan. Hoher Druck verhindert die Flüssigkeitsbildung durch ständigen Gasüberlauf in der Metallkammer, während niedriger Druck festes Ethan in der Metallkammer und im Füllrohr bildet. Die Vermeidung von Eisbildung ist für das Experiment unerlässlich. Das Halten der Füllspitze an der Flüssigkeit/Luft-Grenzfläche hilft, feste Ethanbildung zu verhindern.
    3. Eintauchen (Abbildung 2A-C)
      VORSICHT: Verwenden Sie beim Umgang mit flüssigem Stickstoff und flüssigem Ethan einen Kittel und eine Schutzbrille.
      1. Nimm einen 12-mm-Deckdeckel mit dünner Pinzette.
      2. Sauge überschüssiges Medium mit Seidenpapier auf.
      3. Halte den Deckdeckel mit der Pinzette halb mit einem Klemmring, der an den Kryo-Pümpel angepasst ist.
      4. Legen Sie die Pinzette, die den Deckmantel hält, in den Halter des Kryopampels. Tupfen Sie den restlichen Überschuss von Medium mit Whatman-Papier ab.
      5. Aktivieren Sie den Kryo-Kolben, um den Coverslip in die Ethanlösung in der Metallkammer zu tauchen.
      6. Übertragen Sie den Deckmantel schnell in das Rohr mit gefrorenem Aceton (1 Deckmantel/Tube).
        HINWEIS: Verwenden Sie nicht dieselbe Pinzette zum Entnehmen der Proben und zum Eintauchen, um eine Verunreinigung mit dem Kulturmedium zu vermeiden. Seien Sie besonders vorsichtig, wenn Sie Coverslips > 12 mm verwenden (Coverslips mit 15- oder 18 mm Durchmesser passen zum Träger, sind aber schwerer einzutauchen). Während dieses Schrittes ist es möglich, den Deckmantel nach dem Eintauchen in flüssigen Stickstoff zu tauchen, um den Transfer in den Eppendorf zu erleichtern, während die Probe eingefroren bleibt. Da das Aceton bei -96 °C gefriert, ist es notwendig, die Deckfolien auf gefrorenes Aceton zu setzen, um den Einfrier-Substitution zu ermöglichen.
    4. Gefriersubstitution und Rehydration
      VORSICHT: Arbeiten Sie unter der Haube beim Bearbeiten von Proben während der Einfriersubstitution. Steigende Temperatur erzeugt Druck im Inneren des Rohrs, was eine Rohrexplosion auslösen kann.
      1. Inkubieren Sie die Röhren in Trockeneis mit einem Neigungswinkel (ca. 45°).
      2. Über Nacht auf einem Orbitalshaker agieren. Stellen Sie die geschlossene Box auf einen Shaker bei 4 °C oder RT, damit die Temperatur von -180 °C auf -80 °C steigt.
      3. Entferne den Großteil des Trockeneis aus der Box (bewahre nur ein paar am Boden der Box auf), entlasse den Druck in die Röhren, indem du sie schnell öffnest und schließt, und rühre weiter 45 Minuten am Orbitalshaker, um die Temperatur von -80 °C auf -20 °C weiter zu steigern.
      4. Überführen Sie die Überdeckfolien auf eine 12-Well-Platte (oder einen beliebigen geeigneten Behälter) mit vorgekühltem reinem Ethanol (100 %) Lösung. Inkubieren Sie 5 Minuten und beginnen Sie mit der schrittweisen Rehydrierung wie folgt: EtOH 100% (5 Min) - EtOH 95% (3 Min) - EtOH 95% (3 Min) - EtOH 70% (3 Min) - EtOH 50% (3 Min) - EtOH 25% (3 Min) - H2O 100%.
      5. Übertrage die Deckzettel in PBS und orientiere sie unter dem Mikroskop (kratze die Oberfläche mit einer Spitze), damit sie alle nach oben zeigen.
        HINWEIS: EtOH 100 % und 95 % werden bei -20 °C gelagert, EtOH 70 % und EtOH 50 % bei 4 °C sowie EtOH 25 % und ddH2O bei RT, um die Temperatur bis RT weiter anzuheben. Für die Membrankennzeichnung ist die Zugabe von PFA/GA (0,1 %/0,02 %) in Aceton- und Rehydrationslösungen erforderlich, mit Ausnahme von ddH2O.
  2. Expansion
    1. Proteinverankerung
      1. Bereite frische 1,4 % Formaldehyd-/2 % Acrylamid-Lösung (FA/AA) in PBS einmal.
      2. Platzieren Sie Abdeckfolien in eine 4/12-Well-Platte, die mit 0,5/1 mL AA/FA gefüllt ist.
      3. Inkubiere 3-5 Stunden bei 37 °C ohne Rührung.
        HINWEIS: Das Formaldehyd verbindet freie Amingruppen von Proteinen mit Acrylamid. Das überschüssige Acrylamid hilft, die normalerweise durch Formaldehyd induzierte Proteinvernetzung zu begrenzen und verankert die Proteine am zukünftigen Expansionspolymer. Je nach biologischer Probe kann eine Verlängerung des Protein-Ankerschritts über Nacht erforderlich sein. In jedem Fall hat eine längere Inkubation keinen Einfluss auf die folgenden Schritte. Füllen Sie freie Brunnen mit Wasser oder platzieren Sie sie in eine feuchte Kammer, um Verdunstung zu vermeiden.
    2. Gelierung
      1. Tau, APS (10 %) und Gelierungslösung (Natriumacrylat 19 %, Acrylamid 10 %, Bis-Acrylamid 0,1 %, TEMED 0,5 % verdünnt in 10x PBS) auf Eis 10 Minuten vor der Gelierung.
      2. Bereite eine feuchte Kammer mit einer dünnen Schicht feuchten Gewebes und Parafilm vor und lagere sie dann 10 Minuten bei 4 °C.
      3. Stelle die feuchte Kammer auf Eis.
      4. Nehmen Sie die Deckschichten aus der Protein-Ankerlösung heraus und entfernen Sie die überschüssige Lösung mit einem Seidenpapier (zwei hintereinander).
      5. APS (Endkonzentration 0,5 %) in die Gelationslösung geben, 2-3 Sekunden vorziehen und 2 Tropfen 35 μL auf den Parafilm der feuchten Kammer geben.
      6. Jeden Tropfen mit dem Deckmantel bedecken, die Zellen zeigen die Gelationslösung.
      7. Inkubiere 5 Minuten auf Eis, damit das Gel eindringt.
      8. Inkubiere bei 37 °C für 30–60 Minuten.
    3. Denaturierung
      1. Stanzen Sie das Gel mit einem Biopsie-Stanzwerkzeug (0,4 cm Durchmesser, Abbildung 2D) und bewegen Sie 10/15 Minuten in eine 6-Well-Platte, die mit 1 ml Denaturationspuffer gefüllt ist, bis sich die Gele von den Deckfolien lösen.
      2. Das Gel wird in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr übertragen, das mit frischem Denaturationspuffer gefüllt ist.
      3. Inkubieren Sie 1 Stunde 30 Stunden bei 95 °C.
      4. Das Gel für 10 Minuten auf ddH2O übertragen und dreimal wiederholen, um den Denaturationspuffer richtig zu reinigen.
      5. Messen Sie das Gel mit Millimeterpapier oder einem Bremssattel, um den Gel-Expansionsfaktor zu berechnen.
      6. Übertragen Sie das Gel auf PBS zur Immunfärbung.
      7. Alternativ können die Gele in PBS-azid 0,02 % bei 4 °C für kurze Zeit (Tabelle 1) oder bei längerer Lagerung bei -20 °C (Tabelle 1) gelagert werden. Für eine längere Lagerung müssen die Gele in mehreren Wasserbädern inkubiert werden: Glycerol-50%-Lösung für 2-3 Stunden unter Rührung und bei -20 °C in einem ausreichenden Lösungsvolumen, das an die Gelgröße angepasst werden muss.
        HINWEIS: Das Gel kann ganz gehalten werden, wenn es gewünscht ist (Abbildung 2D, E) (Schritt 2.2.3.1). Bis zu 5 Punches (entspricht einem ganzen Gel) können in einem Rohr gesammelt werden (Schritt 2.2.3.2). Denaturationstemperatur und -zeit müssen eingehalten werden (Schritt 2.2.3.3). Hohe Hitze kann das Öffnen des Rohrs auslösen, was zur Verdampfung des Denaturationspuffers und/oder zum Ausstoßen des Gels führt. Achten Sie darauf, Safe-Lock-Schläuche zu verwenden oder sie abzudecken. Das Waschen des Gels nach der Denaturierung muss in destilliertem Wasser erfolgen, da PBS SDS-Niederschlag auslöst und die Effizienz der Wascharbeiten beeinträchtigt. Dieser Schritt löst eine leichte Ausdehnung des Gels aus, die keine Auswirkungen auf die folgenden Schritte des Protokolls hat (Schritt 2.2.3.4). Das Glycerol kann in PBS verdünnt werden, um Platz bei großen Gelen zu sparen. Für 0,4 mm Punch werden Gele idealerweise in einer 12-Well-Platte mit 3 ml Wasser: Glycerol, gefüllt, aufbewahrt.

3. Immunfärbung und endgültige Expansion

  1. Wechsel das PBS-Bad für weitere 15 Minuten Inkubation.
  2. Schneiden Sie das gesamte Gel in 4 gleich große Stücke.
  3. Übertragen Sie die Gelstücke/Punches in einen angepassten Träger (Abbildung 2D, E) und inkubieren Sie mit primären Antikörpern, die in PBS-BSA 2 % verdünnt wurden, für 3 Stunden bis über Nacht mit Rührung (siehe Tabelle 2 und Tabelle 3 für detaillierte Zustände).
  4. Waschgel 3x mit PBS+Tween 0,1 % für 10 Minuten RT mit Bewegung.
  5. Inkubieren Sie das Gel in sekundäre Antikörper und Hoechst in PBS-BSA 2 % für 3 Stunden bis über Nacht mit Bewegung (siehe Tabelle 2 und Tabelle 3 für detaillierte Bedingungen).
  6. Waschgel 3x mit PBS+Tween 0,1 % für 10 Minuten RT mit Bewegung.
  7. Optional: Durchführung der Pan-Markierung des gesamten Proteoms durch Inkubation des Gels mit NHS-Ester (siehe Tabelle 2 für Details ) in PBS für 1 Stunde 30 bei RT unter Rührung, dann 3-mal in PBS+Tween 0,1 % für 10 Minuten waschen.
  8. Übertragen Sie das Gel auf einen angepassten Träger und beginnen Sie mit der Gelexpansion durch Inkubation in destilliertem Wasser (ddH2O).
    HINWEIS: Die Konzentration und Art des Waschmittels (Tween, Triton-X100, Saponin), das für Antikörperwaschungen verwendet wird, können an biologische Proben angepasst werden. Das mehrfache Austausch des Wassers ist entscheidend, um Salzspuren zu beseitigen, die eine vollständige Ausdehnung verhindern.

4. Montage und Bildgebung

  1. Bedecken Sie die Überdeckfolien mit Polylysin (siehe Abschnitt 1.1), indem Sie sie mit etwa 200 μL Polylysin abdecken, 1 Stunde bei RT inkubieren und 3x in ddH2O waschen, um das überschüssige Polylysin zu entfernen. Lassen Sie die Deckdeckel trocknen und lagern Sie sie bis zur Anwendung bei 4°C.
  2. Platzieren Sie expandierte Gele auf unbeschichtete Abdeckfolien in der Bildkammer, um die Ausrichtung der Proben mit einem Fluoreszenzmikroskop zu überprüfen.
  3. Nach der Orientierung trocken Gel auf einem fusselfreien Papier, um das überschüssige Wasser zu entfernen, und auf polylysinbeschichtete Überdeckfolien zu montieren (siehe Schritt 1.1 zum Protokoll).
  4. Beobachten Sie Proben mit einem umgekehrten Mikroskop.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit hebt die Ergebnisse hervor, die Kryofixierung mit Expansionsmikroskopie an zwei verschiedenen Probentypen kombiniert haben: kultivierten Säugetierzellen und T.-brucei-Parasiten . Beide Proben wurden vor der Expansion und Immunfärbung entweder kryofixiert oder chemisch fixiert in 4 % PFA. Beachten Sie, dass andere chemische Fixierungen möglicherweise besser für bestimmte Organellen (wie Methanol oder Glutaraldehyd) geeignet sind und dass nur PFA, eine gängige chemische Fixierung, zur Vereinfachung mit der Kryofixierung vergleichbar ist.

Humane RPE1 (retinale Pigmentepithelzellen) wurden mit αβ-Tubulin, ATP5a und Hoechst gefärbt, um Mikrotubuli, Mitochondrien und Kerne zu visualisieren. Zusätzlich wurden Gele vor der Expansion mit fluoreszierendem NHS-Ester inkubiert, einem Farbstoff, der mit den freien Amingruppen reagiert und somit das gesamte zelluläre Proteom färbt. Wir konnten mehrere Vorteile der Kryofixierung im Vergleich zur chemischen Fixierung beobachten, wie bereitsgezeigt wurde 23. Das auffälligste Merkmal war, dass die Kryofixierung das mitochondriale Netzwerk perfekt konservierte, sowohl sichtbar mit NHS-Ester als auch spezifische Antikörper gegen die ATP-Synthase-Untereinheit Alpha (ATP5a) (Abbildung 3A,B). Da ATP5a zudem in der inneren mitochondrialen Membran lokalisiert ist, könnten wir mitochondriale Kristalle mittels Kryofixierung auflösen (Abbildung 3B). Im Gegenteil, die PFA-Fixierung erlaubte nicht, das mitochondriale Netzwerk zu erhalten, weshalb mitochondriale Kristalle in diesem Zustand nicht sichtbar waren (Abbildung 3C). Wir färbten außerdem Mikrotubuli unter beiden Bedingungen und zeigten, dass die Kryofixierung bessere dynamische Mikrotubuli wie zytoplasmatische oder astrale Mikrotubuli erhält (Abbildung 3B-E). Stabile Mikrotubuli wie in Centriolen und Zilien, nicht-membranösen Organellen, die aus 9-fachen Mikrotubuli bestehen, waren in PFA-fixierten Zellen ebenso erhalten geblieben, wenn nicht sogar besser als kryofixierte Zellen (Abbildung 3B', C'). Es ist wichtig zu beachten, dass Kryofixierung, da sie die Integralität zellulärer Proteine erhält, möglicherweise weniger auf sehr dichte Strukturen wie Zentriolen/Zilien anwendbar ist. Diese Beobachtung wurde auch an starren Strukturen wie Kernporen gemacht, bei denen chemische Fixierung ein Auswaschen zytoplasmatischer Proteine auslöst, was eine bessere Beobachtung der Kernporenstrukturenermöglicht 23,32. Schließlich konnten wir zeigen, dass die Kryofixierung auch den Quervernetzungseffekt der chemischen Fixierung umgeht, was die Expansionskapazität negativ beeinflusst, wie bei mitotischen Spindeln gezeigt, die im kryofixierten Zustand fast doppelt so stark expandiert waren wie PFA (Abbildung 3D,E).

Trypanosoma brucei-Zellen wurden auf TDH34 gefärbt (Abbildung 4A-D), um das einzigartige Mitochondrium sichtbar zu machen, und für BiP35 (Abbildung 4E, F), um das endoplasmatische Retikulum hervorzuheben. Zusätzlich wurden Gele mit fluoreszierendem NHS-Ester gefärbt. Wie in menschlichen Zellen beobachtet, erhält Kryofixierung in Kombination mit Expansion die gesamte zelluläre Architektur besser (Abbildung 4B,E), insbesondere diese beiden membranösen Strukturen, im Vergleich zur PFA-Fixierung (Abbildung 4C,D,F). Das Mikrotubuli-Zytoskelett von T. brucei ist starrer und stabiler als das menschlicher Zellen; folglich wurde kein signifikanter Unterschied zwischen PFA und Kryofixierung beobachtet. Darüber hinaus verhindert die Auflösungsgrenze der U-ExM-Technik, dass wir einzelne Mikrotubuli unterscheiden können (nicht gezeigt).

Insgesamt adressiert die Kryofixierung die Einschränkungen der klassischen chemischen Fixierung, wie etwa die Erhaltung membranöser Organellen (Mitochondrien, endoplasmatisches Retikulum) und dynamischer Zytoskelettelemente (zytoplasmatische oder astrale Mikrotubuli). Außerdem bewahrt die Kryofixierung keine Querverbindung zwischen Proteinen und erhält die Expansionskapazität vollständig, insbesondere bei starren und dichten Strukturen.

Die Kontrolle der Qualität der Kryofixierung und -expansion ist entscheidend, um die zelluläre Ultrastruktur biologischer Proben zu erhalten. Mehrere Fehler können zu einer schlechten Fixierung führen und Artefakte in den biologischen Proben erzeugen. Hier heben wir die häufigsten Nachteile der Kryofixierung und Folgen einer schlechten Fixierung hervor. Das offensichtlichste Artefakt, das durch die Kryofixierung entsteht, ist das Auftreten von Rissen im Inneren der biologischen Probe (Abbildung 5A), die ebenfalls in der Kryoelektronenmikroskopie häufig sind. Obwohl diese Risse die intrinsische Ultrastruktur der Organellen nicht verändern, wie in Abbildung 5A (Einlage) für Mitochondrien und Mikrotubuli gezeigt, könnten sie zu einer Fehlinterpretation der biologischen Relevanz dieser Risse führen und müssen sorgfältig betrachtet werden. Es gibt keinen spezifischen Zusammenhang zwischen Manipulationsproblemen und dem Auftreten/Häufigkeit dieser Risse.

Ein spezifisches Merkmal, das auf eine schlechte Fixierung hinweist, ist das Auftreten von "blasenartigen Strukturen" im Zellzytoplasma, was auf das Vorhandensein von Eiskristallen hinweist. Diese Strukturen sind besonders sichtbar bei NHS-Ester-Färbung (Abbildung 5B). Sie gehen meist mit begrenzter Erhaltung von Zytoskelettelementen einher, wie wellenförmigen Mikrotubuli (Abbildung 5B), und einer sehr schlechten Erhaltung membranöser Organellen (Mitochondrien in Abbildung 5B). Diese Merkmale weisen wichtige Fixierungsprobleme auf, die durch (i) ungeeignetes Ethanvolumen und/oder eine ungeeignete Temperatur (Schritte 2.2.4-2.2.6 nach Protokoll), (ii) nicht allmähliches Erwärmen der biologischen Probe (Schritte 2.3 und 2.4 des Protokolls) und (iii) das Vorhandensein von Verunreinigungen in der Gefriersubstitutionslösung (Schritt 2.2.1) aus dem Protokoll verursacht werden können. Repräsentative Bilder von Natriumacrylatlösungen, die den erwarteten Anteil von 38 % Natriumacrylat, nutzbar (farblos und durchsichtig [1]) oder leicht gelb und durchsichtig [2]), oder nicht für die Ausdehnung nutzbar (gelb/orange und trüb [3]), hervorheben, sind in Abbildung 5C dargestellt.

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Abbildung 1: Cryo-ExM-Arbeitsablauf. (A) Lebende Zellen (menschliche Zellen oder T. brucei) werden kryofixiert, indem sie in flüssiges Ethan bei -180 °C getaucht und in gefrorenem Aceton auf Trockeneis inkubiert werden. Die Gefriersubstitution erfolgt durch einen konstanten und langsamen Temperaturanstieg von -180 °C auf -80 °C durch Inkubation auf Trockeneis, was eine Acetonverflüssigung (-96 °C) auslöst, und dann von -80 °C auf -20 °C durch Inkubation ohne Trockeneis. Die Rehydrierung erfolgt durch aufeinanderfolgende Bäder aus Ethanol, gemischt mit einer halbmondförmigen Konzentration aus destilliertem Wasser, zusammen mit einem stetigen Temperaturanstieg von -20 °C auf Raumtemperatur. (B) Rehydratierte Proben werden dann wie folgt zur Expansion durchgeführt: Die Proben werden in einer Mischung aus Acrylamid: Formaldehyd (AA/FA) bei 37 °C inkubiert, wodurch die Proteine an das schwellbare Polymer aus Acrylamid, Bis-Acrylamid und Natriumacrylat (AA/BIS/SA) verankert werden, wobei letzteres dem Gel die Expansionseigenschaft verleiht. Die Proben werden in NaCl/SDS bei 95 °C inkubiert, um eine Destabilisierung der Protein-Protein-Interaktion und eine sanfte Denaturierung durchzuführen. Dieser Schritt ist für die isotrope Expansion unerlässlich. Die Proben werden anschließend mit normalen primären und sekundären Antikörpern immungefärbt und schließlich in destilliertem Wasser expandiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2. Kryo-Tauch- und Expansions-Setup. (A) Kryo-Kolben in scharfer Position (oberes Panel) und unten (unteres Panel). Der Pfeil zeigt den PUSH-Knopf an, um das Tauchen zu aktivieren. (B) Kryotauch-Setup, bereit zum Eintauchen, das den für die Kryofixierung geeigneten Flüssigstickstoffgehalt (N2) anzeigt, erkennbar an der Höhe des Schaums um den Dewar (rote Pfeilspitze). Die abnehmbare Spinne ist durch Sternchen gekennzeichnet. (C) Abbildung der Schlüsselschritte des Kryotauchens vom Halten des Deckblatts (oben links), der Position der Deckfolien in flüssigem Ethan-Dewar (unten links) und des Sammelrohrs zur Gefriersubstitution (rechts). (D) Veranschaulichung der "Gel-Punching"-Methode zur Immunfärbung in menschlichen Proben. Polymerisiertes Gel auf Deckschichten (1) wird mit einem speziellen Biopsiestanz (P) geschnitten, wodurch ein Gel-Punch mit 0,4 cm Durchmesser (2) entsteht, der in einer Silikonplatte (rechte Paneele) gefärbt werden kann, um die Antikörpermenge zu reduzieren. (E) Veranschaulichung der 'Gel-Cutting'-Methode zur Immunfärbung in menschlichen und T. brucei-Proben . Polymerisierte und denaturierte Gele (1) werden in 4 gleiche Stücke (2) geschnitten, was ihre Inkubation in einer 12-Well-Platte mit Antikörpern ermöglicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3. Vergleich von Kryofixierung und PFA-Fixierung in menschlichen Zellen. (A) Rotierende Scheibenabbildung von kryofixierten und expandierten RPE1-Zellen, gefärbt auf αβ-Tubuline (Cyan), mitochondriale ATP-Synthase-Subeinheit 5a (ATP5a, gelb) und NHS-Ester (rot/grau), die die hervorragende Erhaltung sowohl membranbasierter Organellen als auch von Zytoskelettelementen, einschließlich Zentriolen und Zilien (Pfeilspitze), zeigt. Skalenbar: 10 μm. (B, C) Rotierende Scheibenabbildung von kryofixiertem (B) und PFA-fixierten (C) RPE1-Zellen, gefärbt auf αβ-Tubuline (cyan), mitochondriale ATP5a (gelb) und Hoechst (magenta), mit Schwerpunkt auf primärem Zilium (Pfeile, B', C') und Mitochondrien (B", C"). Wenn Kryo- und PFA-Fixierung gleichermaßen Zentriolen und primäre Zilien erhalten, übertrifft die Kryo-Fixierung die PFA bei der Erhaltung der mitochondrialen Struktur weitgehend (B", C"- rote Pfeilspitzen zeigen mitochondriale Kristalle, die nur unter kryofixierten Bedingungen sichtbar sind) Skalenbalken: 1, 1 bzw. 2,5 μm. (D,E) Rotierende Scheibenabbildung von kryofixierten (D) und PFA-fixierten (E) mitotischen RPE1-Zellen, gefärbt auf αβ-Tubuline gelb/grau), mitochondrialer ATP5a (magenta) und Hoechst (BOP-Blau) zeigt, dass die Kryofixierung eine bessere Ausdehnung der mitotischen Spindel (rote Pfeilspitzen) ermöglicht und bessere mitotische Spindelmikrotubuli erhält (rote Pfeile). Messungen der mitotischen Spindellänge: 12 μm bzw. 7 μm für Kryofixierung bzw. PFA-Fixation. Maßstabsbalken: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 4. Vergleich der Kryofixierung und PFA-Fixierung bei Trypanosoma brucei. (A, B) Konfokale Bilder von kryofixierten und erweiterten T.-brucei-prozyklischen Zellen, gefärbt auf mitochondriale Threonin-Dehydrogenase (TDH, gelb) und NHS-Ester (rot/grau), die die hervorragende Erhaltung des einzigartigen Mitochondriums und die allgemeine Zellarchitektur zeigen. Skalenbalken: 5 μm. (C, D) Konfokales Bild von PFA-fixierten und expandierten T. brucei-prozyklischen Zellen, gefärbt auf TDH (gelb) und NHS-ester (rot/grau). Im Vergleich der Erhaltung der mitochondrialen Strukturen und des Netzwerks übertrifft die Kryofixierung die PFA-Fixierung. Skalenbalken: 5 μm. (E, F) Konfokale Bilder von kryofixierten (E) und PFA-fixierten (F) und expandierten T. brucei-prozyklischen Zellen, gefärbt auf endoplasmatischen Retikulummarker BiP und NHS-ester (grau), was zeigt, dass die Kryofixierung eine bessere Expansion und Erhaltung des endoplasmatischen Retikulums ermöglicht. Maßstab: 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 5. Probleme mit der Kryofixierung. (A,B) Rotierende Scheibenbilder von kryofixierten und expandierten RPE1, gefärbt für αβ-Tubuline (Cyan), mitochondriale ATP-Synthase-Untereinheit 5a (ATP5a, gelb) und NHS-Ester (rot), die klassische Effekte der Kryofixierung zeigen: Risse (A, Pfeile) und Blasen (B, Pfeil). Während Risse die Ultrastrukturen der Organellen (A) nicht beeinträchtigen, ist das Vorhandensein von Blasen im Zytoplasma (B) ein Hinweis auf eine schlechte Fixierung und verändert die Erhaltung subzellulärer Organellen (Mitochondrien und Mikrotubuli, Einsätze) erheblich. Skalenbalken: 5 μm und 2 μm (Einsätze). (C) Bild, das verschiedene Natriumacrylatlösungen zeigt und den erwarteten Aspekt von 38 % Natriumacrylat hervorhebt, der verwendbar ist (farblos und durchsichtig (1) oder leicht gelb und durchsichtig (2)) oder nicht für die Expansion verwendbar (gelb/orange und trüb (3)). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 1: Speicherbedingungen der Lösung Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Liste der Antikörper Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Immunfärbungserkrankungen Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

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In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das Kryofixierung mit Expansionsmikroskopie (Cryo-ExM) integriert und einen robusten Ansatz zur Visualisierung subzellulärer Kompartimente bietet, während Artefakte vermieden werden, die häufig mit chemischer Fixierung in Verbindung gebracht werden, wie strukturelle Verzerrungen und Antigenverlust. Durch die Bewahrung der zellulären Architektur in einem nahezu nativen Zustand eliminiert Cryo-ExM die Notwendigkeit umfangreicher Fixationsoptimierung und ermöglicht eine genauere Proteinlokalisierung.

Obwohl das Protokoll im Allgemeinen unkompliziert ist, erfordern mehrere kritische Schritte besondere Aufmerksamkeit, um erfolgreiche Ergebnisse zu gewährleisten. Der Kryotauchschritt ist besonders empfindlich, da er sowohl spezifische Materialien (siehe Materialtabelle) als auch ein gewisses Maß an Geschicklichkeit erfordert, insbesondere beim Umgang mit der flüssigen Ethanfüllung, die eine potenzielle Falle darstellt. Vorkenntnisse über Kryofixierungstechniken sind vorteilhaft; Wir empfehlen, bei der ersten Anwendung dieser Methode einen Kryo-EM-Spezialisten oder einen Elektronenmikroskopie-Facility Manager zu konsultieren. Während der Expansionsphase ist es unerlässlich, die Denaturationsbedingungen strikt einzuhalten, da Abweichungen sowohl die Probenerhaltung als auch die Expansionseffizienz beeinträchtigen können. Schließlich ist es entscheidend, für alle Reagenzien (siehe Tabelle 1) angemessene Lagerbedingungen aufrechtzuerhalten (siehe Tabelle 1), um Reproduzierbarkeit und gleichbleibende Bildqualität über die Zeit sicherzustellen.

Dieses Papier hebt mehrere zentrale Vorteile des Cryo-ExM-Protokolls hervor. Bemerkenswert ist, dass die Kryofixierung den Verlust löslicher Proteine minimiert – eine häufige Einschränkung herkömmlicher Fixationsmethoden – und die Membranintegrität besser bewahrt, wodurch die Genauigkeit der zellulären Bildgebung verbessert wird. Eine große Stärke dieser Technik liegt in ihrer Kompatibilität mit Standard-Weitfeld- und Konfokalmikroskopen. Im Gegensatz zu vielen anderen Superauflösungsmethoden, die spezialisierte und oft teure Geräte erfordern, kann ExM mit herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopen implementiert werden. Ein weiterer bedeutender Vorteil von ExM ist seine Vielseitigkeit. Die Technik wurde erfolgreich auf eine Vielzahl biologischer Proben angewandt – von einzelnen Zellen bis hin zu komplexen Geweben – und zeigt ihre breite Anwendbarkeit in unterschiedlichen Forschungsbereichen. Dieses Papier betont insbesondere die Kompatibilität dieses Protokolls mit zwei sehr unterschiedlichen Modellsystemen: T. brucei und menschlichen Zellen, weist jedoch darauf hin, dass eine größere oder komplexere Probe eine Hochdruck-Gefrierfixierung erfordern würde, da manuelles Eintauchen nicht ausreicht, um die gesamteProbe zu erhalten.. Die Expansionsmikroskopie hat die Fähigkeit revolutioniert, nanoskalige zelluläre Strukturen zu visualisieren, die zuvor schwer oder unmöglich aufzulösen waren, und so Durchbrüche in Bereichen wie Zellbiologie, Entwicklungsbiologie und Neurowissenschaftenermöglicht. Insbesondere war die Methode in der Parasitologie bahnbrechend, einem Fachgebiet, in dem die konventionelle Lichtmikroskopie oft nicht überzeugt. Für viele Parasiten hat sich die Ultrastruktur-Expansionsmikroskopie (U-ExM) als Wendepunkt erwiesen, da sie eine hochauflösende Bildgebung komplexer Organellen wie Apicoplast, Conoid und zytoskelettale Elemente mit beispielloser Klarheitermöglicht. Diese Fortschritte zeigen die Kraft von U-ExM, zuvor unzugängliche strukturelle Details aufzudecken, neue Entdeckungswege in Zellbiologie, Neurowissenschaften und Parasitenbiologie zu eröffnen und die Suche nach potenziellen therapeutischen Zielen zu unterstützen. Darüber hinaus bleibt ExM kompatibel mit häufig verwendeten Immunfluoreszenzantikörpern, was die Integration in bestehende Arbeitsabläufe erleichtert. In den meisten Fällen wirken Antikörper, die routinemäßig für Fluoreszenzmikroskopie oder Western Blotting verwendet werden, wirksam auf erweiterten Proben, wodurch spezialisierte Reagenzien überflüssig werden. Diese Zugänglichkeit macht Cryo-ExM zu einer attraktiven Option für viele biologische Forschungslabore, da es hochauflösende Bildgebung ohne die üblicherweise mit fortschrittlichen Bildgebungssystemen verbundenen Kosten oder Komplexität bietet.

Trotz seiner Vorteile hat ExM gewisse Einschränkungen. Ein wesentlicher Nachteil ist der erhebliche Konsum von Antikörpern, der teuer oder problematisch sein kann, insbesondere bei selbstgemachten Antikörpern, die in begrenzten Mengen erhältlich sind. Deshalb schlagen wir diese Protokollstrategie vor, um das Volumen der für die Immunfärbung verwendeten Antikörper zu reduzieren (Abbildung 2D, E). Der Expansionsprozess erhöht außerdem die Dicke der Probe, was die Fähigkeit beeinträchtigen kann, tiefere Strukturen zu visualisieren, da die Arbeitsdistanz von Standardobjektiven im Mikroskop begrenzt ist. Diese Einschränkung kann besonders herausfordernd sein, wenn größere, dickere Proben untersucht werden, in denen tiefere Bereiche mit herkömmlichen Mikroskopen möglicherweise nicht effektiv abgebildet werden. Darüber hinaus kann Gewebeexpansion manchmal mechanische Verzerrungen verursachen, die sorgfältige Validierungs- und Korrekturschritte erfordern, um eine genaue räumliche Darstellung sicherzustellen. Schließlich ist die klassische ExM streng von der Probenfixierung abhängig, die von biologischen Proben oder subzellulärer Struktur abweichen kann, um sie zu beobachten. Während Zentriolen und Cilien stabil genug sind, um ohne Vorfixierung erweitert zu werden, erfordern zelluläre Organellen verschiedene Arten chemischer Fixierung (PFA, Methanol, Glutaraldehyd), die Artefakte erzeugen und die Beobachtung mehrerer Zellstrukturen zusammen verhindern können. Da ExM schließlich mit verschiedenen Super-Resolution-Bildgebungsmodalitäten wie der strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (SIM)39, der stimulierten Emissionsdepletionsmikroskopie (STED)40, der direkten stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM)41 und neuerdings der Lichtblattmikroskopie42 kompatibel ist, bietet der in dieser Studie beschriebene Ansatz ein vielseitiges Werkzeug, um zelluläre Strukturen mit hoher Präzision zu untersuchen. Eine aktuelle Studie kombinierte Kryofixierung mit iterativer Expansionsmikroskopie32, wodurch die Grenzen der Auflösung weiter ausgereizt und der natürliche Zustand der Zelle dank Kryofixation so weit wie möglich erhalten blieb.

Indem diese fortschrittlichen Bildgebungstechniken Zellen in ihrem ursprünglichen Zustand erfassen, ebnet Cryo-ExM den Weg für zukünftige Studien komplexer zellulärer Prozesse mit beispielloser Klarheit. Dieser Ansatz eröffnet auch neue Möglichkeiten für die Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) und erweitert so ihr Potenzial für multimodale Bildgebung weiter.

Zusammenfassend stellt ExM ein leistungsstarkes Werkzeug für Superauflösungsbildgebung dar, das breite Anwendbarkeit auf verschiedene biologische Proben hinweg bietet. Seine Kompatibilität mit Standardmikroskopen, die Vielseitigkeit bei den Probentypen und die relativ einfache Umsetzung machen es zu einer attraktiven Wahl für viele Labore. Mit fortschreitenden Fortschritten in der Technik erwarten wir weitere Verbesserungen bei Auflösung, Antikörpernutzung und Probenhandhaben, die ihre Fähigkeiten verbessern und sie für eine Vielzahl biologischer Anwendungen noch zugänglicher machen werden. Cryo-ExM stellt insbesondere einen vielversprechenden Fortschritt dar, da er eine Möglichkeit bietet, zelluläre Strukturen mit außergewöhnlicher Detailgenauigkeit zu untersuchen und dabei deren natürliche Integrität zu bewahren, was letztlich die Grenzen der modernen Mikroskopie erweitert.

Offenlegungen

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Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Jennifer Vieillard für ihren kritischen Rat und die Lektüre des Manuskripts. Wir erkennen den Beitrag der SFR Santé Lyon-Est (UAR3453 CNRS, US7 Inserm, UCBL) Einrichtung CIQLE (Mitglied von LyMIC) zur Aufnahme der Bilder von RPE1-Zellen an. Wir danken Mónica Fernández Monreal vom BIC für den Zugang zum Plunger und Ethan sowie dem Bordeaux Imaging Centre, einer Serviceeinheit des CNRS-INSERM, und der Universität Bordeaux, einem Mitglied der nationalen Infrastruktur France BioImaging, für die Erfassung von T.-brucei-Bildern . Diese Arbeit wurde vom CNRS (T. brucei) und INSERM (menschliche Zellen) unterstützt und von folgenden Institutionen finanziert: Agence National de la Recherche (ANR-20-CE91-0003, ANR-19-CE17-0014 bis M.B), die LabEx ParaFrap (ANR-11-LABX-0024) und Fondation pour la Recherche sur le Cerveau (FRC-AP2024, M.L). P.H wurde durch ANR-OIL-Finanzierung unterstützt (ANR24-CE15-2171-01 an L.R), L.K. von ANR-BBDIV (ANR-22-CE13-0014 an B.D)

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
5-ml-Röhrchen-MetallhalterDominique DutscherQB-E5Freeze-Substitutionsschritt
620 Manueller Kryo-KolbenRHOSThttps://rhost-em.com/Kryofixierungsschritt
Aceton 99,8 % AcroSealAcros OrganicsKatze. Nr. 67-64-1  Freeze-Substitutionsschritt
Acrylamyd 40 % (AA)Sigma-AldrichA4058Expansionsverfahren  (Ankern)
Acrylsäure  Sigma-Aldrich8.00181 Expansionsverfahren (Polymer)
Ammoniumpersulfat (APS)Thermo Fisher17874Expansionsverfahren (Polymer)
Biopsie-SchlagDominique DutscherPUK-40Benötigt zum Schneiden des Gels vor der Denaturierung 
BSASigma-AldrichP1379Immunfärbung 
Zellkammer AttofluorInvitrogenA7816Bildaufnahmekammer, angepasst an 24-mm-Überdeckungen für die Bildgebung
ZellkammerLebenslanger Dienst im Magning10900Bildgerätekammer, angepasst an 18-mm-Abdeckungen für die Bildgebung
Deckfolien 12 mm&nlffel;Dominique Dutscher100040Zellwachstum / Anbindung von T. brucei
Coverslips 24 mm & nbsp;Dominique Dutscher900547Imaging 
Deckfolien 18mmVWR631-0153Imaging 
Ethane gaz Linde Gaz88888DEBenötigt für die Kryofixierung
Formaldehyd 36.5– 38 % (FA)Sigma-Aldrich  F8775Expansionsverfahren  (Ankern)
Glutaraldhehyd 25 % (GA)Sigma-Aldrich  G5882Freeze-Substitutionsschritt
Glycerol Euromedex EU3550Langzeit-Gelspeicherung 
Flüssiger Stickstoff Linde Gaz2200975Benötigt für die Kryofixierung (Abkühlung des Systems)
Mikroröhren-Clear-Lock 5 ml Dominique Dutscher390932ABenötigt für die Gefriersubstitution
Nadel 18GDominique Dutscher050123BMusste Aceton sammeln
N,N-Methylbisacrylamid 2% (BIS)Sigma-AldrichM1533, SIGMAExpansionsverfahren (Polymer)
Paraformaldehyd 16 % (PFA)EMSKatze. Nr. 15710Freeze-Substitutionsschritt
Poly-D-LysinSigma-AldrichP1024Beschichtung von Coverslips für Proben/Bildgebung 
Poly-L-LysinSigma-AldrichP1274Beschichtung von Coverslips für Proben/Bildgebung 
Druckreduicer Linde GazCPLH0SJ-LIN224Druckreduicer ermöglicht Ethan-Diffusion (Kryofixierung)
Seringe Terumo 10 mlDominique Dutscher50132Musste Aceton sammeln
Silikon-Elastomer-KitDow4001834Kit zur Herstellung von silionierten Bohrlochplatten (Immunfärbung) 
Natriumacrylat 97-99 % (SA)Sigma-Aldrich408220Expansionsverfahren (Polymer)
AK ScientificR624Expansionsverfahren (Polymer)
NatriumdodecylsulfatEuromedexEU0660Expansionsverfahren (Denaturierung)
Tetramethylethylendiamin (TEMED)Thermo Fisher17919Expansionsverfahren (Polymer)
Schläuche Thermowissenschaftlich8060-0060Schläuche für Ethan-Störung (Kryofixierung)
Tween-20Euromedex1005-7Immunfärbung 
Pinzette Dumont n° 5 FineScienceTools11255-20Manipulation der Coverzettel 

Referenzen

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