Massenspektrometrie-basiertes Laktylom und Bestätigung laktylierter Proteine

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, bei der Zelllinien des Epiepephorus-Cellkarzinoms als Beispiel zur Analyse der Proteinlaktylierung verwendet werden. Der Prozess beinhaltet die Analyse der Proteinlaktylierung von der Zellkultur bis zur Bestätigung der Kandidaten, einschließlich laktylierungsbasierter Massenspektrometrie-Analyse und Bestätigung durch Immunausfällung.

Zusammenfassung

Erstmals 2019 identifiziert, hat sich die Laktylierung, eine neue posttranslationale Modifikation (PTM) an Lysinresten, als interessant in verschiedenen Pathologien und physiologischen Kontexten erwiesen. Sie besitzt zwei Isomere (L- und D-Laktylation) und ist dafür bekannt, die Komplexbildung, Zelllokalisierung oder Stabilität von Zielproteinen zu verändern. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Analyse der Laktylierung aus der Zellkultur bis zur Bestätigung potenzieller laktylierter Ziele, anhand der TE11-Epheulplattenepithel-Karzinomzellzell-Zelllinie als Beispiel. Das folgende Protokoll liefert Details zur Identifikation laktylierter Proteine mittels L-Lactylysin (K_L-LA)-spezifischer Immunpräzipitation (IP) von Peptiden für die Massenspektrometrie-(MS)-Analyse: (1) Proteinextraktion, (2) Proteinreduktion, Alkylierung und -verdauung, (3) Proteinreinigung und Peptidkonzentration, (4) IP mit K_L-LA-Perlen und (5) Konzentration von K_{L-LA-Peptiden} . Im Anschluss an diese Schritte werden die MS-Rohdaten analysiert, um laktylierte Stellen zu identifizieren, und die Bestätigung dieser mutmaßlich laktylierten Proteine mittels IP wird beschrieben. Mit dieser Methode können 100 bis 500 Peptide identifiziert und laktylierte Proteine von Interesse bestätigt werden. Abschließend lässt sich sagen, dass die Untersuchung laktylierter Proteine das Potenzial hat, unser Verständnis der PTM-gesteuerten Zellsignalübertragung sowohl unter normalen als auch bei Krankheitszuständen zu verbessern.

Einleitung

Lactylierung ist eine posttranslationale Modifikation (PTM) an Lysinresten, die Metaboliten verwenden, die aus der Glykolyse abgeleitet werden. L-L-Lactyl-CoA und Lactoylglutathion sind Substrate der L-Laktylierung (K_{L-LA) bzw. D-L-L-Lactylation} (K_D-LA) ^1,2. L-Laktylierung ist ein enzymatischer Prozess, an dem Enzyme wie Acetyltransferase ^3,4 beteiligt sind. Im Gegensatz dazu ist die D-Laktylierung ein nicht-enzymatischer Prozess durch nukleophile Substitution zwischen Lactoylglutathion und einem Lysinresidu⁵. Als dynamischer Prozess werden Deacetylasen wie HDAC1-3 als Radierer der Laktylierung⁶ identifiziert. Seit seiner Entdeckung im Jahr 2019³ wurde gezeigt, dass es in verschiedenen Pathologien und physiologischen Kontexten von Interesse ist². Dieses PTM wurde erstmals auf Histonen durch die Beobachtung einer Massenverschiebung von 72,021 Da mit Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC)-Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS^{) identifiziert.} Seitdem wurde die Laktylierung auf anderen Proteinen als Histonen nachgewiesen und es wurde gezeigt, dass sie je nach Kontext^die funktionelle Vielfalt, Lokalisierung oder Stabilität der modifizierten Proteine beeinflusst.

Da PTMs häufig in geringer Häufigkeit¹¹ vorkommen und Teil eines dynamischen und vorübergehenden Prozesses¹² sind, ist eine Anreicherung des untersuchten PTM durch Immunpräzipitation (IP) erforderlich. Anschließend wird MS häufig verwendet, um das PTM-gebundene Proteom auf verdauten Peptiden wie Phosphoproteom oder Ubiquitinationsprofilierung¹¹ zu beschreiben. Wie bei anderen PTMs, Lactylome oder angereicherten laktylierten Peptiden ist MS-basierte Proteomik die Goldstandardmethode zur Identifizierung neuer Laktylierungsstellen.

Dieses Protokoll beschreibt die Identifizierung von_{K-L-LA-angereicherten} Peptiden mittels MS-basierter Proteomik, gefolgt von der Bestätigung laktylierter Proteine durch Immunpräzipitation. Anhand der Zelllinien des ösophagösen Plattenepitelzellkarzinoms (ESCC) als Beispiel beschreiben wir ein Protokoll zur Extraktion laktylierter Proteine für MS-basierte Identifikation laktylierter Ziele und deren anschließende Bestätigung durch IP.

Protokoll

Da PTMs ein dynamischer und vorübergehender Prozess sind, ist es wichtig, die Konfluenz, bei der das gesamte Laktylierungsniveau optimal ist, im Voraus durch Durchflusszytometrie oder Western Blotting mit einem Anti-K_{L-LA-Antikörper} festzulegen. Beispielsweise ist eine Konfluenz von 70 % bis 80 % in ESCC-Zelllinien für Laktylom- und IP-Experimente vorzuziehen, da der Gesamtlaktylierungsgrad am höchsten ist. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Zellkultur

1. Wachsen Sie Zellen in 100-mm-Petrischalen, bis die erforderliche Konfluenz erreicht ist, wie bereits erwähnt.
   HINWEIS: Wachsen Sie genügend Zellen, um zwischen 0,5 und 1 mg Proteine für Lactylome oder mehr als 2 mg für IP zu erhalten.
2. Spülen Sie die Zellen mit 5 ml vorgekühlter 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ab.
3. Fügen Sie 500 μL vorgekühltes PBS hinzu und entnehmen Sie die Zellen mit einem Zellschaber. Übertragen Sie auf eine 1-mL niedrigbindende Mikroröhre.
4. Zentrifugiere Zellen bei 2.000 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT) und entsorge das klare Supernatant. Zellpellets können bei -80 °C gelagert werden.

2. Lactylome

HINWEIS: Arbeiten Sie immer mit Handschuhen, um eine Kontamination der Probe zu verhindern. Verwenden Sie immer gefilterte Spitzen, niedrig bindende Mikroröhren und MS-fähiges Wasser.
HINWEIS: Biologische Replikationen (nach unserer Erfahrung 3–5) sollten immer durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die identifizierten Modifikationen reproduzierbar sind.

1. Proteinextraktion
   HINWEIS: Arbeit auf Eis.
   1. Bereiten Sie den Lactylom-Lysepuffer vor (Tabelle 1) vor und lagern Sie ihn vor der Anwendung bei 4 °C. Fügen Sie direkt vor der Anwendung Proteaseinhibitoren hinzu.
   2. Extrahieren Sie die Proteine mit dem entsprechenden Volumen des Lysepuffers.
   3. Sonikate auf Eis, 12 Zyklen mit jeweils 5 Sekunden Puls + 5 Sekunden aus, mit einer Intensität von 20%-25%.
   4. Zentrifugieren Sie bei 16.000 x g für 10 Minuten bei 4 °C. Übertragen Sie das klare Supernatant mit den Proteinen in ein neues niedrig bindendes Mikrorohr.
   5. Quantifizieren Sie Proteine mit einem Bicinchoninsäure-(BCA)-Kit gemäß der Empfehlung des Herstellers.
      HINWEIS: Das BCA-Kit ist mit maximal 3 M Harnstoff kompatibel. Daher müssen die Proben entsprechend verdünnt werden.
   6. Übertragen Sie 500 μg auf 1 mg Proteine in neue niedrigbindende Mikroröhren. Verwenden Sie für jede Probe die gleiche Proteinmenge. Schließen Sie das Volumen aller Proben mit dem Lactylome-Lysepuffer auf dasselbe Endvolumen ab.
2. Reduktion, Alkylierung und enzymatische Verdauung
   1. Dithiothreitol zu einer Endkonzentration von 5 mM hinzufügen. 2 Minuten bei 95 °C inkubieren.
   2. Inkubiere 30 Minuten bei RT.
   3. Fügen Sie Chloracetamid zu einer Endkonzentration von 7,5 mM hinzu. Inkubieren Sie im Dunkeln 20 Minuten bei RT.
   4. Fügen Sie das 3-fache des Probevolumens (aus Schritt 2.1.6) von 1 M (NH₄)₂CO₃ hinzu, um Harnstoff von 8 M auf 2 M zu reduzieren.
      HINWEIS: Wenn das Gesamtvolumen die Kapazität der Mikroröhren übersteigt, werden sie in zwei Mikroröhren aufgeteilt.
   5. Fügen Sie 1 μg MS-Trypsin pro 100 μg Proteine hinzu. Inkubieren Sie über Nacht bei 30 °C. Beginnen Sie mit der Probenreinigung.
3. Reinigung und Peptidkonzentration
   HINWEIS: Ich arbeite bei RT.
   1. Säuere die Probe durch Zugabe von Trifluoressigsäure (TFA) zu einer Endkonzentration von 0,2 %.
   2. Bereiten Sie folgende Lösungen frisch in MS-haltigem Wasser vor: 0,1 % TFA, 1 % Ameisensäure (FA) und 1 % FA/50 % Acetonitril.
   3. Verwenden Sie C18 100-mg-Säulen, um mit der Reinigung fortzufahren.
      HINWEIS: Um diese Säule zu verwenden, verwenden Sie zwei Pipettenspitzen: Laden Sie die Säule mit einer und schneiden Sie die Spitze der anderen Säule ab, um die Flüssigkeit aus der Säule auszustoßen. Stellen Sie sicher, dass die Säule konstant feucht bleibt. Verwenden Sie pro Probe eine Säule.
   4. Laden Sie die Säule mit 1 ml 100% Acetonitril, der Benetzungslösung, auf und werfen Sie aus. Wiederholen Sie das zweimal.
   5. Die Säule ausgleichen, indem man 1 mL 0,1 % TFA auflädt und auswirft. Zweimal wiederholen.
   6. Laden Sie die Säule mit 1 ml der versauerten Probe auf. Fahren Sie mit 10 Zyklen Ladung/Auswurf der Probe fort. Wiederholen, wenn noch eine Probe übrig ist.
   7. Waschen Sie die Säule, indem Sie 1 ml 0,1 % TFA aufladen und auswerfen. Zweimal wiederholen.
   8. Für die Elution werden 10 Lade-/Auswurfzyklen mit 750 μL 1 % FA/50 % Acetonitril durchgeführt. In einem neuen, niedrig bindenden Mikrorohr gesammelt. Wiederholen Sie dies mit zusätzlichen 750 μL 1 %/50 % Acetonitril, insgesamt 1,5 ml gereinigte Peptide.
      HINWEIS: Identifizieren Sie das Mikrorohr an der Seite statt an der Kappe, um Kontaminationen von Proben beim Durchbohren von Löchern zu vermeiden.
   9. Stechen Sie 1 bis 3 Löcher in die Kappe der Mikroröhren mit einer Nadel zur Verdunstung ein.
   10. Mit einem Vakuumkonzentrator konzentrieren Sie die Proben bei 60 °C so lange wie nötig (bei Proben mit einem Endvolumen von 1,5 ml kann dies mindestens 4 Stunden dauern). Anschließend wird mit der Immunpräzipitation der Peptide fortgesetzt.
4. Immunpräzipitation mit K_L-LA-Perlen
   1. Bereiten Sie den Waschpuffer und den Lactylome-IP-Puffer vor (Tabelle 2).
   2. Auf Eis geben Sie 200 μL IP-Puffer zu den konzentrierten Peptiden und mischen Sie sich gründlich auf- und ab, bis sie sich auflösen. Einige Niederschläge können noch sichtbar sein.
   3. Zentrifugiere mit 12.000 x g für 10 Minuten bei 4 °C, um eventuelle Niederschläge zu entfernen.
      HINWEIS: Nach der Zentrifugation kann die Probe als Kontrollschritt dosiert werden, zum Beispiel mit einem Spektrophotometer zur Quantifizierung der Peptidkonzentration bei 205 nm.
   4. Waschen Sie K_L-LA Agarose-konjugierte Perlen dreimal mit 200 μL eiskaltem 1x PBS, indem Sie bei 2.000 x g für 1 Minute bei 4 °C zentrifugieren und nach jedem Waschen das klare Übersupernatant entfernen.
      HINWEIS: Für 1 mg Protein zu Beginn dieses Protokolls verwenden Sie 20 μL K_{L-LA-Agarose-konjugierte} Perlen, die zuvor in 0,5 ml niedrigbindenden Tuben zur einfachen Anwendung aliquotiert wurden.
   5. Übertragen Sie das klare Supernatant mit den resuspendierten Peptiden in das 0,5-ml-Mikrorohr mit den vorgewaschenen Perlen. Versiegeln Sie die Röhren mit Paraffinfolie, um Leckagen zu vermeiden.
   6. Über Nacht mit sanfter End-to-End-Rotation bei 4 °C inkubieren.
      HINWEIS: Die Schritte 2.4.7-2.4.12 werden alle bei 4 °C durchgeführt.
   7. Pelletiere die Perlen durch Zentrifugation bei 2.000 x g für 1 Minute. Entsorge das klare Supernatant.
   8. Fügen Sie 200 μL Lactylome IP-Puffer hinzu und waschen Sie 15 Sekunden lang, indem Sie das Rohr umkehren. Zentrifugieren Sie mit 2.000 x g für 30 Sekunden und entsorgen Sie das klare Supernatant.
   9. Wiederhole Schritt 2.4.8 einmal.
   10. Fügen Sie 200 μL Waschpuffer hinzu und waschen Sie 15 s lang, indem Sie das Rohr umkehren. Zentrifugieren Sie mit 2.000 x g für 30 Sekunden und entsorgen Sie das klare Überlagermittel.
   11. Wiederhole Schritt 2.4.10 zweimal.
   12. Fügen Sie 200 μL MS-Qualitätswasser hinzu und waschen Sie 30 Sekunden lang, indem Sie das Rohr umkehren. Zentrifugieren Sie bei 2.000 x g für 1 Minute und entsorgen Sie das klare Überstandsmittel.
       HINWEIS: Die restlichen Schritte des Lactylome-Protokolls werden bei RT durchgeführt.
   13. Elutieren Sie die gebundenen Peptide mit 100 μL Elutionspuffer (0,1 % TFA frisch vorbereitet) für 1 Minute mit sanfter End-to-End-Rotation bei RT. Zentrifugieren Sie bei 2.000 x g für 2 Minuten.
   14. Wiederholen Sie Schritt 2.4.13 zweimal und kombinieren Sie die Elute. Fahren Sie mit der Reinigung der Proben fort.
5. Konzentration und Reinigung von K_{L-LA-Peptiden}
   1. Bereiten Sie folgende Lösungen in frischem Wasser der MS-Qualität vor: 0,1 % TFA, 1 % FA und 1 % FA/50 % Acetonitril.
      HINWEIS: Bereiten Sie vor Beginn der Reinigung die richtige Menge Lösung in 1,5 mL Mikroröhren vor (Schritt 2.5.3: 300 μL 100 % Acetonitril, Schritt 2.5.4: 300 μL 0,1 % TFA, Schritt 2.5.6: 300 μL 0,1 % TFA und Schritt 2.5.7: 300 μL 1 % FA/50 %).
   2. Verwenden Sie 100 μL C18-Spitzen, um mit der Reinigung fortzufahren.
      HINWEIS: Die 100 μL C18-Spitzen werden auf die gleiche Weise wie herkömmliche Pipettenspitzen verwendet. Halten Sie den Daumen angespannt und lassen Sie den Kolben zwischen den Schritten niemals los, um die Säule feucht zu halten und das Einströmen von Luft zu verhindern.
   3. Aspirieren Sie 100 μL 100% Acetonitril, die Benetzungslösung, und dosieren Sie vorsichtig, ohne die gesamte Flüssigkeit auszustoßen. Wiederholen Sie das zweimal.
   4. Die Säule ausgleichen, indem Sie 100 μL 0,1 % TFA aspirieren und vorsichtig abgeben. Zweimal wiederholen.
   5. Laden Sie die Säule mit 100 μL der Probe der K_L-LA-Peptide auf. Fahren Sie mit 10 Lade-/Auswurfzyklen in einer neuen, niedrigbindenden Mikroröhre fort. Wiederholen Sie das, wenn noch eine Probe übrig ist.
   6. Waschen Sie die Säule, indem Sie 100 μL 0,1 % TFA aspirieren und dosieren. Wiederholen Sie das zweimal.
   7. Fahren Sie mit 10 Lade-/Auswurfzyklen für die Elution mit 100 μL 1 % FA/50 % Acetonitril in einer neuen niedrig bindenden Mikrotube durch. Wiederholen Sie das zweimal und kombinieren Sie die Eluate.
      HINWEIS: Die Peptide, die an die C18-Spitze binden, könnten verhindern, dass die Spitze jeweils 100 μL aspiriert. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis keine Flüssigkeit mehr im Mikrorohr ist (300 μL) bei Schritt 2.5.7.
   8. Stechen Sie 1 bis 3 Löcher in die Kappe der Mikroröhren mit einer Nadel zur Verdunstung ein.
      HINWEIS: Identifizieren Sie die Mikroröhren an der Seite des Röhrchens statt an der Kappe, um Kontaminationen der Proben beim Durchbohren der Löcher zu vermeiden.
   9. Mit einem Vakuumkonzentrator konzentrieren Sie die Proben bei 60 °C so lange, wie die Flüssigkeit verdampft (bei einem Gesamtvolumen von 300 μL kann dies mindestens 2 Stunden dauern).
   10. Suspendiere die konzentrierten Peptide in 30 μL mit 1 % FA.
   11. Folgen Sie den Richtlinien Ihrer Massenspektrometrie-Plattform und quantifizieren Sie Peptide mit einem Spektrophotometer bei 205 nm, um ihre Konzentration zu bestimmen.
   12. In ein Glasfläschchen übergeben und bis zur MS-Analyse bei 4 °C halten.

3. MS-Analyse und Bioinformatik

HINWEIS: Die Proben wurden in der Proteomics Core Facility der University of Sherbrooke mit einem Massenspektrometer (MS) analysiert (betrieben im datenabhängigen Erfassungsmodus mit paralleler Akkumulation-serieller Fragmentierung (DDA-PASEF)).

1. Massenspektrometrie
   1. Für jede Probe werden 375 ng Peptide in ein Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesystem (HPLC) injiziert.
   2. Lade Peptide mit einer konstanten Durchflussrate von 4 μL/min auf eine Fangsäule.
   3. Trennen Sie die Peptide in einer analytischen C18-Säule mit einem 2-H-Gradienten von 5%-37 % Acetonitril in 0,1 % FA bei einer Durchflussrate von 400 nL/min.
   4. Elektrosprüh-Ionisation mit folgenden Einstellungen durchführen: Kapillarspannung: 1500 V, Trockengas: 3,0 L/min, Trockentemperatur: 180 °C, TIMS-in-Druck: 2,6 mBar.
   5. Erfassen Sie das Massenspektrum im Bereich von 100–1700 m/z mithilfe des DDA-Auto-MS/MS-Modus.
      HINWEIS: Das Instrument ist so eingestellt, dass Ladungszustände von 0 bis 5+ erkannt werden. Eine duale Trapped Ion Mobility Spectrometry (TIMS)-Konfiguration wird verwendet, mit einer Rampezeit von 100 ms und 10 Parallel Accumululation-Serial Fragmentation (PASEF) Scans pro Aufnahmezyklus, was zu einem Duty Cycle von 1,17 Sekunden führt. Der dynamische Ausschluss ist auf 0,4 Minuten gesetzt.
   6. Fragmentierung wird mit einer kollisionsinduzierten Dissoziation (CID) durchgeführt, die linear von 20–59 eV über einen Ionenmobilitätsbereich von 0,6–1,6 Vs/cm² erhöht wird.
      HINWEIS: Die Zielintensität ist auf 20.000 gesetzt, mit einer Intensitätsschwelle von 2.500. Ein Standard-Filterpolygon wird angewendet, um Vorläufer entlang der diagonalen Scan-Linie für +2, +3 und +4 geladene Peptide in der m/z-Ionen-Mobilitätsebene zu priorisieren.
2. Datenvorverarbeitung: MaxQuant-Analyse
   HINWEIS: Die nächsten Schritte werden mit der MaxQuant v.2.6.7¹³ Software durchgeführt, um die laktylierten Peptide zu identifizieren.
   1. Im oberen rechten Bereich klicken Sie auf den Reiter Konfiguration und überprüfen Sie, ob eine Laktylierung als Änderung hinzugefügt wurde.
   2. Wenn nicht, verwenden Sie die Unimod.org Datenbank¹⁴. Melden Sie sich als Gast an und suchen Sie nach Laktylation (Accession #2114).
   3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen. Schreiben Sie unter Name Lactylation (K), geben Sie die Komposition wie in Unimod geschrieben ein, indem Sie auf die Schaltfläche "Ändern" klicken.
   4. Überprüfen Sie die erhaltene monoisotopische Masse. Klicken Sie auf OK.
   5. Oben links auf dem Bildschirm, in Blau, klicken Sie auf die Schaltfläche "Änderungen speichern ".
   6. Im oberen linken Bereich klicken Sie auf Rohdaten. Laden Sie Rohdaten und benennen Sie sie automatisch mit dem Button Bruchbruch.
   7. Stellen Sie unten links die Anzahl der Threads anhand der Anzahl der auf dem Computer zugänglichen Kernen fest.
   8. Im Reiter Gruppe spezifisch klicken Sie in Blau auf Änderungen .
   9. Füge Lactylation zu Variablen-Modifikationen hinzu, indem du auf die Pfeiltaste klickst, um dem rechten Quadrat hinzuzufügen.
   10. Klicken Sie auf Label-free quantification. Geben Sie LFQ ein und ändern Sie den Normalisierungstyp auf null.
   11. Klicken Sie auf Digestion. Stellen Sie sicher, dass Trypsin/P dem rechten Quadrat hinzugefügt wird.
   12. Erhöhen Sie die maximal verpasste Spaltung auf 4 , da die Laktylierung die Verdauung von Trypsin beeinträchtigen könnte.
   13. Klicken Sie auf Instrument. Ändern Sie die Peptidtoleranz der Hauptsuche auf 20, da Laktylierung kein gängiges PTM ist.
   14. Im oberen linken Bereich klicken Sie auf Globale Parameter. Fügen Sie eine Fasta-Datei hinzu, die zuvor von Uniprot oder Ensembl heruntergeladen wurde, für die entsprechende Spezies.
   15. Klicken Sie auf die Identifier-Regel und Test , um sicherzustellen, dass die Fasta-Datei korrekt gelesen werden kann.
   16. Klicken Sie auf Proteinquantifizierung in Blau . Fügen Sie Lactylation dem rechten Quadrat hinzu.
   17. Klicken Sie auf Identification in Blau . Ändern Sie FDR auf 0,05. Stellen Sie sicher, dass Second-Peptide und Match zwischen Durchläufen überprüft sind.
   18. Klicken Sie blau auf Label-free quantification . Prüfen Sie die iBAQ- und Top3-Boxen.
   19. Klicke oben rechts auf Performance.
   20. Im unteren Abschnitt klicken Sie auf Start in Blue.
3. Identifikation laktylierter Proteine
   HINWEIS: Am Ende des MaxQuant-Laufs werden mehrere Ausgabedateien erhalten, wie zum Beispiel:
   • Lactylation (K)Standorte: primäre Datei von Interesse – enthält ortsspezifische Informationen zu laktylierten Lysinresten in einer präzisen Peptidsequenz (identifiziertes Protein, Lokalisierung der Laktylierung in Sequenz, Intensitäten, Konfidenzniveau).
   • Lactylationsparameter: enthält alle Informationen zu Einstellungen und Schwellenwerten, die während der MaxQuant-Analyse verwendet werden.
   • Lactylationspeptide: identifizierte modifizierte und unmodifizierte Peptide.
   • Lactylationsproteingruppen: identifizierte Proteingruppen und deren Zusammenhang mit der nachgewiesenen Laktylierung.
   Die Verwendung dieser Dateien hängt von der Forschungsfrage ab. Der nächste Schritt beschreibt, wie man eine laktylierte Stelle identifiziert.
   1. Öffnen Sie die Lactylation (K)Sites-Datei in Excel.
   2. Duplizieren Sie den Tab unten Lactylation (K)Sites , um die Originaldaten zu behalten.
   3. Sortiere von A nach Z die Spalten Umgekehrte und potenzielle Verunreinigung . Wenn in einigen Zeilen Wert vorhanden ist, lösche diese Zeilen.
   4. In diesem neuen Tab behalten Sie nur die notwendigen Spalten, wie z. B. folgende Spalten: (1) Protein: UniProt¹⁴ Primäre Zugangsnummer, (2) Positionen innerhalb der Proteine: Vorhergesagte Position der Laktylierung, wichtig zu bestätigen, wie später beschrieben, (3) Proteinnamen, (4) Gennamen, (5) Anzahl der Lactylation (K auf dem entsprechenden Peptid detektiert), (6) Lactylation (K) Wahrscheinlichkeiten (Wahrscheinlichkeit von 1 auf der Position der Laktylierung), (7) Intensität (Summe aller individuellen Intensitäten des entsprechenden Peptids).
   5. Vervollständigen Sie alle fehlenden Werte wie Protein- oder Gennamen.
   6. Behalten Sie nur die erste Zugangsnummer in der Spalte "Proteine". Die erhaltene Tabelle stellt alle laktylierten Peptide sowie das wahrscheinlichste Protein dar, in dem dieses Peptid vorkommt.
      HINWEIS: Da die Laktylierung kein häufiges PTM ist, werden zwischen 100 und 500 Peptide als laktyliert identifiziert. Da sich die detektierten Peptide von einem Replikat zum anderen unterscheiden, ist es möglich, eine Schwelle von mindestens 2 biologischen Replikaten festzulegen.
   7. Um die Position eines modifizierten Restes zu bestätigen, verwenden Sie ein Ausrichtungsweb-Tool wie BLAST von NIH¹⁵ oder Align von UniProt¹⁶ mit der Peptidsequenz in der Spalte "Lactylation (K) Probabilities" (löschen Sie jede Wahrscheinlichkeit) und der Proteinsequenz aus UniProt-Datenbank¹⁷.
      HINWEIS: Da mehrere Laktylierungsstellen in einer einzigen Proteinsequenz identifiziert werden können, ist es möglich, diese Stellen gleichzeitig auszurichten. Dies hilft auch, doppelte Stellen zu identifizieren, die auf verschiedenen Peptiden, aber an derselben Stelle in der Proteinsequenz liegen können.
   8. Die Datenanalyse hängt von der Forschungsfrage ab, aber es ist notwendig, Schritte wie Normalisierung, Zentrierung, Skalierung und Logaritamtransformation zu berücksichtigen, bevor man eine statistische Datenanalyse¹⁸ durchführt.
   9. Um die durch die MS-Analyse identifizierten laktylierten Proteine zu bestätigen, wird das Immunpräzipitationsprotokoll verwendet.

4. Immunpräzipitation (IP)

1. Proteinextraktion
   HINWEIS: Arbeit auf Eis.
   1. Bereiten Sie den IP-Lysis-/Waschpuffer vor (Tabelle 3) vor und lagern Sie ihn vor der Verwendung bei 4 °C. Fügen Sie die Proteaseinhibitoren direkt vor der Anwendung hinzu.
      HINWEIS: Für die Probenvorbereitung kann ein Zellpellet verwendet werden, das bei -80 °C konserviert wurde. Bei der Arbeit mit frischen Zellen befolgen Sie die Schritte 4.1.2 und 4.1.3. Ansonsten wird das Zellpellet im gleichen Volumen des IP-Lyse-/Waschpuffers wie in Schritt 4.1.2 angegeben wieder suspendiert und mit Schritt 4.1.4 fortgesetzt.
   2. Gib 1 ml IP-Lyse-/Waschpuffer dazu und inkubiere Zellen bei 4 °C für 10 Minuten.
   3. Zellen werden mit einem Zellschaber entnommen und die Lyse auf eine 1,5-mL-Mikroröhre übertragen.
   4. Inkubieren Sie mit sanfter End-to-End-Rotation für 30 Minuten bei 4 °C.
   5. Zentrifugiere mit 16.000 x g für 10 Minuten bei 4 °C.
   6. Übertragen Sie den klaren Supernatant auf eine neue 1,5-mL-Mikroröhre.
   7. Quantifizieren Sie Protein mit einem BCA-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
2. Vorbeseitigung der Perlen und K_L-LA Antikörper-Inkubation
   HINWEIS: Arbeiten Sie auf Eis. Für jede experimentelle Bedingung bereiten Sie eine Kontroll-IP-Röhre (IgG derselben Spezies wie der K_L-LA Antikörper) und eine Röhre für K_L-LA IP vor.
   1. Übertragen Sie 1 mg Proteine auf eine neue 1,5-ml-Mikroröhre. Füllen Sie alle Proben auf dasselbe Endvolumen mit IP-Lyse-/Waschpuffer ab.
      HINWEIS: Dieses Protokoll kann mit magnetischen oder Agaroseperlen durchgeführt werden. Für die folgenden Schritte wurden magnetische Perlen verwendet.
   2. Übertragen Sie das benötigte Volumen an Perlen auf eine neue 1,5-mL-Mikroröhre.
   3. Um die Perlen vorzuwaschen, magnetisieren Sie die Perlen für 30 Sekunden oder bis die Lösung klar ist. Entsorgen Sie das klare Überstandsmittel. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 500 μL IP-Lyse-/Waschpuffer. Entsorgen Sie das klare Überlagermittel nach jedem Waschen. Fügen Sie das gleiche Volumen des IP-Puffers hinzu wie das Volumen der ursprünglich entnommenen Perlen.
   4. Inkubieren Sie die Proteinproben mit 10–15 μL der vorgewaschenen Perlen und sanfter Ende-zu-Ende-Rotation für 20 Minuten bei 4 °C.
      HINWEIS: Für 1 mg Protein verwenden Sie 10–15 μL magnetische Perlen. Dieser Schritt minimiert die unspezifische Proteinbindung an die Perlen während des Immunpräzipitationsprotokolls.
   5. Magnetisieren Sie die Perlen für 30 Sekunden oder bis die Lösung klar ist. Übertragen Sie den klaren Supernatant auf eine neue 1,5-mL-Mikrotube.
   6. Fügen Sie 1,5 μL Anti-K_{L-LA-Antikörper}in ein Rohr und die entsprechende Menge IgG in ein anderes Rohr hinzu.
      HINWEIS: Für 1 mg Protein zu Beginn dieses Protokolls verwenden Sie 1,5 μg Antikörper.
   7. Inkubieren Sie die Proben über Nacht mit sanfter End-to-End-Rotation bei 4 °C.
3. K_{L-LA Immunausfällung}
   HINWEIS: Arbeit auf Eis.
   1. Bereiten Sie den IP-Lysis-/Waschpuffer vor (Tabelle 3) vor und lagern Sie ihn vor der Verwendung bei 4 °C. Fügen Sie die Proteaseinhibitoren direkt vor der Anwendung hinzu.
   2. Die Perlen wie in Schritt 4.2.3 beschrieben vorwaschen.
      HINWEIS: Für 1 mg Protein zu Beginn dieses Protokolls verwenden Sie 40 μL magnetische Perlen.
   3. Inkubieren Sie die Proben mit 40 μL vorgewaschener magnetischer Perlen mit sanfter Runddrehung von Ende zu Ende für 4 Stunden bei 4 °C.
   4. Magnetisieren Sie die Perlen für 30 Sekunden oder bis die Lösung klar ist. Sammeln Sie das erste klare Supernatant. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 500 μL IP-Lyse/Waschpuffer. Entfernen Sie das klare Supernatant nach jedem Wasch.
      HINWEIS: Der erste Supernatant kann quantifiziert und im Western Blotting (WB) verwendet werden. Es ist nützlich, die Wirksamkeit der Immunpräzipitation zu bewerten.
   5. Suspendieren Sie die Perlen mit 20 μL 2x Laemmli und 5 % β-Mercapttoethanol-Puffer.
   6. Inkubieren Sie bei 95 °C für 5 Minuten, bevor Sie auf ein SDS-PAGE-Gel geladen werden. Alternativ können denaturierte Proben mehrere Wochen bei -20 °C gelagert werden.
4. WB-Erkennung
   1. Stellen Sie die IP-Röhren 30 Sekunden lang auf den magnetischen Halter, bevor Sie die Probe entnehmen und auf ein SDS-PAGE-Gel legen.
   2. Durchführung von Weißbliedern mit einem Antikörper gegen das interessierte Protein und/oder dem_{Anti-K-L-La-Antikörper} , um den Pull-down laktylierter Proteine im 5%-Rinderserumalbumin (BSA) zu bestätigen. Sekundäre Antikörper wurden bei 1:5000 in 5% BSA verdünnt.
   3. Erkennen Sie die Bänder mittels HRP-basierter chemilumineszenzbasierter Erkennung.

Ergebnisse

Als Beispiel wurde die TE11-Zelllinie des Speiseröhrenplattenepithelkarzinoms kultiviert, bis eine 80%ige Konfluenz erreicht war. Nach dem in Abbildung 1 dargestellten Ablauf und der MaxQuant-Analyse wie in diesem Protokoll beschrieben wurde das Lactylom bestimmt. In diesen Zellen wurden 137 Peptide als potenziell laktyliert identifiziert, was 82 einzigartige Proteine darstellt, da mehrere Stellen auf demselben Protein identifiziert wurden (Abbildung 2A). Beachten Sie, dass dies keine eindeutigen Peptide berücksichtigt. In diesen Experimenten mit Speiseröhren-Plattenepithelkarzinom-Zelllinien wird eine Anzahl von 100 bis 500 identifizierten Peptiden erwartet.

Laktylierte Proteine, die identifiziert wurden, stehen in Zusammenhang mit mehreren biologischen Prozessen, wie der Chromatin-Umgestaltung oder der Chromatin-Assemblierung, die bereits in der Literatur als mit laktylierten Proteinen angereichert beschrieben wurden (Abbildung 2B). Einige der ersten identifizierten laktylierten Proteine waren Histone, die ebenfalls in diesen Daten zu finden sind, wie zum Beispiel Histon H1.2 (Tabelle 4). Lactylation konnte auf mehreren verschiedenen Lysinresten desselben Proteins identifiziert werden. Beispielsweise wurden zwei Laktylierungsstellen auf Histon H1.2 identifiziert: Lysine (K) 168 (wahrscheinlich) und 191. Am ersten Peptid (Tabelle 4, Zeile 2) wurde beobachtet, dass der K168-Rest mit einer höheren Wahrscheinlichkeit das laktylierte ist, mit 0,733 auf 1, während K169 nur eine Wahrscheinlichkeit von 0,267 hat. HNRNPA1 ist ein gutes Beispiel für ein Peptid, das ausgerichtet werden muss, um den richtigen modifizierten Rest zu bestimmen.

Um die Laktylierung von HNRNPA1 anhand der Lactylom-Ergebnisse (Tabelle 4) zu validieren, wurde ein IP-Test durchgeführt, der auf diese posttranslationale Modifikation abzielte. Zunächst wurden G-Perlen und A/G-Perlen verglichen, um zu bestimmen, welcher Perlentyp die optimale Interaktion mit dem Anti-K-L-La-Antikörper zeigt. Nach der Durchführung von IP mit einem K_{L-LA-Antikörper} und gefolgter Weißbliederung gegen K_L-LA wurde eine sichtbare Anreicherung von K_{L-LA-Proteinen} beobachtet, im Vergleich zum Input, wie erwartet, bei beiden Perlentypen (Abbildung 3). Diese Ergebnisse zeigen die Effizienz und Robustheit des Protokolls bei der Anreicherung laktylierter Proteine. Es wurde kein deutlicher Unterschied zwischen den beiden getesteten Perlentypen festgestellt. Um die durch MS identifizierten Ziele zu validieren, können dann spezifische IPs bestätigt werden. Zum Beispiel wurde die Laktylierung von HNRNPA1, die durch MS identifiziert wurde (Tabelle 4), kalibriert. Ein spezifisches Band, das HNRNPA1 entspricht, wurde nach K_L-LA IP und HNRNPA1 WB nachgewiesen, was darauf hinweist, dass HNRNPA1 durch Laktylierung modifiziert wird (Abbildung 4). Während sowohl G- als auch A/G-Perlen das Zielprotein erfolgreich immunpräzipitierten, wird bei A/G-Perlen ein intensiveres Signal von HNRNPA1 beobachtet, was auf eine verstärkte Affinität oder Erholung hindeutet.

Abbildung 1: Überblick über den Arbeitsablauf für die Lactylom-Analyse. Abkürzungen: IP = Immunpräzipitation; K_L-LA = L-Lactyllysin; LC-MS/MS = Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse für einige Proteine, die für das Laktylom der TE11-Zellen gewonnen wurden. (A) Gesamtzahl der identifizierten Proteine und Peptide. Mehrere Laktylierungsstellen können auf demselben Protein identifiziert werden. (B) Die fünf wichtigsten biologischen Prozesse, angereichert für laktylierte Proteine in TE11-Zellen, die mit der STRING-Datenbank gewonnen wurden. Der P-Wert wurde für mehrere Tests mit Benjamini-Hochberg korrigiert. Die Zahl in jedem Balken repräsentiert die Anzahl der Proteine im Netzwerk, die als laktyliert identifiziert wurden, aus der Gesamtzahl der Proteine in dieser Genontologie (GO). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Immunpräzipitation von K_L-LA unter Verwendung von G- oder A/G-Perlen und WB-Detektion von Pan-K_L-LA in TE11-Zellen. Der Nachweis von Pan-K_L-LA dient als entscheidende Kontrolle, um die Wirksamkeit und Spezifität der Immunpräzipitation dieses PTM zu bestätigen. Dieses Experiment stellt sicher, dass das IP erfolgreich Proteine anreichert, die die K_{L-LA-Modifikation} beherbergen. (*) zeigt die schweren und leichten Ketten des Antikörpers an, wie klar in IP beobachtet: IgG-Lanes (Control IP) (N = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Immunpräzipitation von K_L-LA mit G- oder A/G-Perlen und Nachweis von HNRNPA1 durch WB. Der Nachweis von HNRNPA1 durch WB in K_{L-LA-spezifischen} Immunpräzipitationen mit G- oder A/G-Perlen bestätigt die Laktylierung in TE11-Zellen (N = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Lösung	Abschließende Schwerpunkte
Harnstoff	8 M
Ammoniumbicarbonat	1 M
HEPES	20 mM

Tabelle 1: Lactylom-Lysepuffer. Zubereitung in MS-Wasser und Anpassung des pH-Werts auf 8.

Lösung – Lactylom-Waschpuffer	Abschließende Schwerpunkte
NaCl	100 mM
EDTA	1 mM
Tris-HCl	20 mM
Add for Lactylome IP Buffer	Abschließende Schwerpunkte
NP-40	0.5%

Tabelle 2: Lactylome-Waschpuffer und IP-Puffer. Zubereitung in MS-Wasser und Anpassung des pH-Werts auf 8 für beide Lösungen.

Lösung	Abschließende Schwerpunkte
Natriumchlorid	100 mM
Natriumfluorid	50 mM
Tris-HCl (pH 7,5)	50 mM
β-Glycerophosphat	40 mM
EDTA (pH 8)	5 mM
Glycerol	5%
Triton X-100	1%
Frisches hinzufügen:
Protease-Inhibitor-Cocktail 100X	1X
PMSF	1 mM
Orthovanadate	0,2 mM

Tabelle 3: IP-Lyse-/Waschpuffer. Er muss frei von Denaturatoren sein, da diese das Vorhandensein der PTMs auf Proteinen destabilisieren können.

Positionen innerhalb von Proteinen		Protein	Proteinnamen	Gennamen	Anzahl der Laktylationen (K)	Lactylation-(K)-Wahrscheinlichkeiten		Intensität
168		P16403	Histon H1.2	HIST1H1C	1	KPAAATVTK(0,733)K(0,267)		1,98E+04
191		P16403	Histon H1.2	HIST1H1C	1	SAAK(1)AVKPK		6,91E+04
51		A8K2U0	Alpha-2-makroglobulinähnliches Protein 1	A2ML1	1	VCLDLSPGYSDVK(1)		3.18E+04
5; 5; 5		C9JMM0	Chromobox-Proteinhomolog 3	CBX3	1	ASNK(1)TTLQK		1.21E+05
10; 10; 10		C9JMM0	Chromobox-Proteinhomolog 3	CBX3	1	TTLQK(0.828)MGK(0.172)		2,49E+05
112; 141		O76095-2	Protein JTB	JTB	2	K(0,858)ALEK(0,18)VRK(0,962)		1,47E+04
350; 298; 298; 297; 285; 245; 253; 169; 48; 100; 95; 93; 79; 23; 93; 92; 79; 28; 74; 50; 73; 51; 57; 56; 48; 61; 66; 66; 73		P09651	Heterogenes nukleäres Ribonukleoprotein A1	HNRNPA1	1	SSGPYGGGGQYFAK(1)PR		6.13E+04

Tabelle 4: Repräsentative Ergebnisse für laktylierte Peptide, die für die TE11-Zelllinie des ösophagusen Plattenepithelkarzinoms gewonnen wurden. Diese Tabelle folgt der MaxQuant-Analyse.

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Immunpräzipitation von_{K-L-LA-modifizierten} Proteinen in MS verwendet werden kann, um neue laktylierte Proteine und deren Laktylationsstellen zu entdecken. Dieses Laktylom-Protokoll wird mit konjugierten Perlen durchgeführt, könnte aber je nach Forschungsfrage auch mit K_{L-LA-Antikörpern} oder sogar K_{D-LA-Antikörpern} erreicht werden. Wenn man einen Antikörper statt konjugierter Perlen verwendet, erleichtert die Wahl eines polyklonalen Antikörpers die Bildung enger Komplexe, da er an mehrere Epitope binden kann; allerdings kann dieser Ansatz Variabilität verursachen. Ein Vorteil der Verwendung konjugierter Perlen ist, dass sie verhindern, dass der Antikörper ausleckt – also aus dem festen Träger freisetzt – was die MS-Proben kontaminieren könnte. Es ist außerdem zeiteffizienter als die Verwendung eines unkonjugierten Antikörpers.

Außerdem ist es wichtig zu beachten, dass die Menge der identifizierten Peptide in dieser Art von Analyse von mehreren Faktoren^beeinflusst werden kann. Erstens spielt die Antikörperspezifität eine entscheidende Rolle dabei, sicherzustellen, dass das richtige Protein eingefangen wird. Das Hinzufügen eines Vor-Clearing-Schrittes mit Agaroseperlen könnte eine Möglichkeit sein, unspezifische Wechselwirkungen zu entfernen. Andererseits ist unbekannt, ob Laktylierung die Trypsinverdauung beeinflussen kann, da sie Peptide auf der c-terminalen Seite des Argininrests spaltet, aber vor allem das Lysinrest. Falls dies der Fall ist, könnte dies potenziell zu einer verminderten Peptidabdeckung führen. Daher ist es möglich, andere Optionen für Proteasen in Betracht zu ziehen. In diesem Protokoll wird der Parameter "Max. verpasste Spaltungen" erhöht, um diese Einschränkung zu berücksichtigen. Schließlich sollte auch die Probenvorbereitung und -handhabung, wie zum Beispiel die Verwendung von Handschuhen zur Verhinderung einer Kontamination von Proben mit Keratinen aus der Haut, oder die Stabilität der Modifikation, da PTM-Wechsel ein dynamischer und manchmal schneller Prozess^ist, ebenfalls berücksichtigt werden.

Im Gegensatz zum breiteren MS-Ansatz, der zu niedriger Erkennung von niedrig vorhandenem PTM führte, wie etwa Laktylierung, ermöglicht die Identifizierung angereicherter_{K-L-la-Peptide} mittels MS-basierter Proteomik eine detaillierte Analyse der PTM-Stellen, wie etwa die Identifikation neu charakterisierter Laktylationsstellen und laktylierter Proteine¹⁹. Western Blot kann Informationen über das allgemeine Laktylierungsmuster in Zellen liefern, kann jedoch keine Angaben zur proteinspezifischen Laktylierung geben. Daher ist IP der am häufigsten verwendete Ansatz zur Bestätigung von MS-detektiertem PTM²⁰. Der Proximity-Ligationsassay (PLA) ist eine weitere Technik, die verwendet werden kann, um die Laktylierung potenzieller Ziele zu bestätigen, die durch Proteomik²¹ identifiziert wurden. Diese Technik kann auch die Lokalisierung der modifizierten Proteine anzeigen, weist jedoch eine geringere Spezifität auf. Die Verwendung eines laktylierungsspezifischen IP-Ansatzes ist für ein breites PTM-Screening geeignet, aber es könnte je nach Forschungsfrage interessant sein, proteinspezifische IP durchzuführen.

Bei der Quantifizierung des Anteils eines spezifischen laktylierten Proteins in einem Gesamtproteinextrakt reicht die Durchführung eines IP allein nicht aus. Obwohl IP mit K_L-LA-Perlen den Einfang laktylierter Proteine ermöglicht, quantifiziert dies den Anteil der Laktylierung nicht genau, da sie sich auf die Anreicherung von Zielproteinen beschränkt. Daher ist Massenspektrometrie erforderlich, die eine detailliertere Analyse ermöglicht, die eine präzise quantitative Messung der Laktylierung ermöglicht. Daher könnte die Durchführung von IP eines potenziell laktylierten Proteins mit einem Antikörper gegen dieses Protein, gefolgt von Massenspektrometrie, den Prozentsatz laktylierter Proteine in einer Gesamtproteinprobe bestimmen, während die Durchführung von IP ein effizienter Ansatz ist, um die Laktylierung der durch MS als laktylierten identifizierten Proteine zu bestätigen.

In einem IP mit nicht-konjugierten Antikörpern ist die Optimierung des Perlen-zu-Antikörper-Verhältnisses unerlässlich, um eine optimale Aufnahme laktylierter Proteine sicherzustellen. Tatsächlich beeinflusst das Gleichgewicht zwischen diesen beiden Komponenten direkt die Spezifität und Effizienz des IP. Ein Überschuss an Antikörpern kann zu einer unspezifischen Bindung führen, was das Hintergrundrauschen erhöht und die Gesamtgenauigkeit der Erkennung verringert. Im Gegensatz dazu kann das Gegenteil zu einer ineffizienten Zielproteinanreicherung führen, was zu schwächeren Signalen und geringerer Empfindlichkeit führt. Diese technischen Überlegungen sind entscheidend, um zuverlässige und präzise Ergebnisse bei der Untersuchung laktylierter Proteine zu erzielen.

Abschließend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um Veränderungen der Laktylationsprofile nach der Deregulation der Homöostase, wie etwa Krebs ^8,10, zu überwachen, die die medikamentenbezogene Reaktion beeinflussen könnten. Die Identifizierung von Biomarkern könnte sogar mit diesem Verfahren erreicht werden. Anwendbar auf mehrere Zelllinien, Gewebetypen und sogar Patientenbiopsien, birgt diese Technik das Potenzial, das Verständnis der PTM-gesteuerten Zellsignalübertragung bei Krankheiten oder normalen Bedingungen zu vertiefen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
100 uL Zip Tip C18	Pierce	87784
Acclaim PepMap100 C18	Dionex Corporation	164946	0,3 mm I.D. x 5 mm
Acetonitril (MS-Qualität)	Fisher	A955-4
Ammoniumbicarbonat	Sigma-Aldrich	A6141-500
Anti-HNRNPA1 monoklonaler Antikörper	Novus Biologicals	NB100-672
Anti-L-Lactyllysin (KL-La) monoklonaler Antikörper	PTM-Bio	PTM1401RM
Anti-Maus-IgG, HRP-gebundener Antikörper	CST	7076S
Anti-Kaninchen-IgG, HRP-gebundener Antikörper	CST	7074S
Azure 280	Biosysteme	AZI280-01
BCA-Trikot	Thermo Fisher Scientific	P123227
Bovin Serum Albumin (BSA)	Wisent	800-095-EG
Captive Spray nanoESI-Quelle	Bruker Daltonics
Chloracetamid	Sigma-Aldrich	C0267
Clarity Max Western ECL Substrat	Bio-Rad	1705062
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher Scientific	R0861
Dynabeads Protein-G-Perlen für Immunpräzipitation	Thermo Fisher Scientific	10004D
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
Ameisensäure (FA; MS-Grad)	Thermo Fisher Scientific	A117-50
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
HEPES (1M)	Wisent	330-050-EL
Hypersep C18 100mg Säule	Fisher	60108-302
KL-LA Agarose konjugierte Perlen	PTM-Bio	PTM-1404
Laemmli 2X (SDS, Bromophenol)	Wisent, J.T. Baker	800-100-CG, D293-01
Mikroröhre mit niedriger Bindung 0,5 mL	Sarstedt	72.704.600
Niedrigbindende Mikroröhre 1,5 mL	Thermo Fisher Scientific	P190410
Mikroröhre 1,7 mL	Axygen	MCT-175-C
NanoElute HPLC-System	Bruker Daltonics		1,9 μm Partikelgröße, 75 μm I.D. x 25 cm
Normaler Rabbit IgG polyklonaler Antikörper	Millipore Sigma	12-370
PepSep	Bruker Daltonics	1811112
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Wisent	311-425-CL
PMSF	Thermo Fisher Scientific	36978
Proteaseinhibitor-Cocktail (PIC)	Sigma-Aldrich	P8340-5
Sera-Mag SpeedBeads Protein A/G Magnetpartikel	Thermo Fisher Scientific	09-981-920
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S9888-500
Natriumfluorid	Sigma-Aldrich	S1504
Natriumorthovanadat	Sigma-Aldrich	S6508
TimsTOF pro Massenspektrometer	Bruker Daltonics
Trifluoressigsäure (TFA)	Thermo Fisher Scientific	A116-50
Tris-HCl	Wisent	600-125-IK
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trypsin (MS-Grad)	Pierce	90058
Harnstoff	Thermo Fisher Scientific	U15-500
Vaccufuge plus	Eppendorf	22820168
Wasser (MS-Qualität)	VWR	10803-890A
Β-Glycerophosphat	Sigma-Aldrich	G5422
β-Mercapptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148