Methodenartikel

Multi-omics-Techniken zur Profilierung von Chromatin-Zustandsübergängen in primären Maus-Cholangiozyten mit geringem Input

DOI:

10.3791/68606

⸱

3. Juli 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Oncology, Tianjin First Central Hospital, School of Medicine, Nankai University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, 3Shenzhen Hospital, Southern Medical University, 4Tianjin Institute of Urology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Manuskript stellt ein umfassendes Protokoll für Low-Input-ChIP-seq zur Profilierung von Histonmodifikationen und ATAC-seq zur Beurteilung der Chromatinzugänglichkeit in kleinen Mengen primärer Maus-Cholangiozyten vor.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die polyzystische Lebererkrankung (PLD) ist eine erbliche Erkrankung, die durch die Bildung von flüssigkeitsgefüllten Zysten gekennzeichnet ist, die von Cholangiozyten abgeleitet werden und zu einer fortschreitenden Erkrankung und einer signifikanten Einschränkung der Lebensqualität der Patienten führen. Die derzeitigen Behandlungen für PLD sind unzureichend, was die Notwendigkeit neuartiger therapeutischer Strategien unterstreicht. Die Rolle der epigenetischen Regulation bei der PLD-Progression, insbesondere der Chromatinzugänglichkeit und der Histonmodifikationen, ist noch wenig erforscht. Traditionelle epigenetische Profilierungstechniken wie ChIP-seq und DNase-seq erfordern eine große Anzahl von Zellen, die nur schwer aus primären Cholangiozyten gewonnen werden können. Um dies zu beheben, haben wir die ChIP-seq- und ATAC-seq-Protokolle mit niedrigem Input für eine geringe Anzahl primärer Cholangiozyten optimiert. Diese Ansätze ermöglichen die Analyse von Histonmodifikationen und der Zugänglichkeit des Chromatins mit minimalem Zelleinsatz. Low-Input-ChIP-seq nutzt die Mikrokokken-Nuklease (MNase) für die DNA-Fragmentierung, während ATAC-seq die Tn5-Transposase verwendet, um offene Chromatinregionen zu erfassen. Diese Multi-Omics-Techniken liefern wertvolle Einblicke in die Dynamik des Chromatinzustands während des Schicksalsübergangs von Cholangiozyten bei PLD und anderen Gallenerkrankungen. Wichtig ist, dass die optimierten Protokolle sicher auf andere Primärzellen mit niedrigem Input anwendbar sind und die Erforschung epigenetischer Mechanismen in verschiedenen zellulären Kontexten ermöglichen. Diese Arbeit stellt einen systematischen Ansatz zur Untersuchung von Veränderungen des Chromatinzustands vor und trägt zur Entwicklung epigenetisch basierter Therapiestrategien für PLD und verwandte Erkrankungen bei.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PLD ist eine Erbkrankheit, die durch die Entwicklung mehrerer flüssigkeitsgefüllter Zysten gekennzeichnet ist, die von Cholangiozyten abgeleitet sind. Da sich diese Zysten nach und nach ausbreiten, beeinträchtigen sie die Lebensqualität der Patienten erheblich 1,2. Die bestehenden Behandlungsstrategien für PLD sind unzureichend, bieten nur einen begrenzten Nutzen, führen aber häufig zu hohen Rezidivraten und Komplikationen 3,4. Daher besteht ein dringender Bedarf an sichereren und effektiveren Therapieansätzen, um die ungelösten klinischen Herausforderungen bei der PLD-Behandlung zu bewältigen.

Unter normalen Bedingungen bleiben Cholangiozyten ruhig, während sie bei PLD eine übermäßige Proliferation aufweisen, was ein wichtiger Faktor für das Fortschreiten der Krankheitist 5,6. Die molekularen Mechanismen, die diesem zystischen Übergang zugrunde liegen, sind noch unklar. Während die epigenetische Regulation, einschließlich der Zugänglichkeit von Chromatinen und Histonmodifikationen, eine wichtige Rolle bei den Übergängen des Zellschicksals spielt 7,8, ist ihre Rolle bei der PLD-Progression noch wenig untersucht. Viele epigenetische Profiling-Techniken erfordern jedoch eine große Anzahl von Zellen. Traditionelles ChIP-seq, das auf Chromatinfragmentierung durch Ultraschall beruht, sowie Chromatin-Zugänglichkeitsassays wie DNase-seq und MNase-seq erfordern in der Regel über 10bis 6 Zellen - weit mehr als die Anzahl, die aus primären Cholangiozyten gewonnen werden kann.

Dieses Manuskript bietet ein umfassendes Protokoll für ChIP-seq 9,10,11 mit niedrigem Input zur Profilierung von Histonmodifikationen und ATAC-seq 11,12,13 zur Beurteilung der Chromatinzugänglichkeit bei einer geringen Anzahl primärer Cholangiozyten. Low-Input-ChIP-seq verwendet MNase zur Fragmentierung von DNA9, während ATAC-seq DNA-Fragmente aus offenen Chromatinregionen mit Hilfe der Tn5-Transposase12 erfasst. Die Multi-Omics-Analyse mit diesen Ansätzen bietet wertvolle Einblicke in die Dynamik des Chromatinzustands während des Schicksalsübergangs von Cholangiozyten bei PLD und anderen Gallenerkrankungen und erleichtert so die Entwicklung epigenetisch zielgerichteter Therapien.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Vorbereitung von Lösungen und Cholangiozyten für ATAC-seq

  1. Mindestens 1 Tag vor dem ATAC-seq-Experiment ist der ATAC-Lysepuffer mit den in Tabelle 1 aufgeführten Reagenzien herzustellen.
    HINWEIS: ATAC Lysis Buffer kann mindestens 1 Monat lang bei 4 °C im Dunkeln gelagert werden.
  2. Bei frisch isolierten primären Cholangiozyten14 sind die Zellen unmittelbar nach der Isolierung mit einem Hämozytometer zu zählen und mit dem ATAC-seq-Experiment fortzufahren.
    HINWEIS: Je früher, desto besser, um die Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu minimieren. Wenn es jedoch auf Eis gehalten wird, ist es in der Regel kein Problem, innerhalb von 2 Stunden fortzufahren.

2. ATAC-Gleichung

HINWEIS: Verwenden Sie 100.000 Cholangiozyten für ATAC-seq. Bewahren Sie die Proben und Lösungen auf Eis auf. Für das ATAC-seq-Experiment dauert die gesamte Prozedur ca. 2 Tage.

  1. Bei 500 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
  2. Entsorgen Sie den Überstand, fügen Sie 200 μl ATAC-Lysepuffer mit Proteasehemmer hinzu, pipettieren Sie vorsichtig, um ihn zu mischen, und inkubieren Sie ihn 20 Minuten lang auf Eis. In den ersten 10 Minuten vorsichtig pipettieren, um zu mischen.
  3. Bei 1.500 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
  4. Bereiten Sie den Transpositionsreaktionspuffer (50 μl) vor, indem Sie 3 μl Enzymmischung aus dem ATAC DNA Library Prep Kit, 10 μl 5x Puffer aus dem ATAC DNA Library Prep Kit und 37 μl nukleasefreies Wasser mischen. Gründlich mischen.
  5. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, legen Sie das gesammelte Kernpellet auf Eis und fügen Sie sofort 50 μl Transpositionsreaktionspuffer hinzu. Vorsichtig resuspendieren und 60 Minuten lang bei 37 °C inkubieren, dabei alle 10 Minuten auf den Boden der Tube schnippen, um zu mischen.
    HINWEIS: Bereiten Sie den Transpositionsreaktionspuffer vor, bevor Sie den Überstand verwerfen, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern.
  6. Reinigen Sie die DNA mit dem PCR-Aufreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    HINWEIS: In diesem Schritt könnten verbleibende Protein-G-Kügelchen aus dem Cholangiozyten-Isolierungsprozess14 entfernt werden. DNA-Proben können zur Langzeitkonservierung bei -80 °C gelagert werden.
  7. Führen Sie die Bibliothekserstellung mit dem ATAC DNA Library Prep Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
    HINWEIS: Bewahren Sie alle Proben und Lösungen auf Eis auf, sofern nicht anders angegeben. Auch wenn sich die Verfahren bei anderen Kit-Marken unterscheiden können, sind alle mit unserem Protokoll kompatibel.
    1. PCR-Anreicherung: Bereiten Sie den PCR-Anreicherungsmix (50 μl) in einem PCR-Röhrchen vor, indem Sie die folgenden Komponenten in der angegebenen Reihenfolge mischen: 10 μl DNA-Probe (aus Schritt 2.6), 14 μl nukleasefreies Wasser, 10 μl 5x TAB, 5 μl PPM, 1 μl TAE, 5 μl P5-Primer und 5 μl P7-Primer. Vorsichtig pipettieren, um zu mischen.
    2. Übertragen Sie das Röhrchen in ein PCR-Gerät und führen Sie das folgende Programm aus: (72 °C für 3 min) x 1 Zyklus, (98 °C für 30 s) x 1 Zyklus, (98 °C für 15 s, 60 °C für 30 s, 72 °C für 3 min) x 15 Zyklen und (72 °C für 5 min) x 1 Zyklus und halten Sie es bei 4 °C.
    3. Reinigung: Bringen Sie die DNA Clean-Kügelchen vor der Verwendung 30 Minuten lang auf Raumtemperatur und führen Sie dann eine zweistufige Reinigung der magnetischen Beads durch.
      1. Erste Runde: 30 μl DNA Clean-Kügelchen zu den PCR-Produkten geben (aus Schritt 2.7.2), vorsichtig pipettieren, um zu mischen, und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie das PCR-Röhrchen auf einen Magnetseparator und warten Sie, bis die Lösung klar wird (~5 min). Übertragen Sie den Überstand vorsichtig in ein neues Röhrchen und entsorgen Sie die DNA Clean-Kügelchen.
      2. Zweite Runde: 7,5 μl DNA Clean-Kügelchen in den gesammelten Überstand geben (aus Schritt 2.7.3.1), vorsichtig pipettieren, um zu mischen, und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie das Röhrchen auf einen Magnetabscheider und warten Sie, bis die Lösung klar wird (~5 min). Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
    4. Lassen Sie das Röhrchen auf dem Magnetabscheider und spülen Sie die DNA Clean Kügelchen 2 x 30 s lang mit 200 μl frisch zubereitetem 80%igem Ethanol bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand nach jedem Spülen vorsichtig. Während sich das Röhrchen noch auf dem Magnetabscheider befindet, öffnen Sie den Röhrchendeckel und trocknen Sie die Kügelchen 10 Minuten lang an der Luft. Zum Schluss fügen Sie 22 μl nukleasefreies Wasser hinzu, um die DNA zu eluieren.
      HINWEIS: DNA-Proben können zur Langzeitkonservierung bei -80 °C gelagert werden.
  8. Sequenzieren Sie die Bibliotheken mit einem Standard-Sequenzer der nächsten Generation.
    HINWEIS: Wir empfehlen, mindestens 50 Millionen Lesevorgänge am Paarende zu erhalten.

3. Vorbereitung von Lösungen und Cholangiozyten für Low-Input ChIP-seq

  1. Bereiten Sie mindestens 1 Tag vor dem ChIP-seq-Experiment mit geringer Eingabe den ChIP-Lysepuffer, den ChIP-MNase-Puffer, den ChIP-Stopp-Puffer, den ChIP-2x-RIPA-Puffer, den ChIP-RIPA-Puffer und den ChIP-LiCl-Puffer unter Verwendung der in Tabelle 2, Tabelle 3, Tabelle 4 und Tabelle 5 aufgeführten Reagenzien vor.
    HINWEIS: Die oben genannten Lösungen können mindestens 1 Monat lang bei 4 °C gelagert werden.
  2. Bei frisch isolierten primären Cholangiozyten14 werden die Zellen unmittelbar nach der Isolierung mit einem Hämozytometer gezählt und mit dem ChIP-seq-Experiment mit niedrigem Input fortgefahren.
    HINWEIS: Je früher, desto besser, um die Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu minimieren. Wenn es jedoch auf Eis gehalten wird, ist es in der Regel kein Problem, innerhalb von 2 Stunden fortzufahren.

4. Tag 1 des Low-Input-ChIP-seq: Zelllyse, MNase-Verdau und Antikörper-Inkubation

HINWEIS: Für das ChIP-seq-Experiment mit geringer Eingabe dauert das gesamte Verfahren ca. 3 Tage.

  1. Teilen Sie die Cholangiozyten in Aliquots von 100.000 Zellen pro Röhrchen und bewahren Sie die Proben und Lösungen auf Eis auf.
    HINWEIS: Wenn Sie ein ChIP-seq-Experiment mit geringer Eingabe für mehrere Histonmodifikationen durchführen, ist es akzeptabel, das Volumen proportional zu vergrößern, bevor der Histonmodifikationsantikörper hinzugefügt wird. Die Reagenzvolumina in den folgenden Schritten basieren auf einem Röhrchen mit 1 × 105 Zellen.
  2. Bei 2.000 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
  3. Entsorgen Sie den Überstand, fügen Sie 19 μl ChIP-Lysepuffer mit Proteasehemmer hinzu, pipettieren Sie vorsichtig zum Mischen und inkubieren Sie ihn 10 Minuten lang auf Eis. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen.
  4. Fügen Sie 19 μl ChIP MNase Puffer hinzu und pipettieren Sie vorsichtig, um es zu mischen.
  5. 2 μl MNase (0,01 U/μl) zugeben und vorsichtig pipettieren, um zu mischen. Bei 37 °C 5 min inkubieren.
    HINWEIS: Die Inkubationszeit ist entscheidend. Die Endkonzentration von MNase beträgt 0,0005 U/μL. Die optimale Konzentration von MNase kann anhand des Zelltyps und der Zellanzahl bestimmt werden.
  6. Legen Sie die Probe sofort auf Eis, fügen Sie 5 μl ChIP STOP-Puffer hinzu, um den Aufschluss zu beenden, und pipettieren Sie vorsichtig, um sie zu mischen.
  7. Fügen Sie 45 μl ChIP 2x RIPA-Puffer mit Proteaseinhibitor hinzu, pipettieren Sie vorsichtig, um es zu mischen, und inkubieren Sie es 10 Minuten lang auf Eis.
  8. Zentrifugieren Sie bei 20.000 × g für 15 min bei 4 °C. Den Überstand langsam in ein neues Röhrchen umfüllen.
    HINWEIS: In diesem Schritt könnten verbleibende Protein-G-Kügelchen aus dem Cholangiozyten-Isolierungsprozess14 entfernt werden.
  9. Fügen Sie 40 μl ChIP-RIPA-Puffer hinzu.
  10. Bei Immunpräzipitationsproben (IP) fügen Sie 1 μg Antikörper pro Probe hinzu und inkubieren Sie die Suspension über Nacht auf einem Rotator (20 U/min) bei 4 °C.
  11. Bei Eingangsproben keine Antikörper hinzufügen und die Suspension über Nacht auf einem Rotator (20 U/min) bei 4 °C inkubieren.

5. Tag 2 der Low-Input-ChIP-seq: Immunpräzipitation, Wash und Elution

HINWEIS: Befolgen Sie für IP-Beispiele die Schritte 5.1 bis 5.7. Führen Sie für Eingabebeispiele die Schritte 5.8 bis 5.12 aus.

  1. Protein G Kügelchen mit 1 mL eiskaltem ChIP RIPA Puffer vorwaschen.
  2. Geben Sie 400 μg Protein G-Kügelchen zu den Proben und inkubieren Sie sie mit Rotation (20 U/min) bei 4 °C für 2 h.
  3. Waschen Sie die Kügelchen 5 x 5 min lang mit 150 μL eiskaltem ChIP RIPA Buffer für 5 min bei 4 °C auf einem Rotator (20 U/min). Entfernen Sie den Überstand mit einem Magnetabscheider.
  4. Waschen Sie die Kügelchen mit 150 μL eiskaltem ChIP LiCl Buffer für 5 min bei 4 °C auf einem Rotator (20 U/min). Entfernen Sie den Überstand mit einem Magnetabscheider.
  5. Fügen Sie 30 μl ChIP-Elutionspuffer (29 μl nukleasefreies Wasser und 1 μl Proteinase K) hinzu, um die Kügelchen zu resuspendieren, und schütteln Sie sie 90 Minuten lang bei 900 U/min bei 55 °C. Bewegen Sie die Tube regelmäßig vorsichtig, um die Perlen in der Schwebe zu halten.
  6. Sammeln Sie den Überstand mit einem Magnetabscheider und geben Sie ihn langsam in ein neues Röhrchen. Inkubieren Sie 40 Minuten lang bei 72 °C, um Proteinase K zu inaktivieren.
  7. Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Fluorometer.
    HINWEIS: DNA-Proben können zur Langzeitkonservierung bei -80 °C gelagert werden.
  8. Für Eingangsproben 1 μl Proteinase K zugeben und 90 Minuten lang bei 900 U/min bei 55 °C schütteln.
  9. Aufreinigung der DNA durch Phenol-Chloroform-Extraktion. Fügen Sie 130 μl DNA-Extraktionsreagenz hinzu und wirbeln Sie kräftig ein, bis die Lösung rosa wird. Bei 20.000 × g 5 min zentrifugieren.
  10. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen, fügen Sie 130 μl eiskaltes Isopropanol hinzu und fügen Sie dann 1 μl Glykogen und 6,5 μl 3M NaAc hinzu. Bei 20.000 × g 15 min zentrifugieren.
  11. Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie ihn einmal mit 1 ml 70%igem Ethanol und zentrifugieren Sie ihn 15 Minuten lang bei 20.000 × g . Trocknen Sie das Pellet und resuspendieren Sie es in 30 μl nukleasefreiem Wasser.
  12. Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Fluorometer.
    HINWEIS: DNA-Proben können zur Langzeitkonservierung bei -80 °C gelagert werden.

6. Tag 3 von Low-Input ChIP-seq: Bibliotheksaufbau und Sequenzierung

  1. Führen Sie die Bibliothekserstellung mit einem ChIP DNA Library Prep Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
    HINWEIS: Zu den Schritten gehören die Endvorbereitung, die Adapterligation und die Bibliotheksverstärkung. Pipettieren Sie 5 ng ChIP-Samples (Eingangs- und IP-Samples) für den Bibliotheksaufbau. Bewahren Sie alle Proben und Lösungen auf Eis auf, sofern nicht anders angegeben. Auch wenn sich die Verfahren bei anderen Kit-Marken unterscheiden können, sind alle mit unserem Protokoll kompatibel.
  2. Endvorbereitung: Bereiten Sie den Reaktionspuffer für die Endvorbereitung (65 μl) in einem PCR-Röhrchen vor, indem Sie 5 ng DNA-Probe (aus Schritt 5.6 oder Schritt 5.11), 15 μl End Prep Mix 4, 6,5 μl Tris EDTA und nukleasefreies Wasser auf ein Endvolumen von 65 μl mischen. Übertragen Sie das Röhrchen in ein PCR-Gerät und führen Sie das folgende Programm durch: 20 °C für 15 Minuten, 65 °C für 15 Minuten und halten Sie es bei 4 °C (heißer Deckel: 105 °C).
  3. Adapterligation: DNA-Adapter S im Verhältnis 1:100 verdünnen. Bereiten Sie den Adapter-Ligationsreaktionspuffer (100 μl) in einem PCR-Röhrchen vor, indem Sie 65 μl Endvorbereitungsprodukte (aus Schritt 6.2), 25 μl Rapid Ligation Puffer 2, 5 μl Rapid DNA-Ligase und 5 μl verdünnte DNA Adapter S mischen. Übertragen Sie das Röhrchen in ein PCR-Gerät und führen Sie das folgende Programm durch: 20 °C für 15 Minuten, gefolgt von einem Halten bei 4 °C (heißer Deckel: 105 °C).
  4. Reinigung:
    1. Bringen Sie die DNA Clean Kügelchen vor Gebrauch 30 Minuten lang auf Raumtemperatur. Geben Sie 60 μl DNA Clean-Kügelchen in die Adapterligationsprodukte (aus Schritt 6.3). Zum Mischen vorsichtig pipettieren und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    2. Legen Sie das PCR-Röhrchen auf einen Magnetseparator und warten Sie, bis die Lösung klar wird (~5 min). Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
    3. Halten Sie das Rohr auf dem Magnetabscheider. Spülen Sie die DNA Clean Kügelchen 2 x 30 s lang mit 200 μl frisch zubereitetem 80%igem Ethanol bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand nach jedem Spülen vorsichtig.
    4. Während sich das Röhrchen noch auf dem Magnetabscheider befindet, öffnen Sie den Röhrchendeckel und trocknen Sie die Kügelchen 5 Minuten lang an der Luft. Zum Schluss fügen Sie 22,5 μl 10 mM Tris-HCL (PH 8,0) hinzu, um die DNA zu eluieren.
  5. Bibliotheksamplifikation: Bereiten Sie den Bibliotheksamplifikationsreaktionspuffer (50 μl) in einem PCR-Röhrchen vor, indem Sie 20 μl Aufreinigungsprodukte (aus Schritt 6.4), 2,5 μl i5 PCR Primer, 2,5 μl i7 PCR Primer und 25 μl Amplifikationsmix mischen. Vorsichtig pipettieren, um zu mischen. Übertragen Sie das Röhrchen in ein PCR-Gerät und führen Sie das folgende Programm aus: (95 °C für 3 Minuten) x 1 Zyklus, (98 °C für 20 s, 60 °C für 15 s, 72 °C für 30 s) x 18 Zyklen, (72 °C für 5 Minuten) x 1 Zyklus und bei 4 °C halten.
  6. Reinigung: Bringen Sie die DNA Clean-Kügelchen vor der Verwendung 30 Minuten lang auf Raumtemperatur und führen Sie dann eine zweistufige Reinigung der magnetischen Beads durch.
    1. Erste Runde: Geben Sie 30 μl DNA Clean-Kügelchen zu den Library Amplification-Produkten (aus Schritt 6.5). Zum Mischen vorsichtig pipettieren und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie das PCR-Röhrchen auf einen Magnetseparator und warten Sie, bis die Lösung klar wird (~5 min). Übertragen Sie den Überstand vorsichtig in ein neues Röhrchen und entsorgen Sie die DNA Clean-Kügelchen.
    2. Zweite Runde: Geben Sie 7,5 μl DNA Clean-Kügelchen in den gesammelten Überstand. Zum Mischen vorsichtig pipettieren und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie das Röhrchen auf einen Magnetabscheider und warten Sie, bis die Lösung klar wird (~5 min). Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig. Halten Sie das Rohr auf dem Magnetabscheider. Spülen Sie die DNA Clean Kügelchen 2 x 30 s lang mit 200 μl frisch zubereitetem 80%igem Ethanol bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand nach jedem Spülen vorsichtig. Während sich das Röhrchen noch auf dem Magnetabscheider befindet, öffnen Sie den Röhrchendeckel und trocknen Sie die Kügelchen 10 Minuten lang an der Luft. Zum Schluss fügen Sie 22,5 μl 10 mM Tris-HCl (PH 8,0) hinzu, um die DNA zu eluieren.
      HINWEIS: DNA-Proben können zur Langzeitkonservierung bei -80 °C gelagert werden.
  7. Sequenzieren Sie die Bibliotheken in einem Standard-Sequenzer der nächsten Generation.
    HINWEIS: Wir empfehlen, mindestens 10-20 Millionen Pair-End-Lesevorgänge zu erhalten.

7. Datenanalyse von ATAC-seq und Low-input ChIP-seq

  1. Vorbereitung der virtuellen Analyseumgebung (miniconda)
    1. Laden Sie Miniconda3 mit den folgenden Befehlen von der Website herunter und folgen Sie den Installationsanweisungen von Miniconda.
      wget https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
      Bash-Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
    2. Erstellen Sie eine virtuelle Umgebung für die Analysepipeline von ATAC-seq und ChIP-seq.
      conda create -n NGSpipeline
      conda aktivieren NGSpipeline
      conda install bioconda::fastqc bioconda::multiqc bioconda::trim-galore bioconda::bowtie2 bioconda::samtools bioconda::macs2 bioconda::d eeptools bioconda::p icard bioconda::igv
    3. Laden Sie die Referenzgenomsequenzdatei herunter und erstellen Sie einen Alignment-Index für das Bowtie2-Alignment.
      WGET https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_mouse/release_M25/GRCm38.p6.genome.fa.gz
      GunZip GRCm38.p6.genome.fa.gz
      bowtie2-build-s GRCm38.p6.genome.fa GRCm38_bowtie2_index
  2. Führen Sie eine Qualitätskontrolle von ATAC-seq-Reads und ChIP-seq-Reads mit FastQC durch und fassen Sie den Qualitätskontrollbericht mit MultiQC zusammen, um die GC-Verzerrung der Sequenzierungsergebnisse und eine ausreichende Bibliothekskomplexität für die nachgelagerte Analyse sicherzustellen. Verwerfen Sie die Sequenzbibliothek mit signifikant unterschiedlichen Ergebnissen der Qualitätskontrolle.
    fastqc -o ......
    multiqc
  3. Trimmen-Sequenzierungsadapter mit Trimm in Hülle und Fülle.
    trim_galore -q 20 --phred33 --stringency 3 --length 25 -e 0.1 --paired -j -o
  4. Ordnen Sie getrimmte Lesevorgänge der mm10-Referenzgenomassemblierung mit Bowtie2 unter Verwendung von Standardparametern zu und übergeben Sie Additionsparameter (--very-sensitive -X 2000) an bowtie2 für ATAC-seq aufgrund der großen Längenverteilung des ATAC-seq-Fragments.
    1. Für ATAC-seq:
      bowtie2 -p --very-sensitive -X 2000 -x -1 -2 | samtools view -S -O BAM -@ -o
    2. Für ChIP-seq:
      bowtie2 -p -x -1 -2 | samtools view -S -O BAM -@ -o
  5. Entfernen Sie Reads mit niedrigem Alignment-Score (q30) und Reads, die an das Mitochondriengenom und das Nicht-Standard-Chromosom ausgerichtet sind.
    samtools view -bh -q 30 -f 2 | samtools view -h | grep -v 'chrM' | grep -v 'random' | grep -v 'chrUn' | samtools sort -l 9 -O BAM -o
  6. Verwenden Sie den Befehl Picard MarkDuplicates, um PCR-Duplikate zu entfernen.
    picard MarkDuplicates I= O= M= REMOVE_DUPLICATES=wahr
  7. Rufen Sie Peak mit dem MACS2-Befehl callpeak mit dem Parameter -f BAMPE -g mm -B -q 0.01 auf.
    macs2 callpeak -f BAMPE -t -g mm -n -B -q 0.01
  8. Generieren Sie BigWig-Dateien mit dem Befehl Deeptools BamCoverage.
    samtools index -@ 4
    bamCoverage -b     -o -bs 50 -p --effectiveGenomeSize2652783500--normalizeUsing RPGC -e -ignoreDuplicates
  9. Verwenden Sie den IGV-Genombrowser, um die narrowPeak-Datei von macs2 und die BigWig-Dateien von Deeptools BamCoverage anzuzeigen.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um die Chromatinlandschaft primärer Cholangiozyten zu generieren, optimierten wir die Low-Input-ChIP-seq- und ATAC-seq-Protokolle für eine geringe Anzahl (~100.000) primärer Cholangiozyten. Die Ergebnisse der Agarose-Gelelektrophorese für primäre Cholangiozyten zeigten, dass bei 1 × 105 primären Cholangiozyten 0,02 U MNase bei 37 °C für 5 min zur Produktion von Mononukleosomen führte, was als optimale Konzentration identifiziert wurde (Abbildung 1).

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um die Dynamik des Chromatinzustands, die dem Zustandsübergang zystischer Cholangiozyten zugrunde liegt, systematisch und umfassend zu kartieren, ist es uns gelungen, ChIP-seq und ATAC-seq mit niedrigem Input für eine begrenzte Anzahl von primären Cholangiozyten zu optimieren. Obwohl sich diese Studie auf primäre Cholangiozyten konzentrierte, sind wir zuversichtlich, dass das Protokoll auch auf andere hochlebensfähige Primärzellen mit begrenzter Verfügbarkeit angewendet werden kann. In ä...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (82402166 to R.J.) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5 M EDTASolarbioE1170
1 M Tris-HCl (pH=7,5)SolarbioT1140
1 M Tris-HCl (pH=8,0)SolarbioT1150
3 M NaAcBeyotimeST342
8 M LiClSigmaL7026
Agarose-GelBiosharpBS081
ATAC DNA-Bibliothek VorbereitungskitVazymeTD501
CaCl2Sangon BiotechA5013301 M Lager
ChIP DNA-Bibliothek VorbereitungskitVazymeND607
DNA Saubere KügelchenVazymeN411
DNA-ExtraktionsreagenzSolarbioP1012
EGTASolarbioE8050100 mM (pH = 8) Lager
FluorometerInvitrogenQ33226
GlykogenThermo ScientificR0561
HämozytometerQIUJINGXB. K.25.
Igepal CA-630SigmaI889610% Lagerbestand
MagnetabscheiderPromegaZ5342
MgCl2Sangon BiotechA1002881,5 M Lagerbestand
MNaseSigmaN37550,01 U/µ L Lager
NaClSangon BiotechA6104765 M Lager
NP40SolarbioN8030
Nukleasefreies WasserLife TechnologiesAM9937
PCR-InstrumentApplied Biosystems4484073
PCR AufreinigungskitQIAGEN28106
ProteasehemmerRoche
Protein G KügelchenInvitrogen10004D
Proteinase KTransGenGE201-01
RotatorKylin-BellQB-528
SDSSolarbioS801010%  Lager
NatriumdesoxycholatSigmaS1827
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Referenzen

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