Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Zusammenfassung

Dieses Video zeigt Techniken für die Kennzeichnung von menschlichen embryonalen Stammzellen und mesenchymalen Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen. Diese Technik kann für eine in vivo Verfolgung der transplantierten Stammzellen mit optischen Bildgebung und zur histopathologischen Korrelation mit Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden.

Zusammenfassung

Optical Imaging (OI) ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Werkzeug zur In-vivo-Überwachung der neuen Stammzell-basierten Therapien. Die Technik basiert auf ex vivo-Markierung von Stammzellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff, anschließende intravenöse Injektion der markierten Zellen und Visualisierung ihrer Anreicherung in bestimmten Zielorganen oder Pathologien basiert. Die vorgestellte Technik zeigt, wie wir von humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) Etikett durch einfache Inkubation mit dem lipophilen Fluoreszenzfarbstoff DiD (C67H103CIN2O3S) und wie wir humanen embryonalen Stammzellen (hES) Etikett mit der FDA zugelassen Fluoreszenzfarbstoff Indocyaningrün (ICG). Die Aufnahme-Mechanismus erfolgt über die Einhaltung und Verbreitung der lipophilen Farbstoff in die Phospholipid-Doppelschicht der Zellmembran. Die Kennzeichnung Effizienz ist in der Regel verbessert werden, wenn die Zellen mit dem Farbstoff in serum-freien Medien als der Inkubation in Serum-haltigen Medien Gegensatz bebrütet werden. Darüber hinaus ist der Zusatz des Transfektionsagens Protaminsulfat deutlich verbessert Kontrastmittelaufnahme.

Protokoll

Kennzeichnung von mesenchymalen Stammzellen mit dem fluoreszierenden Farbstoff DiD

1. Zu Beginn des Verfahrens zur Kennzeichnung mesenchymale Stammzellen, trypsinize und zählen Sie die Zellen, um eine Suspension mit einer definierten Anzahl von Zellen erhalten.
2. Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und saugen aus alten Medien von den Flaschen mit den Zellen markiert werden
3. Waschen Sie die Zellen mit 10 ml Mg / Ca-freiem PBS. Saugen Sie die PBS. Die Mg-und Ca würde hemmen die Trypsin, deshalb verwenden wir PBS ohne diese.
4. Add vorgewärmten 0,05% Trypsin, für eine T75-Kolben verwenden wir 5ml. Stellen Sie sicher, dass die gesamte O....

Diskussion

OI ist ein relativ neues bildgebendes Verfahren, basierend auf der Detektion von Fluoreszenz. OI ist so sensibel wie Radiotracer-basierten Imaging-Techniken, aber nicht mit einer Bestrahlung Exposition verbunden. OI stellt ein wirksames Mittel zur Verfolgung Zellen nicht-invasiv und wiederholt damit einen Einblick in die Zellwanderung an den Zielort. Eine wichtige Einschränkung der Technik ist die begrenzte Eindringen in das Gewebe von fluoreszierenden Sonden in vivo. So ein Tracer Akkumulation im tiefen Gewebe, mehr als etwa 5-10 cm von de.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Indocyanin-Grün (IR-125)	Reagenz	Fisher Scientific	AC41254-1000
DMSO	Reagenz	Sigma-Aldrich	D-2650
D-MEM, hoher Glukosegehalt	Reagenz	Sigma-Aldrich	D5648
Gelatine	Reagenz	Sigma-Aldrich	G1890	Mit PBS auf eine Endkonzentration von 0,1 % verdünnen
PBS, ohne Mg und Ca	Reagenz	GIBCO, von Life Technologies	14190-144
Trypsin-EDTA 0,05 %	Reagenz	Invitrogen	25300-120
Trypsin-EDTA 0,25 %	Reagenz	Invitrogen	25200-114
FCS, charakterisiert	Reagenz	Hyclone	SH30071.03
Zellsieb (40 μm Nylon)	Reagenz	BD Biosciences	352340
DiD	Reagenz	Molecular Probes, Life Technologies	V-22887
Knockout-DMEM	Reagenz	GIBCO, von Life Technologies	10829018
Knockout-Serumersatz	Reagenz	GIBCO, von Life Technologies	10828028
b-Mercapt–ethanol	Reagenz	Sigma-Aldrich	7522
Nicht-essentielle Aminosäuren	Reagenz	GIBCO, von Life Technologies	11140050
FGF-2	Reagenz	R&D Systems	233-FB-025
Glutamin 200 mM	Reagenz	GIBCO, von Life Technologies	25030081
Penicillin/Streptomycin	Reagenz	GIBCO, von Life Technologies	15140-122
Protaminsulfat	Reagenz	American Pharmaceutical Partners