Fixierung von Ultraschallwandlern für die Neuromodulation des Rückenmarks bei Mäusen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Ultraschallschallkopf-Fixationssystem, das speziell für die Ultraschallstimulation des Rückenmarks bei wachen Mäusen entwickelt wurde. Die Methode verwendet ein Fixierungssystem, um eine genaue Positionierung des Ultraschallwandlers zu gewährleisten und gleichzeitig den Versuchspersonen eine freie Bewegung zu ermöglichen, ohne die Präzision der Stimulation zu beeinträchtigen.

Zusammenfassung

Fokussierter Ultraschall (FUS) hat sich als innovative nicht-invasive Neuromodulationstechnologie herauskristallisiert, die ein erhebliches Potenzial für die neuronale Regulation des Rückenmarks aufweist. Das Erreichen einer stabilen Schallkopffixierung entlang der Wirbelsäule stellt jedoch erhebliche technische Herausforderungen dar. Bestehende Immobilisierungsmethoden erfordern oft eine verlängerte Tieranästhesie oder weisen eine unzureichende Adhäsionssicherheit auf. Diese kritischen Einschränkungen unterstreichen die dringende Notwendigkeit, ein neuartiges Fixierungsparadigma zu entwickeln, das sowohl die Betriebsstabilität als auch die physiologische Kompatibilität gewährleistet. Mit diesem Protokoll wird ein innovatives Ultraschallschallkopf-Fixationssystem zur Stimulation des Rückenmarks bei wachen, sich frei bewegenden Mäusen eingeführt. Die Etablierung einer zuverlässigen Methode für die präzise Platzierung des Ultraschallschallkopfs an der Wirbelsäule ist der Schlüssel für Neurostimulationsexperimente. Diese Methode integriert drei Phasen: die chirurgische Freilegung des T13-Wirbelkörpers, das Präzisionsschleifen des Dornfortsatzes zur Schaffung einer planaren Kontaktschnittstelle und die sichere adhäsive Verbindung der Metallbasis und des Kollimators mit der Wirbelsäule unter Verwendung von Prothesenbasismaterial und Adhäsivmischung. Es ermöglicht ein natürliches motorisches Verhalten durch uneingeschränkte Bewegung und gewährleistet eine stabile Positionierung mit minimalen räumlichen Variationen zwischen den Sitzungen, was die Untersuchung von ultraschallvermittelten Rückenmarkseingriffen in bewussten Tiermodellen erleichtert. Es ist besonders relevant für Studien, die Verhaltensbewertungen bei der Reparatur von Wirbelsäulenverletzungen, der Modulation der Blut-Rückenmarks-Barriere und chronischen Schmerzmechanismen erfordern. Durch die Bewältigung einer kritischen technischen Herausforderung in der Neuromodulationsforschung im Wachzustand bietet dieses Protokoll eine stabile Schnittstelle zwischen Schallkopf und Wirbelsäule ohne Bewegungseinschränkung und ebnet damit den Weg für genauere und zuverlässigere experimentelle Ergebnisse.

Einleitung

Das Rückenmark ist ein wichtiger Knotenpunkt für die Integration von Informationen zwischen dem zentralen und dem peripheren Nervensystem, was es für die klinische Forschung in Bereichen wie der Schmerzsignaltransduktion, der Rekonstruktion motorischer neuronaler Netzwerke und der Regulierung der Neuroplastizität wertvoll macht. Fokussierter Ultraschall (FUS), eine aufstrebende nicht-invasive Neuromodulationstechnologie, hat sich zu einem wichtigen Mittel der neuronalen Regulation des Rückenmarks entwickelt. Mit seinen physikalischen Eigenschaften der tiefen Gewebepenetration, der räumlichen Auflösung im Millimeterbereich und der kontrollierbaren Energieabgabeparameter erstreckt sich seine Anwendung von der Grundlagenforschung an Neuromechanismen bis hin zu präklinischen Translationsstudien verschiedener pathologischer Modelle des Rückenmarks.

Die Forschung zeigt, dass FUS die neuronalen Schaltkreise des Rückenmarks auf zwei Arten regulieren kann: entweder durch Hemmung oder durch Aktivierung durch thermische und mechanische Effekte. Es zeichnet sich auch durch seine zeitliche Reversibilität und Sicherheit für das Gewebe^{aus 1,2,3}. In der Studie von Modellen für Rückenmarksverletzungen hat FUS die motorischen Fähigkeiten von Ratten verbessert, indem es Entzündungsreaktionen moduliert und die neuronale Reparatur fördert ^4,5,6. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass FUS die Blut-Rückenmarks-Schranke öffnet und die Effizienz der lokalen Arzneimittelabgabe durch einen Mikroblasen-vermittelten Kavitationseffekt verbessert ^7,8. Auf dem Gebiet der neuropathischen Schmerzen haben Liao et al. bestätigt, dass FUS neuropathische Schmerzmanifestationen bei Ratten wirksam lindert, indem es die KCC2-Expression reguliert und den CaMKIV KCC2-Signalweg hemmt⁹. Song et al. zeigten, dass eine niedrig intensive tsFUS, die am lumbalen Rückenmark appliziert wurde, die mechanische Allodynie signifikant reduzierte und die Mikrogliaaktivierung bei einer Ratte mit chronischer Verengungsverletzung unterdrückte¹⁰. Das Erreichen einer präzisen Rückenmarksmodulation mit FUS hängt von der räumlichen Stabilität des Ultraschall-Energieabgabesystems ab. Die derzeitigen Fixationsstrategien werden hauptsächlich in zwei Kategorien unterteilt: 1) Starre Fixationsmethode: Sie erreicht eine präzise Positionierung durch die Verwendung eines stereotaktischen Rahmens, erfordert jedoch eine kontinuierliche Anästhesie, die die neuronale Aktivität der Versuchspersonen unterdrückt und die Validität von Verhaltensbewertungen beeinträchtigt 1,2,3,4,10 ; 2) Flexible Fixationsmethode: Es ermöglicht die Forschung an bewussten Probanden mit Hilfe eines elastischen Gurtgeräts, aber aufgrund der großen Beweglichkeit der Wirbelsäule kommt es zu Verschiebungsfehlern und Schallkopfablösung ^6,8,9. Darüber hinaus führt die geometrische Heterogenität der Lamina der Wirbelsäule zu einer signifikanten Abschwächung der Ultraschallenergie, wodurch die Effizienz der neuronalen Modulation verringert^{wird 7,8}.

Diese Studie schlägt auf innovative Weise ein implantierbares fokussiertes Ultraschall-Schallkopf-Fixierungsschema für die Erforschung der neuronalen Modulation des Rückenmarks bei bewussten, sich frei bewegenden Mäusen vor. Dieses Protokoll verwendet einen minimal-invasiven chirurgischen Ansatz zur Integration der Metallbasis, des Kollimators und der Wirbelsäule, unterstützt das wiederholte Tragen des Ultraschallwandlers, stellt die Konsistenz des Ultraschallziels sicher und hält die Dämpfung der Ultraschallenergie durch die Lamina in einem akzeptablen Bereich. Die entwickelte Methodik adressiert die kritischen Einschränkungen bestehender Ansätze und ermöglicht so zuverlässigere und reproduzierbare Experimente zur Neuromodulation des Rückenmarks an wachen, sich verhaltenden Tieren. Zu den wichtigsten Parametern gehören ein 2,5 cm langer Mittellinienschnitt bei T13, eine Fixierung der Metallbasis aus Edelstahl und ein Volumenverhältnis von 3:1 zwischen dem Prothesengrundmaterial und dem Cyanacrylat-Klebstoff. Zu den Einschränkungen gehören eine moderate chirurgische Invasivität und eine vom Bediener abhängige Präzision bei der Knochenoberflächenpräparation.

Protokoll

Alle in der vorliegenden Studie beschriebenen tierexperimentellen Verfahren wurden vom Institutional Ethical Committee of Animal Experimentation der Shenzhen Institutes of Advanced Technology genehmigt (Zertifikatsnummer: SIAT-IACUC-200721-YGS-NLL-A1313). Alle Experimente verwendeten männliche C57BL/6J-Mäuse (8 Wochen alt). Die Mäuse wogen zum Zeitpunkt der Operation 18-22 g.

1. Einleitung und Aufrechterhaltung der Anästhesie (5 ± 1 min)

1. Laden Sie den Anästhesiekreislauf 5 Minuten lang vor.
2. Stellen Sie die Induktionskammer so ein, dass sie 4 % Isofluran in medizinische Luft mit einer Durchflussrate von 2 l/min abgibt.
3. Wechseln Sie nach Verlust des Aufrichtreflexes zur Beatmung der Gesichtsmaske.
4. Stellen Sie den Verdampfer so ein, dass er eine Konzentration von 1,5-2% Isofluran aufrechterhält.
5. Halten Sie die Körpertemperatur der Maus mit einer wärmenden Decke auf 37 °C und einen Zielbereich von 36-38 °C während der gesamten Anästhesie.
6. Tragen Sie Terramycin Augensalbe auf.

2. Positionierung (1 ± 1 min)

1. Verwenden Sie einen einstellbaren stereotaktischen Adapter für die Maus.
2. Positionieren Sie die Maus in Bauchlage mit Wirbelsäulenausrichtung, um die physiologische Krümmung der Wirbelsäule zu erhalten.
3. Befestigen Sie den Kopf der Maus mit Ohrstangen.
4. Positionieren Sie die Gliedmaßen symmetrisch.

3. Vorbereitung des Operationsfeldes (1 ± 1 min)

1. Verwenden Sie einen elektrischen Haarschneider (Klingenabstand 0,1 mm), um Haare von der Operationsstelle zu entfernen.
2. Stellen Sie sicher, dass der Enthaarungsbereich ca. 3 cm × 1 cm beträgt.
3. Führen Sie drei Durchgänge des Scherens in die entgegengesetzte Richtung des Haarwachstums durch.

4. Inzision und Annäherung (2 ± 1 min)

1. Wischen Sie den Bereich 3 Mal (30 s-Intervalle) mit Iodophor ab.
2. Palpieren Sie die letzte Rippe (die bei Mäusen am T13-Wirbel befestigt ist) und verwenden Sie sie als
   das wichtigste Wahrzeichen. Erstellen Sie einen 2,5 cm langen Schnitt auf Höhe des T13-Wirbels entlang
   die dorsale Mittellinie mit einem Skalpell.
3. Präparieren Sie sequentiell die subkutane Faszie.
4. Legen Sie die paraspinalen Muskeln durch die anatomischen Ebenen frei.

5. Dissektion der paraspinalen Muskeln (5 ± 1 min)

1. Stellen Sie die Vergrößerung des Operationsmikroskops auf 5x ein, um eine optimale Visualisierung der paraspinalen Muskeln und Wirbelstrukturen zu ermöglichen.
2. Führen Sie eine scharfe Dissektion der paraspinalen Muskeln mit einer Mikroschere durch.
3. Resektion der dorsalen und lateralen paraspinalen Muskeln unter Beibehaltung der ventralen Muskelschichten.
4. Behandeln Sie Blutungen mit resorbierbarer hämostatischer Gaze.

6. Installation auf Metallsockel (1 ± 1 min)

1. Montieren Sie den Fixierstab (Kunststoff) an den stereotaktischen Adapter.
2. Montieren Sie die maßgefertigte Metallbasis (Edelstahl, 0,28 g) am distalen Ende des Stabes (Abbildung 1A).
3. Positionieren Sie die maßgefertigte Metallbasis bilateral an den Wirbelsäulenquerfortsätzen T13.
4. Überprüfen Sie die Stabilität der Kupplung.

7. Vorbereitung der Knochenschnittstelle (2 ± 1 min)

1. Entfernen Sie unter dem Operationsmikroskop restliches Muskelgewebe aus der Lamina und den Dornfortsätzen.
2. Erreichen Sie eine vollständige Blutstillung mit steriler Kompression aus Baumwolle.
3. Erstellen Sie eine planare Kontaktfläche mit einem Präzisionsknochenbohrer mit kontinuierlicher Salzbewässerung. Betreiben Sie den Bohrer mit einer Drehzahl von 5.000-10.000 U/min, um die Wärmeentwicklung zu minimieren. Tragen Sie während des Bohrens einen Augenschutz und eine Maske.
4. Entfernen Sie Knochenstaub mit mit Kochsalzlösung angefeuchteten Wattestäbchen.

8. Abdichtung des Fixiersystems (3 ± 1 min)

1. Mischen Sie die Prothesengrundmaterialien und den Cyanacrylat-Klebstoff (Kleber 502) im Volumenverhältnis 3:1. Tragen Sie Nitrilhandschuhe und eine Schutzbrille, um Haut-/Augenkontakt zu vermeiden.
2. Befestigen Sie den Ultraschallkollimator (Kunststoff, 0,6 g, Abbildung 1B) und die Metallbasis mit der Klebstoffmischung an der Wirbelsäule (Abbildung 1C).
3. Lassen Sie die Klebstoffmischung unter kontrollierten Umgebungsbedingungen (24 ± 1 °C, 40-60 % relative Luftfeuchtigkeit) aushärten. Statische Positionierung für 60 s bis zur visuellen Bestätigung der vollständigen Erstarrung (Verlust des Oberflächenglanzes und Bildung einer starren Grenzfläche) beibehalten.
4. Trennen Sie den Metallsockel von der Befestigungsstange aus Kunststoff.
5. Überprüfung der Fixierungsstabilität: Üben Sie eine sanfte Rotationskraft auf die Metallbasis in der horizontalen Ebene aus. Beobachten Sie die Grenzfläche zwischen Kollimator und Wirbel unter 5-facher Vergrößerung auf jede Verschiebung (<0,1 mm Toleranz). Wenn die Bewegung die Toleranz überschreitet, die Klebstoffmischung erneut auftragen (Schritt 8.2) und die Aushärtung wiederholen (Schritt 8.3).

9. Wundverschluss (1 ± 1 min)

1. Richten Sie die gewickelten Kanten so aus, dass die Metallbasis vollständig eingekapselt ist.
2. Führen Sie eine unterbrochene Naht mit 4-0 Seidennähten durch.
3. Wischen Sie den Schnitt mit einem Iodophor ab.
4. Entfernen Sie verbleibende Blut-/Knochenreste in der laminaren Expositionsstelle des Kollimators und verpacken Sie sie mit steriler Watte zur Abdichtung und Blutstillung.

10. Postoperatives Management

1. Thermoregulation: Halten Sie die Maus auf einer wärmenden Decke (37 °C), bis sich die Gehfähigkeit vollständig erholt hat (in der Regel 2-3 Stunden nach der Narkose).
2. Postoperative Antibiotikaprophylaxe: Verabreichen Sie Cefazolin-Natrium (50 mg/kg, gelöst in 0,9% Kochsalzlösung bis zu einer Konzentration von 50 mg/ml) durch subkutane Injektion in den dorsalen Halsbereich unmittelbar nach der Operation.
3. Halten Sie die Wundhygiene aufrecht. Reinigen Sie die Wunde in den ersten 3 Tagen einmal täglich mit einem mit Kochsalzlösung angefeuchteten Wattestäbchen und untersuchen Sie die Operationsstelle täglich auf Anzeichen von Infektionen, Dehiszenzen oder Entzündungen.
4. Postoperative Analgesie: Carprofen (5 mg/kg, subkutan) alle 12 Stunden für 3 Tage nach der Operation verabreichen¹¹.
   HINWEIS: Abbildung 1D zeigt das Fixierungssystem, das nach der Wiederherstellung in eine lebende Maus implantiert wurde.

11. Entsorgung gefährlicher Abfälle

1. Sammeln Sie Knochenstaub und blutkontaminierte Materialien in auslaufsicheren Biohazard-Beuteln, die mit "Biohazard"-Symbolen gekennzeichnet sind, um sie an eine lizenzierte Entsorgungseinrichtung für medizinische Abfälle zu übergeben.
2. Legen Sie nicht ausgehärtetes Prothesengrundmaterial und 502-Klebstoffreste in versiegelte, chemikalienbeständige Behälter mit der Aufschrift "Chemischer Abfall" und lagern Sie sie in einem dafür vorgesehenen belüfteten Schrank zur Entsorgung über Protokolle zur Entsorgung chemischer Abfälle.
3. Entsorgen Sie Nadeln, Skalpellklingen und Knochenbohrer in durchstichsicheren Behältern für scharfe Gegenstände, die mit "Biohazard"-Etiketten gekennzeichnet sind.

12. Sicherheitshinweise

1. Vermeiden Sie beim Umgang mit Prothesenbasismaterialien direkten Hautkontakt, indem Sie Nitrilhandschuhe und Schutzbrillen tragen, und führen Sie das Mischen und Aushärten in einem gut belüfteten Abzug durch, um das Einatmen flüchtiger Monomere zu minimieren.
2. Entsorgen Sie Reststoffe als chemischen Abfall gemäß den institutionellen Richtlinien. Vermeiden Sie bei 502 Cyanacrylat-Klebstoffen Haut- oder Augenkontakt und spülen Sie sie sofort 15 Minuten lang mit Wasser ab, wenn eine Exposition auftritt, und suchen Sie einen Arzt auf. Verwenden Sie sie in belüfteten Bereichen, lagern Sie sie an kühlen, trockenen Orten fern von Zündquellen und vermeiden Sie den Kontakt mit Baumwoll- oder Wollstoffen.
3. Wenn Sie Präzisionsbohrmaschinen verwenden, sichern Sie das Handstück, tragen Sie einen Gesichtsschutz und eine chirurgische Maske und spülen Sie die Bohrstelle mit Kochsalzlösung, um thermische Verletzungen zu vermeiden.

Ergebnisse

Offener Feldtest
Der Freilandtest wurde entwickelt, um mögliche Verhaltensänderungen bei Mäusen nach einer Operation zu bewerten (Abbildung 2A). Es wurde eine Standard-Freifeldkammer von 40 cm × 40 cm verwendet, um den Mäusen ausreichend Aktivitätsraum zu bieten und gleichzeitig relativ konstante Umgebungsbedingungen aufrechtzuerhalten und externe Störungen zu minimieren. Das Experiment bestand aus zwei Phasen: vor der Operation und 7 Tage nach der Operation. In jeder Pha...

Diskussion

In dieser Studie wird ein neuartiges Wirbelkopplungsprotokoll vorgestellt, das eine präzise Ultraschall-Neuromodulation des Rückenmarks bei wachen, sich frei verhaltenden Mäusen ermöglicht. Im Gegensatz zu herkömmlichen Fixationsansätzen überwindet diese Methodik die Grenzen herkömmlicher Fixationsansätze. Im Gegensatz zu starren stereotaktischen Rahmen, die eine kontinuierliche Anästhesie erfordern (was die neuronale Aktivität unterdrückt und Verhaltensbewertungen erschwert

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anästhesie-Induktionskammer	Shenzhen RWD	https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts
Cyanacrylat-Klebstoff (502 Kleber)	Chemische Werke in Peking	https://item.taobao.com/item.htm? detail_redpacket_pop=wahr& id=736 869038961& LTK2=1752156592779 MDBP47QQP4VYV57MQ156E& ns=1& priceTId=214780251752156543206 3926e1996& query=502%E8%83% B6%E6%B0%B4%20%E5%8C%97 %E4%BA%AC%E5%8C%96%E5% B7%A5%E5%8E%82& Artikelnummer=52584 34238219
Grundmaterialien für Prothesen	New Century Dental	https://www.sncdental.com/product-item-11.html
Befestigungsstange			Gewohnheit
Isofluran	Shenzhen RWD	https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts
Gestell aus Metall			Gewohnheit
Mikroinstrument	Shenzhen Zongshi Scientific Instruments Co., Ltd.
Präzisions-Bohrer	Shenzhen RWD	https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment
Mehrkanal-Anästhesiesystem für Kleintiere	Shenzhen RWD	https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia/data_66.html
Stereotaktischer Adapter für Mäuse und juvenile Ratten	Changsha Mayue	https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop =wahr& id=651346369142& ltk2=1752 157416717wlsrozz5uroehtbq5ycim4 & ns=1& priceTId=214781ce1752157 3520498589e101a& query=%E8%84 %91%E7%AB%8B%E4%BD%93%E5%AE% 9A%E4%BD%8D%E4%BB%AA%20% E9%95%BF%E6%B2%99%E8%BF% 88%E8%B6%8A& skuId=4891677573 207& spm=a21n57.1.hoverItem.14& utparam=%7B%22aplus_abtest% 22%3A%22a478799868a3178d0dd 433b763909e16%22%7D& xxc= taobaoSuche
Operationsmikroskop	Shenzhen Zongshi Scientific Instruments Co., Ltd.	https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment
Chirurgisches Nahtmaterial (Prolene)	Ethicon (Johnson & Johnson)	https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop =wahr& id=774292384846& ltk2= 1752157506907c0321finubb5 rpkub6av6n& ns=1& priceTId= 214781ce1752157493734800 4e101a& query=%E5%BC%B A%E7%94%9F%E7%BC%9D %E7%BA%BF& skuId=594224 1331046& spm=a21n57.1.hoverI
Terramycin Augensalbe	Pfizer	https://theterramycin.com/terramycin-ophthalmic-ointment/
Ultraschall-Kollimator			Gewohnheit