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Methodenartikel

Definierte xenofreie Reprogrammierung von Nabelschnurblut-Vorläuferzellen zu induzierten pluripotenten und blastomerähnlichen Stammzellen

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DOI:

10.3791/68613

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22. August 2025

 ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, The Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt chemisch definierte Methoden für die xenofreie (XF), feederfreie (FF) und episomale Reprogrammierung von myeloischen Vorläuferzellen aus menschlichem Nabelschnurblut (CB) zu konventionellen humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC). Diese XF/FF CB-hiPSC (XF-hiPSC) können effizient in Blastomer-ähnliche Tankyrase/PARP1-Inhibitor-regulierte naive Stammzellen (TIRN-SC) umgewandelt werden, die eine erhöhte Differenzierung und ein interspeziesartiges Chimärenpotenzial besitzen.

Zusammenfassung

Die Reprogrammierung von myeloischen Vorläuferzellen aus humanem Nabelschnurblut (CB) in einen hochgetreuen Zustand humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSC) kann unter Verwendung nicht-integrierender episomaler Vektoren und stromaler Signale erreicht werden. Diese konventionellen, geprimten CB-hiPSC-Linien können anschließend chemisch mit hoher Effizienz in einen Blastomer-ähnlichen Tankyrase/PARP-Inhibitor-regulierten naiven Stammzellzustand (TIRN-SC) mit funktioneller Totipotenz zurückversetzt werden. PARP-regulierte TIRN-SCs sind humane Stammzellen mit hoher epigenetischer Plastizität, stabilen epigenomischen Prägungen und einer höheren Differenzierungspotenz als herkömmliche, liniengeprimte hiPSCs. In dieser Arbeit werden optimierte XF/FF-Methoden für eine effiziente mesenchymale Stroma-aktivierte episomale Reprogrammierung von CD34+ CD33+ CB myeloischen Vorläuferzellen in konventionelle XF/FF hiPSC skizziert. Die TIRN-Reversion potenzierte reproduzierbar die konventionelle XF/FF-hiPS-Krankheit, um transkriptionelle, epigenetische und funktionelle Merkmale menschlicher Embryozellen im Spaltstadium mit verminderter Genexpression im Spaltstadium zu übernehmen. Wir haben validiert, dass TIRN-revertierte CB-abgeleitete XF-hiPSC eine deutliche Verbesserung der gerichteten Differenzierung mehrerer Linien (einschließlich hämatovaskulärer Linien) über ein breites Repertoire genetisch unabhängiger Hintergründe zeigte. Diese Methoden dienen als erster Schritt zur Generierung von cGMP-konformen TIRN-SC-Linien für HLA-definierte "Universal"-Spender-TIRN-SC (UTIRN-SC)-Banken in klinischer Qualität. Die Ableitung von UTIRN-SC-Linien mit verbesserter Differenzierungsvielfalt aus CD34+ CD33+ CB-Vorläufern könnte einen großen Einfluss auf die regenerative Medizin haben. Zum Beispiel könnten UTIRN-SCs Gewebebanken von HLA-definierten, kryokonservierten Herz-, Gefäß- und Neuralspender-Vorläuferzellen für umfassende Zelltherapien mit mehreren Abstammungslinien "von der Stange" erzeugen.

Einleitung

Obwohl humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) vielversprechende Möglichkeiten für personalisierte zelluläre Therapien bieten, steht ihre klinische Anwendung vor großen Herausforderungen, einschließlich Tumorigenität, Immunogenität sowie phänotypischer und funktioneller Heterogenität1, die sich auf ihre Sicherheit, Wirksamkeit und Kosteneffizienz auswirken. Darüber hinaus werden liniengebundene Vorläuferzellen, die von konventionellen, geprimten hiPSC-Linien abgeleitet sind, mit hochvariablen Interlinien-Differenzierungseffizienzenerzeugt 2 und weisen eine eingeschränkte in vivo-Transplantation und Funktionalität auf. Solche Einschränkungen können jedoch durch optimierte Reprogrammierungsmethoden3 oder alternative Stammzellzustände 4,5 überwunden werden.

Obwohl die Effizienz der nichtviralen episomalen Reprogrammierung von Haut- oder Blutsomatzellen in hiPSC gering ist (~0,01 %-2 %)6, kann eine hochoptimierte Vier-Faktor-Reprogrammierung von CB-Vorläuferzellen erreicht werden, die unter mesenchymalen Stromastem-Stamm-Vorläuferzellen (MSC)-aktivierten Co-Kulturbedingungen eine Bulk-Effizienz von bis zu 50 % erreichenkann 7. In diesem System wurde die zelluläre Reprogrammierung von myeloischen CB-Vorläuferzellen durch lösliche und kontaktabhängige Stromasignale beschleunigt. Stroma-geprimte (SP) episomale CB-abgeleitete hiPSC-Linien differenzierten sich in vaskuläre Vorläuferzellen (VP) mit höherer Effizienz als herkömmliche Fibroblasten-abgeleitete hiPSC 3,5. SP-CB-iPSC-abgeleitete VP zeigte eine authentischere embryonale VP-Transkriptionsidentität, eine verringerte Seneszenz und eine Empfindlichkeit gegenüber DNA-Schäden 3,4. SP-CB-iPSC-abgeleitetes VP zeigte auch eine robustere in vivo-Transplantation als herkömmliches hiPSC-abgeleitetes VP nach systemischer oder direkter Transplantation in den Glaskörper von adulten immundefizienten Mäusen, die durch retinale Ischämie und Reperfusion geschädigt wurden 3,4.

Zimmerlin et al. etablierten ein zweistufiges chemisches Reprogrammierungssystem ("LIF-5i -> LIF-3i"), das geprimte, konventionelle humane pluripotente Stammzellen in einen TIRN-SC-Zustand mit verbessertem Multi-Lineage-Differenzierungspotenzial überführt5. Differenzierte TIRN-SC-abgeleitete vaskuläre Vorläuferzellen zeigten eine höhere Funktionalität, eine größere genomische Stabilität und eine überlegene in vivo-Transplantation, wie ihre verbesserte Fähigkeit zur Migration und Revaskularisierung der tiefen neuronalen Schichten der ischämischen Netzhaut zeigt4. TIRN-SC wurde proteogenomisch reprogrammiert, um einen funktionellen hybriden Blastomer-ähnlichen Zustand mit hohem Beitrag im interspezifischen Chimären-Assayzu erlangen 8. TIRN-SC behielt die DNMT1-Expression bei und war an CpG-methylierten genomisch geprägten Regionen vor Erosion geschützt. Interessanterweise wurden SP-CB-hiPSC effizienter in TIRN-SC revertiert als hiPSC, die mit alternativen, weniger effizienten Methoden gewonnen wurden 5,9.

Somit sind TIRN-SCs ein alternativer Stammzellzustand mit verbesserter Differenzierungsfähigkeit in mehreren Linien und effizientem Chimärenbeitrag. Weitere Optimierung der
Die TIRN-SC-Reprogrammierung unter definierten, cGMP-konformen Kulturbedingungen wird die Generierung eines breiten Spektrums an funktionellen, transplantierbaren Zelltypen und Geweben für Therapien erleichtern. Um den Bedarf an kostengünstigen therapeutischen Vorläuferzellen zu decken, können diese Methoden zur Herstellung von cGMP-basierten Bänken von "Universal Donor" TIRN-SC (UTIRN-SC) unter Verwendung von HLA-definiertem CD34+ hämatopoetischem CB oder peripheren Blutvorläuferzellen angewendet werden. HLA-definierte UTIRN-SC-abgeleitete Vorläuferzellen könnten die Bedürfnisse einer größeren Anzahl von Patienten erfüllen, die eine sofortige Regeneration komplexer Gewebe über mehrere Linien benötigen.

Die für die klinische Knochenmarktransplantation (BMT) entwickelten Paradigmen könnten die Entwicklung von UTIRN-SC-Banken aus teilweise HLA-angepassten oder HLA-haplo-identischen hämatopoetischen Stammzellen aus nationalen Spenderregistern leiten. Eine prädiktive, globale computergestützte Analyse der kombinierten Top-10-Haplotypen aus 18 Ländern, einschließlich der USA, würde eine durchschnittliche Patientenabdeckung von 68,4 % solcher hiPSC-Haplobanken liefern10. Eine definierte UTIRN-SC-Bank könnte nicht nur liniengebundene Vorläuferzellen liefern, sondern auch therapeutische TIRN-SC-Anwendungen von interspezifischen Blastozysten-Komplementationssystemen bei Haustieren (z.B. Schweinen) für die Ganzorgangenerierungunterstützen 11,12, einschließlich der Erzeugung von toleranzinduzierenden hämatopoetischen Vorläuferzellen zur Verringerung der Transplantatabstoßung in Populationen mit breiter genetischer Vielfalt (z.B. USA).

Dieses modifizierte Reprogrammierungsprotokoll zur Generierung von TIRN-kompetenten XF/FF hiPSC-Linien ist ein erster Schritt für die Entwicklung zukünftiger cGMP-konformer UTIRN-SC-Banken. Dieses Protokoll beschreibt die schrittweise stroma-geprimte Reprogrammierung und funktionelle Validierung von humanen myeloischen CB-Vorläuferzellen in konventionelle XF-hiPSC-Linien. Diese XF-hiPS-Zellen zeigten eine einfache Reversion in TIRN-SC mit einer ähnlichen Effizienz wie Nicht-XF-Methoden7 und erreichten eine uneingeschränkte funktionelle Pluripotenz, einschließlich einer verbesserten Fähigkeit, gut geformte Teratome zu erzeugen, die durch Lineage-Bias reduziert sind (im Vergleich zu isogenen geprimten XF-hiPSC)4,5,9. Wir skizzieren auch Protokolle, die TIRN-revertierte XF-hiPSC für ihre verbesserte und robuste direkte Differenzierung zu hämatovaskulären Linien validieren.

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Protokoll

Alle Reprogrammierungsexperimente entsprachen den von der National Academy of Sciences und der International Society of Stem Cell Research (ISSCR) veröffentlichten Richtlinien. Für die hiPS-Erzeugung wurden die Protokolle zur Entnahme von Spenderzellen und die Einwilligungserklärung der Spender von der Aufsicht des Institutional Review Board (IRB) der Johns Hopkins University (JHU) genehmigt. Alle Experimente wurden im Rahmen des JHU Institutional Stem Cell Research Oversight (ISCRO) durchgeführt und entsprechen den institutionellen Standards für die Einwilligungserklärung und die Bewertung der Provenienz. Darüber hinaus wurden alle Tierverwendungen und chirurgischen Eingriffe in Übereinstimmung mit den vom JHU Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigten Protokollen durchgeführt. Alle Versuche, bei denen tierexperimentelle Eingriffe durchgeführt werden (z. B. subkutane/intramuskuläre Injektionen von NOD. Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ (NOG SCID) Mäuse (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) für die Teratomanalyse und den Blastozystentransfer in ICR-pseudoschwangere Mäuse) wurden von der JHU IACUC überprüft und zugelassen. Diese Überprüfungen umfassten Überlegungen zu ethischen Opfern, humanen Haltungen und geeigneten Maßnahmen zur Minimierung von Tierbeschwerden.

1. Feeder-freie xenofreie hiPSC-Episomale Reprogrammierung

  1. Vorbereitung der hämatopoetischen Vorläuferzellen des Spenders
    1. Verwenden Sie kryokonservierte CD34+ hämatopoetische Stamm-/Vorläuferzellen (z. B. 1x106 CB-Zellen für Neugeborene) sofort nach der Entbindung oder lagern Sie Kryoröhrchen in einem Lagertank für flüssigen Stickstoff. Stellen Sie sicher, dass die Zellen während des Transports und der Handhabung kontinuierlich in einem gefrorenen Zustand gehalten wurden.
      HINWEIS: Alternativ können auch nicht kryokonservierte Spenderzellen unmittelbar nach der Entnahme und CD34-Anreicherung mit zugelassenen Protokollen verwendet werden.
    2. Öffnen Sie vor dem Auftauen der Zellen im Wasserbad vorsichtig das sterilisierte Kryofläschchen in einer Biosicherheitswerkstatt, um das eingeschlossene Gas im Fläschchen freizusetzen, und verschließen Sie das Fläschchen dann fest.
    3. Stellen Sie das Fläschchen für 1 bis 2 Minuten in ein 37 °C heißes Wasserbad. Schwenken Sie das Fläschchen vorsichtig, bis fast kein Eis mehr übrig ist. Nehmen Sie das Fläschchen aus dem Wasserbad und sterilisieren Sie es gründlich (z. B . 70 % Ethanolspray).
      HINWEIS: Alle Schritte erfordern eine geeignete aseptische Technik und werden in einem sterilen biologischen Sicherheitshaubenschrank durchgeführt.
    4. Übertragen Sie die Zellen vorsichtig und langsam in ein leeres steriles konisches 50-ml-Röhrchen. Waschen Sie die Durchstechflasche mit 1 ml kaltem xenofreiem Expansionsmedium für den hämatopoetischen Vorläufer (XF-HP) (Tabelle 1) und mischen Sie es vorsichtig (tropfenweise entlang der Ränder des Röhrchens) mit den Zellen, um das DMSO-Kryoprotektivum zu verdünnen.
    5. Lassen Sie das Röhrchen 30 s lang in einem Gestell stehen und fügen Sie langsam (tropfenweise) 2 mL kaltes XF-HP Medium hinzu. Schwenken Sie die Zellsuspension vorsichtig, während Sie das Medium hinzufügen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, indem Sie nacheinander 4, 8 und 4 ml kaltes XF-HP Medium (bis zu 20 ml Gesamtvolumen) hinzufügen. Die verdünnten Zellen werden bei 100 x g 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
      HINWEIS: Pipettieren Sie die Zellen in der Kryoprotektivlösung und während der Verdünnungsschritte nicht auf und ab. XP-HP medium tropfenweise und langsam zugeben, bis das DMSO mindestens 10-fach verdünnt ist. Verwenden Sie kaltes Medium, da die DMSO-Verdünnung zu einer exothermen Reaktion führt.
    6. Zellfreier Überstand in einer Biosicherheitswerkbank aspirieren. Lösen Sie das Küvettenpellet vorsichtig. Resuspendieren Sie in 2 ml XF-HP-Expansionsmedium für die Zellzählung mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler.
    7. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen auf Multi-Well-Platten mit extrem geringer Adhäsion für Zellkulturen (z. B. 2 ml Zell/XF-HP Medium-Mischung in 1 Well einer 6-Well-Platte).
    8. Wickeln Sie die Platte fest in Saran-Folie ein, um hypoxische Bedingungen nachzuahmen. Die Platte in einen Inkubator (37 °C, 5 % CO2, feuchte Atmosphäre) stellen. Alternativ können Sie die unverpackte Platte in einen Inkubator mit O2 -Kontrolle (5 % O2, 5 % CO2, feuchte Atmosphäre) stellen.
    9. Kultivieren Sie die hämatopoetischen Vorläuferzellen 3 Tage lang in XF-HP Medium.
  2. Zubereitung der mesenchymalen Stammvorläuferzellen (MSC)
    1. Tauen Sie ein aliquotes (0,75 - 1x10,6 Zellen) humanes MSC mit niedriger Passage (p2 bis p3) auf, indem Sie ein kryokonserviertes Aliquot in einem 37 °C warmen Wasserbad für 1 bis 2 Minuten inkubieren. Schwenken Sie das Fläschchen vorsichtig, bis fast kein Eis mehr übrig ist. Nehmen Sie das Fläschchen aus dem Wasserbad und sterilisieren Sie es gründlich (d. h. 70 % Ethanol).
      HINWEIS: Humanes MSC mit geringer Passage (p2) kann unter Verwendung etablierter Protokolle aus menschlichem Knochenmark gekauft oder hergestellt und kryokonserviert werden. MSC kann etwa 7-10 Tage im Voraus aufgetaut und am Tag vor der Nukleofektion als Feeder-Schicht bestrahlt/plattiert werden (Abbildung 1).
    2. Übertragen Sie die Zellen vorsichtig und langsam (tropfenweise entlang der Ränder des Röhrchens) in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit kaltem, xenofreiem serumfreiem mesenchymalem Stammzellenmedium (XF-MSC) (Tabelle 1) in einer Biosicherheitswerkbank, um das DMSO-Kryoprotektivum mindestens 10-fach zu verdünnen (z. B. 1 ml kryokonserviertes Zellaliquot in 9 mL XF-MSC-Medium übertragen).
    3. Verwenden Sie 1 oder 2 ml kaltes XF-MSC-Medium, um das Röhrchen zu spülen und in das konische Röhrchen zu mischen. Die verdünnten Zellen werden bei 100 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
    4. Zellfreier Überstand in einer Biosicherheitswerkbank aspirieren. Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 1 ml XF-MSC-Medium zur Zellzählung mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler.
    5. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen auf gewebebehandelte Zellkultur-Multiwell-Platten (z. B. 5.000-6.000 Zellen procm2 oder etwa 50.000 Zellen in 1 Well einer 6-Well-Platte). Stellen Sie die Platten in einen Inkubator (37 °C, 5 % CO2, feuchte Atmosphäre). Frischen Sie das XF-MSC-Medium alle 2-3 Tage in einer Biosicherheitswerkbank auf.
    6. Am Tag vor der Nukleofektion ist der zellfreie Überstand in einer Biosicherheitswerkbank zu aspirieren. MSC einmal mit PBS (2 ml/Well) waschen. PBS ansaugen. Fügen Sie 1 ml/Well Zelldissoziationsreagenz hinzu (z. B. 1X Trypsin-EDTA-Lösung). 5 min bei 37 °C in einem CO2 -Inkubator inkubieren.
    7. Neutralisieren Sie das Dissoziationsreagenz, indem Sie 1 ml XF-MSC-Medium (mindestens 2-fache Verdünnung) hinzufügen und vorsichtig mit einer Pipette in eine Einzelzellsuspension zerreiben. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Bei 100 x g 5 min zentrifugieren.
    8. Aspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml XF-MSC-Medium für die Zellzählung mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler.
    9. Bestrahlen (2.000 rad) mesenchymale Vorläuferzellen unter 5 Passagen mit einem G- oder Röntgenbestrahlungsgerät und einer Platte auf Arg-Gly-Asp (RGD) peptidbeschichtete synthetische Oberflächen-6-Well-Platten (2x105 Zellen pro Well) in XF-MSC-Medium. Bewahren Sie die Platten über Nacht in einem Inkubator auf (37 °C, 5 % CO2, feuchte Atmosphäre).
  3. Xenofreie episomale Reprogrammierung
    1. Sammeln Sie 3 Tage alte CB HP-Kulturen in XF-HP-Expansionsmedium in einem konischen 15-ml-Röhrchen in einer Biosicherheitswerkbank. Bei 200 x g 5 min zentrifugieren.
    2. Zellfreier Überstand in einer Biosicherheitswerkbank aspirieren.  Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 1 ml XF-HP-Expansionsmedium für die Zellzählung mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler.
    3. Kombinieren Sie 1x106 expandierte HP-Zellen mit 100 μl humaner CD34+ -Zellnukleofektionslösung (humanes CD34+ -Zellnukleofektor-Kit). 6 μg gereinigtes konzentriertes Episom (<5 μl) zugeben und vorsichtig mit der Kunststoff-Transferpipette des Nukleofektionskits in eine Nukleofektorküvette überführen. Vermeiden Sie Blasen. Die Küvette wird in den Nukleofektorapparat eingesetzt und das Programm U-008 verwendet.
      HINWEIS: Bereiten Sie Bestände des episomalen EBNA-basierten pCEP4-Vektors pEP4 EO2S EM2K (OCT4, SOX2, MYC, KLF4) durch routinemäßige Transformation in TOP10 E. coli vor und reinigen Sie mit Plasmid-Maxi-Prep-Kits. Am Tag der Nukleofektion reinigen und konzentrieren Sie das Plasmid mit einem PCR-Aufreinigungskit 7.
    4. Geben Sie unmittelbar nach der Nukleofektion 500 μl vorgewärmtes XF-HP-Expansionsmedium in die Küvette und übertragen Sie die Zellen in 1 ml XF-HP-Medium mit einer sterilen Transferpipette auf 1 Well mit einer 6-Well-Zellkulturplatte mit extrem geringer Anhaftung.
      HINWEIS: Nukleofectierte Zellen sind sehr zerbrechlich und überleben die Scherbelastung durch normale 1-ml-Pipettenspitzen nicht. Die Übertragung auf Kulturplatten mit extrem geringer Bindung ist ein Schritt, der die Zellwiederherstellung nach der Nukleofektion vor der endgültigen Bindung an RGD-beschichtete Platten fördert.
    5. Wickeln Sie die Platte fest in Plastikfolie ein, um hypoxische Bedingungen nachzuahmen. Stellen Sie die Platte in einen CO2 -Inkubator (37 °C, 5 % CO2, feuchte Atmosphäre). Alternativ können Sie die unverpackte Platte in einen Inkubator mit O2 -Kontrolle (5 % O2, 5 % CO2, feuchte Atmosphäre) stellen. 4 bis 6 Stunden inkubieren.
      HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht es nukleofectierten HP-Zellen, sich zu erholen, bevor sie auf MSC-Monolayer übertragen werden.
    6. Sammeln Sie die Zellen in einem konischen 15-ml-Röhrchen in einer Biosicherheitswerkbank. Bei 200 x g 5 min zentrifugieren.
    7. Den Überstand in einer Biosicherheitswerkbank ansaugen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 mL XF-HP Expansionsmedium. Nukleofisierte HP-Zellen auf bestrahltes MSC mit einer Dichte von etwa 17.500 Zellen procm2 in RGD-beschichteten Platten in XF-HP-Expansionsmedium (2 mL/Well), ergänzt mit dem ROCK-Inhibitor Y-27632 (Endkonzentration 10 μM). Stellen Sie die Platte in einen CO2 -Inkubator (37 °C, 5 % CO2, feuchte Atmosphäre).
    8. Zwei Tage nach der Nukleofektion geben Sie 2 ml (gleiches Volumen) E8-Medium in jede Vertiefung in einer Biosicherheitswerkbank.
    9. Ersetzen Sie jeden zweiten Tag die Hälfte des Volumens des Kulturmediums durch E8-Medium. Sammeln Sie schwimmende Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen, zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 200 x g und geben Sie die zurückgewonnenen Zellen wieder in die Kultur.
    10. Bereiten Sie an Tag 21 mit vitronectin-beschichtete Gewebekulturen behandelte 6-Well-Platten vor. Geben Sie 1 ml verdünnte Vitronektinlösung (z. B. 40 ml/ml für Vitronectin-XF) in 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte und inkubieren Sie 1 Stunde lang bei Raumtemperatur.
    11. Entnahme einzelner XF-hiPSC-Kolonien manuell mit einem inversen Mikroskop in einer Biosicherheitswerkstatt. Zeritieren Sie mit der Pipette und übertragen Sie die einzelnen Kolonien auf vitronektinbeschichtete Platten in E8-Medium, das mit dem ROCK-Inhibitor Y-27632 (Endkonzentration 5 μM) ergänzt wird. Stellen Sie die Platte in einen CO2 -Inkubator (37 °C, 5 % CO2, feuchte Atmosphäre).
    12. Ersetzen Sie am nächsten Tag vorsichtig das Medium durch E8-Medium ohne ROCK-Inhibitor-Supplementierung. Wechseln Sie das E8-Medium danach täglich (2 ml/Well) in eine Biosicherheitswerkbank.

2. Routinemäßige hiPS-Kultur und -Wartung

  1. Wenn die Kolonien 5 bis 6 Tage später größer werden (d. h. 0,5 bis 1 mm Durchmesser oder etwa 80 % Konfluenz), aspirieren Sie das Medium in einer Biosicherheitswerkbank.
  2. Fügen Sie 2 ml/Well PBS hinzu, um die Zellen zu waschen. Aspirieren Sie das PBS. Fügen Sie 1 ml EDTA-basierte Zelldissoziationslösung hinzu. 5 min in einem CO2 -Inkubator (37 °C, 5 % CO2, feuchte Atmosphäre) inkubieren. Überprüfen Sie mit einem Mikroskop, ob die Zellen locker anhaften (z. B. glänzende Rundzellen, aber noch an der Platte befestigt sind).
  3. Saugen Sie die Dissoziationslösung vorsichtig in einer Biosicherheitswerkbank an, ohne die Zellen zu stören.
  4. Sammeln Sie die Zellen in 1-2 ml E8-Medium, das mit dem ROCK-Inhibitor Y-27632 (Endkonzentration 5 μM) ergänzt wird, mit nicht kräftigem Pipettieren, um die Zellklumpen zu erhalten. Übertragen Sie Zellklumpen auf vitronectinbeschichtete (siehe Abschnitt 1.3.11) 6-Well-Zellkultur-behandelte Platten (entspricht 10 Kolonien pro Well oder 1:10-Teilung). Stellen Sie die Platte in einen CO2 -Inkubator (37 °C, 5 % CO2, feuchte Atmosphäre).
  5. Setzen Sie die Subkultivierung mit einer EDTA-basierten Zelldissoziationslösung alle 5-7 Tage fort.
    HINWEIS: Eine zusätzliche Subklonierung oder manuelle Kolonieauswahl ist für die SP-CB-hiPSC-Reprogrammierung in der Regel nicht erforderlich, aber wenn hiPSC-Klone Kolonien mit abnormaler Morphologie enthalten (z. B. spontane Differenzierung wie Fibroblasten oder Embryoidkörperbildung, Entstehung abnormaler, nicht flacher Kolonien), wählen Sie die Kolonien manuell mit einer Mikropipette und einem Mikroskop in einer Biosicherheitswerkbank aus oder verwerfen Sie aberrante Klone. Eine ineffiziente, instabile Reprogrammierung von hiPSC ist nicht mit der TIRN-SC-Reversion kompatibel.

3. Phänotypische Validierung von XF-hiPSC-Klonen

  1. Erweitern Sie XF-hiPSC-Klone um mindestens 5-7 Passagen für die Erstvalidierung (Abbildung 2), wie in Abschnitt 2 beschrieben, vor der Langzeit-Kryokonservierung und Anwendung in funktionellen Studien. Notieren Sie die Anzahl der Durchgänge auf jedem kryokonservierten Fläschchen.
    HINWEIS: Die anfängliche Charakterisierung von XF-hiPSC-Klonen mit geringer Passage kann durch mehrere Assays bestätigt werden, z. B. durch Akaline-Phosphatase-Aktivität und TRA-1-Antigen- oder NANOG-Immundetektion.
  2. Führen Sie die XF-hiPSC-Validierung und -Zählung mit alkalischer Phosphatase-Färbung durch (Abbildung 2A,B).
    HINWEIS: Die Reprogrammierungseffizienz in Bulkkulturen kann bei P0 3-5 Wochen nach episomalen Nukleofektionen bestimmt werden, indem die Anzahl der vollständig reprogrammierten Kolonien pro einzelner Eingangszelle, die an Tag 3 plattiert wurde, aufgezähltwird 7,13.
    1. Aspirieren Sie Nährmedium in einer Biosicherheitswerkbank.
    2. Waschen Sie die Zellen mit PBS (2 mL pro Well). PBS ansaugen. Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 2 % Paraformaldehyd/PBS-Lösung. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. Entfernen und entsorgen Sie die Paraformaldehyd/PBS-Lösung gemäß den Sicherheitsrichtlinien für chemische Abfälle.
    4. Waschen Sie die Zellen mit PBS (2 mL pro Well). PBS ansaugen. 1-2 ml alkalisches Phosphatasesubstrat zugeben und 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur unter langsamem Rühren inkubieren.
    5. Waschen Sie 3 Mal mit PBS, um die Reaktion zu stoppen. Mikrofotografie und Aufzählung.
      HINWEIS: Vermeiden Sie eine übermäßige Inkubationszeit oder -temperatur, da dies zu falsch positiven Färbungen führen kann.
  3. Führen Sie die Validierung und Enumeration von XF-hiPSC-Färbungen mit TRA-1-Antigen-Immunfärbungen durch (Abbildung 2C).
    HINWEIS: Für die episomale Reprogrammierung sollte der Nachweis der transgenen Expression und des EBNA1-Vektorrückgrats während der ersten Passagen unter Verwendung veröffentlichterProtokolle 7 durchgeführt werden. Die routinemäßige Validierung umfasst die Karyotypisierung durch G-Banding (Abbildung 2D) oder Ganzgenom-Array-basierte Abdeckungsassays. Die grundlegende funktionelle Pluripotenz kann auch unter Verwendung von Teratomdifferenzierungsprotokollen (Abbildung 2E) oder quantitativen Multigenexpressions-Scorecards von ungerichteten Embryoidkörperdifferenzierungen14 bestimmt werden.
    1. In einer Biosicherheitswerkbank replizieren Immunfärbewells für TRA-1-60- oder TRA-1-81-Antigene für 30 Minuten, indem Fluorochrom-konjugierte Lebendfärbe-Antikörper in der entsprechenden Konzentration in das E8-Medium gegeben werden.
    2. Aspirieren Sie das Nährmedium. Zweimal mit E8 medium (2 mL pro Well) waschen.
    3. Mikroskopische Aufnahme und Aufzählung in E8-Medium oder phenolrotfreiem Medium.
      HINWEIS: Alternativ können die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 2%iger Paraformaldehyd/PBS-Lösung fixiert und mit Standardantikörpern auf TRA-1-Antigene immungefärbt werden.
  4. Validierung des XF-hiPSC-Immunphänotyps durch Durchflusszytometrie.
    1. In einer Biosicherheitswerkbank das Nährmedium aspirieren.
    2. Waschen Sie die Zellen in PBS (2 mL pro Well). PBS ansaugen. Fügen Sie ein enzymatisches Dissoziationsreagenz hinzu (z. B. Accutase, 1 ml pro Well). Die Platte 5 min bei 37 °C in einem CO2 -Inkubator (5 % CO2, feuchte Atmosphäre) inkubieren.
    3. Sammeln Sie die Zellen, indem Sie ein gleiches Volumen Kulturmedium hinzufügen und durch ein Zellsieb (40-70 μm Filter) passieren. Zellen bei 200 x g für 5 min zentrifugieren.
    4. Resuspendieren Sie das Zellpellet in PBS mit 5 % FBS (1 ml pro Well-Äquivalent). Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler. Verteilen Sie etwa 100.000 bis 200.000 Zellen in Rundbodenröhrchen pro FACS-Assay (wobei das Volumen bei etwa 100 μl pro Assay gehalten wird).
    5. Bei extrazellulären Färbungen wird nach einem optionalen Blockierungsschritt mit reinem Mausserum (5 μl pro Assay, 5 min bei Raumtemperatur) mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern (z. B. TRA-1-81 PE, SSEA4 APC) gemäß den Anweisungen des Herstellers inkubiert. Mit 3 mL PBS waschen. 5 min bei 300 x g zentrifugieren. Resuspendieren Sie in FACS-Puffer (z. B. PBS mit 5 % FBS) und erfassen Sie mit einem FACS-Instrument.
      HINWEIS: Verwenden Sie immer geeignete Isotypkontrollen und färben Sie parallele Proben, um die Spezifität der immundetektierten Proteine zu validieren.
    6. Befolgen Sie bei intrazellulären Färbungen (z. B. NANOG-PE, OCT3/4-PE, SOX2-PE) die Anweisungen des Herstellers für die Fixierungs-/Permeabilisierungsschritte. Inkubieren Sie mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern oder passenden Isotypkontrollen. Erfassen Sie mit einem FACS-Instrument.

4. Kryokonservierung und Auftauen von XF-hiPSC-Klonen

  1. Erweitern Sie XF-hiPSC-Klone um mindestens 5-7 Passagen, um eine erste Validierung (Abbildung 2) durchzuführen, bevor Sie sie langfristig kryokonservieren und in funktionellen Studien anwenden. Notieren Sie die Anzahl der Durchgänge auf jedem kryokonservierten Fläschchen.
    1. Aspirieren Sie Nährmedium in einer Biosicherheitswerkbank.
    2. Waschen Sie die Zellen mit PBS (2 mL pro Well). PBS ansaugen.  Fügen Sie eine EDTA-basierte Zellablösungslösung (1 ml pro Well) hinzu, um XF-hiPSC-Kolonien in Zellklumpen zu dissoziieren. Inkubieren Sie die Platte 5 min lang in einem CO2 -Inkubator (37 °C, 5 % CO2, feuchte Atmosphäre). Prüfen Sie mit einem Mikroskop, ob die Zellen locker anhaften (z. B. glänzende Rundzellen).
    3. Aspirieren Sie die Dissoziationslösung vorsichtig, ohne die Zellmonolayer-Kolonien zu stören, und sammeln Sie die Zellen in 1-2 ml E8-Medium mit nicht kräftigem Pipettieren, um Zellklumpen (10-50 Zellen pro Klumpen) zu erhalten. Sammeln Sie XF-hiPSC in einem sterilen konischen 15-ml-Röhrchen. Zellen bei 200 x g für 5 min zentrifugieren.
    4. Den Überstand in einer Biosicherheitswerkbank ansaugen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einer Gefrierlösung (Tabelle 2, ~ 1 Well-Äquivalent pro ml).
    5. Übertragen Sie die Zellen in kryogene Röhrchen für die Langzeitlagerung. Legen Sie die Röhrchen in einen Behälter für langsames Gefrieren und lassen Sie die Proben über Nacht in einem -80 °C-Gefrierschrank einfrieren. Legen Sie die Kryofläschchen am nächsten Tag zur Langzeitlagerung in einen Flüssigstickstoff-Gefrierschrank.
  2. Zum Auftauen ist eine Platte durch Vorbeschichtung mit Vitronektin vorzubereiten (siehe Abschnitt 1.3.11).
    1. Stellen Sie das gefrorene Fläschchen in ein 37 °C heißes Wasserbad und tauen Sie die Zellen ~1-2 Minuten lang auf. Sterilisieren (z. B . Ethanolspray).
    2. XF-hiPSC wird langsam in ein steriles konisches 15-ml-Röhrchen mit 9 ml Auftaumedium überführt (Tabelle 2), um die Zellen in einer sterilen biologischen Sicherheitshaube langsam 10-fach zu verdünnen.
      HINWEIS: Nicht kräftig pipettieren.
    3. Bei 200 x g 5 min zentrifugieren.
    4. Aspirieren Sie den zellfreien Überstand in einer Biosicherheitswerkbank. Resuspendieren Sie das Zellpellet in E8-Medium (1-2 mL), das mit einem ROCK-Inhibitor (Endkonzentration 5 mM) ergänzt wird.
      Hinweis: Der Ausschluss von Y-27632 führt zu einer schlechten Wiederherstellungseffizienz nach dem Auftauen.
    5. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen in 1 oder 2 vitronectin-beschichtete Vertiefungen einer 6-Well-Platte. Am nächsten Tag wechseln Sie das Medium durch reguläres E8-Medium ohne ROCK-Inhibitor für die Zellexpansion.

5. Xenofreie hämatovaskuläre Differenzierung von XF-hiPSC

  1. Differenzieren Sie XF-hiPSC mit unserem optimierten xenofreien hämato-vaskulären Differenzierungsprotokoll (Abbildung 3)4.
    HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von15 geändert.
    1. Bereiten Sie XF-hiPSC bei ~40-50 % Konfluenz (1-3 Tage nach dem Passaging) vor.
    2. Kulturmedium aspirieren und 2 ml mesodermales Bestimmungsmedium (Tabelle 2) in eine Biosicherheitswerkbank geben.
    3. Nach 2 Tagen aspirieren Sie das Medium und geben Sie 2 ml/Vertiefung Gefäßdifferenzierungsmedium (Tabelle 2) in eine Biosicherheitswerkbank. Wenn bei diesem Schritt viele tote oder schwimmende Zellen sichtbar sind, waschen Sie es einmal mit 2 mL PBS.
    4. Ersetzen Sie das Gefäßdifferenzierungsmedium bis zum 11. Tag alle zwei Tage in einer Biosicherheitswerkbank.
      HINWEIS: Wenn das Medium aufgrund der hohen Zelldichte und des niedrigen pH-Werts gelb wird, fügen Sie täglich 1 ml frisches Medium hinzu oder ersetzen Sie es.
  2. Nach 7-10 Tagen Kultur in vaskulärem Differenzierungsmedium reinigen Sie CD31+ - oder CD34+ -Gefäßzellen aus der adhärenten Monoschicht mit einer magnetischen Zellsortiermethode.
    HINWEIS: Jeder einzelne Klon kann unterschiedliche Kinetiken der Differenzierung aufweisen. Bestimmung des Peak-Zeitpunkts für die CD31/CD34-Expression durch FACS-Analyse (Abbildung 4A). Eine FACS-Analyse der prä- und postmagnetischen Bead-Anreicherung ist erforderlich. Hämatopoetische Vorläuferzellen (HP) können in diesem Stadium aus dem Überstand gewonnen und mit CD34-Mikrokügelchen angereichert werden. CD34+ XF-hiPSC-abgeleitetes HP kann mit Hilfe eines Methylcellulose-Assays weiter validiert werden (Abbildung 4B-C)16.
    1. In einer Biosicherheitswerkbank das Kulturmedium aspirieren und die Zellen in PBS waschen (2 mL pro Well). Aspirieren Sie PBS und dissoziieren Sie hiPSC-Kolonien in einzelne Zellen durch Zugabe eines enzymatischen Dissoziationsreagenzes (z. B. Accutase, 1 ml pro Well). Inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei 37 °C in einem CO2 -Inkubator (5% CO2, feuchte Atmosphäre).
    2. Sammeln Sie in einer Biosicherheitswerkbank Zellen, indem Sie ein gleiches Volumen Kulturmedium hinzufügen. Zellen bei 200 x g für 5 min zentrifugieren.
    3. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem vaskulären Differenzierungsmedium (Tabelle 2). Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler. Etwa 50.000 bis 100.000 Zellen werden für den FACS-Assay zur prämagnetischen Bead-Anreicherung mit direkt konjugierten Anti-CD31- oder Anti-CD34-Antikörpern bereitgestellt.
    4. Die restlichen Zellen bei 300 x g 5 min zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem magnetischen Bead-Anreicherungspuffer (PBS pH 7,2, 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA) in einer Biosicherheitswerkbank.
    5. Die Zellen werden durch ein Zellsieb (40-70 μm Filter) geleitet. Bei 300 x g 5 min zentrifugieren. Resuspendieren Sie in einem 60 μl magnetischen Bead-Anreicherungspuffer.
    6. Fügen Sie 20 μl FcR-Blockierungsreagenz hinzu, fügen Sie dann 20 μl CD31- oder CD34-Mikrokügelchen hinzu und inkubieren Sie 15-20 Minuten bei 4 °C.
    7. Waschen Sie die Zellen mit 2 mL magnetischem Bead-Anreicherungspuffer in einer Biosicherheitswerkbank und Zentrifuge (300 x g, 5 min).
    8. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 mL magnetischem Bead-Anreicherungspuffer in einer Biosicherheitswerkbank.
    9. Platzieren Sie eine LS-Säule in das Magnetfeld eines magnetischen Zellseparators in der Biosicherheitswerkbank. Waschsäule mit 3 mL magnetischem Bead-Anreicherungspuffer.
    10. Zellen auf Spalte anwenden.  Sammeln Sie unmarkierte Zellen in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Waschen Sie die Säule 3 Mal mit 3 mL magnetischem Bead-Anreicherungspuffer.
    11. Nehmen Sie die Säule aus dem Separator und setzen Sie sie auf ein neues konisches 15-ml-Röhrchen.
    12. Spülen Sie die magnetisch markierten Zellen aus, indem Sie 3-5 ml endotheliales Wachstumsmedium hinzufügen. Bei 200 x g 5 min zentrifugieren.
    13. Resuspendieren Sie in 1 mL endothelialem Wachstumsmedium in einer Biosicherheitswerkbank. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler. Reservieren Sie etwa 50.000 Zellen für die postmagnetische Bead-Anreicherung, sortieren Sie die Reinheit durch FACS-Analyse mit direkt konjugierten Anti-CD31- oder Anti-CD34-Antikörpern.
    14. Isoliertes VP kann auf Fibronektin-beschichteten (10 μg/ml) Gewebekultur-behandelten Platten von Kolben in endothelialem Wachstumsmedium weiter expandiert werden.

6. Experimentelle Designrichtlinien für die funktionelle Validierung von XF-hiPSC

  1. Legen Sie Bestände an validierten XF-hiPSCs in den frühesten Passagen unter Verwendung einer etablierten nicht-integrierenden Methode an, wie z. B. episomale 7,17, Sendai-Virus18 oder mRNA19-Reprogrammierung.
    ANMERKUNG: Ein Vergleich der Effizienz und Zuverlässigkeit von Nicht-Reprogrammierungsmethoden ist an anderer Stelleenthalten 6. Die Clearance von transgenem Material in episomalen oder Sendai-Virus-Reprogrammierungsmethoden kann während der ersten Passagen mit PCR-Methoden überprüft werden 7,20. Die transgene Retention ist nicht mit der TIRN-SC-Generierung kompatibel.
  2. Validierung des normalen Karyotyps in XF-hiPSC-Klonen durch G-Banding oder Ganzgenom-Array-basierte Abdeckungsassays9.
  3. Validierung der Genexpression und der epigenomischen Integrität von XF-hiPSC-Linien (d. h. elterliche Prägungen, X-Aktivierung) unter Verwendung von DNA-Methylierungs- und Genexpressionsarrays oder Sequenzierungsmethoden 5,11,14.
  4. Validierung der grundlegenden funktionellen Pluripotenz unter Verwendung von Teratom-Differenzierungsprotokollen (Abbildung 2E), quantitativen Embryoidkörper-Differenzierungsassays (EB) unter Verwendung von RT-PCR-Arrays14 oder gerichteten Differenzierungsassays auf die 3 Keimblätter9.
    HINWEIS: Quantitative Methoden für die Differenzierungskapazität mehrerer Linien und den proliferativen Index von Teratom-Assays innerhalb der Linie unter Verwendung histologischer Charakterisierung durch Mikroskopie sind an anderer Stelle verfügbar4. Die Protokolle für die gerichtete Differenzierung in Richtung mesodermaler Linien und die hämato-vaskuläre Spezifizierung (Abbildung 4A-C) wurden zuvor detailliertbeschrieben 4,5,9, sowie ein gerichteter Differenzierungsassay für das definitive Endoderm (Abbildung 4D)5. Beispiele für gerichtete Differenzierungsassays in Richtung Ektoderm sind an anderer Stelle gegeben 4,5.

7. Chemische TIRN-Adaption von XF-hiPSC

  1. Kaufen oder bereiten Sie hauseigene MEF-Feeder mit niedrigem Durchgang aus CF1- oder CF1 x DR4-Hybrid-E13.5-Mausembryonen gemäß den veröffentlichten Protokollenvor 9,21. 200.000 MEF-Feeder pro Vertiefung in einer gelatinierten (0,1 % Gelatine in Wasser, 1 ml pro Vertiefung) mit Gewebekultur behandelten 6-Well-Platte mindestens einen Tag vor dem TIRN-Anpassungsschritt abfüllen (detaillierte TIRN-Protokolle finden Sie an anderer Stelle 4,5,9).
  2. Pflege und Erweiterung transgenfreier XF-hiPSC-Kulturen mit validierten normalen Karyotypen in einem feederfreien Kultursystem (z. B. E8-Medium, siehe Tabelle 1 für die hauseigene Formulierung).
  3. Ersetzen Sie das E8-Medium durch das LIF-5i-Medium (2 mL pro Well; Tabelle 1) nachdem XF-hiPSC-Kulturen ~50% Konfluenz erreicht haben (d.h. 3-5 Tage nach der Erstplattierung) in einer Biosicherheitswerkbank.
  4. Am nächsten Tag wird das Kulturmedium aspiriert und LIF-5i-adaptiertes XF-hiPSC einmal mit PBS (2 mL pro Well) in einer Biosicherheitswerkbank gewaschen. Aspirieren Sie den Überstand und geben Sie 1 ml enzymatisches Zelldissoziationsreagenz in jede Vertiefung. 5 min bei 37 °C in einem CO2 -Inkubator inkubieren.
  5. Mit einer Pipette vorsichtig in eine Einzelzellsuspension in einer Biosicherheitswerkbank zerreiben. Neutralisieren Sie mit LIF-5i-Medium (1 ml pro Well). Sammeln Sie die Zellsuspension in einem sterilen konischen 15-ml-Röhrchen.  Bei 200 x g 5 min zentrifugieren.
  6. Den Überstand in einer Biosicherheitswerkbank ansaugen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 2 mL LIF-5i-Medium.
    HINWEIS: Wenn möglich, nehmen Sie ein Aliquot für die Zellzählung. Es ist möglich, die enzymatische Aktivität mit LIF-5i/LIF-3i-Medium zu neutralisieren, ohne mit Inhibitoren oder Wachstumsfaktoren zu supplementieren.
  7. Waschen Sie die MEF-Platte zweimal mit PBS (2 mL pro Well in 6-Well-Platten) und fügen Sie Zellen hinzu (1 Well-Äquivalent von LIF-5i-angepassten Zellen auf 1 Well von MEF-Feedern in 2 mL LIF-5i-Medium).
    HINWEIS: Die Optimierung der anfänglichen Beschichtungsdichten für jede einzelne XF-hiPSC-Linie ist optional. Wenn im vorherigen Schritt Zellen gezählt wurden, legen Sie mindestens 1 x 106 Zellen pro Vertiefung auf die Feeder.  Die Platte in einen CO2 -Inkubator (37 °C, 5 % CO2, feuchte Atmosphäre) überführen.
  8. Kultivierung und Konservierung von XF-hiPSC für 3-5 Tage in LIF-5i auf MEF in einem CO2 -Inkubator (37 °C, 5% CO2, feuchte Atmosphäre). Wechseln Sie den LIF-5i medium täglich.
  9. Wenn kuppelförmige TIRN-SC-Kolonien gebildet werden (nach 3-5 Tagen Kultur auf Feedern), aspirieren Sie das Kulturmedium in einer Biosicherheitswerkbank. Waschen Sie jede gut mit 2 ml PBS.
  10. PBS ansaugen. Geben Sie 1 ml Zellablösungslösung (z. B. Accutase) in jede Vertiefung. 5 min bei 37 °C in einem CO2 -Inkubator (5 % CO2, feuchte Atmosphäre) inkubieren.
  11. Geben Sie 1 ml LIF-3i-Medium (Tabelle 1) in jede Vertiefung in einer Biosicherheitswerkbank, um das Dissoziationsreagenz zu neutralisieren. Zerreiben und sammeln Sie die Zellen vorsichtig in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Bei 200 x g 5 min zentrifugieren.
  12. Den Überstand in einer Biosicherheitswerkbank ansaugen. Resuspendieren Sie in LIF-3i-Medium (1 ml pro Well) für die Zellzählung mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler. Platte ~5 x 105 Zellen in 2 mL LIF-3i-Medium pro Well auf bestrahltes MEF in gelatinierten 6-Well-Platten in einer Biosicherheitswerkbank.
    HINWEIS: Wiederholen Sie die Schritte 7.12 5o 7.16 für alle folgenden Passagen.  Nach der anfänglichen LIF-5i-adaptierten Kultur werden LIF-3i-Kulturen mit einer niedrigeren Dichte (2x105 Zellen/Well) und einer Passage alle 3-4 Tage disponiert.
  13. Passage: TIRN-revertiertes XF-hiPSC für mindestens 6-7 kontinuierliche Passagen im LIF-3i-Medium vor der Verwendung in funktionellen Studien oder Kryokonservierung. Zeichnen Sie die Anzahl der Durchgänge entweder in einem xenofrei grundierten Kulturmedium (z. B. E8) oder in einem LIF-5i/LIF-3i TIRN-Medium auf.
    HINWEIS: Die TIRN-Umkehrung von XF-hiPSC-Leitungen mit hohem Durchgang (z. B . >p40) ist ineffizient und wird nicht empfohlen. Linien mit hoher Passage beherbergen oft chromosomale oder subchromosomale Defekte, die nicht mit einer effizienten TIRN-Reversion kompatibel sind und zu einer schlechten Reversionseffizienz und einer eingeschränkten Kulturstabilität führen. Auch die Verwendung von TIRN-Kulturen, die mehr als 15 Passagen im LIF-3i-Medium durchlaufen haben, wird für funktionelle Studien nicht empfohlen . Der funktionelle Einfluss der TIRN-Reversion von XF-hiPSC ist zwischen 7 und 15 Passagen im LIF-3i-Medium am ausgeprägtesten.

8. Experimentelle Designrichtlinien für die gerichtete Differenzierung von XF/FF hiPSC-abgeleiteten TIRN-SC.

  1. Direkte Verwendung von XF/FF hiPSC-abgeleitetem TIRN-SC in etablierten gerichteten Differenzierungsprotokollen ohne "Re-Priming"-Schritt (d. h. es ist nicht erforderlich, TIRN-Stammzellen vor ihrer Verwendung in gerichteten Differenzierungsassays wieder auf konventionelle "geprimte" Bedingungen umzuschalten).
  2. Zur funktionellen Bewertung des TIRN-Einflusses auf XF-hiPSC richten Sie isogene Geschwisterkulturen mit entsprechender Passagezahl parallel ein. Halten Sie geprimte/TIRN-Geschwister-isogene XF-hiPSC-Kulturen parallel in ihren jeweiligen Medien (z. B. E8 auf Vitronektin vs. LIF-3i auf MEF) und gleichzeitig einen Teratom-Assay durchführen (Abbildung 5) oder mit identischen Embryoidkörpern oder gerichteten Differenzierungsprotokollen und -materialien differenzieren (Abbildung 6).
  3. Führen Sie, wenn möglich, eine Funktionsbewertung von terminalen differenzierten Abstammungslinien durch. Zum Beispiel können vaskuläre Vorläuferzellen durch Proteinexpression, DiI-konjugierten acetylierten Low-Density-Lipoprotein (LDL)-Aufnahmeassay und Matrigel-Röhrchenassay bewertet werden (Abbildung 7).
    HINWEIS: Zusätzliche funktionelle Assays für CB-hiPSC- und TIRN-SC-abgeleitetes VP (d. h. DiI-Ac-LDL-Aufnahme-/Seneszenz-/Proliferations-/Migrationsassays, In-vitro-Matrigel-Röhrchenassays, tierische Matrigel-Plugassays, Xenotransplantationsassays) werden an anderer Stelle ausführlich beschrieben 3,4.
  4. Passen Sie die anfängliche Plattierungsdichte und -kinetik an (Abbildung 6) für jeden einzelnen XF-hiPSC-Klon in jedem Differenzierungsassay an und optimieren Sie sie.
    HINWEIS: TIRN-revertierte XF-hiPSC haben in gerichteten Differenzierungsassays eine robustere proliferative und differenzierbarere Kapazität als geprimte XF-hiPSC. TIRN-Kulturen erfordern in der Regel eine geringere anfängliche Plattierungsdichte als E8-Kulturen und erfordern keine Verwendung von anti-apoptotischen Ergänzungen, um das klonale Überleben zu verbessern.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll optimiert veröffentlichte Methoden für die effiziente Reprogrammierung myeloischer Vorläufer in einen hochgetreuen, geprimten pluripotenten Zustand unter Verwendung episomaler Vektoren und stromaler Signale7. Das Protokoll (Abbildung 1) skizziert definierte Methoden für die stromal-geprimte episomale Reprogrammierung von humanen CB CD34+ -Vorläuferzellen in XF-hiPSC und weist an, wie ihre Funktionalität über gerichtete hämato-vasku...

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Diskussion

Die Zambidis-Gruppe berichtete ursprünglich über eine hochoptimierte episomale Vier-Faktor-Methode zur Reprogrammierung von an die Abstammungslinie gebundenen myeloischen Vorläuferzellen in CB-hiPSC mit einer Bulk-Effizienz von bis zu 50% in gereinigten Episomen-exprimierenden Zellen7. Darin haben wir eine modifizierte Version des ursprünglichen episomalen Reprogrammierungsprotokolls für humane CB-Vorläufer unter XF/FF-Stroma-geprimten Bedingungen vorgestellt. Die...

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Offenlegungen

Es müssen keine Angaben gemacht werden.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des NIH/NEI (R01EY032113; ETZ), dem Maryland Stem Cell Research Fund (2023-MSCRFV-5995; 2024-MSCRFV-6248; 2025-MSCRFV-0005; 2025-R2-MSCRFV-0004 (ETZ) und der Lisa Dean Moseley Foundation (ETZ).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Amaxa Biosystems Nukleofector IILonzaAAB-1001
anti-CD143 (BB9) Antikörper, APC-konjugiert BD Biowissenschaften557929Verwenden Sie 10-20 & Mikro; L pro Assay (FACS)
Anti-CD144-Antikörper, PE-konjugiert BD Biowissenschaften560410Verwenden Sie 10-20 & Mikro; L pro Assay (FACS)
anti-CD146-Antikörper, PE-konjugiert BD Biowissenschaften550315Verwenden Sie 10-20 & Mikro; L pro Assay (FACS)
anti-CD184/CXCR4-Antikörper, APC-konjugiert BD Biowissenschaften555976Verwenden Sie 10-20 & Mikro; L pro Assay (FACS)
Anti-CD31-AntikörperBD Biowissenschaften5503891:100 in Blockierungslösung für den Immunfluoreszenz-Assay verdünnen
Anti-CD31-Antikörper, APC-konjugiert eBiowissenschaften17-0319-42Verwenden Sie 2 & Mikro; L pro Assay (FACS)
Anti-CD34-Antikörper, APC-konjugiert BD Biowissenschaften555824Verwenden Sie 5 & Micro; L pro Assay (FACS)
Anti-CD45-Antikörper, PE-konjugiert BD Biowissenschaften555483Verwenden Sie 10-20 & Mikro; L pro Assay (FACS)
anti-NANOG-Antikörper, PE-konjugiertBD Biowissenschaften560483Verwenden Sie 10-20 & Mikro; L pro Assay (FACS)
anti-OCT4-Antikörper, PE-konjugiertForschung & Forschung D-SystemeIC1759PVerwenden Sie 10 &Micro; L pro Assay (FACS)
Anti-SOX17-Antikörper, Alexa488-konjugiert BD Biowissenschaften562205Verwenden Sie 5 & Micro; L pro Assay (FACS)
Anti-SOX2-Antikörper, PE-konjugiertForschung & Forschung D-SystemeIC2018PVerwenden Sie 10 &Micro; L pro Assay (FACS)
anti-SSEA-4-Antikörper, APC-konjugiert Forschung & Forschung D-SystemFAB1435AVerwenden Sie 5 & Micro; L pro Assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE Antikörper, NL493 konjugiertForschung & Forschung D-SystemNLLC1435GVerwendung in einer Verdünnung von 1:50 (lebende und fixierte Immunfärbungen)
Anti-TRA-1-60 A488 Konjugat-KitThermoFisher ScientificNr. A25618
anti-TRA1-60 Antikörper, PE konjugiertBD Biowissenschaften560193Verwenden Sie 10 &Micro; L pro Assay (FACS)
anti-TRA-1-60 GloLIVE Antikörper, NL557 konjugiert Forschung & Forschung D-SystemeNLLC4770RVerwenden Sie at  a 1:50 Verdünnung (lebende und fixierte Immunfärbungen)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antikörper, DyLight 488 konjugiertStemgent09-0068Verwendung in einer Verdünnung von 1:100 (lebende und fixierte Immunfärbungen)
anti-TRA1-81 Antikörper, PE konjugiertBD Biowissenschaften560161Verwenden Sie 10 &Micro; L pro Assay (FACS)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antikörper, DyLight 488 konjugiertStemgent09-0069Verwendung in einer Verdünnung von 1:100 (lebende und fixierte Immunfärbungen)
CD31 MicroBead Kit, MenschMiltenyi Biotec130-091-935
CD34 MicroBead Kit, MenschMiltenyi Biotec130-046-702
CD34+ gemischte Spender,  Nabelschnurblut, 1 Million ZellenAlleZellenCB, CR, CD34+, Gemischt, PS, CS10, 1MAlternative Zellquellen sind die fetale Leber, das adulte Knochenmark und mobilisiertes peripheres Blut
CF1 MausDer Charles-Fluss023
CHIR99021Forschung & Forschung D-SystemNr. L5283rekonstituieren bei 100 mM in DMSO
Corning Costar 6-Well-Platten, mit Gewebekulturen behandeltCorning3506
Corning Synthemax II-SC Substrat, 10 mg FläschchenCorning3535Verwendung bei 5 μ g/cm2 als Ersatz für Corning 3978
Corning Synthemax-R 6-Well-PlatteCorning3978Nicht mehr lieferbar und ersetzt durch 3535
Costar 6-Well-Platte mit klarem flachem Boden und ultraniedrigem AufsatzCorning3471
Gräfin  Folie der ZellzählkammerThermo Fisher ScientificNr. C10228
Gräfin automatisierter ZellzählerThermo Fisher ScientificAMQAX1000
CryoStore CS10StemCell-Technologien100-1061
DII-AC-LDLThermo Fisher ScientificNr. L3484Verwendung bei 5-15 & Mikro; g/mL
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific11995065
DMEM/F-12 , GlutaMAX ErgänzungThermo Fisher Scientific10565018
DMEM/F-12, HEPESThermo Fisher Scientific11330032
DMSO (Dimethylsulfoxid)Sigma AldrichNr. D2650
DR4-MausDas Jackson-Labor3208
Essential 8 (E8) mittelStemCell-Technologien5940
Fötales Bovin-Serum (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30071.03
REPARIEREN & PERM-Zellpermeabilisierungs-KitThermo Fisher ScientificGAS004
ForskolinStemgent04-0025rekonstituieren bei 100 mM in DMSO
Gelatine (Schwein)Sigma AldrichG1890-100GIn Wasser resuspendieren und mit einem Autoklaven sterilisieren
humane CD34+-Zell-Nukleofektor  BausatzLonzaVPA-1003
Isotyp Maus IgG1 PE konjugiertBD Biowissenschaften554680
Isotyp Maus IgG2a PE konjugiertBD Biowissenschaften558595
Isotyp Ratte IgG2b PE konjugiertForschung & Forschung D-SystemeIC013P
KnockOut-Serum-ErsatzThermo Fisher Scientific10828-028
L-AscorbinsäureMillipore SigmaNr. A8960
L-Glutamin (100-fach)Thermo Fisher Scientific25030-081
LS-SäulenMiltenyi Biotec130-042-401
MatrigelCorning356237Verwenden Sie 200 &Micro; L/Well in 48-Well-Platten
MEM Nicht-essentielle Aminosäure (MEM NEAA) (100X)Thermo Fisher Scientific11140-050
MethoCult SF H4436StemCell-Technologien04436
MidiMACS-TrennzeichenMiltenyi Biotec130-042-302
mTeSR1 mittelStemCell-Technologien85850
Kryo-Fläschchen von NalgeneThermo Fisher Scientific5000-0020
Paraformaldehyd-Lösung, 4% in PBSThermo Fisher ScientificJ19943. K2mit PBS auf die erforderliche Konzentration verdünnen
PD0325901Sigma AldrichArtikel-Nr.: PZ0162rekonstituieren bei 100 mM in DMSO
Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml)Thermo Fisher Scientific15140-122
pEP4 E02S EM2K EpisomAddgene20923Plasmide wurden in TOP10 E vermehrt.  coli (Invitrogen) und gereinigt mit QIAGEN Plasmid Maxi Kits.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Biologische Industrien02-023-1A
Poietics humane mesenchymale Stammzellen LonzaPT-2501750.000 Zellen an Durchgang 2 können gemäß den Anweisungen des Herstellers für 1-2 Durchgänge vor dem Einsatz oder der Sekundärübermittlung aufgetaut und erweitert werden
PurmorphaminStemgent04-0009Rekonstitution bei 10 mM in DMSO
rekombinantes Activin APeprotech120-14Eresuspend at  (100 &Mikro; g/ml) in sterilem PBS, 0,1 % Human- oder Rinderserumalbumin
rekombinante humane FGF2Peprotech100-18 Mrd.resuspend at  (100 &Mikro; g/ml) in sterilem PBS, 0,1 % Human- oder Rinderserumalbumin
rekombinante humane FGF-basisch (bFGF)Peprotech100-18 Mrd.Resupend bei 100 & Mikro; g/ml in 0,1 % Rinderserum/Humanalbumin in PBS
rekombinanter humaner FLT3-LigandForschung & Forschung D-Systeme308-FKHB oder  308E-GMPresuspend at  (100 &Mikro; g/ml) in sterilem PBS, 0,1 % Human- oder Rinderserumalbumin
rekombinantes humanes InsulinBiogems10-365
rekombinanter humaner Kit-LigandForschung & Forschung D-SystemeBT-SCF oder BT-SCF-GMPresuspend at  (100 &Mikro; g/ml) in sterilem PBS, 0,1 % Human- oder Rinderserumalbumin
rekombinante humane LIFPeprotech300-05Resupend bei 100 & Mikro; g/ml in 0,1 % Rinder-/Humanserumalbumin in PBS
rekombinantes humanes TGFβ 1Peprotech  100-21Resupend bei 100 & Mikro; g/ml in 0,1 % Rinder-/Humanserumalbumin in PBS
rekombinantes humanes Thrombopoietin Forschung & Forschung D-Systeme288-TPN oder 288E-GMPresuspend at  (100 &Mikro; g/ml) in sterilem PBS, 0,1 % Human- oder Rinderserumalbumin
rekombinantes humanes TransferrinMillipore SigmaNr. T3705
rekominantes humanes BMP4Peprotech120-05resuspend at  (100 &Mikro; g/ml) in sterilem PBS, 0,1 % Human- oder Rinderserumalbumin
SB431543SelleckchemNr. S1067Rekonstitution bei 10 mM in DMSO
SIGMAFAST, alkalisches Phosphatasesubstrat, chromogen, TabletteMillipore SigmaNr. B56551 Tablette in 10 ml gereinigtem Wasser auflösen
NatriumselenitMillipore SigmaNr. S5261
Stemolecule Y27632 in LösungStemgent04-0012-02ROCK-Inhibitor in Lösung (10 mM)
StemPro Accutase Reagenz zur ZelldissoziationThermo Fisher ScientificNr. A11105-01
StemPro MSC SFM XenoFree (XF-MSC)Thermo Fisher ScientificA1067501Bereiten Sie XF-MSC Medium zu, indem Sie 5 ml StemPro MSC SFM XenoFree Supplement mit 500 mL StemPro MSC SFM Basal Medium mischen. Aliquotiertes Medium kann bei -20 °C kryokonserviert werden.
Vorbauspanne SFEMStemCell-Technologien9600
Thermo Scientific Mr. Frosty GefrierbehälterThermo Fisher Scientific5100-0001
Ulex Europaeus Agglutin I (UEA-1), biotyniliertVector LaboratorienNr. B-1065-21:200 in Blockierungslösung für den Fluoreszenzassay verdünnen
VEGFPeprotech100-20resuspend at  (100 &Mikro; g/ml) in sterilem PBS, 0,1 % Human- oder Rinderserumalbumin
Versene LösungThermo Fisher Scientific15040066
Vitronectin XF-MatrixStemCell-Technologien7180verdünnen bei 40 & Mikro; L/ml im CellAdhere Verdünnungspuffer
XAV939Sigma AldrichX3004rekonstituieren bei 100 mM in DMSO
β-MercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985-023lichtempfindlich

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