Methodenartikel

Leucin-Reißverschluss-basierte Zellsortierung zur Aufreinigung von Dual-Vektor-transduzierten Zellen

DOI:

10.3791/68628

⸱

24. Oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1City of Hope Los Angeles and National Medical Center, 2Lymphoma and Cellular Therapy Services, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 3Department of Hematology and Hematopoietic Cell Transplantation, City of Hope National Medical Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur selektiven Aufreinigung von dual-transduzierten T-Zellen aus einer Mischung von co-transduzierten T-Zellen. Dieser Ansatz kombiniert zwei retrovirale Vektoren, die jeweils eine Komponente einer gepaarten Leucin-Reißverschluss-basierten Zellsortierungsmethode kodieren, die eine selektive immunomagnetische Aufreinigung von Dual-Vektor-transduzierten Zellen ermöglicht.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adoptive T-Zelltherapien, einschließlich chimärer Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen, haben eine beeindruckende klinische Wirksamkeit gegen hämatologische Malignome gezeigt und sind vielversprechend bei der Behandlung solider Tumormalignome. Trotz dieser Erfolge wurden mehrere Resistenzmechanismen gegen die T-Zell-Immuntherapie identifiziert, die den therapeutischen Erfolg einschränken, darunter der Verlust oder die schwache Expression von Zielantigenen, die Entwicklung einer T-Zell-Erschöpfung und das Vorhandensein einer immunsuppressiven Tumormikroumgebung. Um diese Resistenzmechanismen zu überwinden, wurden mehrere zelltechnische Strategien entwickelt. Es können jedoch mehrere Resistenzmechanismen gleichzeitig auftreten, was eine Kombination mehrerer technischer Strategien zur Optimierung der Anti-Tumor-Aktivität erforderlich macht. Einschränkungen bei der Vektorverpackung begrenzen die Abgabe großer Mengen genetischer Informationen an T-Zellen und stellen eine Herausforderung bei der gemeinsamen Expression mehrerer manipulierter Konstrukte dar. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Co-Transduzierung von T-Zellen mit zwei Vektoren, um mehrere Transgene zu kodieren, wodurch die Anzahl der manipulierten Funktionen erhöht wird. Durch die Co-Expression einer auf Leucin-Reißverschluss basierenden Zellsortierungsmethode, die als Zip-sort bezeichnet wird, leiten wir die selektive immunomagnetische Aufreinigung von dual-transduzierten Zellen, die zwei unterschiedliche Vektoren enthalten haben.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die CAR-T-Zelltherapie hat die Behandlung von B-Zell-Leukämie, Lymphomen und multiplem Myelom revolutioniert 1,2. CAR-T-Zellen werden auch auf bösartige Tumoren untersucht3. Es wurden jedoch wiederkehrende Mechanismen für das Versagen der CAR-T-Zelltherapie identifiziert, einschließlich einer schlechten Expression oder eines Verlusts des CAR-Zielantigenmoleküls, der Entwicklung einer T-Zell-Dysfunktion (Erschöpfung), einer aktiven Immunsuppression durch die Tumormikroumgebung und eines begrenzten T-Zelltransports und einer begrenzten Persistenz von T-Zellen in der Tumormikroumgebung 3,4,5,6 . Während individuelle technische Lösungen entwickelt wurden, um zu versuchen, jeden dieser CAR-T-Zell-Resistenzmechanismenzu überwinden 3, ist die Einführung mehrerer technischer Funktionen in ein Zelltherapieprodukt zur gleichzeitigen Überwindung mehrerer Resistenzmechanismen aufgrund der begrenzten genetischen Verpackungskapazität von retroviralen und lentiviralen Vektorsystemen eine Herausforderung7.

Um Einschränkungen in der Vektorverpackungskapazität zu überwinden, wird zunehmend die Co-Transduktion von T-Zellen mit mehreren Vektoren eingesetzt. Die Vektor-Co-Transduktion wurde zur Untersuchung von logikgesteuerten und medikamentenregulierten T-Zell-Engineering-Strategien in präklinischen Studien 8,9,10 und in einer kürzlich durchgeführten klinischen Studie zur Bewertung von CD19/CD22-Dual-CAR-T-Zellen zur Überwindung von Vektorverpackungsbeschränkungen eingesetzt11. Die Co-Transduktion erzeugt jedoch gemischte Zellprodukte, die Kombinationen von einfach- und dual-transduzierten T-Zellen enthalten, was die Funktionalität des Produkts beeinträchtigen kann, wenn es von Komponenten abhängt, die von beiden Vektoren kodiert werden, und auch zu einer Konkurrenz zwischen einfach transduzierten T-Zellenführen kann 12.

Um diese Herausforderungen zu meistern, haben wir eine Methode namens Zip-sort entwickelt, bei der heterodimerisierende Leucin-Reißverschlüsse - die jeweils aus einem von zwei co-transduzierten Vektoren exprimiert werden - zur direkten einstufigen immunmagnetischen Aufreinigung von dual-transduzierten Zellenverwendet werden 13. In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden zur Konstruktion retroviraler Vektoren, die unsere Zip-Sort-Methode, die Produktion und Konzentration retroviraler Überstände, die Aktivierung und Co-Transduktion von T-Zellen sowie die immunomagnetische Aufreinigung von dual-transduzierten Zellen (Zip-Sort) umfassen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tierversuche wurden im Parvin Animal Research Laboratory der City of Hope (COH) unter dem Protokoll #23145 durchgeführt, das vom COH Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt wurde, und im Vivarium des Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) unter dem Protokoll #99-07-025, das vom MSKCC Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt wurde. Humane T-Zellen wurden aus de-identifizierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) isoliert, die Ficoll-Paque aus Leukozytenreduktionsfiltern gereinigt wurden, die vom City of Hope Blood Donor Center gewonnen und gemäß dem Protokoll #24427 verwendet wurden, das vom City of Hope Institutional Review Board genehmigt wurde. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Biosicherheitsstandards durchgeführt.

1. Zip-Sort-Vektordesign

  1. Wählen Sie den Expressionsvektor Ihrer Wahl aus, um die interessierenden Zellen genetisch zu verändern.
    HINWEIS: Die Zip-Sort-Methode umfasst sekretierte Reißverschlüsse und Fangreißverschlüsse, die beide aus unterschiedlichen Vektoren exprimiert werden und sich intrazellulär paaren und zur Zelloberfläche gelangen, um eine selektive Reinigung von Zellen zu ermöglichen, die beide Vektoren enthalten (Abbildung 1A-D)13. Sekretierte Reißverschlüsse werden von Vektor 1 exprimiert und enthalten ein Affinitäts-Tag. Capture-Reißverschlüsse werden von Vektor 2 exprimiert und halten den sezernierten Reißverschluss auf der Oberfläche der Zelle zurück. Die blockierende Reißverschlussmodifikation besteht aus einem kovalent verknüpften zweiten Reißverschluss, der eine unspezifische extrazelluläre Reißverschlusspaarung des sezernierten Reißverschlusses blockiert. Die Modifikation des blockierenden Reißverschlusses ist erforderlich, um eine extrazelluläre Paarung zu verhindern, wenn Proteinen mit länglichen extrazellulären Domänen (typischerweise extrazelluläre Domänen, die größer als eine Domäne mit kurzen Scharnieren sind) ein Fangreißverschluss hinzugefügt wird.
  2. Wählen Sie einen Satz von sekretierten und Capture-Reißverschlüssen aus der Zusatztabelle 1 und der Zusatzdatei 1 aus, um Vektoren zu testen und zu erstellen.
  3. Klonen Sie Reißverschlusssequenzen in gepaarte Expressionsvektoren unter Verwendung molekularbiologischer Standardtechniken13 - jeder von zwei Vektoren kodiert entweder den sezernierten Reißverschluss des Affinitätstags oder den Fangreißverschluss (Abbildung 1D).
    1. Siehe Ergänzende Tabelle 1 und Ergänzende Datei 1 für Sequenzen von Reißverschluss-Konstrukten. Die Reißverschlusssequenzen wurden am 5' (N-Ende) einer polycistronischen Nachricht platziert, um ihre Ausprägung zu verbessern und dadurch die Sortierausbeute zu erhöhen. Platzieren Sie nachfolgende Transgene stromabwärts, getrennt durch selbstspaltende 2A-Peptide (Abbildung 1D). Frühere Experimente hatten jedoch Erfolg, die Reißverschlüsse in einer 3'-Konfiguration zu platzieren, wenn eine hohe Ausprägung beibehalten wurde.

2. Retrovirus-Produktion

  1. Bereiten Sie Phoenix-Eco-Zellen (ATCC CRL-3214, Maus-Tropenvirus) oder Phoenix-Eco ɑ-V β-3 Zellen13 (Zugabe von ɑ-V β-3 zur Verbesserung der Adhäsion von Phoenix-Eco) oder 293Vec-RD11414 (humantropisches Virus) oder 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 Zellen (Zugabe von ɑ-V β-3 zur Verbesserung der Adhäsion von 293Vec-RD114) 1 Tag vor der Transfektion vor.
    HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert keine Modifikation der Verpackungslinien mit ɑ-V β-3-Integrinen, aber diese Modifikation verbessert die Adhäsion dieser Zelllinie an Gewebekulturflaschen und erleichtert die Entnahme retroviraler Überstände.
    1. Trypsinisieren Sie Zellen in einem T175-Kolben, der Phoenix- oder 293Vec-RD114-Zellen bei ~80% Konfluenz mit 0,25% Trypsin-EDTA enthält.
      1. Entfernen Sie das Medium, waschen Sie adhärente Zellen mit 10 ml PBS und halten Sie die Zellen ungestört, um Serumkomponenten zu entfernen, die Trypsin hemmen, fügen Sie 5 ml 0,25 % Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 37 °C.
      2. Dissoziieren und sammeln Sie die Zellen in 5 ml DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 % GlutaMAX (als vollständiges DMEM bezeichnet).
      3. Die Zellen werden in einem konischen 15-ml-Röhrchen pelletiert, indem sie 5 min lang bei 4 °C bei 340 x g zentrifugieren. Medien dekantieren.
    2. Resuspendieren Sie zentrifugenpelletierte Zellen in 10 ml vollständigem DMEM und einer Platte auf einer 10 cm großen Gewebekulturschale ca. 1,5 x 10 6 Phoenix-Eco-Zellen, Phoenix-Eco ɑ-V β-3, 293Vec-RD114 Zellen oder 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 Zellen, die mit einem Hämazytometer gezählt wurden.
    3. Schütteln oder schwenken Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C, damit die Zellen an der Platte haften können.
  2. Etwa 18-24 Stunden später stellen Sie sicher, dass die Zellen zu 60 % bis 70 % konfluent sind, wobei gesunde, adhärente Zellen dendritische Fortsätze aufweisen.
  3. Stabil transfizieren Sie Phoenix-Eco-, Phoenix-Eco ɑ-V β-3-Zellen, 293Vec-RD114 oder 293Vec-RD114 ɑ-V β-3-Zellen mit retroviralen LZRS-Vektorkonstrukten (Addgene Plasmid #31601, EBNA-basierte episomal stabile Transfektion) oder PB-Vektorkonstrukten13 (piggyBac-Transposon-basierte genomische stabile Integration, Ergänzende Datei 1) unter Verwendung des Transfektionskits (Table of Materials), wie unten beschrieben.
    1. Für jede Transfektionsreaktion werden 2 μg LZRS-Vektor-DNA oder PB-Vektor-DNA und 16 μl Enhancer-Reagenz in 300 μl EC-Puffer in einem Mikrozentrifugenröhrchen kombiniert.
    2. Für eine stabile Integration von PB-Vektorkonstrukten fügen Sie zusätzlich 1 μg des hyperaktiven piggyBac-Transposase-Vektors pCMV-hyPBase15 hinzu (Sanger Institute).
    3. 5 s schonend vortexen lassen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. 20 μl Transfektionsreagenz zugeben, 10 s vortexen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um DNA-Mizellen-Komplexe zu erzeugen.
    4. Geben Sie 300 μl vollständiges DMEM in das Röhrchen, pipettieren Sie mehrmals, um es gründlich zu mischen, und geben Sie die Mizellensuspension tropfenweise mit einer 1-ml-Pipette in die plattierten Verpackungslinienzellen.
    5. Vorsichtig schwenken, um eine gleichmäßige Abscheidung der Mizellen zu gewährleisten. Nach 24 Stunden trypsinisieren die transfizierten Zellen und beurteilen die anfängliche retroviral kodierte Konstruktexpression mittels Durchflusszytometrie.
    6. Trypsinisierte Zellen werden in einen T75-Kolben mit 20 mL vollständigem DMEM überführt und je nach Antibiotikaresistenz-Gen 2 μg/mL Puromycin oder 10 μg/ml Blasticidin hinzugefügt, um die transfizierten Zellen auszuwählen. Sobald die Zellen eine Konfluenz von 70 % bis 75 % erreicht haben, trypsinisieren sie und werden in einen T175-Kolben mit 40 ml vollständigem DMEM übertragen. Beibehaltung der Auswahl von Antibiotika in den Medien während der Erweiterung der Verpackungslinie.
    7. Wenn die Zellen zu 80 % bis 85 % konfluent sind, trypsinisieren sie erneut und bestätigen die Expression des Konstrukts durch Durchflusszytometrie. Frieren Sie ein Aliquot der Zellen unter Verwendung von Gefriermedien (50 % vollständiges DMEM, 40 % FBS, 10 % DMSO) ein und durchqueren Sie die Zellen in zwei T175-Kolben (1:10-1:12 Split-Verhältnis) mit 40 mL vollständigem DMEM.
  4. Sammeln und konzentrieren Sie retrovirale Überstände aus vollständig ausgewählten stabilen Verpackungslinien, die in T175-Kolben gezüchtet werden, wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 85 % erreichen.
    1. Entfernen Sie vor der ersten Entnahme Antibiotika aus dem Medium, indem Sie das Medium in T175 24 h vor der ersten beabsichtigten Entnahme durch 40 ml frisches, vollständiges DMEM ersetzen.
    2. Überstände 24 Stunden nach dem Medienwechsel auffangen und filtrieren, indem der gesammelte Überstand durch 50-ml-Spritzen geleitet wird, die mit Spritzenvorsatzfiltern (0,45 μm, Polyvinylidenfluorid) ausgestattet sind. In einem konischen 50-ml-Röhrchen sammeln.
    3. 5x Polyethylenglykol (PEG) Lösungskonzentrat (40 % (Gew./Vol.) PEG 8.000 MW mit 2,4 % (Gew./Vol) NaCl) gefiltertem Überstand zugeben und das Rohr mehrmals umdrehen, um es gründlich zu mischen (PEG-Fällungsschritt).
    4. Geben Sie 40 ml vollständiges DMEM zurück in den ursprünglich geernteten T175-Kolben, inkubieren Sie weitere 24 Stunden und sammeln Sie den Virusüberstand täglich für insgesamt 2 aufeinanderfolgende Tage.
    5. Das Virus 1-2 Tage bei 4 °C ausfällen. Das ausgefällte Virus erscheint als flockiges, schwimmendes oder sedimentiertes Material.
    6. Zentrifugieren Sie PEG-präzipitierte Virussuspension bei 2.100 x g für 15 min bei 4 °C. Nicht ausgefällten Überstand verwerfen.
    7. Resuspendieren Sie jedes PEG-präzipitierte Viruspellet in 500 μl RPMI, ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin, 1 % GlutaMAX, 1 % Natriumpyruvat, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren und 0,1 % β-Mercaptoethanol (als vollständiges RPMI bezeichnet).
    8. Das resuspendierte Virus sofort zur Transduktion verwenden oder in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen und bei -80 °C lagern.

3. Tag 0: Anreicherung und Aktivierung von Maus-T-Zellen

  1. Beschichten Sie eine mit Gewebekulturen behandelte 6-Well-Platte mit 1,5 ml PBS pro Well, die 2 μg/mL Anti-CD3 (Klon 145-2C11) und 2 μg/ml Anti-CD28 (Klon 37.51) enthält. 2 h bei 37 °C inkubieren.
  2. Entnehmen Sie Milz von Spendermäusen, dissoziieren Sie Zellen durch einen 40-μm-Filter und sammeln Sie Milzzellen in vollständigem RPMI. Splenozyten werden durch Zentrifugieren bei 340 x g für 5 min bei 4 °C pelletiert.
    HINWEIS: Weibliche BALB/cJ-Mäuse im Alter zwischen 6 und 8 Wochen wurden in dieser Studie als Spendermäuse verwendet.
  3. Überstand verwerfen, Pellet vorsichtig vortexen, 1 ml Erythrozyten-Lysepuffer hinzufügen, 3x-5x zum Mischen pipettieren, 1 min bei Raumtemperatur inkubieren, mit 10 mL vollständigem RPMI abschrecken und Zellen durch Zentrifugieren bei 340 x g für 5 min bei 4 °C herunterschleudern.
  4. Der Überstand wird verworfen, 800 μl PBS mit 0,5 % BSA und 2 mM EDTA (als MACS-Puffer bezeichnet) und 200 μl Maus-CD19-Mikrokügelchen hinzugefügt. Zum Mischen pipettieren und 15 min bei 4 °C inkubieren.
  5. Bereiten Sie 1 LD-Säule pro Mausmilz vor. Fixieren Sie die Spalte KOP an einem MACS-Trennzeichen. Legen Sie ein konisches 15-ml-Röhrchen darunter, um CD19-depletierte Splenozyten zu sammeln. Befeuchten Sie die Säule mit 2 mL MACS-Puffer.
  6. Nach der Inkubation mit CD19-Mikrokügelchen werden die Zellen mit 5 mL kaltem MACS-Puffer gewaschen, die Zellen durch Zentrifugieren bei 340 x g für 5 min bei 4 °C granuliert und der Überstand verworfen. Resuspendieren Sie in 1 ml MACS-Puffer und fügen Sie der LD-Spalte Zellen hinzu. Warten Sie, bis die Suspension durchgegangen ist, bevor Sie sie mit 1 mL und dann mit 2 mL MACS-Puffer waschen.
  7. Sammeln Sie den Durchfluss der CD19-depletierten Splenozyten, um sie nachgelagert zu verwenden. LD-Säule verwerfen, CD19-depletierte Splenozyten durch Zentrifugieren bei 340 x g für 5 min bei 4 °C schleudern. Überstand verwerfen und in 18 ml vollständigem RPMI resuspendieren. Fügen Sie rekombinantes humanes IL-2 (rhIL-2) zu einer Endkonzentration von 50 I.E./ml hinzu.
  8. Entsorgen Sie die Antikörperlösung von der mit Antikörpern beschichteten 6-Well-Platte. 3 ml resuspendierte B-Zell-depletierte Splenozyten werden in jede Vertiefung der mit Antikörpern beschichteten 6-Well-Platte gegeben.

4. Tag 1: Retrovirale Transduktion von Maus-T-Zellen

  1. Beschichten Sie eine nicht mit Gewebekulturen behandelte 6-Well-Platte mit 1,5 ml PBS pro Well, die 2 μg/ml Anti-CD3 (Klon 145-2C11), 2 μg/ml Anti-CD28 (Klon 37,51) und 20 μg/ml RetroNectin enthält.
    HINWEIS: Nicht-Gewebekulturplatten werden während der RetroNectin-Beschichtung gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet.
  2. 2 h bei 37 °C inkubieren. Beschichtungslösung entsorgen oder zur Wiederverwendung aufbewahren (kann einmal wiederverwendet werden). Platte mit 1 ml PBS mit 2 % BSA pro Vertiefung blockieren, 10 min bei 37 °C inkubieren und die Blockierungslösung verwerfen.
  3. In der Zwischenzeit den PEG-präzipitierten Virusüberstand in einem 37 °C warmen Wasserbad auftauen.
    HINWEIS: 500 μl jedes co-transduzierten PEG-konzentrierten Retrovirus, das aus einem T175-Kolben erzeugt wurde, sollten ausreichen, um bis zu 2 x 106 aktivierte T-Zellen pro Well mit > Dualtransduktionseffizienz von 20 % dual zu transduzieren.
  4. Geben Sie unter den gewünschten Bedingungen Co-Transduktions-Virusüberstände in die 6-Well-Plattenvertiefung, bringen Sie das endgültige Volumen auf mindestens 2 mL mit vollständigem RPMI und 50 IE/ml rhIL-2 und schleudern Sie es 1 h lang bei 2.100 x g und 32 °C.
  5. Fügen Sie 0,5-2 x 10x 6 aktivierte T-Zellen pro Vertiefung hinzu und drehen Sie die Platte bei 340 x g für 10 min bei 32 °C. Wenn die Zellen nicht haften, wiederholen Sie den Schleudern bei 340 x g für weitere 10-20 Minuten bei 32 °C. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.

5. Tag 2: Bewertung der Vektorexpression und optionale Retransduktion

  1. Unterbrechen Sie 100-200 μl adhärente Zellen pro Bedingung aus der Transduktionsplatte für die Durchflusszytometrie. Der Benutzer sollte für jeden einzelnen Vektor und jedes Affinitäts-Tag einen durchflusszytometrisch nachweisbaren Marker identifizieren und diesen verwenden, um die Effizienz der Vektor-Einzelvektor-Transduktionseffizienz, die Effizienz der Doppelvektor-Transduktion und die Präsentation des Affinitäts-Tags mithilfe der Durchflusszytometrie zu bewerten.
  2. Führen Sie die Durchflusszytometrie an co-transduzierten Zellen durch, wie unten beschrieben.
    1. Richten Sie die Achsen der Erfassungsparameter ein, um Vektorreporter für Vektor 1 und Vektor 2 anzuzeigen (Abbildung 1C).
    2. Erstellen Sie Histogramme für die Affinitäts-Tag-Reißverschlussfärbung (z. B. FLAG oder CD34) für jeden der vier Expressionsquadranten von Vector 1 und Vector 2, um sicherzustellen, dass die Affinitäts-Tag-Färbung auf Zellen beschränkt ist, die Vektor 1 und Vektor 2 Transduktionsreporter mitexprimieren.
  3. Wenn die Zellen ausreichend dual-transduziert sind, um genügend Zellen für nachgelagerte Experimente zu gewährleisten (in der Regel 20 % oder mehr Dual-Transduktion), führen Sie die folgenden Schritte aus.
    1. Beschichten Sie die doppelte Anzahl der anfänglichen Wells, die zur Transduktion jeder T-Zelllinie verwendet wurden, mit PBS mit 2 μg/ml Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern, um die T-Zell-Stimulation aufrechtzuerhalten. 2 h bei 37 °C inkubieren.
    2. Übertragen Sie Zellen in neue Wells mit vollständigem RPMI mit 50 IE/ml rhIL-2 (erhält die T-Zell-Stimulation).
  4. Wenn die Zellen nicht ausreichend dualtransduziert sind, um genügend Zellen für nachgelagerte Experimente zu gewährleisten (in der Regel < 20 % Dualtransduktion), führen Sie die folgenden Schritte aus.
    1. Führen Sie die Re-Transduktion mit dem gleichen Protokoll wie Tag 1 durch, erhöhen Sie jedoch die Anzahl der Wells, die ursprünglich zur Berücksichtigung der T-Zell-Expansion verwendet wurden, um die Anzahl der Wells zu verdoppeln.
    2. Über Nacht bei 37 °C inkubieren. Wiederholen Sie die Durchflusszytometrie 24 h später.
      HINWEIS: Vektorkodierte Konstrukte, einschließlich des Affinity-Tag-Reißverschlusses, zeigen eine maximale Expression 2 Tage nach der ersten Transduktion.

6. Tag 3: Immunmagnetische Selektion von T-Zellen (Zip-Sortierung)

  1. Pool-Wells der Zellen, die unter den gleichen Co-Transduktionsbedingungen erzeugt wurden, in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
  2. Zellen bei 340 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Überstand verwerfen und Zellen in 500 μl MACS-Puffer mit 30 μl Mikrokügelchen (DYKDDDDK (FLAG) oder humanem CD34) pro 1 x 107 Zellen für 30 min bei 4 °C inkubieren.
  3. Nach der Inkubation die Zellen mit 5 mL kaltem MACS-Puffer waschen. Zellen bei 340 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Überstand verwerfen und Pellet in 1 ml MACS-Puffer resuspendieren.
  4. Selektieren Sie transduzierte T-Zellen positiv mit einer LS-Säule, wie unten beschrieben.
    1. Befeuchten Sie die Säule mit 2 mL MACS-Puffer. Tragen Sie die Zellsuspension auf die LS-Säule im Magnetständer auf.
    2. Nacheinander mit MACS-Puffer (1 mL, 2 mL, 3 mL) waschen. Eluieren Sie zurückgehaltene Zellen aus der Säule, indem Sie die Säule aus dem Magnetständer entfernen, 5 ml vollständiges RPMI in die Säule geben und den Zellkolben einsetzen.
    3. Erfassen Sie die Zellen in einem konischen 15-ml-Röhrchen oder direkt in einem T25-Kolben. Äquilibrieren Sie die Zellen bei 0,5 x 106 Zellen/ml in vollständiger RPMI mit 50 IE/ml rhIL-2.
    4. Wenn Sie mit < 20%igen Dualtransduktion beginnen, eluieren Sie die Zellen optional auf eine zweite LS-Säule für eine sequentielle Positivselektion, um die Reinheit nach der Sortierung zu erhöhen.
  5. Kultivieren Sie CAR-T-Zellen in T25- oder T75-Kolben mit etwa 0,5 x 10,6 Zellen/ml vollständigem RPMI und 50 IE/ml rhIL-2.
  6. Optional: Wenn T-Zellen für In-vivo-Experimente verwendet werden, sollte eine Kultivierung in 1 μM Dasatinib in Betracht gezogen werden, um die durch die Tonik-Signalgebung von CAR-Zellen induzierte Dysfunktion abzuschwächen, die während der anfänglichen Kulturperiode aufgetreten ist13,16.
  7. Die Durchflusszytometrie gemäß den Schritten 2.1 und 2.2 für vorsortierte und nachsortierte T-Zellen ist durchzuführen, um die Ausbeute und Reinheit nach der Zip-Sortierung (% dual-transduziert) zu beurteilen.
    Ausbeute = 100 x Gesamtzahl der zurückgewonnenen dual-transduzierten Zellen / Gesamtzahl der dual-transduzierten Zellen in der Vorsortier-Population)

7. Tag 4: Fortsetzung der T-Zell-Kultur

  1. Fügen Sie frisches, vollständiges RPMI und 50 IE/ml rhIL-2 für das gesamte Kulturvolumen hinzu, um die T-Zellkonzentration bei 0,5-1 x 106 Zellen/ml zu halten.
  2. Optional: Wenn T-Zellen für in vivo-Experimente verwendet werden sollen, fügen Sie frische 1 μM Dasatinib hinzu.

8. Tag 5: Charakterisierung von Zip-sortierten T-Zellen

  1. Optional: Bereiten Sie 100-200 μl T-Zell-Suspension pro mit Antikörpern gefärbten Zustand vor, um CARs oder andere Proteinprodukte, die von den Zip-Sort-Vektoren kodiert werden, mittels Durchflusszytometrie nachzuweisen.
  2. Führen Sie In-vitro - oder In-vivo-Experimente mit CAR-T-Zellen durch.
  3. Optional: Wenn T-Zellen für In-vivo-Experimente verwendet werden, waschen Sie die Zellen, um Dasatinib zu entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen in der Konzentration, die für eine retroorbitale oder Schwanzveneninjektion gemäß den institutionellen Richtlinien erforderlich ist.

9. Tag 0: Reinigung und Stimulation menschlicher T-Zellen

  1. Tauen Sie ein Fläschchen mit kryokonservierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) schnell in einem Wasserbad auf (oder verwenden Sie frisch isolierte PBMCs). Geben Sie aufgetaute PBMCs in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 5 mL MACS-Puffer, bereiten Sie ein Aliquot für die Zählung vor und pelletieren Sie die Zellen, indem Sie sie 5 Minuten lang bei 4 °C bei 340 x g zentrifugieren.
  2. Überstand verwerfen und Zellen in MACS-Puffer resuspendieren (40 μl Puffer pro 1 x 107 Zellen insgesamt verwenden). Fahren Sie mit der T-Zellisolierung mit dem Pan T-Zell-Isolationskit für Menschen gemäß den Anweisungen des Herstellers fort.
    1. Kurz gesagt, fügen Sie 10 μL Pan T Cell Biotin-Antibody Cocktail pro 1 x 107 Gesamtzellen hinzu. 5 min bei 4 °C inkubieren.
    2. Fügen Sie 30 μl MACS-Puffer pro 1 x 107 Zellen insgesamt hinzu. Fügen Sie 20 μl Pan T Cell MicroBead Cocktail pro 1 x 10 7 Gesamtzellen hinzu.
    3. 10 min bei 4 °C inkubieren. Füllen Sie das Volumen der Zellsuspension mit MACS-Puffer auf mindestens 500 μl auf.
    4. Fahren Sie mit der magnetischen Zelltrennung mit einer LS-Säule fort und sammeln Sie den Durchfluss mit angereicherten (unberührten) T-Zellen.
  3. Zählen Sie die T-Zell-Ausbeute und die Pelletzellen, indem Sie 5 Minuten lang bei 4 °C bei 340 x g zentrifugieren. Überstand verwerfen. Resuspendieren Sie humane T-Zellen in vollständigem RPMI bei 1 x 106 Zellen/ml mit rhIL-2 bei 50 IE/ml.
  4. In ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 2 mL PBS geben Sie das erforderliche Volumen des Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 für die T-Zell-Expansion und -Aktivierung (25 μl Kügelchen pro 1 x 106 Zellen, bei einem Verhältnis von 1:1 Kügelchen zu T-Zellen) und schleudern Sie es bei 340 x g für 5 Minuten bei 4 °C herunter, um die Kügelchen zu waschen. Überstand verwerfen.
  5. Resuspendierte T-Zellen werden mit gewaschenen Kügelchen gemischt und zur Kultur in einen T25-Kolben umgefüllt.

10. Tag 3: Retrovirale Transduktion von humanen T-Zellen

  1. Beschichten Sie eine 6-Well-Platte ohne Gewebekultur mit 1,5 ml PBS pro Well, die 20 μg/mL RetroNectin enthält.
  2. 2 h bei 37 °C inkubieren. Beschichtungslösung entsorgen oder zur Wiederverwendung aufbewahren (kann einmal wiederverwendet werden).
  3. In der Zwischenzeit werden PEG-präzipitierte Virusüberstände für die Co-Transduktion in einem 37 °C warmen Wasserbad aufgetaut.
  4. Geben Sie den Co-Transduktions-Virusüberstand entsprechend den gewünschten Transduktionsbedingungen in die Vertiefungen der RetroNectin-beschichteten 6-Well-Platte, zählen Sie und fügen Sie die gewünschte Menge an T-Zellen hinzu (in der Regel 0,5 - 2 x 106 T-Zellen/Well), bringen Sie das Volumen auf bis zu 3 ml mit vollständigem RPMI, das rhIL-2 enthält, und drehen Sie es 45 Minuten lang bei 340 x g bei 32 °C.
  5. Nach 24 h halten Sie die T-Zellen bei 1 x 106 Zellen/ml in vollständigem RPMI mit 50 IE/ml rhIL-2.
  6. Die Zellen werden von der 6-Well-Platte auf den T25-Kolben übertragen, wenn das zur Aufrechterhaltung der gewünschten Konzentration der T-Zellen erforderliche Volumen die Volumenkapazität der 6-Well-Platte übersteigt.

11. Tag 6: Zip-Sortierung von humanen CAR-T-Zellen

  1. Entfernen Sie Dynabeads aus T-Zellen vor der immunomagnetischen Aufreinigung auf Basis von Affinitäts-Tags (Zip-Sort), um eine mögliche Dynabead-assoziierte Retention in der magnetischen Säule zu vermeiden, und vor der Durchflusszytometrie, um mögliche Interferenzen mit der durchflusszytometrischen Analyse zu vermeiden.
  2. Vortexen Sie kurz, um Dynabeads zu dissoziieren und T-Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen zu übertragen und in den Dynabead-Magneten einzuführen. Drehen Sie das Rohr ein paar Mal um und warten Sie 5 Minuten, bis die Dynabeads an den Magneten gebunden sind.
  3. Übertragen Sie die Zellsuspension ohne Dynabeads vorsichtig in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen, indem Sie mit einer Pipette aspirieren. Zählen Sie die wiedergewonnene Zellkonzentration und verwenden Sie das Volumen, um die Gesamtzellausbeute zu berechnen.
  4. Bewerten Sie die CAR-Expression mit Hilfe der Durchflusszytometrie gemäß dem obigen Maustransduktionsprotokoll.
  5. Schleudern Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 340 x g für 5 min bei 4 °C und inkubieren Sie in 500 μl MACS-Puffer mit 30 μl Mikrokügelchen (DYKDDDDK (FLAG) oder humanem CD34) pro 1 x 107 Zellen.
  6. Führen Sie die Schritte 6.3 bis 6.5 aus, um Zip-sortierte humane CAR-T-Zellen zu erhalten.
  7. Bewerten Sie die Lebensfähigkeit nach der Sortierung durch Hämazytometer-Viabilitätsprüfung mit Trypanblau-Ausschluss. Es wird erwartet, dass die Rentabilität vor der Sortierung > 80 % liegen wird. Dies kann nach der Zip-Sortierung unter 80 % fallen, erholt sich aber über 4-5 Tage.
  8. Expandieren Sie humane T-Zellen in vollständigem RPMI mit 50 IE/ml rhIL-2 und halten Sie die T-Zellkonzentration bei ca. 1 x 106 Zellen/ml. Die Expansion und Wartung der T-Zellen nach der Sortierung kann entsprechend den Standard-Expansions- und Nutzungsprotokollen des Benutzers angepasst werden.
  9. Führen Sie nachgelagerte experimentelle Tests durch, wie z. B. Tötungsassays, Zytokinproduktion und In-vivo-Analysen mit T-Zellen, in der Regel nach Tag 8.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Protokoll demonstrieren wir die Co-Transduktion und die einstufige immunomagnetische Selektion von T-Zellen, die mit zwei unterschiedlichen retroviralen Vektoren doppelt transduziert wurden (als Zip-Sort, Abbildung 1 bezeichnet)13. Jeder Vektor kodiert für einen Teil eines heterodimerisierenden Leucin-Reißverschlusspaares, das selektiv auf der Oberfläche von dual-transduzierten T-Zellen dargestellt wird (Abbildung 1A). Ein sezer...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier haben wir ein Protokoll zur Generierung von Zip-Sort-Vektorsätzen, zur Herstellung von Retroviren, zur Co-Transduzieren von Maus- und menschlichen T-Zellen und zur immunmagnetischen Reinigung von dual-transduzierten Zellen (Zip-Sort) beschrieben. Das obige Protokoll wurde für retrovirale Vektoren sowie für Maus- und humane T-Zellen optimiert. Obwohl die Zip-Sort-Methode nicht mit anderen Vektorsystemen evaluiert wurde, sind im Prinzip wahrscheinlich andere Vektorsysteme, einschließl...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.R., S.C., S.E.J. und M.v.d.B. sind Miterfinder von Patentanmeldungen im Zusammenhang mit der Zip-sort-Technologie. A.P.B. berät Abbvie und Bristol Myers Squibb. M.v.d.B. erhielt Forschungsunterstützung von Seres Therapeutics und Aktienoptionen von Seres Therapeutics und ThymoFox; er hat Tantiemen von Wolters Kluwer erhalten; Er hat Seres Therapeutics, Vor Biopharma, Rheos Medicines, Frazier Healthcare Partners, Nektar Therapeutics, Notch Therapeutics, Ceramedix, Lygenesis, Pluto Therapeutics, GlaskoSmithKline, Da Volterra, ThymoFox, Garuda, Novartis (Ehepartner), Synthekine (Ehepartner), Beigene (Ehepartner), Kite (Ehepartner), MustangBio (Ehepartner) und Cellectar (Ehepartner) beraten, Honorare von ihm erhalten oder daran teilgenommen. er hat IP-Lizenzierung bei Seres Therapeutics und Juno Therapeutics; Er hat eine treuhänderische Funktion im Stiftungsrat der DKMS (einer gemeinnützigen Organisation) inne; und er ist Vorsitzender des wissenschaftlichen Beirats von Smart Immune.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.C. wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft gefördert (Research Fellowship; Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). S.E.J. wird durch einen Karriereentwicklungspreis des NCI (Fördernummer K08-CA252157) unterstützt. S.E.J. erhielt auch Unterstützung von der American Society for Clinical Oncology (Young Investigator Award), dem National Marrow Donor Program (Amy Program Award) und dem Parker Institute for Cancer Immunotherapy (Bridge Scholar Award). Die Forschung im van den Brink-Labor wird durch die Auszeichnungen des National Cancer Institute unterstützt: P01-CA023766, R35-CA284024, R01-CA228308; Auszeichnung des National Heart, Lung, and Blood Institute R01-HL164902 und Auszeichnung des National Institute of Aging P01-AG052359. Diese Forschung wird zum Teil durch die Stiftung Deana and Steve Campbell Chief Physician Executive Distinguished Chair unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Verwandt mit der Tumorzelllinie
Nr. 1498ATCCTIB-49
BM185-CD19Nr. 13
BM185-CD20Nr. 13
4D-Nucleofector Core UnitLonzaAAF-1003B
4D-Nucleofector X EinheitLonzaAAF-1003X
Lonza SF Puffer-Kit
Virusproduktion
10 cm Gewebekultur (TC)-behandelte ZellkulturschaleCorning353003
Konisches 50-ml-RöhrchenThermo Scientific339652
EffecteneQiagen301425
pENTR1a-PlasmidAddgene17398
LZRS-RfaAddgene31601
PB MMLV puro (viraler Vektor für Maus-T-Zellen)Nr. 13
PB SFG blastR (viraler Vektor für humane T-Zellen)Nr. 13
pCMV-hyPBaseSanger Institut
Phoenix-EcoATCCCRL-3214
Phoenix-Eco alpha V beta 3Nr. 13Phoenix-Eco modifiziert, um an Kulturflaschen mit höherer Avidität zu haften
PB-EF1a Intron WPRE mCD4 P2A MCS Integrin beta 3Nr. 13optional zur Verbesserung der Adhäsion von Zellen der Verpackungslinie auf Kulturkolben
PB-EF1a intron WPRE hCD8a 2A integrin alpha VNr. 13optional zur Verbesserung der Adhäsion von Zellen der Verpackungslinie auf Kulturkolben
Biovec-RD113Biovec Pharma
Biovec-RD113 alpha V beta 3Biovec PharmaDiese Studie wurde mit Alpha-V-Beta-3-Vektoren transfiziert
Millex-HV Spritzenvorsatzfilter (0,45 μ m)MilliporeSLHVR33RRS
Polyethylenglykol 8000 (PEG)Fisher ScientificNr. BP233-1
NatriumchloridFisher ScientificNr. S271-500
PuromycinSanta Cruz Biotechsc-108071B
BlastizidinSanta Cruz BiotechSC-204655
T175 Kolben mit TC-Behandlung Corning353112
Trypsin-EDTA (0,25%), PhenolrotGibco25200056
Zellmedien
2-MercaptoethanolGibco21985023
RPMI1640Gibco11-875-119
DMEMGibco11-965-118
FBSSigmaNr. F2442
GlutamaxGibco35050061
MEM-nicht-essentielle AminosäurenGibco11140050
Penicillin-StreptomycinGibco15140-163
NatriumpyruvatGibco11360070
T Zellstimulation/-transduktion
Konisches 15-ml-RöhrchenThermo Scientific339650
6-Well-Nicht-TC-PlatteGibco351146
6-Well-TC-PlatteGibco353046
Anti-CD19-Mikrokügelchen Miltenyi Biotec130-121-301
InVivoMab Anti-Maus CD28 (Klon 37.51)BioXCell (Englisch)Artikel-Nr.: BE0015-1
InVivoPlus Anti-Maus CD3ε (Klon 145-2C11)BioXCell (Englisch)BE0001-1
RinderserumalbuminSigma AldrichNr. A4737-1G
DasatinibKaiman-Chemie11498
Dynabeads Humaner T-Aktivator CD3/CD28Gibco11131D
EDTA (0,5 M), pH 8,0, RNase-freiInvitrogenAM9260G
HybriMax RBC-LysepufferSigmaNr. R7757-100ML
LD-SäuleMiltenyi Biotec130-042-901
Pan T Zell-Isolationskit, menschlichMiltenyi Biotec130-096-535
Dynamag-15 MagnetInvitrogen12301D
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1X)Corning21040CV
RetronektinTakaraT100B
rhIL-2Proleukin (Aldesleukin)
T25-ZellkulturflascheCorning353109
Zip-sort
&Mikro; MACS DYKDDDDK IsolationskitMiltenyi Biotec130-101-591
CD34 MicroBead Kit, MenschMiltenyi Biotec130-046-702
QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
LS-SäuleMiltenyi Biotec130-042-401
Durchflusszytometrie und Zellüberwachung
Anti-CD90.1 Thy1.1 APC (Klon OX-7)BD BiowissenschaftenKatze# 561409; RRID:AB_10683163
Anti-V5-Tag Antikörper, (Klon 4C12E11) iFluor 488GenScriptKat# A01803, RRID:AB_2925231
Myc PEZell-SignaltechnikKat# 2233; RRID:AB_823474
Myc Alexa 647Zell-SignaltechnikKat# 2233; RRID:AB_823474
APC-Anti-DYKDDDK-Tag (Klon L5)BioLegendeKat# 637307; RRID:AB_2561496
Maus Anti CD34 Antikörper, Alexa Fluor 647, (Klon QBEnd/10)Novus BiologicalsKat# NBP2-34713AF647; RRID:AB_2925234
Streptag FITCGenScriptKat# A01736; RRID:AB_2622221
Inkuzyt SX5Schneidermuskel
Penteon DurchflusszytometerAgilent

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. June, C. H., Sadelain, M. Chimeric Antigen Receptor Therapy. New Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
  2. Mikkilineni, L., Kochenderfer, J. N. CAR T cell therapies for patients with multiple myeloma. Nat Rev Clin Oncol. 18 (2), 71-84 (2021).
  3. Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614 (7949), 635-648 (2023).
  4. Berger, T. R., Maus, M. V. Mechanisms of response and resistance to CAR T cell therapies. Curr Opin Immunol. 69, 56-64 (2021).
  5. Labanieh, L., Majzner, R. G., Mackall, C. L. Programming CAR-T cells to kill cancer. Nat Biomed Eng. 2 (6), 377-391 (2018).
  6. Fucà, G., Reppel, L., Landoni, E., Savoldo, B., Dotti, G. Enhancing Chimeric Antigen Receptor T-Cell Efficacy in Solid Tumors. Clin Cancer Res. 26 (11), 2444-2451 (2020).
  7. Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. Viral Vector Systems for Gene Therapy: A Comprehensive Literature Review of Progress and Biosafety Challenges. Appl Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).
  8. Hyrenius-Wittsten, A., et al. SynNotch CAR circuits enhance solid tumor recognition and promote persistent antitumor activity in mouse models. Sci Transl Medi. 13 (591), eabd8836(2021).
  9. Tousley, A. M., et al. Co-opting signalling molecules enables logic-gated control of CAR T cells. Nature. 615 (7952), 507-516 (2023).
  10. Li, Y., et al. KIR-based inhibitory CARs overcome CAR-NK cell trogocytosis-mediated fratricide and tumor escape. Nat Med. 28 (10), 2133-2144 (2022).
  11. Ghorashian, S., et al. CD19/CD22 targeting with co-transduced CAR T-cells to prevent antigen negative relapse after CAR T-cell therapy of B-ALL. Blood J. , (2023).
  12. Qin, H., et al. Preclinical Development of Bivalent Chimeric Antigen Receptors Targeting Both CD19 and CD22. Mol Ther Oncol. 11, 127-137 (2018).
  13. James, S. E., et al. Leucine zipper-based immunomagnetic purification of CAR T cells displaying multiple receptors. Nat Biomed Eng. 8 (12), 1592-1614 (2024).
  14. Ghani, K., et al. Efficient Human Hematopoietic Cell Transduction Using RD114- and GALV-Pseudotyped Retroviral Vectors Produced in Suspension and Serum-Free Media. Human Gene Ther. 20 (9), 966-974 (2009).
  15. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc Natl Acad Sci U S Am. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  16. Weber, E. W., et al. Transient rest restores functionality in exhausted CAR-T cells through epigenetic remodeling. Science. 372 (6537), eaba1786(2021).
  17. Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduct Targeted Ther. 6 (1), 1-24 (2021).
  18. Kahlig, K. M., Saridey, S. K., Kaja, A., Daniels, M. A., George, A. L., Wilson, M. H. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc Natl Acad Sci. 107 (4), 1343-1348 (2010).
  19. Shy, B. R., et al. High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails. Nat Biotechnol. 41 (4), 521-531 (2023).
  20. Liu, Z., et al. Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronic vector. Sci Rep. 7 (1), 2193(2017).
  21. Cui, Z., Yuan, P., Zhao, Z., Zhao, F., Lu, L. Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro. J Vis Exp. (213), e66966(2024).
  22. Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J Clin Invest. 119 (4), 964-975 (2009).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Leucine ZipperCell SortingDual Vector TransductionT Cell EngineeringImmunomagnetic PurificationAdoptive T Cell TherapyCAR T CellsTumor MicroenvironmentTransgene CoexpressionCell Purification

Verwandte Artikel