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Methodenartikel

Etablierung eines Aufzuchtsystems für Chilithripse (Scirtothrips dorsalis Hood) zum Virulenzscreening von entomopathogenen Pilzen

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DOI:

10.3791/68600

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18. Juli 2025

 ,  ,  , 
1Master Program in Plant Medicine and Good Agricultural Practice, National Chung Hsing University, 2Department of Entomology, National Chung Hsing University, 3Applied Zoology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, 4International Doctoral Program in Agriculture, National Chung Hsing University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Für die Massenaufzucht von Chilithripsen mit einer modifizierten Methode mit abgelösten Blättern in agarhaltigen Glasbehältern wurde ein Bioassay-Protokoll für abgelöste Blätter etabliert, das ein hohes Überleben und eine synchronisierte Entwicklung gewährleistet. Dieses System ermöglicht ein effizientes Screening der Virulenz entomopathogener Pilze gegen Larven des 2. Stadiums und bietet eine zuverlässige Thripsversorgung für Labor-, Gewächshaus- und Feldbewertungen.

Zusammenfassung

Der Chilithrips (Scirtothrips dorsalis Hood) ist ein wirtschaftlich bedeutender Schädling von Zier- und Nahrungspflanzen in Taiwan. Entomopathogene Pilze (EPF) sind ein umweltfreundliches biologisches Bekämpfungsmittel zur Bekämpfung von Thripsen. Es ist entscheidend, die Virulenz von EPF-Isolaten vor der Feldanwendung unter Laborbedingungen gegen Chilithripse zu screenen. Begrenzte Daten über die Aufzuchtmethode von Chilithripsen stellen jedoch eine Herausforderung für groß angelegte Laborscreenings dar. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine modifizierte Laboraufzuchtmethode für die Massenproduktion von S. dorsalis entwickelt.

Bei der Methode wird ein Aufzuchtsystem mit abgelösten Blättern verwendet, bei dem ein agarhaltiger Glasbehälter verwendet wird, der für die Bewertung von EPF gegen Chilithripse geeignet ist. Dieses optimierte Bioassay-System für abgetrennte Blätter eignet sich zur Beurteilung der Wirksamkeit von EPF gegen Chilithripse. Das System ist in der Lage, eine große Anzahl von Thripsen im gleichen Entwicklungsstadium für das Virulenz-Screening zu produzieren. Dem Test zufolge zeigte das Ergebnis, dass Cordyceps cateniannulata (Cc-NCHU-213)-Isolat 7 Tage nach der Inokulation (d.p.i.) die höchste Virulenz (53,6%) gegenüber Larven von Chilithripsen im 2. Stadium aufwies. Darüber hinaus blieben die in Agar eingebetteten Blattscheiben über 7 Tage lang frisch, so dass die Thripse während des gesamten Beobachtungszeitraums überleben konnten (90 % Überlebensrate der Kontrollbehandlung), was auf die Stabilität des Aufzuchtsystems hinweist. Dieses Protokoll zeigt ein stabiles Aufzuchtsystem für die Massenproduktion und für die Bewertung der Virulenz von EPF-Isolaten gegen Chilithripse, das für andere Thripse nützlich sein kann und ein Screening nach potenziellen EPF-Isolaten zur Bekämpfung von Thripsen im Feld ermöglicht.

Einleitung

Die Chilithripse (Scirtothrips dorsalis Hood; Thysanoptera: Thripidae) ist ein polyphager Schädling, der über 100 Pflanzenarten in 40 verschiedenen Pflanzenfamilien befällt, darunter Gemüse sowie Zier- und Obstkulturen1. Sie ist im tropischen und subtropischen Asien-Südostasien, Indien, Japan und Taiwan beheimatet2. Unseres Wissens nach ist der Chili-Thrips der Schädling von Acker- und Zierpflanzen, einschließlich Mango, Tee, Heidelbeere und Lotus in Taiwan. In den letzten zwei Jahrzehnten ist der Chilithrips in mehreren Ländern aufgrund der zunehmenden Globalisierung und des offenen Agrarhandels zu einem bedeutenden Wirtschaftsschädling geworden. Darüber hinaus trugen das hohe Fortpflanzungspotenzial und die Anpassungsfähigkeit an neu befallene Gebiete zur Ausbreitung dieses Schädlings bei 1,3.

Der Chilithrips ernährt sich hauptsächlich von jungem Laub, Trieben, Blütenblättern und unreifen Früchten, was zu Nekrose und Absterben des Gewebes führt3. Darüber hinaus dienen sie als Vektor für verschiedene Pflanzenkrankheiten, darunter das Erdnussknospen-Nekrosevirus (GBNV), das Erdnuss-Chlorotik-Fan-Spot-Virus (GCFSV), das Erdnuss-Gelbfleckenvirus (GYSV)4 und das Tabak-Streak-Virus (TSV)5. Infolgedessen kann die Fütterung durch Chilithripse den Ertrag und den Wert der betroffenen Pflanzen erheblich reduzieren. Eine erfolgreiche Bekämpfung von Chilithripsen beruht auf einem integrierten Schädlingsbekämpfungsplan, der kulturelle, biologische und chemische Bekämpfungsstrategien anwendet1. In Taiwan verwenden Biobauern häufig nicht-chemische Materialien wie Öl und Neemöl oder biologische Bekämpfungsmethoden, einschließlich des Einsatzes von Raubmilben und winzigen Piratenkäfern (nach persönlicher Beobachtung). Basierend auf den Rückmeldungen der Landwirte kann die Anwendung dieser Öle während der Blüte- und Fruchtsaison jedoch die Bestäubung beeinträchtigen und die Pollen schädigen, was zu einer Verringerung des Ertrags und des wirtschaftlichen Wertes führt. Daher ist die Entwicklung wirksamer alternativer Bekämpfungsmaßnahmen für Chilithripse für Biolandwirte von entscheidender Bedeutung.

Entomopathogene Pilze (EPF) sind eine Gruppe von insektentötenden Pilzen, die sich als wirksame und nachhaltige Schädlingsbekämpfungstechnik erwiesenhaben 6,7,8. Mehrere Studien haben die Wirksamkeit von EPF gegen Chilithripse gezeigt. Kommerzielle EPFs, Beauveria bassiana GHA (BotaniGard_ES) und Metarhizium brunneum F52 (Met-52 EC), haben eine signifikante Kontrolle von Chilithripsen an Rosenpflanzen gezeigt 9,10. Auch die Populationen von Chilithripsen an Paprikapflanzen können durch Cordyceps javanica (= Isaria fumosorosea)11 reduziert werden. Andere EPFs, wie Lecanicillium lecanii und Purpureocillium lilacinum, wurden gegen Chilithripse in verschiedenen Kulturen, einschließlich Chilipflanzen und Tee, getestet und waren wirksam bei der Bekämpfung dieses Schädlings12,13.

Einige frühere Studien, die die Wirksamkeit von EPFs zur Thripsbekämpfung in Gewächshäusern oder im Feld untersuchten, wurden ohne vorheriges Screening auf die wirksamsten EPF-Arten/-Stämme durchgeführt, was deren Wirksamkeit einschränkte. Ein sorgfältiges Screening von EPFs kann die Schädlingsbekämpfung erheblich verbessern. In vielen Studien wurden Thripse für Bioassays an intakten Pflanzen in Käfigen gezüchtet11,14. Während ein intaktes Pflanzenzuchtsystem eine natürlichere Umgebung für Thripse bietet, stellen sie eine Herausforderung bei der Bewältigung verschiedener Entwicklungsstadien dar, da Thripse in jeder Phase unterschiedliche Verhaltensweisen zeigen. Diese Variabilität kann die Auswahl der Zielstufen für bestimmte experimentelle Zwecke erschweren. Darüber hinaus können die Bodenbedingungen innerhalb des intakten Pflanzenzuchtsystems die Verpuppung und Ausscheidung von Chilithripsen beeinflussen, wodurch die Anzahl der für nachfolgende Biotests verfügbaren Individuenverringert wird 15, wodurch die Ressourcen für weitere Biotests begrenzt werden. Darüber hinaus benötigen Ganzpflanzenaufzuchtsysteme mehr Platz und kontinuierliche Pflege der Pflanzen, da gestresste Pflanzen das Verhalten von Thripsen verändern können und zeit- und ressourcenintensiver sein können. Es gibt nur wenige Berichte über Thripsezuchtsysteme, die auf nicht lebendem Pflanzenmaterial (z. B. abgelöstem Pflanzengewebe oder künstlicher Nahrung) für Labor-Bioassay-Experimente basieren, aber die Details dieser Methoden waren oft unklar oder wurden weggelassen12,16.

Ziel dieser Studie war es, ein einfaches, kostengünstiges und nachhaltiges Massenaufzuchtsystem für Chilithripse unter Laborbedingungen zu entwickeln. In diesem Protokoll wurde eine Blattscheibenaufzuchtmethode7 modifiziert, um einen effizienteren und kontrollierteren Ansatz für die Massenaufzucht von Thripsen zu bieten, der eine präzise Auswahl der Entwicklungsstadien für Bioassays durch eine strenge Kontrolle der Umweltbedingungen ermöglicht. Darüber hinaus wurde ein stabiles und reproduzierbares Bioassay-System entwickelt, um die Virulenz von entomopathogenen Pilzisolaten (EPF) anhand von 50 % letaler Zeit (LT50) und 50 % medianer letaler Konzentration (LC50) zu bewerten, die sich auf die geschätzte Zeit unter einer bestimmten Dosierung beziehen, und die Konzentration der Pilzsuspension, die erforderlich ist, um eine 50%ige Mortalität von Chilithripsen zu verursachen. beziehungsweise. Durch die Anwendung dieser Methode können die im Feld gesammelten Thripse korrekt identifiziert werden, und die stabilen Laborkolonien von Thripsen können aufrechterhalten werden, um die Wirksamkeit verschiedener Pilzisolate mit einer einfacheren und reproduzierbareren Methodik zu testen.

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Protokoll

HINWEIS: Das vollständige experimentelle Flussdiagramm ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Sammlung von Chilithripsfeldern und Erhaltung der Kolonie

  1. Sammlung von Chili-Thripsen
    1. Untersuchen Sie beide Seiten der Blätter und innerhalb der Blüten visuell auf einen Befall mit Chilithripsen an Heidelbeerpflanzen in einer betroffenen Heidelbeerfarm.
    2. Notieren Sie die Details jeder Probe (z. B. Teil der Pflanze und Schwere des Befalls) und bestätigen Sie mit den Landwirten die Produktionspraktiken, wie z. B. konventionelle Landwirtschaft oder ökologische Landwirtschaft, einschließlich der Anwendung von Mineralöl und natürlichen Feinden.
    3. Schneiden Sie die von Chilithripsen befallenen Blätter und Blüten ab und geben Sie sie in den Plastikbeutel mit Reißverschluss (Tabelle der Materialien), dann verschließen Sie den Reißverschlussbeutel mit etwas Luft im Inneren, um die Thripse am Leben zu erhalten. Bringen Sie die Probe innerhalb von 3 h ins Labor.
      HINWEIS: Geben Sie die Probe in einen Kühler, wenn die Zeit der Feldentnahme mehr als 3 Stunden beträgt.
    4. Bereiten Sie einen Glasaufzuchtbehälter (35 mm Höhe, 45 mm Innendurchmesser) vor, legen Sie drei Lagen kreisförmiges Papiertuch (Durchmesser 40 mm) auf den Boden des Glasaufzuchtbehälters und fügen Sie dann 8-10 Tropfen (400-500 μL) gefiltertes Wasser hinzu (Abbildung 1 und Materialtabelle).
    5. Sammeln Sie ein junges, rotes Mangoblatt von den Mangofeldern (Abbildung 1). Waschen Sie das Blatt und prüfen Sie es unter einem Lichtmikroskop (Materialtabelle) auf Insekteneier oder andere Insektenbefall, bevor Sie den Aufzuchtbehälter aus Glas vorbereiten. Schneiden Sie das Mangoblatt mit einem Lederschneider (Materialtabelle) in eine kreisförmige Scheibe (40 mm) und legen Sie sie auf das nasse Papiertuch.
      HINWEIS: Mangoblätter sind eine stabilere Ressource für die Fütterung von Thripsen als junge Heidelbeerblätter, die nur saisonal wachsen.
    6. Beobachten Sie die Chilithripse unter einem Lichtmikroskop bei 10-facher Vergrößerung und übertragen Sie 10 erwachsene Thripse (fünf Männchen und fünf Weibchen) mit einem feinen Malpinsel (Materialtabelle) in den Glasaufzuchtbehälter.
    7. Verschließen Sie jeden Glasaufzuchtbehälter mit zwei Schichten Parafilm (Materialtabelle) und bohren Sie etwa 40 kleine Löcher mit einem Insektenstift #00 zur Belüftung (Materialtabelle).
    8. Bewahren Sie den Aufzuchtbehälter aus Glas in einem Inkubator bei 25 ± 1 °C, ~70 % relativer Luftfeuchtigkeit und einer Photoperiode von Hell:Dunkel (L:T) = 12 h: 12 h auf (Materialtabelle).
    9. Die Erwachsenen nach 48 h mit einem Pinsel entfernen.
      HINWEIS: Basierend auf unseren Beobachtungen legen die weiblichen Thripse ~2 Tage nach dem Umsetzen in den Glasaufzuchtbehälter Eier.
    10. Beobachten Sie das Blattgewebe mit den Eiern unter einem Stereomikroskop, um die Eiablage weiter zu bestätigen (Abbildung 1 und Materialtabelle). Legen Sie eine frische Mangoblattscheibe auf das Blatt mit den Eiern und geben Sie 8-10 Tropfen gefiltertes Wasser auf das Papiertuch, um die Feuchtigkeit zu erhalten.
  2. Erhaltung der Chili-Thrips-Population
    HINWEIS: Aus den Eiern schlüpfen nach ~5-7 Tagen 1 Larve des Stadiums.
    1. Setzen Sie das Blatt mit 1Larve im Stadium direkt in einen neuen Aufzuchtbehälter aus Glas um.
      HINWEIS: Setzen Sie 1Larve des Stadiums vorsichtig mit einem Pinsel in einen neuen Aufzuchtbehälter aus Glas um, um eine Kontamination durch faulen und unerwarteten Pilzbefall auf den Mangoblättern zu vermeiden. Basierend auf unseren Beobachtungen legt ein erwachsenes Weibchen durchschnittlich 6 Eier pro Tag.
    2. Beobachte die Chilithripse täglich. Geben Sie alle 4 Tage 8-10 Tropfen gefiltertes Wasser auf das Papiertuch. Geben Sie alle 4 Tage eine frische Mangoblattscheibe in den Behälter, bevor das alte Blatt austrocknet.
      HINWEIS: 1Larve des Stadiums schlüpfen in ~7-10 Tagen, abhängig von den Umweltfaktoren wie Temperatur und Luftfeuchtigkeit.
    3. Beobachten Sie die Chilithripspopulation täglich, bis sich die Thripse zu erwachsenen Thripsen entwickeln, und wiederholen Sie die Schritte aus Schritt 1.1.4 für eine langfristige Populationserhaltung.
  3. Massenaufzucht von Chilithripsen
    1. Sammeln Sie weibliche adulte Tiere aus der gehaltenen Population und bereiten Sie basierend auf den obigen Schritten einen Aufzuchtbehälter aus Glas vor.
    2. Setzen Sie 10 weibliche Erwachsene in den Behälter um und befolgen Sie die Schritte aus den Schritten 1.1.4 bis 1.1.10, um ein Blatt mit Eiern zu erhalten.
      HINWEIS: Ein erwachsenes Weibchen legt durchschnittlich 6 Eier pro Tag.
    3. Setzen Sie ~120 Larven des 1. Stadiums vorsichtig mit einem Pinsel in einen neuen Aufzuchtbehälter aus Glas um.
    4. Beobachte die Chilithripse täglich. Geben Sie alle 4 Tage 8-10 Tropfen gefiltertes Wasser auf das Papiertuch. Geben Sie alle 4 Tage eine frische Mangoblattscheibe in den Behälter, bevor das alte Blatt austrocknet.
    5. Sammeln Sie 1Larve im Stadium 5-7 Tage nach der Eiablage; Sammeln Sie die Larven des 2. Stadiums nach 7-10 Tagen; adulte Tiere nach ~14 Tagen für den Bioassay sammeln (Abbildung 2).
      HINWEIS: Beobachten Sie die Morphologie, um die verschiedenen Stadien von Chilithripsen für weitere Experimente zu unterscheiden (Abbildung 2).

2. Molekulare Identifizierung von Chili-Thripsen

HINWEIS: Thripse, die im Feld gesammelt werden, müssen auf Artebene durch molekulare Identifizierung anhand eines Fragments des mitochondrialen Cytochromoxidase I (COI)-Gens identifiziert werden, einem häufig verwendeten Marker für Chilithripse17,18.

  1. Extraktion von genomischer DNA von Chilithripsen
    1. Sammeln Sie einen erwachsenen Chilithrips in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen (Materialtabelle).
    2. Homogenisieren Sie die Chilithripse mit einem Pelletstößel und isolieren Sie dann die genomische DNA mit dem handelsüblichen Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers (Table of Materials).
  2. PCR-Amplifikation und DNA-Sequenzierung
    1. Amplifizieren Sie das erwartete DNA-Fragment der Chilithripse unter Verwendung eines PCR-Mastermixes (2x) mit einem COI-Primerpaar, dem Forward-Primer LCO 1490 und dem Reverse-Primer HCO 2198, der das partielle mitochondriale COI-Gen amplifiziert (Table of Materials).
      1. Bereiten Sie eine 20-μl-PCR-Mischung vor, die 2 μl genomisches Thrip-DNA-Template, je 1 μl Forward- und Reverse-Primer, 10 μl 2x PCR-Mastermix und 6 μl ddH2O enthält (Materialtabelle).
      2. Führen Sie die PCR mit einem Thermocycler unter den folgenden Zyklusbedingungen durch: anfängliche Denaturierung bei 94 °C für 2 Minuten, 35 Zyklen von 94 °C für 30 s, 52 °C für 1 min, 72 °C für 1 min, gefolgt von einer abschließenden Verlängerung von 72 °C für 10 Minuten (Tabelle der Materialien).
    2. Überprüfen Sie das PCR-Amplikon durch Elektrophorese in einem 1%igen Agarosegel, um das Ergebnis der Amplifikation zu verifizieren (Abbildung 3).
    3. Exzidieren Sie die Zielbande (die erwartete Amplikongröße betrug 658 bp) und reinigen Sie das COI-PCR-Amplikon der Chilithripse mit einem Gel/PCR-Aufreinigungskit gemäß dem Protokoll des Herstellers. Senden Sie das gereinigte Produkt zur Sequenzierung über einen kommerziellen Sequenzierungsdienst. (Tabelle der Materialien).
  3. Sequenz-Analyse
    1. Beurteilen Sie die Qualität der Sequenz mit der referenzierten Software (Table of Materials).
    2. Öffnen Sie die FASTA- oder TXT-Datei und trimmen Sie die Basen mit geringer Qualität sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende manuell, indem Sie die unerwünschten Sequenzen löschen.
    3. Führen Sie eine BLAST-Suche in der NCBI-Datenbank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) mit Standardparametern durch, um die Artidentität zu bestätigen.

3. Vorbereitung von entomopathogenen Pilzen

HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten EPF-Isolate sind in Tabelle 1 aufgeführt.

  1. Rückgewinnung von Pilzisolaten aus der Pilzressourcenbibliothek
    1. Tauen Sie die konservierte Pilzkonidienbrühe (Konidien in 30 % Glycerin suspendiert) aus einem -80 °C Gefrierschrank auf.
    2. Übertragen Sie ca. 10 μl der Konidiensuspension und verteilen Sie sie gleichmäßig auf einer 5,5 cm 1/4 Sabouraud Dextrose-Agar (SDA)-Platte mit einem Zellspreizer in einer Laminar-Flow-Haube. Das Medium wird durch Mischen von 0,75 g Sabouraud-Dextrosebrühe und 1,5 g Agar in 100 ml doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) hergestellt (Materialtabelle).
    3. Verschließen Sie die Petrischale mit Parafilm (Table of Materials) und stellen Sie die Platte für 10-14 Tage bei 25 °C in den Dunkelinkubator.
    4. Subkultivieren Sie das aktiv wachsende Pilzmyzel, indem Sie es auf eine frische 1/4 Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA)-Platte streichen. Inkubieren Sie die Pilze 10-14 Tage lang bei 25 °C in der Dunkelheit, damit sich die Konidien vor der Ernte entwickeln können.
      HINWEIS: Verwenden Sie Pilzkulturen, die etwa 10 Tage alt sind, für nachfolgende Bioassays. Kulturen, die älter als 14 Tage sind, werden für Virulenztests nicht empfohlen, da die Konidialviabilität möglicherweise verringert wird.
  2. Herstellung der Konidiensuspension
    1. Geben Sie 2-3 ml 0,03 % Tween 80 auf die Oberfläche einer 10-14 Tage alten Pilzkultur auf 1/4 SDA. Kratzen Sie die Konidien vorsichtig mit einer sterilen Schlaufe ab (Materialtabelle).
    2. Übertragen Sie die Pilzsuspension in ein sauberes 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
    3. Homogenisieren Sie die Suspension durch Vortexen bei maximaler Geschwindigkeit und filtrieren Sie sie durch Filterpapier, um Hyphenrückstände zu entfernen und eine reine Konidiensuspension zu erhalten.
    4. Verwenden Sie ein Hämozytometer (Materialtabelle), um die Anzahl der Konidien unter einem Lichtmikroskop zu überprüfen, und verdünnen Sie die Suspension auf 108 Konidien/ml.
    5. Die konidische Suspension wird für die anschließende Bioassay-Anwendung in ein mit UV-Licht sterilisiertes Mikrosprühgerät überführt.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Konidiensuspension vor jedem Transfer gründlich vortext wird, um ein Absetzen zu vermeiden. Sterilisieren Sie das Mikrosprühgerät vor dem Gebrauch, indem Sie es 30 Minuten lang in einer Laminar-Flow-Haube ultravioletter Strahlung aussetzen.

4. Virulenzscreening gegen Chilithripse

  1. Vorbereitung der Larven des 2. Stadiums
    1. Sammeln Sie die Larven des 2. Stadiums, indem Sie die Schritte 1.3.1 bis 1.3.5 für das folgende Experiment befolgen.
      HINWEIS: Unterscheiden Sie die Larven des 2. Stadiums anhand ihrer gelben Körperfarbe und ihres breiten Hinterleibs im Vergleich zu den Larven des ersten Stadiums (Abbildung 2).
  2. Vorbereitung des Impfbehälters
    HINWEIS: Wählen Sie die Blattart basierend auf der Zielernte von Chilithripsen aus. In dieser Studie wurden Chilithripse aus dem Feld von befallenen Heidelbeerblättern 'Biloxi' (V. corymbosum L. × V. darrowii Camp) gesammelt. Daher wird der Bioassay von EPF gegen Chilithripse an Heidelbeerblättern durchgeführt.
    1. Sammle junge Blaubeerblätter von einer Blaubeerfarm und wasche die Heidelbeerblätter, um Oberflächenstaub und andere Gliederfüßer, falls vorhanden, zu entfernen.
    2. Trocknen Sie die Blätter an der Luft oder wischen Sie das Wasser mit Papiertüchern ab. Überprüfen Sie dann die Oberfläche der Heidelbeerblätter unter einem Stereomikroskop auf andere Gliederfüßer oder Eier. Entferne alle Gliederfüßer, falls vorhanden.
    3. Schneiden Sie eine Blattscheibe mit einem Durchmesser von 2,8 cm mit einem Lederschneider ab (Materialtabelle), desinfizieren Sie das Blatt mit 1%igem Bleichmittel (Natriumhypochloritlösung) und spülen Sie es 2x mit sterilisiertem Wasser ab, um Bleichmittelrückstände auf den Blättern zu entfernen.
      HINWEIS: Bereiten Sie die Blattscheibe vor der Agarverfestigung vor, um sicherzustellen, dass die Blattscheibe richtig in den Wasseragar eingebettet werden kann.
    4. Autoklavieren Sie eine 2,5%ige Wasser-Agar-Lösung (2,5 g Agar pro 100 mL ddH2O) zur Sterilisation.
    5. Gießen Sie 3 ml 2,5 % Wasseragar in kleine Glasbehälter (35 mm Höhe, 30 mm Innendurchmesser) in einer Laminar-Flow-Haube, bevor der Agar erstarrt. Lassen Sie den Agar auf ca. 40 °C abkühlen, bis er einen halbfesten Zustand erreicht.
    6. Legen Sie die Blattscheibe vorsichtig (mit der axialen Seite nach oben) auf den Agar und betten Sie sie leicht mit minimaler Exposition über der Agaroberfläche ein. Sobald der Wasseragar vollständig erstarrt ist, sind die Glasbehälter bereit für den Bioassay.
  3. EPF-Inokulation und -Beobachtung
    1. Vor dem Auftragen die Konidialsuspension gründlich vortexen. Mit einem Mikrosprühgerät 0,1 ml der Suspension (hergestellt in Schritt 3.2.4) gleichmäßig aus einem Abstand von ca. 10 cm innerhalb des Glasbehälters auf die Oberfläche jeder Blattscheibe auftragen.
      HINWEIS: Testen Sie die Sprühbereiche vor dem Experiment. Stellen Sie sicher, dass das Sprühen die gesamte Blattscheibe gleichmäßig mit einer dünnen Schicht bedeckt. Wenn sich Tröpfchen in stehendem Wasser auf dem Blatt ansammeln, reduzieren Sie das Impfvolumen, um eine Übernässung zu vermeiden.
    2. Trocknen Sie die Konidiensuspension auf dem Blatt 30 Minuten lang unter sterilen Bedingungen (z. B. in einer Laminar-Flow-Haube) an der Luft.
    3. Übertragen Sie 10 Larven des 2. Stadiums mit einem feinen Pinsel in jeden Behälter und verschließen Sie jeden Glasaufzuchtbehälter mit zwei Schichten Parafilm.
    4. Machen Sie ~30 kleine Löcher, indem Sie einen Insektenstift #00 (Materialtabelle) zur Belüftung verwenden.
    5. Beimpfen Sie den Behälter bei 25 ± °C Inkubator mit ~70% relativer Luftfeuchtigkeit und einer Photoperiode von L:D = 12 h: 12 h.
    6. Beobachten und notieren Sie die Sterblichkeit von Chilithripsen unter einem Stereomikroskop bei 10-facher Vergrößerung täglich für 7 Tage.
    7. Bewahren Sie die toten Larven in dem Glasbehälter auf, um die Mykose zu beobachten und die EPF-Infektion zu bestätigen.

5. Bioassay ausgewählter EPF-Isolate

HINWEIS: Für einen dosisabhängigen Bioassay gegen Chilithripse können entweder das virulenteste EPF-Isolat oder mehrere Isolate mit hoher Virulenz ausgewählt werden. Drei verschiedene Konidienkonzentrationen, die von 106 bis 108 Konidien/ml reichten, wurden verwendet, um die Beziehung zwischen Dosis und Pathogenität zu beurteilen.

  1. Herstellung der Konidiensuspension
    1. Stellen Sie das ausgewählte EPF-Isolat nach Schritt 3.1 wieder her.
    2. Bereiten Sie drei Konzentrationen von Konidiensuspensionen (10,6, 10,7 und 108 Konidien/ml) vor, wie in Schritt 3.2 beschrieben.
  2. Vorbereitung der Larven des 2. Stadiums
    1. Sammeln Sie die Larven des zweiten Stadiums, indem Sie Schritt 4.1 befolgen, um neu geschlüpfte adulte Tiere zu erhalten.
  3. Vorbereitung des Impfbehälters
    1. Folgen Sie Schritt 4.2. Zur Vorbereitung des Impfbehälters mit Heidelbeerblattscheiben, die in Wasser-Agar eingebettet sind.
  4. EPF-Inokulation und -Beobachtung
    1. Die EPF-Inokulation mit drei Konzentrationen Konidiensuspension durchführen, wie in Schritt 4.3 beschrieben.

6. Statistische Analyse

  1. Berechnung der Mortalität
    1. Transformieren Sie die Mortalitätsdaten jedes Pilzstamms durch Arcsin-Transformation, bevor Sie eine unidirektionale Varianzanalyse (ANOVA) durchführen, um die Unterschiede zwischen den Pilzbehandlungen zu bewerten (Signifikanzniveau festgelegt als p < 0,05).
    2. Führen Sie Post-hoc-Vergleiche der Behandlungsmittelwerte mit dem Tukey-Test (Honest Significant Difference, HSD) durch.
  2. Berechnung der medianen letalen Zeit (LT50) und der medianen letalen Konzentration (LC50)
    1. Berechnen Sie die Werte für die mediane letale Zeit (LT50) und die mediane letale Konzentration (LC50) mit Hilfe der Probit-Regressionsanalyse.
    2. Erstellen und füllen Sie Variablen mit den Namen "total", "response" und "duration" (für LT50) oder "concentration" (für LC50) mit den beobachteten Daten in der Softwareoberfläche.
      HINWEIS: Wenn die kumulative Mortalität innerhalb des Beobachtungszeitraums 50 % nicht übersteigt, können die LT50- und/oder LC50-Werte nicht zuverlässig geschätzt werden.
    3. Führen Sie eine Probit-Analyse durch, indem Sie zu Analysieren | Regression | Probit. Legen Sie die "Gesamtsumme" als die Gesamtzahl der getesteten Insekten, die "Reaktion" als die Anzahl der toten Insekten und die "Dauer" oder "Konzentration" als Kovariate fest. Legen Sie das Signifikanzniveau für den Heterogenitätsfaktor auf 0,05 fest, indem Sie Optionen drücken und das Signifikanzniveau für die Verwendung des Heterogenitätsfaktors auf 0,05 festlegen.

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Ergebnisse

Das in dieser Studie vorgestellte experimentelle Flussdiagramm zeigte, dass das stabile Aufzuchtsystem der Chilithripse etabliert werden konnte, beginnend mit der Feldsammlung bis zum Screening der Virulenz von EPF-Isolaten (Abbildung 1). Obwohl die morphologische Beobachtung Chilithripse von anderen Blütenthripsen unterscheiden kann, kann die Verwendung der partiellen COI-Sequenz als molekularer Marker, einschließlich PCR-Amplikongröße und COI-Sequenzierung,...

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Diskussion

Chilithripse sind ein weltweit bedeutender Schädling, der zahlreiche wirtschaftlich wichtige Kulturpflanzen wie Mais, Erdnüsse, Pfeffer, Sojabohnen, Erdbeeren, Süßkartoffeln und Tomaten befällt 1,11,19. Aktuelle Bekämpfungsstrategien beruhen auf integrierten Ansätzen, die kulturelle Praktiken, biologische Schädlingsbekämpfungsmittel und chemische Behandlungen umfassen, einschließlich der Verwend...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass bei dieser Arbeit kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Besonderer Dank gilt Herrn Lin, Huanf-Jen von der Humi Blaubeerfarm (Wufeng Dist., Taichung City), der die Heidelbeerpflanzen zur Verfügung gestellt hat. Diese Forschung wurde unterstützt durch 113-2313-B-005 -024 -MY3 des National Science and Technology Council (NSTC).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
#00 InsektennadelEntosphinx DMM0220Hergestellt in Großbritannien
1,5 mL ZentrifugenröhrchenCorning integriertMCT-175-CHergestellt in den USA
10 μ L ImpföseNEST Wissenschaftlich718201Hergestellt in den USA
100 bp DNA-Leiter IIIGeneaidDL007Hergestellt in Taiwan.
2x SuperRed PCR MastermixBiowerkzeugeTE-SR01Hergestellt in Taiwan
6 cm PetrischaleAlpha Plus Wissenschaftlich16021Hergestellt in Taiwan
AgarBioman ScientificAGR001.1Mikrobiologie-Klasse
AgaroseBioman ScientificPB1200Hergestellt in Taiwan
BioGreen Sicherer DNA-Gel-PufferBioman ScientificSDB001THergestellt in Taiwan
Easy DNA Hochgeschwindigkeits-Extraktions-Gewebe-KitFisher BiotecET-100https://www.fisherbiotec.com.au/wp-content/uploads/2021/11/FB-EDNA-DNA-Kits-flyer-11Nov21.pdf (Hergestellt in Australien)
Grundierung vorne: LCO 1490Genomik PO-PR220919G6Sequenz: 5'-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3'
GenepHlow Gel/PCR KitGeneaidDFH300http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf
Aufzuchtbehälter aus Glas Sunshine Lab Equipment UnternehmenGröße: 35 mm Höhe, 45 mm Innendurchmesser. Kann durch jede ähnliche Größe von Kunststoff- oder Glasbechern ersetzt werden.
HämozytometerPaul Marienfeld640030Hergestellt in Deutschland
BrutkastenHipunktNr. F740Hergestellt in Taiwan
Leder-CutterEchte handgefertigte Werkstatthttps://shopee.tw/jj891004? categoryId=100636& entryPoint=ShopByPDP& itemId=16023929406
MiniAmp ThermocyclerThermo Fisher ScientificNr. A37834Hergestellt in den USA
optisches Mikroskop Nikon  Ci-LHergestellt in Japan
MalpinselTian Cheng Bürstenfirma4716608400352Kann durch einen Aquarellpinsel mit feiner Spitze ersetzt werden, der einem Rundpinsel der Größe 0 oder 1 entspricht.
KüchenpapierMai-BlumeBLS007-8Hergestellt in Taiwan
Parafilm MBemisPM-996Hergestellt in den USA
Stößel für PelletsBioman ScientificGT100RHergestellt in Taiwan
Grundierung auf der Rückseite: HCO 2198Genomik PO-PR220919G6Sequenz: 5'-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3'
Sabouraud Dextrose-BrüheHiMediaMH033-500GHergestellt in Indien
stereomikroskopSoptopSZN71Hergestellt in Taiwan
TAE-Puffer 50XBioman ScientificTAE501000Hergestellt in Taiwan
Tween 80PanReac AppliChem142050.1661Hergestellt in Taiwan
Tasche mit ReißverschlussFirma Wenchen Plastic1809000061Größe: 12 cm breit und 17 Zentimeter lang. (Hergestellt in Taiwan)

Referenzen

  1. Kumar, V., Kakkar, G., McKenzie, C. L., Seal, D. R., Osborne, L. S. Weed and pest control-conventional and new challenges. , 53-77 (2013).
  2. Hoddle, M. Scirtothrips dorsalis (chilli thrips). CABI Compendium. , Wallingford, CT, USA. (2022).
  3. Liburd, O. E., Panthi, B. R., Phillips, D. A. Chilli thrips on blueberries in Florida: ENY2053/IN1298. EDIS. 2020 (6), (2020).
  4. Gopal, K., Krishna Reddy, M., Reddy, M., Muniyappa, V. Transmission of peanut yellow spot virus (PYSV) by thrips, Scirtothrips dorsalis Hood in groundnut. Arch Phytopathol Plant Prot. 43 (5), 421-429 (2010).
  5. Prasada Rao, R., et al. The host range of tobacco streak virus in India and transmission by thrips. Ann Appl Biol. 142 (3), 365-368 (2003).
  6. Chang, J. C., et al. Construction and selection of an entomopathogenic fungal library from soil samples for controlling Spodoptera litura. Front Sustain Food Syst. 5, 596316(2021).
  7. Yang, C. J., Nai, Y. S. Assessment of aphidicidal effect of entomopathogenic fungi against mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kalt.). J Vis Exp. (197), e65312(2023).
  8. Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. J Vis Exp. (175), e62882(2021).
  9. Aristizábal, L., Chen, Y., Cherry, R., Cave, R., Arthurs, S. Efficacy of biorational insecticides against chilli thrips, Scirtothrips dorsalis (Thysanoptera: Thripidae), infesting roses under nursery conditions. J Appl Entomol. 141 (4), 274-284 (2017).
  10. Francis, J. R., Manchegowda, H. K. Molecular phylogenetic identification of Metarhizium and Beauveria and their bio-efficacy against chilli thrips, Scirtothrips dorsalis. Int J Trop Insect Sci. 43 (3), 909-918 (2023).
  11. Arthurs, S. P., Aristizábal, L. F., Avery, P. B. Evaluation of entomopathogenic fungi against chilli thrips, Scirtothrips dorsalis. J Insect Sci. 13 (1), 31(2013).
  12. Subramaniam, M. S. R., Babu, A., Deka, B. Lecanicillium lecanii (Zimmermann) Zare & Gams as an efficient biocontrol agent of tea thrips, Scirtothrips bispinosus Bagnall (Thysanoptera: Thripidae). Egypt J Biol Pest Control. 31, 1-14 (2021).
  13. Panyasiri, C., et al. Control efficacy of Purpureocillium lilacinum against chilli thrips (Scirtothrips dorsalis) on chili plant. Insects. 13 (8), 684(2022).
  14. Perera, M., Senanayake, N., Dissanayake, D. Evaluation of Amblyseius swirskii (predatory mite) and Orius laevigatus as biological control agents of chilli thrips (Scirtothrips dorsalis). Ceylon J Sci. 50 (4), 541(2021).
  15. Han, D., et al. Effect of pupation environment on pupal development and eclosion of chilli thrips (Thysanoptera: Thripidae). Environ Entomol. 54 (1), 223-230 (2025).
  16. Tatara, A. Effect of temperature and host plant on the development, fertility and longevity of Scirtothrips dorsalis Hood (Thysanoptera: Thripidae). Appl Entomol Zool. 29 (1), 31-37 (1994).
  17. Kumar, V., Seal, D. R., Osborne, L. S., McKenzie, C. L. Coupling scanning electron microscopy with DNA barcoding: a novel approach for thrips identification. Appl Entomol Zool. 49, 403-409 (2014).
  18. Silva, R., et al. Seasonal abundance of cotton thrips (Thysanoptera: Thripidae) across crop and non-crop vegetation in an Australian cotton-producing region. Agric Ecosyst Environ. 256, 226-238 (2018).
  19. Venette, R., Davis, E. Chilli thrips/yellow thrips, Scirtothrips dorsalis Hood (Thysanoptera: Thripidae) mini pest risk assessment. , Univ Minnesota Tech Bull. (2004).
  20. Mandi, N., Senapati, A. Integration of chemical, botanical and microbial insecticides for control of thrips, Scirtothrips dorsalis Hood infesting chilli. J Plant Prot Sci. 1 (1), 92-95 (2009).
  21. Samota, R., Jat, B., Choudhary, M. D. Efficacy of newer insecticides and biopesticides against thrips, Scirtothrips dorsalis Hood in chilli. J Pharmacogn Phytochem. 6 (4), 1458-1462 (2017).
  22. Panthi, B. R., Renkema, J. M., Lahiri, S., Liburd, O. E. The short-range movement of Scirtothrips dorsalis (Thysanoptera: Thripidae) and rate of spread of feeding injury among strawberry plants. Environ Entomol. 50 (1), 12-18 (2021).
  23. Priyanka, T., et al. Biology and morphometrics of Thrips parvispinus (Karny) (Thysanoptera: Thripidae) on chilli, Capsicum annuum L. Pest Manag Hortic Ecosyst. 30 (1), 85-92 (2024).
  24. Hemalatha, S., Ramaraju, K., Jeyarani, S. Evaluation of entomopathogenic fungi and delivery methods for management of thrips in chillies. Int J Veg Sci. 23 (3), 246-259 (2017).
  25. Xu, X. M., Guerin, L., Robinson, J. Effects of temperature and relative humidity on conidial germination and viability, colonization and sporulation of Monilinia fructigena. Plant Pathol. 50 (5), 561-568 (2001).
  26. Lee, S. J., et al. Transcriptional response of bean bug (Riptortus pedestris) upon infection with entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana JEF-007. Pest Manag Sci. 75 (2), 333-345 (2019).
  27. Yang, Y. -T., et al. Up-regulation of carbon metabolism-related glyoxylate cycle and toxin production in Beauveria bassiana JEF-007 during infection of bean bug, Riptortus pedestris (Hemiptera: Alydidae). Fungal Biol. 120 (10), 1236-1248 (2016).
  28. Qayyum, M. A., et al. Entomopathogenic fungi: prospects and challenges. Entomopathogenic Fungi: Prospects and Challenges. , 57-79 (2024).

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