Optimierte minimal-invasive transsklerale subretinale Injektionstechnik in der Maus

Zusammenfassung

Subretinale Injektionen sind eine unverzichtbare Technik für die präklinische Entwicklung von Therapeutika für Photorezeptor- und RPE-Erkrankungen. Wir beschreiben eine optimierte transsklerale subretinale Injektionstechnik bei Mäusen, die die intraoperativen Erfolgsraten verbessert und Netzhautschäden minimiert.

Zusammenfassung

Die herkömmliche Methode der Materialzufuhr in den subretinalen Raum der Maus beinhaltet eine doppelte Perforation der neuralen Netzhaut, die umfangreiche chirurgische Schäden verursacht. Dies führt zu einer Variabilität in den nachfolgenden Ergebnismessungen der visuellen Funktion, wie z. B. Elektroretinogramm (ERG)-Aufzeichnungen oder Verhaltens-Sehtests, die die Wirksamkeitsbewertungen experimenteller Therapeutika verwirren. Um diese Barrieren zu überwinden, haben wir eine transsklerale minimal-invasive subretinale Injektionstechnik bei Mäusen optimiert. Bei dieser Technik wird der Fornix superior mit Hilfe eines speziell angefertigten Augenlidspekulums aus Wolframdraht zugänglich, um eine konjunktivale Peritomie und Tenotomie durchzuführen. Eine punktuelle Sklerotomie wird mit einem Diamantmesser durchgeführt, ohne die Netzhaut zu durchdringen, durch das vorsichtig eine feine Glasnadel in einem flachen Winkel eingeführt wird. Die Nutzlast wird mit einer Mikroinjektionspumpe in den subretinalen Raum gebracht. Die optische Kohärenztomographie (OCT) wird verwendet, um die Größe und Position der subretinalen Blase unmittelbar nach der Injektion zu beurteilen. Wir verglichen die Ergebnisse dieser Technik mit der konventionellen transretinalen Methode, die mit einer federbelasteten Spritze mit einer 33G-Nadelsklerotomie durchgeführt wurde. ERG-Aufzeichnungen zeigten eine hervorragende Erhaltung der Netzhautfunktion bei transskleral injizierten Mäusen, vergleichbar mit der von nicht injizierten Kontrollmäusen. Im Gegensatz dazu wurde in den konventionell injizierten Kohorten eine signifikante Reduktion des ERG-Signals beobachtet. Zusammenfassend haben wir eine minimal-invasive Technik für die subretinale Injektion bei Mäusen optimiert. Wir zeigen, dass diese Technik eine robuste und effiziente Methode zur Verabreichung von Gentherapien ist, die die anatomische Schädigung der Netzhaut minimiert und die Netzhautfunktion nur minimal beeinträchtigt. Diese Methode senkt die Schwelle für die Entwicklung von Therapien, die sowohl auf das pigmentierte Epithel der Netzhaut als auch auf Photorezeptoren abzielen, um eine Vielzahl von Netzhaut- und Makulaerkrankungen zu behandeln.

Einleitung

Die subretinale Injektion ist ein augenchirurgischer Eingriff, bei dem Material in den potenziellen Raum zwischen der Netzhaut und dem pigmentierten Epithel der Netzhaut (RPE) eingebracht wird. Im Vergleich zu anderen Methoden der Wirkstoffabgabe an das hintere Segment, wie z. B. intravitreale oder suprachoroidale Injektionen, erreichen subretinale Injektionen den unmittelbarsten Zugang sowohl zu den Photorezeptoren als auch zum RPE. Bei der Verabreichung von viralen Gentherapiepartikeln erzielt die subretinale Injektion viel höhere Raten der Photorezeptor- und RPE-Transduktion, was niedrigere Virustiter und ein geringeres Risiko einer viralen Toxizität ermöglicht¹. Darüber hinaus ist der subretinale Raum anatomisch begrenzt, was die systemische Ausbreitung von Viruspartikeln begrenzt und das Risiko von Immunreaktionen senkt². Beim Menschen ist das Sicherheitsprofil der subretinalen Injektionen sehr günstig, wobei die Struktur und Funktion der Netzhaut innerhalb von 1 Monat nach der Injektion wieder auf das Ausgangsniveau zurückkehrt ^3,4. Subretinale Injektionen werden in einer Reihe von Anwendungen eingesetzt, wie z. B. bei der Stammzelltransplantation und der Verabreichung von niedermolekularen Medikamenten², wobei ihre häufigste Verwendung die Verabreichung von viralen Vektoren für die gentherapeutische Behandlung von Netzhauterkrankungen ist. Die relativ niedrigen Virustiter, die minimale systemische Exposition und die hohe Transduktionsrate und -spezifität im Zusammenhang mit subretinalen Injektionen haben sie zu einer unverzichtbaren Technik im Bereich der Netzhaut gemacht. Subretinale Injektionen werden bei Patienten erfolgreich zur Behandlung von erblichen Netzhauterkrankungen, einschließlich Retinitis pigmentosa und Leber-angeborener Amaurose, eingesetzt ^5,6.

Aufgrund ihrer Bedeutung für das Fachgebiet ist die Fähigkeit, subretinale Injektionen bei Mäusen durchzuführen, von entscheidender Bedeutung für präklinische Studien, in denen Therapien für erbliche Netzhauterkrankungen untersucht werden. Die derzeitigen Methoden für subretinale Injektionen bei Mäusen weisen jedoch hohe Misserfolgsraten auf und verursachen häufig chirurgische Schäden an der Netzhaut, was die Zuverlässigkeit und Konsistenz der funktionellen Ergebnismessungen einschränken kann. Herkömmlicherweise werden subretinale Injektionen bei Nagetieren transretinal durchgeführt, so dass die Nadel die vordere Netzhaut durchdringt, an der Linse vorbeigeht und infolge einer zweiten Penetration der Netzhaut in den subretinalen Raum eintritt ^7,8 (Abbildung 1A). Obwohl dieses Verfahren relativ einfach durchzuführen ist, führt es aufgrund des unterschiedlichen Ausmaßes der chirurgischen Schäden zu einer deutlichen Inkonsistenz der experimentellen Ergebnisse. Dies ist besonders einschränkend für Studien, die Verhaltens- und Funktionssehergebnismessungen verwenden. Darüber hinaus ist die kristalline Linse bei Mäusen im Vergleich zum Menschen unverhältnismäßig groß; Dies erhöht das Risiko einer Schädigung der Linse bei der transretinalen Injektion erheblich, so dass das Tier für die Beurteilung des funktionellen Sehvermögens unbrauchbar wird⁴.

Eine alternative Option ist der transsklerale Injektionsweg, der diese Probleme vermeidet, indem er über einen posterioren Zugang in den subretinalen Raum gelangt, bei dem die Nadel in die Sklera, die Aderhaut, die Bruchmembran und das RPE^{eindringt 4,9} (Abbildung 1B). Dieser Ansatz minimiert Netzhautschäden, indem er das Eindringen der Netzhaut vollständig vermeidet. Es ist auch mit einem reduzierten Rückfluss von injiziertem Material aus dem subretinalen Raum¹⁰ verbunden, was konsistentere Ergebnisse und kleinere experimentelle Kohorten ermöglicht. Obwohl die Technik der transskleralen subretinalen Injektion bei Mäusen bereits in der Literatur beschrieben wurde, bleibt ihre weit verbreitete Anwendung durch ihre technischen Schwierigkeiten begrenzt, die die Erfolgsrate beeinträchtigen können⁴. Im Folgenden beschreiben wir einige Verbesserungen des transskleralen Injektionsverfahrens, die die Durchführung einfacher und schneller machen, die experimentelle Variabilität reduzieren und die Erfolgsraten bei der Injektion verbessern. Zu diesen Verbesserungen gehören die Entwicklung eines Mausaugenlidspekulums, die präoperative Verabreichung von Atropin, die Erstellung einer punktgenauen Sklerotomie mit einem Diamantmesser sowie die Optimierung der Nadelgröße und des Injektionsansatzes. Diese Technik erreicht eine hervorragende Abdeckung der Photorezeptoren und des RPE durch virale Transduktionsstörungen, ohne dass es zu chirurgischen Auswirkungen kommt, die durch ERG nachweisbar sind.

Protokoll

Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit dem Duke University Institutional Animal Care and Use Committee und der Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research durchgeführt.

1. Vorbereitung der Tiere

1. Verabreichen Sie eine intraperitoneale Injektion von 1 mg/kg Atropin (in einem Gesamtvolumen von 50 μl) 30 Minuten vor der Durchführung der subretinalen Injektion. Dieser Schritt erhöht die Erfolgsraten erheblich, indem potenziell letale okulokardiale und okulorespiratorische Reflexe verhindert werden, die durch eine vorübergehende Erhöhung des Augeninnendrucks während der Injektion ausgelöst werden^11,12.
   HINWEIS: Unsere Atropin-Dosierung ist für C57BL/6-Mäuse optimiert und muss möglicherweise für andere Mausstämme angepasst werden. Wir haben keine nennenswerten Geschlechts- oder Altersunterschiede bei der Dosierung von Atropin beobachtet.
2. Halten Sie die Maus während des gesamten Eingriffs auf einer warmen Oberfläche, um den Tierkomfort zu maximieren und die Entwicklung des kalten Grauen Stars zu reduzieren.
3. Betäuben Sie die Maus mit 2 % inhaliertem Isofluran in Sauerstoff (2 l/min), bis ein Liegen beobachtet wird und das Tier nicht mehr auf ein Einklemmen der Zehen reagiert. Tragen Sie einen Tropfen 0,5% Proparacain auf das Auge für eine topische Anästhesie auf.
4. Tragen Sie einen Tropfen der Mischung aus 0,2 % Cyclopentolat und 1 % Phenylephrin auf das Auge auf, um die Pupille für die postoperative Darstellung der subretinalen Blase bis zur OCT zu erweitern. Phenylephrin dient auch zur Verringerung intraoperativer Blutungen, indem es oberflächliche Blutgefäße verengt¹³.

2. Sklerotomie

1. Laden Sie vor Beginn des Eingriffs eine Mikronadel aus Glas mit dem gewünschten Volumen der zu injizierenden Lösung. Befestigen Sie die Nadel am Mikroinjektor mit einem Ausgleichsdruck von 5 Hektopascal (hPa), um der Kapillarwirkung entgegenzuwirken. Wir verwenden in der Regel ein Volumen von 1 μl für subretinale Injektionen.
2. Legen Sie die Maus unter ein Präparier-Stereomikroskop. Verwenden Sie eine 20-fache Vergrößerung für die Schritte 2.3-2.6 und eine 50-fache Vergrößerung für die Schritte 2.7-3.5.
3. Bei jungen Mäusen sollte vor dem Eingriff eine laterale Kanthotomie durchgeführt werden, um einen ausreichenden Zugang und eine umfassende Visualisierung der Operationsstelle zu ermöglichen.
4. Legen Sie das überlegene Fornix mit Hilfe eines speziell angefertigten Miniatur-Drahtspekulums frei (Abbildung 1C). Immobilisieren Sie das Spekulum, um das Zurückziehen des Oberlids freihändig zu ermöglichen.
5. Führen Sie mit einer abgewinkelten Vannas-Schere einen paralimbalen Schnitt (~1 mm posterior zum Limbus) in der oberen Bindehaut und der Tenon-Kapsel durch, um die oberen 3-4 Stunden der Sklera freizulegen. Achten Sie darauf, dass die retroorbitale Venenhöhle nicht punktiert wird. Entfernen Sie vorsichtig aber gründlich alle Reste der Tenon-Kapsel, die über der vorgesehenen Injektionsstelle liegen.
6. Fassen Sie den vorderen Rand der Bindehautperitomie und -tenotomie mit einer verriegelnden Zahnzange und führen Sie den Globus vorsichtig ein, um die Sklera superior freizulegen. Immobilisieren Sie die verriegelte Pinzette, um eine freihändige Inferoduktion zu ermöglichen.
7. Tragen Sie sofort einen Tropfen balancierte gepufferte Kochsalzlösung (BSS) auf das Auge auf, um ein Austrocknen der nackten Sklera zu verhindern. Hilfreich ist auch die optische Vergrößerung, die durch das BSS-Tröpfchen erzeugt wird.
8. Führen Sie mit einem Diamantmesser eine punktgenaue Sklelotomie bei ~12 Uhr und ~1-2 mm vom Limbus entfernt durch. Positionieren Sie die Klinge in einer tangentialen Ebene in Bezug auf die Sklera, um sicherzustellen, dass die Sklerotomie so klein und flach wie möglich ist.
   HINWEIS: Dies geschieht aus zwei Gründen: (1) Eine kleine Sklerotomie ermöglicht einen festen Sitz der Glasnadel, wodurch der Rückfluss während des Injektionsschritts reduziert wird, und (2) eine flache Sklerotomie ist entscheidend, um eine Penetration der Netzhaut zu vermeiden. Beachten Sie, dass eine kleine Menge Aderhautblut an der Sklelotomiestelle auftreten kann, was keine negativen Auswirkungen auf das Ergebnis des Eingriffs hat.

3. Transsklerale subretinale Injektion

1. Verwenden Sie zur Vorbereitung der Injektion einen chirurgischen Schwamm, um das gesamte BSS vorsichtig von der Augenoberfläche zu entfernen.
2. Halten Sie die Nadel abgeschrägt in einem flachen Winkel zur Sklera und führen Sie die Spitze langsam und vorsichtig in die Sklerotomie ein, um Zugang zum subretinalen Raum zu erhalten. Um ein Eindringen in die Netzhaut zu vermeiden, tun Sie dies in einem relativ flachen Winkel und gerade tief genug, um die Sklelotomieöffnung um 0,5-1 mm zu entfernen.
   HINWEIS: Die Abschrägung der Nadel ist nach unten positioniert, um die Möglichkeit einer Aderhautentbindung zu minimieren und die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass die Netzhaut mit der vorgeschobenen Nadelspitze durchstochen wird.
3. Während Sie die Nadel in einer ruhigen Position halten, initiieren Sie die Injektion bei 500 hPa mit einem Fußpedal und halten Sie den Druck 15 s lang ununterbrochen aufrecht.
4. Um die Injektion zu beenden, halten Sie den Injektionsdruck aufrecht, bis die Nadel vollständig aus der Sklerotomie entfernt ist. Wenn der Druck vorzeitig abgesetzt wird, während sich die Nadel noch im subretinalen Raum befindet, kann ein großer Teil der injizierten Nutzlast durch Kapillarwirkung schnell wieder aus dem Auge in die Nadel gelangen.
5. Sobald die Nadel zurückgezogen wird, bemerken Sie einen teilweisen Rückfluss der injizierten Lösung durch die Sklerotomiestelle. Dies ist zu erwarten, da 1 μl Volumen die Kapazität des subretinalen Raums auch bei erwachsenen Mäusen übersteigt. Das Fehlen von Reflux kann auf eine fehlgeschlagene Injektion aufgrund einer versehentlichen aderförmigen oder intravitrealen Verabreichung hinweisen.
6. Entferne die Verriegelungszange und das Lidspekulum vom Auge. Achten Sie darauf, dass Sie keinen Druck auf den Globus ausüben, da dies zu einem weiteren Rückfluss der injizierten Lösung führen kann.
7. Tragen Sie unmittelbar nach der Injektion reichlich Gleitgel-Augensalbe auf das Auge auf, um die subretinale Blase bis zum¹⁴. Oktober sichtbar zu machen.
8. Tragen Sie eine topische Erythromycin-Salbe auf das Auge auf und pflegen Sie das Tier nach der Operation allgemein.

Ergebnisse

Eine erfolgreiche Injektion mit dieser transskleralen Technik erzeugt eine subretinale Blase, die in der OCT unmittelbar nach dem Injektionsverfahren beobachtbar ist (Abbildung 2A). Angesichts der technischen Herausforderung dieser Technik ist der Bildgebungsschritt für die Identifizierung erfolgreich injizierter Tiere unerlässlich. Für Forscher, die planen, diese Technik für Gentherapie-Experimente zu verwenden, empfehlen wir, Übungsinjektionen mit Adeno-assoziierten Viruspartikeln (AAV) du...

Diskussion

Die hier beschriebene Technik führt mehrere Verbesserungen gegenüber dem zuvor beschriebenen transskleralen Injektionsansatz⁴ ein, die die Zuverlässigkeit des Verfahrens erhöhen und die chirurgische Schädigung des Auges weiter reduzieren. Eine dieser Verbesserungen ist die Verwendung eines Spekulums, um das obere Augenlid zurückzuziehen, was einen stabilen, ungehinderten und freihändigen Zugang zum Auge ermöglicht. Kommerzielle Spekula sind oft schlecht optimiert,...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,9 % Natriumchlorid-Injektion, USP	Hospira	PAA130066
1% Atropinsulfat Ophthalmische Lösung, USP	Akorn	NDC 17478-215-05
30°; Diamant-Messer	Katena	Nr. K2-6560
AmScope 6W LED-Dual-Schwanenhalsbeleuchtung	AmScope (Englisch)	LED-11CR
Abgewinkelte Vannas Schere	Roboz	RS-5618
BSS Sterile Spüllösung	Alcon	289010-0902
Cyclomydril dilatierende Augentropfen	Alcon	0065-0359-02	0,2 % Cyclopentolat, 1 % Phenylephrin
epT.I.P.S. MicroloaderTM Pipettenspitzen	Eppendorf	5242 956.003
FemtoJet 4i Mikroinjektor	Eppendorf	E5252000021	Eingestelltes Produkt
GenTeal Tears Gleitmittel Augensalbe	Alcon	16027802
Mikroinjektionsnadeln aus Glas	Clunbury Scientific	Nr. B100-58-50	30°; Abschrägung. Durchmesser: 50 µ M außen, 29 &Mikro; m innen
Isofluran-Lösung	Covetrus	29405
MICRON IV Netzhautmikroskop mit bildgeführter OCT	Phönix	N/A
Stereomikroskop SteREO Discovery.V8	Zeiss	495015-0001-000
Stern-Castroviejo Zahnzange mit Verriegelung	Katena	Nr. K5-2552
Zahnzange	Roboz	RS-5172
Wolfram-Reinigungsdrähte für 23s Gauge Nadeln	Hamilton	18306
Ultracell PVA Augenspeere	BVI Medizin	40400-8
Ultra-Fine2015 Insulinspritzen	BD	328438	3/10 mL, 8 mm (5/16 Zoll), 31 G