Methodenartikel

Gezielte Erschöpfung des hornhautsensiblen Nerven durch subkonjunktivale Injektion: Ein Modell zur Untersuchung bakterieller Adhäsion und neuroimmuner Interaktionen

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DOI:

10.3791/68614

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29. August 2025

 ,  ,  , 
1New England College of Optometry

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie etabliert ein verfeinertes Modell für die Erschöpfung der sensorischen Nerven der Hornhaut mit Bupivacain und zeigt dessen Einfluss auf die Adhäsion des Hornhautnervs und der Bakterien. Das Modell simuliert neuropathische Zustände, bietet Einblicke in neuroimmune Wechselwirkungen bei Augeninfektionen und bietet Anwendungen in Studien zur Medikamentenverabreichung, Neuroprotektion, Immunmodulation und Genmodifikation.

Zusammenfassung

Die sensorischen Nerven der Hornhaut spielen eine entscheidende Rolle bei der Unterstützung der Integrität der Augenoberfläche und der Immunabwehrmechanismen. Der Verlust dieser Innervation wurde mit einer erhöhten Anfälligkeit für mikrobielle Invasion in Verbindung gebracht, doch der genaue Beitrag der Nervenerschöpfung zur bakteriellen Adhäsion auf der Hornhaut ist nach wie vor unzureichend charakterisiert. In dieser Arbeit stellen wir eine reproduzierbare und zeitlich kontrollierte Methode zur selektiven Unterdrückung der hornhautsensiblen Nerven unter Verwendung von Bupivacain, einem langwirksamen Natriumkanalblocker, vor. Durch die Kombination von subkonjunktivalen und topischen Verabreichungswegen wird mit dieser Dual-Applikationsstrategie eine robuste, anhaltende Denervierung erreicht, die eine präzise Untersuchung ermöglicht, wie veränderte sensorische Eingaben die Anfälligkeit des Hornhautepithels für bakterielle Besiedlung beeinflussen.

Mit Hilfe dieses Modells untersuchen wir, wie die sensorische Denervierung die mikrobielle Adhäsionsdynamik von Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis und Pseudomonas aeruginosa beeinflusst, drei klinisch relevanten Erregern mit unterschiedlichen Adhäsionsmechanismen. Eine standardisierte bakterielle Inokulation über das Labor-Wipe-Blotting-Verfahren sorgt für eine gleichmäßige Ablagerung auf der Hornhautoberfläche, gefolgt von einer quantitativen Beurteilung der bakteriellen Adhäsion. Die Bupivacain-induzierte Nervendepletion korreliert mit einer verringerten Hornhautnervendichte und einer erhöhten bakteriellen Adhäsion, was einen funktionellen Zusammenhang zwischen sensorischer Depletion und mikrobieller Anfälligkeit bestätigt.

Durch die Simulation neuropathischer Erkrankungen wie diabetischer Neuropathie und neurotropher Keratitis bietet dieser Ansatz einen neuartigen Rahmen für die Untersuchung neuroimmuner Interaktionen bei Augeninfektionen. Über Infektionsmodelle hinaus bietet diese subkonjunktivale Injektionsstrategie eine vielseitige Plattform für die Untersuchung der Pharmakokinetik von Augenarzneimitteln, neuroprotektiver Interventionen und Immunmodulation. Darüber hinaus kann es für Genmodifikationsstudien angepasst werden, einschließlich der subkonjunktivalen Verabreichung von CRISPR/Cas-Konstrukten oder viralen Vektoren, wodurch seine Anwendungen in der ophthalmologischen Forschung und Therapie erweitert werden.

Einleitung

Die sensorische Innervation der Hornhaut spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Integrität der Augenoberfläche und der Immunhomöostase. Die Hornhaut ist eines der am dichtesten innervierten Gewebe des Körpers, das überwiegend von der ophthalmischen Abteilung des Nervus trigeminusversorgt wird 1. Diese sensorischen Nerven vermitteln nicht nur Nozizeption und Blinzelreflexe, sondern regulieren auch die Epithelproliferation, die Wundheilung und die Immunüberwachung 2,3. Jede Störung der sensorischen Innervation kann daher die Hornhautbarriere beeinträchtigen, die Mikroumgebung der Augenoberfläche verändern und die Anfälligkeit für mikrobielle Infektionen erhöhen.

Die sensorische Dysfunktion der Hornhaut wird mit systemischen Erkrankungen wie Diabetes mellitus in Verbindung gebracht und trägt zu Augenerkrankungen bei, einschließlich Erkrankungen des trockenen Auges, diabetischer Keratopathie, neurotropher Keratitis und postoperativer Komplikationen 3,4,5,6,7,8,9,10 . Eine Beeinträchtigung des sensorischen Nerven führt zu einer verminderten Tränenproduktion, einer Epithelausdünnung und einer verzögerten Wundheilung, die alle die bakterielle Besiedlung begünstigen11,12. Der genaue mechanistische Zusammenhang zwischen sensorischer Nervenerschöpfung und bakterieller Adhäsion ist jedoch noch unzureichend verstanden. Während Studien eine erhöhte bakterielle Adhäsion nach Hornhautdenervation nachweisen konnten, fehlt es an standardisierten Modellen, die eine kontrollierte Untersuchung dieses Zusammenhangs ermöglichen.

Um diese Lücke zu schließen, haben wir ein gezieltes Modell der sensorischen Nervenerschöpfung der Hornhaut unter Verwendung von Bupivacain entwickelt, einem lang wirkenden Natriumkanalblocker, der eine klinische Neuropathie nachahmt, ohne dauerhafte Nervenschäden zu verursachen 13,14,15. Dieser pharmakologische Ansatz bietet eine kontrollierte und reproduzierbare Methode zur Untersuchung der Erschöpfung des Hornhautnervs und ihrer Auswirkungen auf die Augenoberfläche15. Durch die Integration dieses Modells mit bakteriellen Adhäsionsassays können wir den Einfluss der sensorischen Nervenerschöpfung auf die mikrobielle Besiedlung systematisch bewerten und dabei Schlüsselaspekte der diabetischen Keratopathie und der neurotrophen Keratitis nachahmen.

Die mikrobielle Adhäsion ist ein kritisches frühes Ereignis bei Hornhautinfektionen, das von der Zusammensetzung des Tränenfilms, den Eigenschaften der Epitheloberfläche und der Immunantwort des Wirts beeinflusst wird. Unter den verschiedenen Krankheitserregern, die in der Lage sind, die Augenoberfläche zu besiedeln, stellen S. aureus, S. epidermidis und P. aeruginosa drei klinisch signifikante Bakterien mit unterschiedlichen Adhäsionsmechanismen dar. P. aeruginosa, ein hochvirulentes gramnegatives Bakterium, nutzt Pili, Flagellen und sekretierte Virulenzfaktoren, um schnell an Hornhautepithelzellen zu haften und in diese einzudringen, was häufig zu einer schweren ulzerativen Keratitis führt16,17. Im Gegensatz dazu nutzt S. epidermidis, ein grampositives kommensales Bakterium, überwiegend gestörte Epitheloberflächen und Tränenfilmveränderungen, um Biofilme zu bilden, was zu persistierenden und oft subklinischen Infektionen beiträgt18,19. Die Unterschiede in den Adhäsionsstrategien zwischen diesen Spezies unterstreichen die Notwendigkeit zu verstehen, wie die Erschöpfung der Hornhautnerven die okuläre Mikroumgebung verändert, um die bakterielle Besiedlung zu begünstigen.

Eine zentrale Herausforderung bei der Untersuchung der bakteriellen Adhäsion ist die Wahl eines geeigneten Impfmodells. Das konventionelle Modell der Kratzverletzung, das häufig in Infektionsstudien verwendet wird, erzeugt Epitheldefekte, um die bakterielle Adhärenz zu erleichtern. Dieser Ansatz ist zwar effektiv bei der Simulation von traumainduzierten Infektionen, führt jedoch zu signifikanten Störvariablen, einschließlich übermäßiger Gewebeschädigung und einer übertriebenen Entzündungsreaktion, die die frühen Stadien der bakteriellen Besiedlung in neuropathischen Hornhäuten nicht genau repräsentieren. Darüber hinaus erschwert die Variabilität der mechanischen Verletzungen das Erzielen reproduzierbarer Ergebnisse. Um diese Einschränkungen zu überwinden, ist eine kontrolliertere und physiologisch relevantere bakterielle Impfmethode erforderlich.

Die Labor-Wipe-Blotting-Technik bietet einen standardisierten Ansatz für die bakterielle Ablagerung, der eine gleichmäßige bakterielle Adhärenz gewährleistet, ohne die Epithelbarrierezu stören 20. Diese Methode ahmt reale Suszeptibilitätsszenarien nach, in denen die bakterielle Adhäsion ohne offensichtliches mechanisches Trauma, aber unter Bedingungen einer veränderten Tränenzusammensetzung und Epithelhomöostase auftritt. Durch die Eliminierung der Variabilität, die mit mechanischen Verletzungen verbunden ist, ermöglicht die Labor-Wipe-Blotting-Methode eine genauere Beurteilung der mikrobiellen Adhäsionsdynamik in neuropathischen Hornhäuten. Darüber hinaus ermöglicht es die kontrollierte Bewertung des Beitrags des Tränenfilms zur bakteriellen Besiedlung, was besonders bei sensorischen Dysfunktionen der Hornhaut relevant ist, bei denen die Tränensekretion beeinträchtigt ist.

Angesichts der entscheidenden Rolle der sensorischen Nerven der Hornhaut bei der Regulierung der Tränenproduktion und der epithelialen Homöostase ist es wichtig, ein reproduzierbares Modell für die Untersuchung der Auswirkungen einer Erschöpfung der sensorischen Nerven auf die mikrobielle Adhäsion zu etablieren. Diese Studie zielt darauf ab, ein Protokoll für die gezielte Erschöpfung der sensorischen Nerven der Hornhaut unter Verwendung von Bupivacain, einem langwirksamen Lokalanästhetikum, zu verfeinern, um seine Auswirkungen auf die Tränensekretion und die bakterielle Adhäsion zu bewerten. Durch die Kombination aus subkonjunktivaler und topischer Bupivacain-Applikation gewährleistet dieser Ansatz eine lokalisierte und anhaltende sensorische Depletion zu einem definierten Zeitpunkt der Spitzenwirksamkeit. Mit Hilfe dieses Modells untersuchen wir, wie sensorische Denervierung die Adhäsionsdynamik von S. aureus, S. epidermidis und P. aeruginosa verändert, was wertvolle Einblicke in den Zusammenhang zwischen Nervendepletion, Tränenfilmveränderungen und mikrobieller Suszeptibilität liefert. Diese Ergebnisse haben weitreichendere Auswirkungen auf das Verständnis der Infektionsanfälligkeit bei neuropathischen Erkrankungen wie der diabetischen Keratopathie und der neurotrophen Keratitis und bieten eine Grundlage für zukünftige Studien zu okulären neuroimmunen Interaktionen und therapeutischen Interventionen.

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Protokoll

Alle Eingriffe mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den von der Association for Research in Vision and Ophthalmology festgelegten Standards durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am New England College of Optometry genehmigt und entsprachen den PHS-Richtlinien zur humanen Pflege und Verwendung von Labortieren. Sechs bis acht Wochen alte männliche und weibliche C57BL/6J-Mäuse (Wildtyp; Stamm Nr. 000664) wurden aus dem Jackson Laboratory gewonnen, und die Mäuse wurden unter normalen zirkadianen Rhythmen (einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus) gezüchtet und erhielten Futter und Wasser. Behalten Sie die sterile Technik während aller Verfahren bei.

1. Vorbereitung der Tiere für die subkonjunktivale Injektion

  1. Induzieren Sie eine Anästhesie mit 2-3% Isofluran in Sauerstoff über einen kalibrierten Verdampfer. Überwachen Sie die Narkosetiefe, indem Sie überprüfen, ob es keine reflexartige Reaktion auf ein sanftes Einklemmen der Zehen gibt.
  2. Beobachten Sie das Tier kontinuierlich auf Anzeichen von starkem Unwohlsein oder Stress.
  3. Wenn Stress beobachtet wird, leiten Sie eine tiefe Anästhesie mit 5% Isofluran ein und bestätigen Sie die Reaktionslosigkeit.
  4. Führen Sie eine Gebärmutterhalsluxation durch, um die Euthanasie sicherzustellen.
  5. Andernfalls führen Sie die Enukleation sofort mit einer gebogenen Enukleationszange für nachgelagerte Analysen durch.

2. Blockade des Hornhautnervs durch subkonjunktivale Injektion

HINWEIS: Implementieren Sie ein zweistufiges Protokoll, das eine subkonjunktivale Injektion und topische Anwendung von Bupivacain umfasst, um eine gezielte Erschöpfung der sensorischen Nerven der Hornhaut zu erreichen. Vollständige subkonjunktivale Injektionen und topische Anwendungen innerhalb von 15 Minuten, um die systemische Anästhesiebelastung zu minimieren.

  1. Vorbereitung und Inzision
    1. Einen kleinen (~0,5 mm) Schnitt an der superotemporalen Limbusregion mit einer 30 G Nadel anlegen. Vermeiden Sie Blutgefäße und minimieren Sie Gewebetraumata. Verwenden Sie die Inzision, um Zugang zum subkonjunktivalen Raum für die kontrollierte Wirkstoffabgabe zu erhalten.
  2. Injektion von Bupivacain
    1. Bereiten Sie eine 0,5%ige Bupivacainhydrochloridlösung unter sterilen Bedingungen vor.
    2. Geben Sie 5 μl der Lösung in eine Hamilton 10 μl Spritze, die mit einer 33 G kleinen stumpfen Nabennadel (Punktform 3) ausgestattet ist.
    3. Injizieren Sie die Lösung in einem Winkel von 15-20° in den subkonjunktivalen Raum, um den Rückfluss zu minimieren und eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten.
    4. Beobachten Sie die Blasenbildung an der Injektionsstelle; Lassen Sie es 5-10 s lang bestehen und verteilen Sie sich in der subkonjunktivalen Tasche, bis es vollständig absorbiert ist.
  3. Topische Verstärkung der Hornhautdesensibilisierung
    1. Tragen Sie unmittelbar nach der subkonjunktivalen Injektion weitere 5 μl 0,5 % Bupivacain direkt auf die zentrale Hornhaut auf.
      HINWEIS: Verwenden Sie diesen Schritt, um die Desensibilisierung der Oberflächennerven zu verbessern und die Wirkung der Lokalanästhesie zu verlängern.
  4. Kontrollgruppe
    1. 5 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) sind sowohl durch subkonjunktivale Injektion als auch durch topische Verabreichung zu identischen Zeitpunkten für Kontrolltiere zu verabreichen. Passen Sie Verfahrensschritte und Volumen an, um injektionsbedingte Effekte zu berücksichtigen.
  5. Analyse der Behandlungsdauer und des Endpunkts
    1. Verabreichen Sie die Bupivacain-Behandlung 15 Tage lang jeden zweiten Tag, um eine anhaltende Erschöpfung der sensorischen Nerven zu erreichen und gleichzeitig die Toxizität zu minimieren.
    2. Am Tag 15 werden die Mäuse 4 Stunden nach der abschließenden Bupivacain-Behandlung mit 5 % Isofluran in Sauerstoff über einen kalibrierten Verdampfer eingeschläfert, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation.
    3. Sofort werden Hornhäute von einer Gruppe von Mäusen (siehe Schritt 5.5.) zur Beurteilung von Veränderungen der Nervendichte mittels Immunhistochemie (siehe Abbildung 1 und Abschnitt 6 des Protokolls) und von einer anderen Gruppe für die bakterielle Adhäsionsanalyse (siehe Abbildung 1 und Abschnitt 5 des Protokolls) entnommen.

3. Tierisches Präparat zur bakteriellen Inokulation

  1. Verabreichen Sie intraperitoneales Ketamin (80-100 mg/kg) und Dexmedetomidin (0,25-0,5 mg/kg), um Mäuse vier Stunden nach der letzten Bupivacain-Injektion und topischen Anwendung an Tag 15 zu betäuben.
  2. Bestätigen Sie die Tiefenanästhesie, indem Sie überprüfen, ob keine reflexartigen Reaktionen auf das Einklemmen der Zehen vorhanden sind.
  3. Spülen Sie die Augenoberfläche 3x mit einer Pipette mit 5 μl sterilem PBS ab, um Tränenflüssigkeitsreste und Ablagerungen zu entfernen und so eine saubere Hornhautoberfläche für bakterielle Adhäsionsstudien zu gewährleisten (siehe Abbildung 1)
  4. Verwenden Sie in der vorgesehenen Versuchsgruppe ein fusselfreies Labortuch, um die Hornhautoberfläche auf standardisierte Weise abzutupfen.
    1. Falten Sie das Seidenpapier, um einen sicheren Halt zu gewährleisten.
    2. Wischen Sie die Hornhaut der anästhesierten Maus 4x vorsichtig ab, beginnend an der zentralen Hornhaut und mit einer Drehbewegung nach rechts und links, um die peripheren Regionen20 einzubeziehen.
      HINWEIS: Üben Sie minimalen Druck aus, um mechanische Verletzungen zu vermeiden, und entfernen Sie effektiv die Tränenflüssigkeit, um die bakterielle Adhäsion zu erleichtern.

4. Vorbereitung des bakteriellen Inokulums und Hornhautinokulation

  1. Bakterienkultur und -aufbereitung
    1. Kultivieren Sie S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 12228 und P. aeruginosa O1 auf tryptischem Soja-Agar (TSA) und inkubieren Sie bei 37 °C mit sterilem Wasser, das in den Inkubator gegeben wird, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.
    2. Ernten Sie einzelne Bienenvölker und suspendieren Sie sie in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Zentrifugieren Sie die Suspension bei 5.000 × g einmal für 5 Minuten, um abgestorbene Zellen und Stoffwechselnebenprodukte zu entfernen.
    3. Resuspendieren Sie das Bakterienpellet in PBS und stellen Sie die Konzentration auf ~10¹¹ KBE/ml ein, um eine hohe Bakterienbelastung für Adhäsionsstudien zu gewährleisten.
  2. Protokoll der Hornhautimpfung
    1. Tragen Sie einmal pro Stunde unter anhaltender Anästhesie ein 5 μl Aliquot der vorbereiteten Bakteriensuspension auf die Hornhautoberfläche auf.
    2. Positionieren Sie die Mäuse in einer leichten Schräglage, um ein Abfließen zu verhindern und eine gleichmäßige Exposition gegenüber dem Inokulum zu gewährleisten.
    3. Wiederholen Sie die Impfung in stündlichen Intervallen, um eine anhaltende bakterielle Exposition nachzuahmen, die für klinische Infektionsszenarien relevant ist.
  3. Euthanasie nach der Inokulation und Beurteilung der bakteriellen Adhäsion
    1. Verabreichen Sie nach 4 Stunden eine intraperitoneale Injektion von Ketamin (80-100 mg/kg) und Xylazin (5-10 mg/kg), um eine tiefe Anästhesie zu gewährleisten.
    2. Führen Sie eine Gebärmutterhalsluxation durch, um die Mäuse human einzuschläfern.
    3. Entkernen Sie die Augen mit einer sterilen Pinzette mit gebogener Spitze unter Einhaltung strenger aseptischer Bedingungen, um eine Kontamination zu vermeiden.
    4. Spülen Sie die Augenoberfläche 5-6x mit sterilen 2 mL PBS in einer Petrischale durch leichtes Schütteln ab, um nicht anhaftende Bakterien gründlich zu entfernen.
    5. Homogenisieren Sie die enukleierten Augen in 1 ml sterilem PBS mit einem mechanischen Gewebehomogenisator, um eine konsistente bakterielle Rückgewinnung zu gewährleisten und aseptische Bedingungen aufrechtzuerhalten, um eine Kontamination zu vermeiden.
    6. Führen Sie serielle sechsfache Verdünnungen des Homogenats in sterilem PBS durch.
    7. Aliquotieren Sie jede Verdünnung auf TSA-Platten und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C, um das Koloniewachstum zu ermöglichen.
    8. Zählen Sie koloniebildende Einheiten (KBE) und drücken Sie die Ergebnisse als logarithmische KBE pro Hornhaut für den quantitativen Vergleich aus.

5. Immunhistochemie

  1. Euthanasieren Sie Mäuse durch Gebärmutterhalsluxation am 15. Tag nach der Behandlung.
  2. Augen vorsichtig enukleieren und einmal bei Raumtemperatur unter sanfter Drehung mit PBS spülen.
  3. Fixieren Sie die enukleierten Augen 1 h lang in 2 % Paraformaldehyd (PFA), um die strukturelle Integrität zu erhalten
  4. Waschen Sie die fixierten Augen 3 x 10 min in 1 mL PBS unter sanfter Rotation bei Raumtemperatur.
  5. Befolgen Sie das zuvor beschriebene Protokoll der Hornhautdissektion21,22
    1. Präparieren Sie die Hornhaut in einer 35 mm breiten Petrischale, die mit einer minimalen Menge PBS gefüllt ist.
    2. Verwenden Sie eine Pinzette mit gerader Kante, um das enukleierte Auge zu stabilisieren, und eine chirurgische Schere, um einen kleinen Schnitt an der hinteren Seite des Globus zu erstellen.
    3. Verwenden Sie den kleinen Schnittpunkt, um vorsichtig entlang der hinteren Seite 360° zu schneiden.
    4. Entsorgen Sie die Netzhaut der Maus, den Sehnerv, die Linse, das Irispigment und alle zusätzlichen Gewebestrukturen, die nicht die Hornhaut sind.
    5. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe mit einer Pinzette oder durch vorsichtiges Einschneiden mit einer chirurgischen Schere, wobei die Hornhaut intakt bleibt.
    6. Waschen Sie die präparierten Hornhäute 3 x 10 min in 1 ml PBS in Mikrozentrifugenröhrchen unter sanfter Rotation bei Raumtemperatur.
  6. Inkubieren Sie die Hornhaut in 1 ml Blockierungslösung (3% BSA + Triton X-100 in PBS) für 1 h bei Raumtemperatur mit kontinuierlicher Rotation.
  7. Verbessern Sie die Permeabilisierung des Gewebes, indem Sie die Hornhaut eine weitere Stunde lang unter den gleichen Bedingungen in 1 ml 20 % EDTA inkubieren.
  8. Die Hornhaut über Nacht bei 4 °C mit dem Kaninchen-Anti-β-Tubulin-III-Primärantikörper unter sanfter Rotation bei Raumtemperatur inkubieren.
  9. Am nächsten Tag inkubieren Sie das Gewebe mit Alexa Fluor 488-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper und DAPI für die Kernfärbung für 2-3 h bei 4 °C im Dunkeln.
  10. Waschen Sie die Hornhaut 3 x 10 min mit PBS unter sanfter Rotation.
  11. Befolgen Sie das zuvor beschriebene Protokoll für die flache Hornhautbefestigung21,22
    1. Montieren Sie die gefärbten Hornhäute flach auf Objektträger, indem Sie die Hornhaut an den Rand des Objektträgers legen, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
    2. Positionieren Sie die Hornhaut wieder in der Mitte des Objektträgers, wobei die Epithelseite nach unten zeigt und die Objektträgeroberfläche berührt.
    3. Machen Sie vier gerade Schnitte (1-2 mm lang) von der peripheren Kante zur Mitte hin und verwenden Sie eine chirurgische Federklinge, um Halbquadranten zu erstellen.
    4. Tragen Sie 20 μl Eindeckmittel auf und legen Sie ein 8 mm dickes Deckglas über die Hornhaut.
    5. Drücken Sie vorsichtig auf das Deckglas, um Luftblasen zu entfernen und eine Faltenbildung der Hornhaut zu verhindern.
    6. Lagern Sie die Probe zum Trocknen bei Raumtemperatur im Dunkeln.
    7. Versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit klarem Nagelschutz, um ein Austrocknen an der Luft zu verhindern, und lagern Sie die Objektträger im Dunkeln, bis sie für die Bildgebung bereit sind.

6. Bildgebung

  1. Führen Sie die konfokale Mikroskopie mit einem aufrechten konfokalen Zwei-Photonen-Mikroskop mit einem Wassertauchobjektiv mit 20x/1,00 NA durch.
  2. Legen Sie die flach montierten Proben auf den Mikroskoptisch und stellen Sie das Wasserimmersionsobjektiv 20x/1,00 NA auf.
  3. Dimmen Sie die Raumbeleuchtung und decken Sie das Mikroskop mit einem undurchsichtigen schwarzen Tuch ab, um Störungen durch externes Licht während der Bildgebung zu minimieren.
  4. Visualisieren Sie die Hornhautnerven mit dem Alexa Fluor 488 nm Laserkanal und detektieren Sie Zellkerne mit dem DAPI 405 nm Laserkanal.
  5. Legen Sie die Bildgröße auf 1.536 x 1.536, die Lochblende auf 1 Airy-Einheit (AU) und die Scangeschwindigkeit auf 1,02 μs fest. Aktivieren Sie bidirektionales Scannen und wenden Sie eine 2-fache Mittelwertbildung an.
  6. Passen Sie die Master-Verstärkung (~750 V) an und minimieren Sie die Intensität der Laserleistung, um Photobleiche und Phototoxizität zu verhindern und gleichzeitig eine klare Bildaufnahme zu gewährleisten.
  7. Führen Sie eine Z-Stack-Bildgebung durch, um die gesamte Hornhautdicke zu erfassen. Legen Sie die erste Fokusebene auf den vordersten Aspekt und die letzte auf den hintersten Aspekt der Probe fest.
  8. Erfassen Sie Z-Stapel in Schritten von 0,8 μm oder 1,0 μm, wobei insgesamt ca. 60 bis 80 Stapel pro Probe erfasst werden.
  9. Beurteilung der Dichte des Hornhautnervs
    1. Analysieren Sie die Hornhautnervendichte mit der Imaris-Software.
    2. Bestätigen Sie die vollständige Bildstärke, indem Sie die Volumenabmessungen überprüfen.
    3. Aktivieren Sie die Option Volumen-Rendering , um eine 3D-Rekonstruktion zu generieren.
    4. Erstellen Sie eine Projektion mit maximaler Intensität, um den Z-Stapel zur Visualisierung und Quantifizierung in eine 2D-Ansicht umzuwandeln.
    5. Bewerten Sie die Hornhautnervendichte auf einer Skala von 0 bis 10 durch verblindete Bewerter, um eine objektive Beurteilung zu gewährleisten.

7. Statistische Auswertung

  1. Bewerten Sie die Datenverteilung mit den Tests Shapiro-Wilk und Kolmogorov-Smirnov.
  2. Wenn der Großteil der Daten einer Normalverteilung folgt, stellen Sie die Ergebnisse als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dar.
  3. Für Vergleiche zwischen zwei Gruppen wenden Sie den Student-t-Test an und verwenden Sie die unidirektionale ANOVA, gefolgt vom Tukey-Test für mehrere Vergleiche für Analysen, an denen drei oder mehr Gruppen beteiligt sind.
  4. Betrachten Sie einen p-Wert < 0,05 als statistisch signifikant.

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Ergebnisse

Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Experimente unabhängig voneinander in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, wobei jedes Replikat 3-4 Mäuse pro Gruppe umfasste.

Signifikante Verringerung der Hornhautnervendichte nach der Behandlung mit Bupivacain
Um die Auswirkungen einer gezielten Depletion der sensorischen Nerven der Hornhaut systematisch zu bewerten, wurde die Dichte der Hornhautnerven mittels Immunmarkierung und konfokaler Mikroskopie untersucht. Die Mäuse erh...

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Diskussion

Die sensorischen Nerven der Hornhaut spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Integrität der Augenoberfläche, der Regulierung der epithelialen Homöostase und der Modulation von Immunreaktionen. Eine Hornhautneuritis, die durch Nervendegeneration und Entzündung gekennzeichnet ist, wird häufig bei systemischen Erkrankungen wie Diabetes mellitus beobachtet, bei denen chronische Hyperglykämie zur peripheren Neuropathie, einschließlich des Verlusts des Hornhautnervs, bei...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5 % Bupivacainhydrochlorid-Lösung Pfizer INC., Vereinigte Staaten von AmerikaNDC 00409-1162-01
30 G NadelHersteller: BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA305106
33 G stumpfe Nadel mit kleiner Nabe (Spitzenform 3)  Hamilton Company, Reno, NV, Vereinigte Staaten von Amerika7803-05
4',6-Diamidino-2-phenylindol, DihydrochloridThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USANr. D1306
RinderserumalbuminSigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von AmerikaNr. A7906
C57BL/6J (Wildtyp) Mäuse Jackson-Labor. 000664
Cantrifuge RotatorThe Lab Depot, Inc. (Dawsonville, GA, USA)Nr. R2020
Klarer NagelschutzNass und wildN/A
Präpariermikroskop (SMZ-160-TLED Stereomikroskop (Präparieren) mit Trinokularanschluss)Stellar Scientific (Baltimore, MD, USA)1.1002E+12
EthylendiamintetraessigsäureSigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von AmerikaNr. E6511
Ziege Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USANr. A-11008
Hamilton 10-μ L SpritzeHamilton Company, Reno, NV, Vereinigte Staaten von Amerika7635-01
Hochpräzise Präparier-MikroschereThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA08-953-1B
IsofluranPatterson Veterinary, USA07-890-8115
Isofluran-VerdampferKent Scientific, USAVETFLO1205S
KetaminhydrochloridDechra Veterinary Products, Overland Park, KS, USADP00050
Kimwipe fusselfreies SeidenpapierKimberly-Clark Professional, Roswell, GA, USA34155
Mikro-Präparierzange mit gebogener Front (für die Enukleation)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von AmerikaF4142-1EA
Mikro-Präparierzange gerade vorneSigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von AmerikaNr. F4017
Petrischalen (100 mm)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA263991
Petrischalen (35 mm)Avantor, über VWR International (Radnor, PA, USA).25373-041
Phosphatgepufferte KochsalzlösungThomas Scientific, Swedesboro, NJ, USAC987D24
ProLong Gold Antifading-EindeckmittelThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USANr. P36930
Kaninchen anti-β-Tubulin IIISigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) T2200
Runder Deckglas Deutsches Glas (8 mm)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA50-949-314
Griffe des SkalpellsSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) Nr. S2896-1EA
Objektträger, MikroskopSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) Nr. S8902-1PAK
Mikrozentrifugenröhrchen mit Schnappverschluss und geringer RetentionThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA3453
Sorvall Instruments RT6000B TischzentrifugeThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA3367898
Chirurgische FederklingenWorld Precision Instruments (Sarasota, FL, USA)504169 
Tryptisches Soja-AgarSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 22091
Xylazin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika1236-20-8

Referenzen

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