Ultraschall-Lokalisationsmikroskopie zur hochauflösenden Kartierung der Mikrogefäße des Nagetiergehirns

Zusammenfassung

Die Ultraschall-Lokalisationsmikroskopie (ULM) ist eine neu entwickelte Technik, die eine noch nie dagewesene Auflösung bei der Bildgebung der Mikrogefäße in vivo ermöglicht. In dieser Arbeit beschreiben wir im Detail, wie man mit Hilfe einer standardisierten funktionellen Ultraschall-Bildgebungsplattform, die für die präklinische Forschung entwickelt wurde, superaufgelöste Bilder der Mikrovaskulatur des Gehirns bei Nagetieren erhalten kann.

Zusammenfassung

Die Ultraschall-Lokalisationsmikroskopie (ULM) ist ein hochauflösendes Bildgebungsverfahren, das eine In-vivo-Visualisierung der mikrovaskulären Architektur des Gehirns ermöglicht und dabei die Beugungsgrenze des herkömmlichen Ultraschalls übertrifft. Durch die Erkennung und Verfolgung von intravenös injizierten Mikrobläschen während ihrer Zirkulation durch die Hirngefäße erstellt ULM hochauflösende Karten der Gefäßdichte, der Strömungsgeschwindigkeit und der rückgestreuten Signalamplitude auf räumlichen Skalen bis hinunter zu 5-10 μm. Dieses Protokoll stellt einen vollständigen Arbeitsablauf für die Durchführung von ULM-Bildgebung bei Nagetieren dar, einschließlich Tierpräparation, Sondenpositionierung, Bildaufnahme, Mikroblaseninjektion und Datenverarbeitung unter Verwendung einer speziellen funktionellen Ultraschallplattform. Es werden zwei Präparationsmethoden beschrieben, die für Mäuse (transkraniell) und Ratten (mit Schädelfenstern) angepasst sind, gefolgt von detaillierten Anweisungen zur Sondenausrichtung und anatomischen Zielbestimmung anhand eines integrierten Hirnatlas. Während der Erfassung werden ultraschnelle Ultraschallsequenzen mit Bolusinjektionen von Mikrobläschen synchronisiert, um dynamische Flussdaten zu erfassen. Nachfolgende Rekonstruktionsschritte umfassen Clutter-Filterung, Bildinterpolation, Mikroblasenerkennung, Subpixel-Lokalisierung und Trajektorienverfolgung. Zu den Ausgaben gehören Dichtekarten, die die Schiffsbelegung widerspiegeln, Geschwindigkeitskarten, die Strömungsmuster und Richtungsabhängigkeit zeigen, sowie Amplitudenkarten, die zusätzlichen Kontrast für die strukturelle Interpretation bieten. Repräsentative Ergebnisse veranschaulichen die erfolgreiche Akquisition über volle koronale Ebenen und verdeutlichen häufige Fallstricke wie schlechte Injektionsqualität, Bewegungsartefakte und schädelinduzierte Aberrationen. Das Protokoll ist sowohl mit Querschnitts- als auch mit Längsschnittstudien kompatibel und eignet sich besonders für die Untersuchung zerebrovaskulärer Veränderungen in Modellen für Alterung, Schlaganfall, Aneurysma und neurodegenerative Erkrankungen. Durch die Kombination von Tiefenpenetration, hoher raumzeitlicher Auflösung und markierungsfreier vaskulärer Bildgebung bietet ULM ein leistungsstarkes Werkzeug für die nicht-invasive Mikrozirkulationsanalyse des Gehirns in präklinischen Modellen.

Einleitung

Obwohl das Gehirn nur 2 % der Körpermasse ausmacht, verbraucht es etwa 20 % seines Sauerstoffs und Glukoses, um die neuronale Aktivität aufrechtzuerhalten¹. Dieser hohe metabolische Bedarf wird durch ein komplexes Gefäßnetzwerk gedeckt, das von großen Arterien und Venen bis hin zu Mikrogefäßen wie Arteriolen, Venolen und Kapillaren reicht und durch neurovaskuläre Kopplung reguliert^{wird 2}. Die Störung dieses fein abgestimmten Prozesses wurde mit einem breiten Spektrum neurologischer Erkrankungen in Verbindung gebracht. Die neurovaskuläre Entkopplung ist beispielsweise ein frühes pathologisches Merkmal bei Krankheiten wie Alzheimer, Parkinson, Huntington und Amyotropher Lateralsklerose (ALS), das oft den klassischen Kennzeichen der Neurodegeneration wie der Amyloid-Beta- und Tau-Pathologie vorausgeht 3,4,5,6. Die Abbildung der komplexen Natur des Gehirns in vivo war daher von primärem Anliegen, um dem wachsenden Bedarf an Verständnis physiologischer Prozesse gerecht zu werden. Technologische Fortschritte haben einzigartige Möglichkeiten geschaffen, um die Funktion und Aktivität des Gehirns sowohl direkt als auch indirekt mit zunehmender Präzision, Auflösung und Zugänglichkeit zu untersuchen.

Doppler-Ultraschall hat sich zu einem leistungsfähigen Werkzeug für die funktionelle Messung der Gehirnaktivität anhand des Blutflusses^{entwickelt 7}. Insbesondere die Power-Doppler-Bildgebung, die entwickelt wurde, um die Bewegung der roten Blutkörperchen (RBCs) zu erfassen, überträgt wiederholte Ultraschallimpulse an Blutgefäße und zeichnet die Amplitude von Ultraschallechos auf, die von bewegten RBCs^{zurückgestreut werden 8}. Das Aufkommen der ultraschnellen Ultraschallbildgebung, insbesondere des funktionellen Ultraschalls (fUS), markierte einen Dreh- und Angelpunkt bei der Überwindung bisheriger Einschränkungen. Tatsächlich wird beim herkömmlichen Ultraschall das Gewebe Zeile für Zeile abgetastet - ein sequentieller Ansatz, der seine Anwendung auf die großen Hirnarterien beschränkt, da der für die Mikrogefäße des Gehirns typische langsame Blutfluss nicht nachgewiesen werden^{kann 9}. Die neuere fUS-Technik verwendet mehrere Ebenenwellenübertragungen, um Tausende von Bildern pro Sekunde zu erfassen, wodurch sowohl die zeitliche Auflösung als auch das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) drastisch verbessert werden. Entscheidend ist, dass fUS die Detektion hämodynamischer Veränderungen in sehr kleinen Gefäßen mit Geschwindigkeiten von nur 1 mm/s ermöglicht und die funktionelle Bildgebung der Gehirnaktivität in Echtzeit bis auf die Ebene der Arteriolen unterstützt⁸.

Während ultraschnelle Dopplermethoden die mikrovaskuläre Bildgebung erheblich verbessert haben, sind sie immer noch durch die beugungsbegrenzte Auflösung von Ultraschall^{eingeschränkt 10}. In Verbindung mit der fUS durchbricht die Ultraschalllokalisationsmikroskopie (ULM) dieses Hindernis und ermöglicht die Visualisierung mikrovaskulärer Strukturen auf Kapillarebene durch den Einsatz von Kontrastmitteln und hochpräzisen Lokalisierungsalgorithmen¹¹. Dies ermöglicht beispiellose Einblicke in die Morphologie und Funktion der Gefäße. Genauer gesagt werden bei der ULM Kontrastmittel aus stabilisierten gasgefüllten Mikrobläschen mit einem Durchmesser von etwa 1-3 μm in den Blutkreislauf injiziert. Sie fungieren als starke akustische Streuer, die als einzelne Punktquellen detektiert werden können. Da Mikrobläschen deutlich kleiner als die Ultraschallwellenlänge sind, können sie räumlich und zeitlich isoliert werden, was als Punkt-Spreizungs-Funktion (PSF) des Systems erscheint. Inspiriert von optischen Superauflösungstechniken wie STORM und PALM wird die Subpixel-Lokalisierung dieser Mikrobläschen mit Hilfe von Dekonvolutionsmethoden erreicht, die ihre Positionen mit hoher Präzision^kartieren 10,12,13,14. Dies ermöglicht die Auflösung von Gefäßstrukturen mit einer räumlichen Auflösung von 5-10 μm, weit über der beugungsbedingten Grenze der herkömmlichen ultraschnellen Ultraschall-Leistungsdopplerbildgebung hinaus.

ULM ist ein leistungsfähiges und effektives Werkzeug für die Gefäßkartierung bis in den Kapillarbereich und überwindet die Grenzen vieler optischer Methoden, die auf oberflächliche Schichten beschränkt sind. Seine Fähigkeit, mikrovaskuläre Bildgebung an lebenden Tieren durchzuführen und longitudinale und pharmakologische Studien zu ermöglichen, ist ein weiterer wichtiger Vorteil der ULM gegenüber anderen Techniken, die eine Fixierung und Färbung des Gehirns erfordern. Die extrahierten Informationen gehen über statische Gefäßkarten hinaus und liefern quantitative Schätzungen des Blutflusses bis auf die Kapillarebene und eröffnen damit vielversprechende Wege sowohl für präklinische als auch für klinische Anwendungen. Um die Reproduzierbarkeit zu erleichtern, beschreiben wir einen vollständigen Arbeitsablauf für die ULM-basierte Bildgebung des Gehirns bei Nagetieren, der unter Verwendung einer standardisierten funktionellen Ultraschallbildgebungsplattform für die präklinische Forschung implementiert wurde.

Protokoll

Alle in dieser Studie beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaft vom 22. September 2010 (010/63/EU) durchgeführt und von der lokalen Ethikkommission (Comité d'éthique en matière d'expérimentation animale number 59, 'Paris Centre et Sud', project #2020-16) genehmigt. Die Experimente wurden an adulten männlichen C57BL/6 Rj-Mäusen (2 Monate alt, 20-30 g) und Sprague-Dawley Rj:Han-Ratten (200-300 g) durchgeführt, die im Handel bezogen wurden. Die Tiere wurden in Vierergruppen pro Käfig unter einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei einer konstanten Temperatur von 22 °C und mit Futter und Wasser ad libitum untergebracht. Vor Beginn der Versuche durchliefen alle Tiere eine mindestens einwöchige Eingewöhnungsphase an die Haltungsbedingungen. Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Tiere

1. Anästhesie und Vorbereitung von Tieren bei Mäusen
   1. Platzieren Sie die Maus in der Isofluran-Induktionskammer und verabreichen Sie 2 % Isofluran mit Luft (0,075 l/min) und Sauerstoff (0,175 l/min oder medizinischer Luft).
   2. Nach 5 Minuten Narkoseeinleitung wird das Tier in den stereotaktischen Rahmen gebracht, der über ein auf 37 °C eingestelltes Heizkissen gelegt wird, um die Körpertemperatur zu halten, und eine kontinuierliche Isofluranabgabe über eine Maske bei gleicher Konzentration und Durchflussrate gewährleisten.
   3. Bestätigen Sie die ausreichende Anästhesietiefe, indem Sie mit festem, aber nicht schädigendem Druck prüfen, ob keine Reflexe als Reaktion auf ein Zehen- oder Schwanzkneifen vorhanden sind. Wenn ein Reflex vorhanden ist, erhöhen Sie die Isoflurankonzentration leicht. Bewerten Sie erneut, bevor Sie fortfahren.
   4. Tragen Sie eine Augensalbe auf, um die Bildung des Grauen Stars zu verhindern.
   5. Rasieren Sie den Kopf der Maus mit einem Trimmer. Tragen Sie eine Enthaarungscreme auf, lassen Sie sie 1-1,5 Minuten einwirken, spülen Sie sie dann mit warmem Wasser ab und trocknen Sie sie mit Gaze. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf, bis alle Haare entfernt sind. Vermeiden Sie es, die Enthaarungscreme über einen längeren Zeitraum stehen zu lassen, da sie die Haut chemisch schädigen kann.
   6. Tragen Sie zentrifugiertes Ultraschallgel (blasenfrei, entgast) auf den Kopf auf, um eine akustische Kopplung zu gewährleisten.
2. Anästhesie und Tiervorbereitung bei Ratten
   1. Nach dem Wiegen der Ratte ist eine intraperitoneale Injektion einer Mischung aus Ketamin (75 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) mit einer 1-ml-Spritze zu verabreichen. Rasieren Sie das Fell auf dem Oberkopf und reinigen Sie die Haut mit einer Jodlösung.
      HINWEIS: Ketamin ist in vielen Ländern eine stark regulierte Substanz und erfordert möglicherweise eine spezielle Genehmigung für die Beschaffung und Verwendung. Alternative Anästhesieschemata können verwendet werden, um eine Anästhesie auf chirurgischem Niveau zu erreichen.
   2. Positionieren Sie das Tier auf einem stereotaktischen Gerät, das auf ein Heizkissen mit 37 °C eingestellt ist, um die Körpertemperatur zu halten. Tragen Sie eine großzügige Menge Augensalbe auf die Augen auf, um Austrocknung und Kataraktbildung zu verhindern.
   3. Injizieren Sie Meloxicam (2 mg/kg) subkutan mit einer 1-ml-Spritze zur intraoperativen Analgesie.
   4. Bestätigen Sie eine angemessene Anästhesietiefe, indem Sie mit festem, aber nicht schädigendem Druck prüfen, ob keine Reflexe als Reaktion auf ein Zehen- oder Schwanzkneifen vorhanden sind. Wenn ein Reflex vorhanden ist, verabreichen Sie eine zusätzliche Dosis, die einem Viertel der anfänglichen Anästhesiedosis entspricht. Warten Sie ca. 5 Minuten, bevor Sie die Anästhesietiefe erneut beurteilen. Fahren Sie nur fort, wenn eine chirurgische Anästhesieebene bestätigt wurde, und beurteilen Sie sie alle 20-30 Minuten neu.
   5. Machen Sie mit einem Skalpell einen Längsschnitt entlang der sagittalen Naht und stellen Sie sicher, dass der Schnitt tief genug ist, um die Haut und das Bindegewebe einzubeziehen, die mit dem Schädel verbunden sind.
   6. Halten Sie das umliegende Gewebe während der gesamten Operation mit physiologischer Kochsalzlösung gut hydratisiert.
   7. Zeichnen Sie mit einem Drehbohrer den Umriss des Schädelfensters leicht nach, indem Sie die Oberflächenschicht des Schädels markieren. Für einen optimalen Zugang zum Gehirn sollte das Fenster je nach Schädelgröße etwa 14 mm in der lateralen Dimension und mindestens 2 mm in der anteroposterioren Dimension betragen.
   8. Fräsen Sie weiter entlang der Kontur, bis kein Knochenwiderstand mehr vorhanden ist. Tragen Sie während des Bohrens regelmäßig einige Tropfen physiologische Kochsalzlösung auf, um den Knochen zu kühlen und thermische Schäden zu minimieren. Ein feiner, abgerundeter Spachtel sollte leicht und ohne Kraftaufwand in den Spalt eingeführt werden.
   9. Mit kurzen, einseitigen Reibbewegungen die letzte Knochenschicht verdünnen, bis der Widerstand kaum noch wahrnehmbar ist.
   10. Führen Sie einen dünnen, leicht gebogenen Spachtel mit abgerundeten Kanten an der Seitenkante des Schädelfensters ein.
   11. Bewegen Sie den Spatel langsam in Richtung Mitte und lösen Sie den Knochen vorsichtig von den Hirnhäuten. Sobald kein Widerstand mehr zu spüren ist, heben Sie das abgelöste Knochenstück an und entfernen Sie es vollständig.
   12. Tragen Sie zentrifugiertes Ultraschallgel auf die Dura auf. Eine Beschreibung des Versuchsaufbaus ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus für die ULM-Bildgebung des Gehirns bei Nagetieren. Das Bildgebungssystem besteht aus einer Ultraschallerfassungseinheit, die mit einer Hochfrequenzsonde verbunden ist, die auf einem motorisierten Positioniertisch montiert ist. Sowohl Mäuse als auch Ratten sind in stereotaktischen Frames dargestellt: Die Maus zeigt eine rasierte Kopfhaut für die transkranielle Bildgebung, während die Ratte durch ein chirurgisch präpariertes Schädelfenster abgebildet wird. Bei beiden Spezies wird ein Schwanzvenenkatheter zur Kontrastmittelinjektion gelegt. Dieser Aufbau ermöglicht die stabile Erfassung von hochauflösenden funktionellen Ultraschalldaten während der Mikroblaseninjektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Katheterisierung der Schwanzvene
   1. Verwenden Sie ein 27 G × 1/2" geflügeltes Infusionsset, das mit einer 18 G × 1/2" Nadel mit 8" Schlauch verbunden ist. Kürzen Sie den Schlauch, wenn möglich, um das Totvolumen zu minimieren.
   2. Drehen Sie den Schwanz des Tieres vorsichtig um 90 Grad, um die seitlichen Schwanzvenen freizulegen (siehe Abbildung 2). Befestigen Sie den Schwanz mit Klebeband, um die Stabilität zu gewährleisten und unnötige Bewegungen während der Katheterisierung zu vermeiden.
   3. Identifiziere die Schwanzvene, indem du am distalen Ende (Spitze des Schwanzes) beginnst und dich in Richtung Basis bewegst. Um diesen Schritt zu erleichtern, kann der Schwanz mit lauwarmem Wasser erwärmt werden, um die Vasodilatation zu fördern und die Sichtbarkeit der Venen zu verbessern.
   4. Üben Sie mit einem Finger sanften Druck auf die Basis des Schwanzes aus und schieben Sie ihn in Richtung der Injektionsstelle (d. h. gegen die Richtung des Blutflusses). Dieses Manöver behindert vorübergehend den venösen Rückfluss, wodurch sich die Schwanzvenen ausdehnen und stärker hervortreten, was das Einführen des Katheters erleichtert.
   5. Führen Sie die 27 G × 1/2" Nadel des geflügelten Infusionssets parallel zur Vene ein und stellen Sie sicher, dass die Abschrägung nach oben zeigt.
   6. Beobachten Sie den Schlauch auf das Vorhandensein von Blutrückschlüssen, was die korrekte Platzierung der Nadel bestätigt.
      HINWEIS: Beginnen Sie mit der Katheterisierung am distalen Ende, um Leckagen durch frühere Punktionen bei nachfolgenden Injektionen zu vermeiden. Wenn sich die Katheterisierung der Schwanzvene als schwierig oder erfolglos erweist, können alternative zentrale Wege in Betracht gezogen werden. Dazu gehören die Sinus retroorbitalis, die Vena jugularis oder die Vena saphena.

Abbildung 2: Querschnittsanatomie des Nagetierschwanzes, der die Gefäßmarkierungen für die Katheterisierung zeigt. Eine schematische Zeichnung eines Querschnitts durch den distalen Nagetierschwanz, die die relativen Positionen der großen Blutgefäße zeigt. In der Nähe der Mittellinie sind zwei Arterien vorhanden: die Arteria caudalis dorsal, die sich im oberen (dorsalen) Bereich befindet, und die Arteria caudalis ventralis, die sich im unteren (ventralen) Teil des Schwanzquerschnitts befindet. Diese Arterien werden in der Regel bei intravenösen Eingriffen vermieden. Flankiert werden die Arterien seitlich von den Schwanzvenen, die symmetrisch zu beiden Seiten verlaufen und knapp unter der Haut liegen, was sie zu den bevorzugten Zugangsstellen für die Katheterisierung oder Mikrobläscheninjektion macht. Diese anatomische Übersicht hilft bei der genauen Lokalisierung der Venen, insbesondere wenn sie durch Erwärmung zur Förderung der Vasodilatation verstärkt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Positionierung des Fühlers mit der IcoScan-Software
   1. Starten Sie auf der Erfassungsplattform die fUS-Erfassungssoftware (z. B. IcoScan für Iconeus One) und erstellen Sie eine Experimentiersitzung. Stellen Sie die Position der Ultraschallsonde ein.
      HINWEIS: Positionieren Sie die Sonde ca. 1 mm über dem Kopf des Tieres. Stellen Sie sicher, dass die Sonde mit dem Ultraschallgel in Kontakt kommt, bevor Sie mit der Bildgebungssequenz beginnen.
   2. Starten Sie die Live-View-Erfassung und passen Sie die Sondenposition nach Bedarf mithilfe der Echtzeit-Bildgebung des zerebralen Blutvolumens (CBV) an. Das Gehirn sollte auf das Bild zentriert sein. Optimieren Sie Bildgebungsparameter wie Kontrast und Kompression, um die Visualisierungsqualität zu verbessern.
   3. Öffnen Sie das Angio3D-Menü in der Erfassungssoftware. Passen Sie die Scan-Parameter (Erste Schnitte, Letzte Schicht und Schrittgröße) an und stellen Sie sicher, dass sie das gesamte Gehirn abdecken. Starten Sie die Akquise.
      HINWEIS: Achten Sie bei der Einstellung der Scan-Parameter darauf, dass der Scan den hinteren Teil des Gehirns, d. h. die gesamten hinteren Arterien, abdeckt.
   4. Lassen Sie die Erfassungssoftware geöffnet und starten Sie die IcoStudio-Software zur Datenanalyse und Visualisierung. Laden Sie den Angio3D-Scan .
   5. Wechseln Sie zum Bereich "Gehirnregistrierung " und registrieren Sie den Scan im Allen Mouse Common Coordinate Framework , indem Sie entweder den vollautomatischen oder den manuellen Registrierungsmodus verwenden.
   6. Speichern Sie die Registrierung als .bps-Datei.
   7. Gehen Sie als Nächstes zum Menü Gehirnnavigation . Verwenden Sie im Bedienfeld "Atlas-Manager " den Navigator "Übergeordneter/untergeordneter Baum", um den Inbus-Maus-Gehirnatlas zu durchsuchen. Wählen Sie die anatomischen Zielregionen aus, die dem Scan im 3-Ansichten-Panel überlagert werden.
   8. Wählen Sie eine Bildebene, die die interessierenden Bereiche überlappt. Legen Sie manuell zwei Marker in der Koronalansicht fest, um den Ziel-Bildgebungsschnitt zu definieren.
   9. Klicken Sie auf das Brain Positioning System (BPS), um die Motorkoordinaten zu extrahieren, die der Sondenposition für die Abbildung der ausgewählten Ebene entsprechen. Überprüfen Sie die Bildvorschau, die aus dem Angio3D-Scan berechnet wurde, und klicken Sie auf BPS-Koordinaten kopieren.
   10. Wechseln Sie zur IcoScan-Software und öffnen Sie das Bedienfeld für die Sondenpositionierung . Klicken Sie auf BPS-Koordinaten eingeben und fügen Sie die in Schritt 1.4.9 extrahierten Werte ein. Die Sonde bewegt sich automatisch und richtet sie an der ausgewählten Bildebene aus.
   11. Führen Sie eine Live View-Erfassung durch, um zu bestätigen, dass die aktuelle Bildebene mit der vorhergesagten Ebene aus Schritt 1.4.8 übereinstimmt.
       HINWEIS: Durch das Speichern und Wiederverwenden derselben räumlichen Marker kann die Bildgebungsebene über Sitzungen hinweg konsistent neu definiert werden, was eine genaue Neupositionierung der Sonde für Längsschnittstudien ermöglicht.

2. ULM-Akquisition

1. Vorbereitung der Mikrobläschen
   HINWEIS: Es kann eine Vielzahl von handelsüblichen Ultraschallkontrastmitteln verwendet werden. Die Gaszusammensetzung, die Blasenkonzentration, der Durchmesser und die Stabilität können jedoch je nach verwendetem Produkt variieren. Bitte beachten Sie die Empfehlungen des Herstellers zur Zubereitung und Lagerung.
   1. Injizieren Sie mit einer sterilen Spritze 5 ml 0,9%ige Natriumchloridlösung durch das Septum in die Durchstechflasche.
      HINWEIS: Bei wiederholten Bolusverabreichungen oder kontinuierlicher Infusion kann ein geringeres Volumen von 0,9% Natriumchloridlösung verwendet werden, um eine konzentriertere Mikroblasensuspension herzustellen. Passen Sie den Verdünnungsfaktor entsprechend der beabsichtigten Anwendung an.
   2. Rühren Sie das Fläschchen 20 s lang kräftig um, um die Mikrobläschen vollständig zu resuspendieren und eine gleichmäßige Dispersion zu erzielen.
2. ULM-Aufnahme
   1. Definieren Sie die Aufnahmeparameter, einschließlich der Ultraschallsequenz, der Bildrate und der Gesamtaufnahmezeit.
      HINWEIS: Empfohlene Parameter für die Aufnahme sind 5-10 min bei 2,5 Hz.
   2. Zeichnen Sie das Volumen der zu injizierenden Mikrobläschen und starten Sie die Erfassung. Sobald die Akquisition begonnen hat, fahren Sie mit der Mikroblaseninjektion fort. Es wird empfohlen, 200 μl für Ratten und 100 μl für Mäuse in geeigneter Verdünnung zu injizieren.
   3. Bestätigen Sie die Kontrastverbesserung im Live View-Bild. Spülen Sie unmittelbar danach die verbleibenden Mikrobläschen im Totvolumen, indem Sie physiologische Flüssigkeit in den Katheter injizieren. Ein typisches Beispiel für ein Intensitätsprofil der Mikroblase ist in Abbildung 3 dargestellt.
   4. Warten Sie, bis die Erfassung abgeschlossen ist, und speichern Sie die Daten.
   5. Am Ende der Erfassung gehen Sie je nach verwendetem Protokoll wie folgt vor:
      1. Bei Mäusen (nicht-invasives Protokoll): Kehren Sie die Anästhesie um, indem Sie die Verabreichung von Isofluran abbrechen und das Tier während der Genesung in einer warmen Umgebung überwachen, bis es vollständig wach ist.
      2. Bei Ratten (invasives Protokoll mit Schädelfenster): Euthanasthan des Tieres durch intraperitoneale Injektion von Euthasol (Pentobarbital-Natrium, 140 mg/kg), in Übereinstimmung mit institutionellen und ethischen Richtlinien.

Abbildung 3: Signalintensität der Mikroblase im Laufe der Zeit. (A) Illustration der für die Signalextraktion verwendeten Region of Interest (ROI), die den gesamten koronalen Hirnschnitt umfasst. (B) Zeitverlauf der Signalintensität der Mikroblase während einer 5-minütigen Erfassung. Der Mikroblasenbolus wurde bei 30 s injiziert, was zu einem charakteristischen Anstieg der Signalamplitude führte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Bildrekonstruktion mit der Software IcoLab

1. Öffnen Sie IcoLab und navigieren Sie zu ULM, indem Sie auf die Registerkarte ULM ganz links auf dem Bildschirm klicken.
2. Klicken Sie auf ULM-Maps berechnen , um den Verarbeitungs-Workflow zu starten, wie in Abbildung 4 dargestellt.
3. Wählen Sie den Quellordner aus, der die erfassten Daten enthält.
4. Wählen Sie den zu verarbeitenden Scan aus und passen Sie bei Bedarf die Grenzen der Verarbeitungszeit an.
5. Klicken Sie auf Weiter , um mit dem Schritt Berichterstellung fortzufahren. Konfigurieren Sie im Schritt Berichterstellung den Ausgabeordnerpfad, in dem die verarbeiteten Dateien gespeichert werden. Legen Sie die Visualisierungsparameter für die Bilder fest, die in den PowerPoint-Bericht aufgenommen werden sollen.
6. Überprüfen Sie die Zusammenfassung der ausgewählten Optionen, die auf dem letzten Bildschirm angezeigt wird.
7. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf AUSFÜHREN , um die Verarbeitung zu starten. Sobald die Verarbeitung abgeschlossen ist, wird eine .trk-Datei generiert, die alle Koordinaten der lokalisierten Mikroblasen enthält, zusammen mit gerasterten TIFF-Dateien für Dichte, Geschwindigkeit und Rückstreuamplitude (BSA).
   HINWEIS: Eine 5-minütige Erfassung kann mehrere Stunden Verarbeitung erfordern. Dieser Schritt wird am besten über Nacht oder auf einer dedizierten Workstation durchgeführt.
   1. Generierung von Mikrobläschendichtekarten: Lokalisierte Positionen aller detektierten Mikrobläschen werden über die gewählte Erfassungszeit akkumuliert. Ordnen Sie diese Positionen einem räumlichen Raster mit fester Auflösung zu.
      HINWEIS: Jedes Pixel in der resultierenden Dichtekarte spiegelt die Anzahl der Mikrobläschen wider, die in diesem räumlichen Abschnitt lokalisiert sind. Die endgültige Ausgabe ist ein Graustufenbild (TIFF), bei dem die Pixelintensität der Gefäßbelegung entspricht und eine hochauflösende Rekonstruktion des Gefäßnetzwerks ermöglicht.
   2. Generierung von Geschwindigkeitskarten: Die Software verfolgt einzelne Mikrobläschen über aufeinanderfolgende Frames hinweg, um Trajektorien zu bilden. Für jede Trajektorie berechnet die Software einen Geschwindigkeitsvektor, indem sie die Verschiebung durch die verstrichene Zeit dividiert (was einen Geschwindigkeitsvektor in mm/s ergibt).
      HINWEIS: Es können zwei Arten von Geschwindigkeitskarten erstellt werden: absolute Geschwindigkeitskarten, bei denen jedes Pixel die durchschnittliche Geschwindigkeitsgröße der Mikroblasen speichert, die sie passieren, und Richtungsgeschwindigkeitskarten, bei denen die Geschwindigkeit entlang einer ausgewählten anatomischen Achse (d. h. x oder z) zerlegt und die entsprechende signierte Komponente gespeichert wird. Diese Maps werden auf demselben räumlichen Raster gerastert und als einzelne TIFF-Bilder gespeichert.
   3. Generierung von BSA-Karten: Für jede lokalisierte Mikroblase wird die Rohamplitude des Ultraschallsignals (Rückstreuintensität) angezeigt. Projizieren Sie diese Amplituden auf das räumliche Raster und akkumulieren Sie die Signalintensität in jedem Pixel. Die resultierende BSA-Karte hebt Bereiche hervor, in denen Mikrobläschen durch den Fokusbereich des Strahls gingen, und bietet einen Kontrast, der die Dichte- und Geschwindigkeitskarten¹⁵ ergänzt.

Abbildung 4: Flussdiagramm der Verarbeitungspipeline für die ULM-Kartenrekonstruktion. Die Abbildung veranschaulicht die sequenziellen Verarbeitungsschritte, die in der Analysesoftware durchgeführt werden, um ULM-Karten aus Ultraschallrohdaten zu generieren. Ausgehend von zusammengesetzten Frames (n = 200) wendet Schritt 1 die Singulärwertzerlegungsfilterung (SVD) an, um Mikroblasensignale (MB) aus dem Gewebehintergrund zu isolieren. In Schritt 2 werden die MB-Signale einer Lanczos-Interpolation unterzogen, was zu einem vorverarbeiteten Bildstapel führt. Schritt 3 führt eine lokale Maxima-Detektion durch und korreliert diese mit der Point Spread Function (PSF) des Systems, um mögliche Mikroblasenpositionen zu identifizieren. In Schritt 4 werden Subpixel-Lokalisierung (Schwerpunktdetektion) und Partikelverfolgung verwendet, um Mikroblasentrajektorien zu extrahieren, aus denen Karten der Geschwindigkeit und der Rückstreuamplitude berechnet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Datenvisualisierung mit der Software IcoStudio

1. Laden Sie eine .trk-Datei in IcoStudio, um mit der Datenexploration zu beginnen.
2. Passen Sie Visualisierungsparameter wie Kontrast, Komprimierung und Farbzuordnung im rechten Bereich an, um die Datendarstellung zu verfeinern.
3. Legen Sie die Integrationszeit fest, indem Sie den Doppelschieberegler am unteren Rand der Hauptansicht verwenden, um die Start- und Endframes zu definieren.
4. Öffnen Sie die Registerkarte Dichte , um das Vorkommen von Mikroblasen anzuzeigen, und wählen Sie zwischen Absolute Dichte (Anzahl pro Pixel) und Richtungsdichte (axial gewichtet).
5. Verwenden Sie die Registerkarte Geschwindigkeit, um die Geschwindigkeit der Mikroblase in mm/s in mehreren Modi anzuzeigen: Absolut, Richtung, Axial und Lateral. Passen Sie Kontrast-, Kompressions- und Geschwindigkeitsschwellenwerte an, um die Visualisierung zu verbessern.
6. Entdecken Sie die Registerkarte BSA, um das Reflexionsvermögen der Mikroblase zu visualisieren und einen alternativen Kontrastmechanismus bereitzustellen, der mikrovaskuläre Strukturen und Bewegungen außerhalb der Ebene hervorhebt. Exportieren Sie hochauflösende PNG-Screenshots oder generieren Sie TIFF-Dateien für die quantitative Analyse mit anpassbaren Einstellungen für Pixelgröße und Datentyp.

Ergebnisse

Die repräsentativen Beispiele in Abbildung 5 zeigen ein typisches Beispiel für ULM-Daten eines Rattengehirns, das nach einer 200-μl-Bolusinjektion mit einer Auflösung von 10 μm über eine Aufzeichnungszeit von mehr als 1 Minute aufgenommen wurde.

Abbildung 5: Repräsentative ULM-Outputs, die von einer kraniotomierten Ratte nach einer einzigen Mikroblaseninjektion gewonnen wurden. Beispielkarten der Mikroblasendichte (MB) (links), der Geschwindigkeit (Mitte) und der rückgestreuten Amplitude (rechts) sind für einen vollständigen koronalen Hirnschnitt dargestellt, der über einen Zeitraum von 1 Minute nach einer 200-μl-Bolusinjektion von Mikrobläschen aufgenommen wurde. Maßstabsleiste: 2 mm. Vergrößerte Einschübe heben das linke kortikale Mikrovaskulatur hervor (Maßstabsbalken: 0,5 mm). Die Dichtekarte spiegelt die räumliche Verteilung der MB-Vorkommen wider und zeigt die Struktur des Gefäßnetzwerks. Die Geschwindigkeitskarte veranschaulicht die Strömungsgeschwindigkeit und die Richtungsabhängigkeit einzelner MB und ermöglicht so eine Unterscheidung zwischen den Schiffstypen. Die Amplitudenkarte zeigt das rückgestreute Ultraschallsignal von MBs und bietet einen zusätzlichen Kontrastmechanismus, der die Visualisierung der Gefäßmorphologie und der Bewegung außerhalb der Ebene verbessert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die resultierenden Karten veranschaulichen drei komplementäre Ansichten der zerebralen Mikrovaskulatur: Mikroblasendichte (MB) (links), Geschwindigkeit (Mitte) und rückgestreute Amplitude (rechts). Jede Karte entspricht einem vollständigen koronalen Schnitt des Gehirns, wobei vergrößerte Einschübe das linke kortikale Mikrovaskulatur hervorheben (Maßstabsbalken: 2 mm bzw. 0,5 mm).

Die Dichtekarte zeigt die räumliche Verteilung der MB-Vorkommen über das Sichtfeld. Die Gefäßmorphologie ist weit unterhalb der Beugungsgrenze aufgelöst und zeigt sowohl große Gefäße als auch feine Kapillarstrukturen. Diese Art von Karte ermöglicht eine klare Visualisierung der Topologie des vaskulären Netzwerks, einschließlich Bifurkationen und Verzweigungsmustern, selbst in tiefen kortikalen Regionen.

Das Geschwindigkeitskennfeld zeigt die Strömungsgeschwindigkeit einzelner MB an, die entlang der axialen (z) Richtung projiziert werden. Diese Projektion erzeugt Geschwindigkeitswerte mit Vorzeichen, wobei negative Geschwindigkeiten die Aufwärtsströmung in den Kortex und positive Werte die Abwärtsströmung widerspiegeln. In der Großhirnrinde von Nagetieren ist die Gefäßarchitektur stark stereotyp: Penetrierende Arteriolen steigen von der Pialoberfläche in die kortikalen Schichten ab, während Venolen von der Hirnrinde zurück an die Oberfläche aufsteigen, um sauerstoffarmes Blut abzuleiten¹⁶. Diese konsistente anatomische Anordnung ermöglicht die Verwendung von Richtungsgeschwindigkeitsmessungen zur Unterscheidung zwischen Gefäßtypen, wobei positive Axialgeschwindigkeiten typischerweise den arteriellen Fluss und negative Geschwindigkeiten eine venöse Drainage anzeigen. Insgesamt stimmen die mit ULM gemessenen Geschwindigkeitswerte mit den zuvor in der Literatur berichteten Bereichen überein^10,17 und reichen von 10-20 mm/s in penetrierenden Arteriolen bis zu mehreren Zentimetern pro Sekunde in großen intrakraniellen Arterien. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit früheren Beobachtungen, dass fließende Mikrobläschen das rheologische Verhalten der roten Blutkörperchen genau nachahmen¹⁸, was die Verwendung von ULM zur Quantifizierung der physiologischen Blutflussdynamik auf der Mikroskala bestätigt.

Die BSA-Karte (Backscattered Amplitude) bietet eine räumliche Darstellung der Ultraschallsignalintensität, die von jedem MB zurückgegeben wird. Da die rückgestreute Energie maximiert wird, wenn MBs den Fokusbereich passieren, bietet diese Karte einen Kontrast basierend auf der Höhenposition. Es hilft bei der Verfeinerung der Segmentierung, indem es Gefäße außerhalb der Ebene oder Gefäße mit geringer Amplitude identifiziert, insbesondere in größeren Tiefen oder in der Nähe der Fokuskanten. BSA-Karten sind auch wertvoll für die Erkennung tiefenbezogener Signaldämpfung oder die Identifizierung von Fehlanpassungen in der Fokusausrichtung¹⁵.

Um die Reproduzierbarkeit des Plane-Targetings mit dem Brain Positioning System zu demonstrieren, zeigt Abbildung 6A ULM-Gefäßdichtekarten, die an Tag 0 (Woche 1) und Tag 7 (Woche 2) unter Narkose von derselben Maus aufgenommen wurden und auf dieselbe koronale Ebene abzielen. Die Überlagerung beider Karten zeigt eine starke räumliche Übereinstimmung des vaskulären Signals, was die Präzision der Ebenenrepositionierung und die Zuverlässigkeit von Längsschnittexperimenten bestätigt, wie zuvor gezeigt^{wurde 19}.

Die quantitative Analyse kann auf jede dieser Ausgaben angewendet werden. Zum Beispiel können Benutzer Gefäße mithilfe von Intensitätsschwellenwerten oder Clustering-Algorithmen segmentieren und dann regionale Statistiken wie Gefäßdichte, durchschnittliche Strömungsgeschwindigkeit und morphometrische Parameter wie Gefäßradius, durchschnittliche Länge, Anzahl der Verzweigungen und andere strukturelle Deskriptoren des Gefäßnetzwerks extrahieren. Vergleiche zwischen kortikalen Regionen oder experimentellen Gruppen (z. B. medikamenteninjiziert vs. Kontrolle) können direkt auf diesen Karten oder durch abgeleitete parametrische Statistiken an häufig identifizierten Gefäßen durchgeführt werden^20,21. Als Beispiel für eine solche Analyse führten wir regionale Quantifizierungen von Gefäßparametern im linken somatosensorischen Kortex (S1BF, Abbildung 6B) und im linken Thalamus (Abbildung 6C) durch. Die Dichtekarten wurden zunächst binarisiert, skelettiert und die Gefäßradien mit Hilfe einer euklidischen Entfernungstransformation geschätzt. Die Strömungsgeschwindigkeiten wurden direkt aus den MB-Trajektorien abgeleitet, und die Strömungsgeschwindigkeit wurde aus dem Behälterradius unter Verwendung des Poiseuilleschen Gesetzes abgeleitet, wie zuvor beschrieben²¹. Die gleiche Methodik, die in dieser Studie beschrieben wurde, wurde hier angewendet. Whisker-Diagramme zeigen die Verteilungen von Gefäßradius, Geschwindigkeit und Durchflussrate für d0 und d7 an, was eine gute Reproduzierbarkeit über Sitzungen hinweg zeigt. Zusammen ermöglichen diese multimodalen ULM-Ergebnisse eine umfassende Charakterisierung des mikrovaskulären Netzwerks des Gehirns und bieten sowohl anatomische als auch dynamische Einblicke mit beispielloser Auflösung.

Abbildung 6: Längsschnittliche Reproduzierbarkeit von Plane-Targeting und Beispiel für vaskuläre Quantifizierungen mit dem Brain Positioning System. (A) ULM-Gefäßdichtekarten, die von derselben anästhesierten Maus an Tag 0 (Woche 1) und Tag 7 (Woche 2) aufgenommen wurden und mit dem Brain Positioning System (Maßstabsbalken = 1 cm) auf dieselbe koronale Ebene abzielen. Die Überlagerung beider Karten zeigt eine starke räumliche Entsprechung des vaskulären Signals, was die Reproduzierbarkeit der Ebenenpositionierung über Sitzungen hinweg veranschaulicht. (B,C) Repräsentative Quantifizierung von vaskulären Parametern, die aus zwei interessierenden Regionen extrahiert wurden: linker somatosensorischer Kortex (S1BF, B) und linker Thalamus (C). Für jede Region zeigen wir die Karte der vaskulären Dichte bei d0 (Maßstabsbalken = 0,5 cm) zusammen mit Whisker-Diagrammen, die die Verteilung des Gefäßradius (μm), der Strömungsgeschwindigkeit (mm/s) und der Flussrate (mm³/s) bei d0 und d7 zeigen (Median, 25.-75. Perzentil, Whisker = 1,5×IQR, Ausreißer einzeln aufgetragen). Diese Ergebnisse verdeutlichen die Fähigkeit der Pipeline, morphometrische und hämodynamische Metriken aus den ULM-Daten zu extrahieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die Ultraschall-Lokalisationsmikroskopie (ULM) stellt einen transformativen Fortschritt in der Ultraschallbildgebung dar und ermöglicht eine hochauflösende Visualisierung des Mikrogefäßsystems jenseits der konventionellen Beugungsgrenze. Diese Diskussion beleuchtet die kritischen Schritte im ULM-Protokoll, befasst sich mit potenziellen Modifikationen und Fehlerbehebungsstrategien, untersucht die Grenzen der Methode, bewertet ihre Bedeutung im Vergleich zu alternativen Bildgebungsmodalitäten und betrachtet ihre Bedeutung und potenzielle Anwendungen in der biomedizinischen Forschung.

Kritische Schritte im ULM-Protokoll

Für die erfolgreiche Implementierung von ULM sind mehrere Schritte entscheidend, deren Einfluss in Abbildung 7 dargestellt ist. Einer der wichtigsten Schritte ist die Verabreichung von Mikrobläschen, da sowohl die Konzentration als auch die Verabreichungsqualität die Bildgebungsergebnisse direkt beeinflussen. Eine optimale Konzentration ist notwendig, um die räumliche Auflösung und die Detektierbarkeit in Einklang zu bringen. Eine unzureichende Verabreichung, wie z. B. eine schlechte Katheterplatzierung oder Extravasation, kann zu einem sehr geringen Gefäßsignal und unvollständigen Rekonstruktionen führen, wie in Abbildung 7B gezeigt, bei der nur eine geringe Anzahl von Mikrobläschen den Blutkreislauf erreicht. Die Bildgebung mit hohen Bildraten, typischerweise im Kilohertz-Bereich, ist unerlässlich, um die schnelle Bewegung von Mikroblasen zu erfassen und eine zuverlässige Verfolgung über Bilder hinweg zu ermöglichen. Jede Instabilität während der Erfassung, wie z. B. Bewegungen durch die Atmung, schlechte Fixierung oder unzureichende Anästhesie, kann die Lokalisationsgenauigkeit beeinträchtigen. Ein Beispiel dafür ist in Abbildung 7C dargestellt, wo übermäßige Bewegung während der Aufnahme zu einem verschwommenen und unbrauchbaren Dichte-Map führt.

Die Lokalisierung und Verfolgung von Mikroblasen hängt von fortschrittlichen Bildverarbeitungsalgorithmen ab, die einzelne Blasen erkennen, Subpixel-Lokalisierungen durchführen und Trajektorien mit Subbeugungspräzision rekonstruieren. Selbst bei korrekter Erfassung und Verarbeitung können anatomische Faktoren wie schädelinduzierte Aberrationen die Bildqualität beeinträchtigen. In der transkraniellen Bildgebung, insbesondere bei älteren Mäusen, kann eine Schädelverdickung zu akustischen Verzerrungen führen. Dies führt zu charakteristischen Verschattungsartefakten unter der sagittalen Naht, wo keine Mikrobläschen nachgewiesen werden, wie in Abbildung 7D dargestellt. Solche Aberrationen verringern das Signal-Rausch-Verhältnis und können Gefäßstrukturen verschleiern, wenn sie nicht durch adaptive Filterung oder durch Verfeinerung der Sondenplatzierung korrigiert werden.

Wenn alle Schritte erfolgreich durchgeführt werden, sind qualitativ hochwertige ULM-Karten möglich, wie in Abbildung 7A gezeigt, wo ein dichtes und gut aufgelöstes Gefäßnetzwerk durch einen transkraniellen Zugang rekonstruiert wird.

Abbildung 7: Referenz- und Fehlerbehebungsbeispiele für die ULM-Bildgebungsqualität bei Mäusen. Panel (A) zeigt eine hochwertige transkranielle ULM-Mikroblasen-Dichtekarte (MB), die an einer jungen erwachsenen Maus aufgenommen wurde und eine erfolgreiche Gefäßkartierung über die gesamte koronale Ebene veranschaulicht. Panel (B) zeigt ein Beispiel für ein schlechtes vaskuläres Signal aufgrund von Mikroblasen-Extravasation oder unzureichendem venösen Zugang, was zu spärlichen MB-Detektionen führt. Panel (C) zeigt eine Erfassung, die durch übermäßige Tierbewegung beeinflusst wurde, was zu einer verschwommenen und nicht interpretierbaren Dichtekarte führt. Panel (D) hebt die schädelinduzierte akustische Aberration hervor, die häufig bei älteren Mäusen beobachtet wird und als Schattenkegel unter der sagittalen Naht sichtbar ist, wo aufgrund des reduzierten Signal-Rausch-Verhältnisses keine MBs nachgewiesen werden. Diese Beispiele dienen als visuelle Referenz für die Identifizierung und Adressierung häufiger experimenteller Artefakte in der ULM-Bildgebung. Maßstabsleiste: 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Einschränkungen der Methode

Trotz seiner vielen Vorteile hat ULM inhärente Einschränkungen, die sich auf seine Anwendbarkeit auswirken. Die Verzerrung von Gefäßen außerhalb der Ebene ist ein wesentliches Problem in der 2D-Bildgebung, da Gefäße, die sich außerhalb der Bildgebungsebene erstrecken, nicht angemessen rekonstruiert werden, was zu unvollständigen Gefäßkarten führt. Diese Einschränkung kann durch den Übergang zu volumetrischen (3D) Bildgebungsansätzen²² gemildert werden, obwohl dies die Rechenkomplexität erhöht. Die Herausforderungen bei der intravenösen Katheterisierung stellen ebenfalls eine Hürde dar, insbesondere in Kleintiermodellen, bei denen das Erreichen einer konsistenten Mikroblasenabgabe technisch anspruchsvoll sein kann. Die Stabilität der Mikroblase ist ebenfalls ein limitierender Faktor, insbesondere bei längeren Bildgebungssitzungen. Aufgrund ihrer kurzen Zirkulationshalbwertszeit können Mikrobläschen wiederholte Bolusinjektionen oder kontinuierliche Infusionsprotokolle erfordern, um einen angemessenen Kontrast während des gesamten Erfassungszeitraums aufrechtzuerhalten. Bewegungsartefakte sind nach wie vor ein großes Problem, insbesondere bei wachen Probanden, bei denen selbst kleine unwillkürliche Bewegungen die hochauflösende Bildgebung beeinträchtigen können. Schließlich ist die Tiefeneindringtiefe bei ULM von Natur aus durch die Ultraschalldämpfung begrenzt. Während dies für die Bildgebung von Nagetieren bei hohen Frequenzen (z. B. 15 MHz) im Allgemeinen nicht problematisch ist, wird es bei größeren Tieren wie Schweinen oder nichtmenschlichen Primaten schwieriger. In diesen Fällen können Sonden mit niedrigerer Frequenz erforderlich sein, um eine ausreichende Bildgebungstiefe zu erreichen, aber dies geht auf Kosten einer geringeren räumlichen Auflösung, was einen wichtigen Kompromiss zwischen Tiefe und Detailgenauigkeit unterstreicht, der bei der Übertragung von ULM auf größere präklinische Modelle berücksichtigt werden muss.

Bedeutung von ULM im Vergleich zu bestehenden Methoden

Die Ultraschall-Lokalisationsmikroskopie (ULM) bietet insbesondere im Rahmen der mikrovaskulären Bildgebung erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen bildgebenden Verfahren. Zu seinen bemerkenswertesten Stärken gehört seine Fähigkeit, die Beugungsgrenze des herkömmlichen Ultraschalls zu überschreiten und eine Subbeugungsbildgebung auf räumlichen Skalen zu erreichen, die mit optischen Techniken wie der Zwei-Photonen-Mikroskopie vergleichbar ist. Im Gegensatz zu diesen optischen Methoden ermöglicht ULM jedoch eine tiefere Gewebepenetration und ermöglicht den Zugang zu Hirnregionen, die sonst nur schwer nichtinvasiv sichtbar sind.

ULM bietet auch funktionelle Bildgebungsfunktionen, die die quantitative Beurteilung der Blutflussgeschwindigkeit, der Perfusionsdynamik und des Gefäßumbaus ermöglichen. Aufgrund dieser Eigenschaften eignet es sich hervorragend für die Untersuchung sowohl physiologischer Prozesse als auch pathologischer Veränderungen in neurovaskulären Netzwerken. Im Vergleich zu MRT und PET ist ULM kostengünstiger, erfordert keine umfangreiche Infrastruktur und vermeidet den Einsatz von Kontrastmitteln mit bekannten Toxizitätsrisiken, indem es stattdessen auf gasgefüllte Mikrobläschen mit günstigen Sicherheitsprofilen setzt.

Die Kombination aus hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung macht ULM besonders wertvoll für eine Reihe von Forschungsanwendungen. Es ist besonders leistungsfähig in Studien, die auf mikrovaskuläre Strukturen und tiefe Hirnkerne abzielen, wo traditionelle Modalitäten oft unzureichend sind. Darüber hinaus ermöglicht ULM im Gegensatz zu histologischen Ansätzen, die eine Gewebefixierung und -färbung erfordern, die Echtzeit-Bildgebung bei lebenden Tieren und unterstützt Längsschnittdesigns und dynamische Eingriffe wie pharmakologische Herausforderungen.

Neben der statischen Gefäßkartierung ermöglicht ULM auch eine hochauflösende funktionelle Bildgebung, indem es die Dynamik des zerebralen Blutflusses mit außergewöhnlicher räumlicher und zeitlicher Präzision erfasst. Jüngste Fortschritte haben seine Machbarkeit für die funktionelle Neurobildgebung des gesamten Gehirns bei Nagetieren gezeigt und reizevozierte und spontane aktivitätsabhängige Veränderungen des Blutflusses auf Kapillarebene in verteilten Gehirnnetzwerken aufgedeckt². Dies positioniert ULM als leistungsfähiges Werkzeug für funktionelle Studien und schließt effektiv die Lücke zwischen mesoskaliger hämodynamischer Bildgebung und neuronaler Aktivitätskartierung.

Überlegungen zu Benutzerfreundlichkeit, Effizienz und Reproduzierbarkeit

Der in diesem Protokoll beschriebene ULM-Workflow wurde für eine einfache Implementierung und Reproduzierbarkeit über verschiedene Versuchsaufbauten hinweg optimiert. Die Verwendung kommerziell erhältlicher Komponenten, einschließlich FDA- und EMA-zugelassener Mikrobläschen und Standardanästhesieverfahren für Nagetiere, gewährleistet eine breite Zugänglichkeit. Darüber hinaus verbessert die Integration der gesamten Verarbeitungspipeline in die dedizierte Software (IcoLab) die Benutzerfreundlichkeit erheblich, indem komplexe Schritte wie die Lokalisierung von Mikroblasen, die Rekonstruktion von Trajektorien und die Kartenerstellung automatisiert werden. Diese optimierte Benutzeroberfläche reduziert den Bedarf an benutzerdefiniertem Code und minimiert Benutzereingriffe, wodurch konsistente Ergebnisse über Benutzer und Experimente hinweg unterstützt werden. Während die hochauflösende ULM-Verarbeitung rechenintensiv ist, insbesondere bei langen Erfassungen oder volumetrischen Daten, reduzieren Batch-Verarbeitungstools und GPU-Beschleunigung die Analysezeit erheblich. Der modulare Aufbau des Protokolls unterstützt auch die Reproduzierbarkeit und ermöglicht es Forschern, die Erfassungs- und Verarbeitungsparameter fein abzustimmen, während ein robuster analytischer Rahmen beibehalten wird. Das Protokoll enthält auch einen speziellen Abschnitt zur Sondenpositionierung mit IcoScan und IcoStudio, der es dem Benutzer ermöglicht, die Sonde über Sitzungen hinweg zuverlässig an genau derselben Bildgebungsschicht mit einer Genauigkeit von ca. 100 μm neu zu positionieren. Diese Eigenschaft ist besonders wertvoll für Längsschnittstudien, bei denen eine präzise räumliche Konsistenz für die Verfolgung von Gefäßveränderungen im Laufe der Zeit unerlässlich ist. Diese Funktionen senken die Einstiegshürde für neue Anwender und unterstützen den skalierbaren Einsatz von ULM sowohl in explorativen als auch in longitudinalen Bildgebungsstudien.

Schlussfolgerung

Dieses Protokoll stellt einen vollständigen Arbeitsablauf für die Implementierung der Ultraschall-Lokalisationsmikroskopie (ULM) in der Bildgebung des Nagetierhirns dar, der die chirurgische Vorbereitung, die Verabreichung von Mikroblasen, die Bildaufnahme und die hochauflösende Gefäßkartierung unter Verwendung einer standardisierten Erfassungs- und Analyseplattform umfasst, die für die präklinische Forschung optimiert ist. ULM stellt einen großen Fortschritt in der biomedizinischen Bildgebung dar und bietet eine hochauflösende In-vivo-Visualisierung des Mikrogefäßsystems mit beispielloser Detailgenauigkeit. Im Vergleich zu bestehenden bildgebenden Verfahren bietet ULM eine einzigartige Kombination aus hoher räumlicher Auflösung, funktioneller Flussquantifizierung und Zugänglichkeit, wodurch es sich besonders gut für Studien der Gefäßentwicklung, der neurovaskulären Kopplung und der Pathophysiologie der Krankheit eignet. Mit zunehmender Reife der Technologie ist ULM bereit, zu einem Eckpfeiler sowohl in der präklinischen Forschung als auch in der klinischen Neurobildgebung zu werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Tiertemperaturregler (Heizplatte gekoppelt mit rektaler Sonde)	Physitemp	TCAT-2DF
Atipamezol	Orion Pharma, Frankreich	Antisedan	5 mg/mL injizierbare Lösung
C57BL/6 Mäuse	Janvier Labs	SC-C57J-M	C57BL/6Rj männliche Mäuse, 8 Wochen alt
Zahnbohrer	Foredom, USA	K.1070 Hochgeschwindigkeits-Rotations-Mikromotor-Kit
Enthaarungscreme	Vichy	N/A
Augensalbe	TVM, Großbritannien	Ocry-Gel
Haarschneider	Phymep	ISIS GT 421 Aesculap
IcoLab-Verarbeitungssoftware (v 1.2.0.0)	Ikoneus, Frankreich	IcoLab
Iconeus One Xpand Konfiguration	Ikoneus, Frankreich	IconeusOne Xpand
IcoPrime 15MHz-Sonde	Ikoneus, Frankreich	IcoPrime-15MHz-Sonde
IcoScan-Akquisitionssoftware (v1.9.0)	Ikoneus, Frankreich	IcoScan
IcoStudio-Analysesoftware (v2.2.0)	Ikoneus, Frankreich	IcoStudio
Jodlösung	Mylan, Frankreich	N/A
Isofluran-Anästhesiestation	Minerve, Esternay, Frankreich	N/A
Ketamin	Virbac, Frankreich	Ketamine1000	100 mg/mL injizierbare Lösung
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	Metacam	0,5 mg/mL injizierbare Lösung
Nadeln	Terumo, Frankreich	AN*1838R1	18 G x & frac12; ” Nadel mit 8" Rohre
Kochsalzwasser	Laboratoire Gilbert Physiodose, Pharmazie, Frankreich	N/A
Skalpell	DREXCO Medical, Frankreich	80011
SonoVue-Mikroblasen	Bracco-Bildgebung	SonoVue 8ul/ml
Pfannenwender	Phymed, Frankreich.	K.1070 Hochgeschwindigkeits-Rotations-Mikromotor-Kit
Sprague-Dawley Rj:Han-Ratten	Janvier Labs	RN-SD-M	RjHan:SD – Sprague Dawley männliche Ratten, 200-300 g
Stereotaxischer Rahmen	David Kopf (Tujunga, USA)	900-WA	Verwendung von Mouse Adaptor  (Ref: 922) und Nicht-Ruptur-Ohrstäben (Ref: 922)
Spritze	DREXCO Medical, Frankreich	2058
Ultraschallgel	DREXCO Medical, Frankreich	Medi'Gel
Geflügeltes Infusionsset	Terumo, Frankreich	SV*27EL
Xylazin 2%	Bayer, Frankreich	Rompun	20 mg/mL injizierbare Lösung