Methodenartikel

Hervorhebung des Übergangs von mitochondrialem Cytochrom C durch Immuntransmissionselektronenmikroskopie

DOI:

10.3791/68633

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15. August 2025

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1Medical Department, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Critical Care Medicine, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan, 3Sichuan Scientist Biotechnology Co., Ltd, 4Department of Critical Care Medicine, Deyang Hospital Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 6Department of Critical Care Medicine, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung mikromorphologischer Veränderungen in Neuronen und des Übergangs von mitochondrialem Cytochrom c mittels Immuntransmissionselektronenmikroskopie.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veränderungen der Proteinposition in der Mikrostruktur stellen oft einen präzisen Regulationsmechanismus auf der Ebene pathologischer Organellen dar. Die genaue Erfassung des Ortes dieses Organellenproteintransfers ist für die Diagnose und Behandlung von Krankheiten von positiver Bedeutung und Wert. Mitochondrien spielen eine zentrale Rolle bei der Nekrose und dem intrinsischen Weg der Apoptose. Unter normalen Bedingungen existiert Cytochrom c (Cyt c) nur zwischen der inneren und äußeren Membran der Mitochondrien und im Zellkern. Wenn Zellen Apoptose durchlaufen, wird die Permeabilität der mitochondrialen inneren Membran verändert und Cyt c wird aus den Mitochondrien in das Zytoplasma freigesetzt. In dieser Studie wurde ein Rattenmodell für zerebrale Ischämie-Reperfusionsschäden etabliert, und die mikromorphologischen Veränderungen von Neuronen, die sich einer Apoptose unterziehen, wurden durch Immuntransmissionselektronenmikroskopie gezeigt. Darüber hinaus zeigt es die Vision, wie Immunogold den Cyt-c-Transfer von der mitochondrialen Matrix in das Zytoplasma nach einer zerebralen Ischämie-Reperfusionsverletzung genauer markiert. Die in diesem Protokoll vorgestellte Immuntransmissionselektronenmikroskopietechnik eignet sich für die Demonstration beliebiger Proteinpositionsübergänge auf mikroskopischer Ebene.

Einleitung

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Laut der globalen Burden of Disease-Studie aus dem Jahr 2021 war der Schlaganfall die 3. häufigste Todesursache und die 4. häufigste Ursache für behinderungsbereinigte Lebensjahre. Es gab 11,9 Millionen neue Schlaganfallereignisse, von denen 65,3 % (7,8 Millionen) auf ischämische Schlaganfälle entfielen1. Der neuronale Tod tritt nach zerebraler Ischämie auf, einschließlich Nekrose und Apoptose. Das am schwersten betroffene Hirngewebe erfährt anschließend den nekrotischen Zelltod. Neuronen in der ischämischen Penumbra- oder Periinfarktzone können nach mehreren Stunden oder Tagen eine Apoptose durchlaufen2. Neben den bioenergetischen und metabolischen Funktionen spielen die Mitochondrien auch eine zentrale Rolle im intrinsischen Signalweg der Apoptose 3,4,5,6.

Cyt C ist ein Protein, das von Kerngenen kodiert wird. Unter normalen Bedingungen existiert Cyt C nur zwischen der inneren und äußeren Membran der Mitochondrien und im Zellkern. Der apoptotische Signalweg, der durch seine Freisetzung vermittelt wird, ist mit der regulatorischen Kontrolle von Bcl-2-Familienmitgliedern verbunden. Nach der Stimulation durch Apoptose werden Bax/Bak-Oligomere gebildet und in die mitochondriale äußere Membranpore eingefügt, was zu Veränderungen des mitochondrialen osmotischen Drucks und einem Verlust des Transmembranpotentials führt. Cyt C wird aus den Mitochondrien in das Zytoplasma freigesetzt, wo es an den Aktivator von Apoptose 1 bindet, um den apoptotischen Komplex zu bilden und Pro-Caspase-9 zu aktivieren. Im Gegenzug werden Caspase-3 und Caspase-7 aktiviert, was die Caspase-Kaskade einleitet und die Zellapoptose7 induziert.

Mit der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) können die Veränderungen der Zellstruktur in verschiedenen Stadien der Apoptose deutlich beobachtet werden. Die elektronenmikroskopische morphologische Beobachtung ist eine zuverlässige Methode zur Bestimmung der Apoptose8. Es kann jedoch keine Veränderungen von Cyt C in der Ultrastruktur beobachten. Es gibt verschiedene Techniken zum Nachweis spezifischer Proteine in der Ultrastruktur: Durchflusszytometrie, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, Spektrophotometrie und Western Blotting. Sie können jedoch die Ortsänderungen des Proteins in der Mikrostruktur nicht genau erfassen. Kolloidales Gold hat Partikel unterschiedlicher Größe, und die Elektronendichte von kolloidalem Gold ist hoch. Die Immunogold-Technologie eignet sich besonders für Einzel- oder Mehrmarkierungs-Lokalisationsstudien der Immunelektronenmikroskopie. Aufgrund seiner inhärenten hell- bis dunkelroten Färbung ist kolloidales Gold auch für die Beobachtung unter Lichtmikroskopie geeignet. Wenn bestimmte Proteine mit Immunogold markiert werden, können die Ortsänderungen mit Hilfe eines TEM in subzellulärer Auflösung sichtbar gemacht werden9.

Dieses Protokoll beschreibt die Hervorhebung des Übergangs von mitochondrialem Cyt C durch Immuntransmissionselektronenmikroskopie (IEM). Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die subzelluläre Translokation von Cyt C während der Ischämie-induzierten Apoptose mittels IEM sichtbar zu machen. Der Grundgedanke für IEM besteht darin, Cyt C mit kolloidalem Gold zu markieren und seine Lokalisationsänderungen in subzellulärer Auflösung mit TEM9 zu visualisieren. IEM kann die dynamischen Veränderungen von Proteinen auf räumlicher Ebene beobachten, was ein leistungsfähiges Mittel zur Erklärung physiologischer und pathologischer Aktivitäten darstellt10.

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Protokoll

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Das Tierprogramm wurde von der Ethikkommission von SLAS genehmigt (IACUC Issue No: SYST-2024-018). Hier wurden 6 erregerfreie männliche SD-Ratten (200-220 g) in unabhängigen Beatmungskäfigen aufgezogen, wobei die Laborumgebung bei 22-25 °C und 45%-65% relativer Luftfeuchtigkeit gehalten wurde. Alle Ratten erhielten während dieser Zeit 1 Woche lang eine adaptive Fütterung mit kostenlosem Wasser und Nahrung.

1. Etablierung des Modells des Verschlusses der mittleren Hirnarterie (MCAO)

  1. Teilen Sie die Ratten nach dem Zufallsprinzip in die MCAO-Gruppe und die Scheinoperationsgruppe ein, wobei in jeder Gruppe drei Ratten enthalten sind. Abbildung 1 für das experimentelle Flussdiagramm.
  2. Überprüfen Sie die an diesem Protokoll beteiligten Geräte gemäß der Liste in Abbildung 2.
  3. Um ein Modell der MCAO für Ischämie-Reperfusionsschäden bei Ratten zu erstellen, verwenden Sie das intraluminale Nahtverfahren.
  4. Fasten Sie die Ratten 12 Stunden vor der Operation mit Wasser zugänglich.
  5. SD-Ratten mit 2% Isofluran (siehe Materialtabelle) in einem Luft-Sauerstoff-Gemisch bei 0,6 l/min anästhesieren. Bestätigen Sie die ordnungsgemäße Anästhesie, indem Sie die Haut der Gliedmaßen mit einer Zange abschneiden. Ratten sollten keine Retraktion oder Beinreflexe haben. Befestigen Sie die völlig bewusstlosen Ratten auf dem Operationstisch und halten Sie die Körpertemperatur mit einem Tiertemperaturhaltegerät auf 37 °C. Kleben Sie die Augen während der Operation zu, um Trockenheit zu vermeiden.
  6. Entfernen Sie das Fell um den Hals mit einem Elektrorasierer und desinfizieren Sie die Haut mit Betadine. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen 1,5 cm langen Schnitt in der Mittellinie des Halses (siehe Materialtabelle), führen Sie eine stumpfe Dissektion an Muskeln und perivaskulärer Faszie durch und legen Sie die Luftröhre frei, um die rechte Arteria carotis communis (CCA), die Arteria carotis externa (ECA) und die Arteria carotis interna (ICA) zu lokalisieren. Chirurgische Instrumente sollten sterilisiert werden, um Infektionen zu vermeiden.
  7. Lifugen Sie das distale Ende der ECA mit einer chirurgischen 6-0-Naht und platzieren Sie eine weitere chirurgische Naht locker um das proximale Ende der ECA bis zum Bifurkationspunkt. Achten Sie darauf, den Vagusnerv nicht zu schädigen.
  8. Clippen Sie die CCA und ICA mit Gefäßklammern und machen Sie einen kleinen Schnitt in der ECA zwischen zwei chirurgischen Nähten.
  9. Führen Sie die monofile Naht in das ECA-Lumen nach unten in Richtung CCA ein, ziehen Sie die chirurgische Naht um den ECA-Stumpf fest, um die intraluminale Naht zu sichern und Blutungen zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die monofile Naht dem Gewicht des Tieres entspricht, um Schäden zu minimieren und ein angestrebtes Infarktvolumen von 40 % in der ipsilateralen Hemisphäre zu erreichen.
  10. Schneiden Sie den restlichen Teil des ECA ab, um den Stumpf freizugeben, und positionieren Sie den ECA-Stumpf unterhalb des Bifurkationspunkts so, dass er ungefähr auf einer Linie mit dem ICA liegt.
  11. Entfernen Sie den mikrovaskulären Clip aus dem ICA und schieben Sie die Naht weiter vor, bis ein leichter Widerstand zu spüren ist, der auf einen Verschluss der mittleren Hirnarterie hinweist. Diese Länge beträgt typischerweise etwa 2 cm. Binden Sie die Naht fest um das Monofilament. Entfernen Sie den anderen mikrovaskulären Clip aus dem CCA.
  12. Schließen Sie den Schnitt mit einer chirurgischen Naht und setzen Sie die Ratte in einen Auffangkäfig, pflegen Sie das Tier bis zu 2 Stunden nach der Ischämie.

2. Wiederherstellung des Blutflusses der mittleren Hirnarterie

  1. Überprüfen Sie vor der erneuten Anästhesie den Neuroscore mit der Longa-Score-Skala, um den Erfolg der Operation zu bewerten, wie in Schritt 3 beschrieben.
  2. Betäuben Sie die Ratte wie oben beschrieben und öffnen Sie den Schnitt wieder. Platzieren Sie einen mikrovaskulären Clip auf dem CCA, ziehen Sie die Verschlussnaht teilweise aus dem ICA zurück, bis das Nahtende durch den ICA sichtbar ist.
  3. Platzieren Sie einen weiteren Mikroclip auf dem ICA über der Stelle der intraluminalen Naht, entfernen Sie die Verschlussnaht vollständig und binden Sie den ECA-Stumpf ab. Reperfusion für 24h.
  4. Entfernen Sie die Clips von CCA und ICA. Verschließen Sie den Schnitt mit einer chirurgischen Naht. Buprenorphin (0,05 mg/kg; siehe Materialtabelle) subkutan verabreichen.
  5. Setze die Ratte zurück in den Käfig, stelle Wasser und püriertes Futter bereit und kümmere dich um sie, bis sie wieder zu Bewusstsein kommt. Die Körpertemperatur der Ratten wird während des gesamten Versuchsverfahrens auf 37± 0,5 °C gehalten.

3. Bewertung des Neuroscores

  1. Bewertung der neurologischen Defizite nach der Operation und 24 h nach der Reperfusion anhand der Longa-Score-Skala11: (0) kein Defizit; (1) Versäumnis, die linke (gelähmte Seite) Vorderpfote vollständig auszustrecken; (2) Kreisen nach links (gelähmte Seite); (3) Sturz nach links (gelähmte Seite); (4) kein spontanes Gehen und vermindertes Bewusstsein; (5) tot.
    HINWEIS: Drei Operatoren wurden gemäß den oben genannten Standards bewertet.

4. Entnahme von Hirngewebe

  1. Entnahme von Hirngewebe 24 Stunden nach der Reperfusion, nachdem neurologische Defizite bewertet und bewertet wurden.
  2. Betäuben Sie die Ratte wie oben beschrieben. Schneiden Sie die Haut ab, um Kopf und Hals freizulegen, und schneiden Sie das Halsmark mit einer chirurgischen Schere von der Halswirbelsäule ab (siehe Materialtabelle).
  3. Trennen und entfernen Sie die hinteren Nackenmuskeln. Entfernen Sie den Schädel vorsichtig mit einer gebogenen Pinzette (siehe Materialtabelle). Achten Sie beim Trennen des Schädels auf die Dura, um Kratzer im Hirngewebe zu vermeiden. Entfernen Sie das Gehirngewebe vollständig.
  4. Legen Sie das Hirngewebe in ein bei 4 °C vorgekühltes TEM- und IEM-Fixiermittel und lagern Sie es bei 4 °C im Kühlschrank.

5. Scheinbetrieb

  1. Führen Sie bei Scheinoperationen alle Verfahren wie oben beschrieben durch, mit der Ausnahme, dass die Okklusion nicht durchgeführt wird.

6. Vorbereitung und Bildgebung von Ultradünnschliffen

  1. Vorbereitung des TEM-Ultradünnschliffs
    1. Fixierung: Bestimmen Sie die Probenahmestelle von frischem Gewebe, um mechanische Schäden wie Traktion, Prellung und Extrusion zu minimieren und sicherzustellen, dass die Gewebedicke 2 mm nicht überschreitet. Stellen Sie sicher, dass das Gewebevolumen 1 mm x 1 mm x 1 mm nicht überschreitet.
    2. Mit TEM-Fixiermittel bei 4 °C für 24 h fixieren. 3x für je 15 min in 0,1 M Phosphatpuffer PB (pH 7,4; siehe Materialtabelle) waschen.
    3. Nach der Fixierung: 1 % Osminsäure ·0,1 M PB (siehe Materialtabelle) für 2 h bei Raumtemperatur (25 °C) zugeben.
    4. Dehydratisierung: Dehydrieren Sie das Gewebe nacheinander in 30 % Ethanol für 10 Minuten, 50 % Ethanol für 10 Minuten, 70 % Ethanol für 15 Minuten, 90 % Ethanol für 15 Minuten, absolutes Ethanol für 15 Minuten und 100 % Aceton für 15 Minuten.
    5. Zahnfleischtauchen: Gewebe nacheinander in Lösung Epoxidharz SPI-Pon 812: Aceton = 1:3 für 30 min, Lösung SPI-Pon 812: Aceton = 1:1 für 30 min und Lösung SPI-Pon 812: Aceton = 3:1 für 1 h (siehe Materialtabelle).
    6. Polymerisation und Einbettung: Tauchen Sie die Probe über Nacht bei 37 °C in reines SPI-Pon 812, wechseln Sie 8 h lang zu frischem SPI-Pon 812 und polymerisieren Sie 48 h lang bei 60 °C (siehe Materialtabelle).
    7. Schneiden: Den eingebetteten Block mit einem Diamantmesser bei 0,8 μm Dicke halbdünn aufschneiden, bei 25 °C 5 min mit Aminotoluolblau beizen. Lokalisieren und selektieren Sie Bereiche mit dicht gepackten Neuronen mit einem Lichtmikroskop für Beobachtung mit hoher Vergrößerung. Machen Sie ultradünne Schnitte mit einem Mikrotom mit einer Dicke von 90 nm. Legen Sie die Proben auf 200-Mesh-Formvar-beschichtete Kupfergitter (siehe Materialtabelle).
    8. Nach der Färbung: Gitter in Uranylacetat bei 25 °C für 15 min färben, dann Gitter in Bleicitrat bei 25 °C für 5 min färben.
  2. Vorbereitung des IEM-Ultradünnschliffs
    1. Führen Sie die Schritte 6.1.1-6.1.4 aus.
    2. Zahnfleischtauchen: Gewebe nacheinander in Lösung eintauchen L. R. Weißes Harz: Ethanol = 1: 3 für 2 h, Lösung L. R. Weißes Harz: Ethanol = 1: 1 für 2 h und Lösung L. R. Weißes Harz: Ethanol = 3: 1 für 2 h.
    3. Polymerisation und Einbettung: Tauchen Sie die Probe über Nacht bei 4 °C in reines L. R. White Resin, wechseln Sie 4 Stunden bei 25 °C zu frischem L. R. White Resin und polymerisieren Sie 78 h lang bei 55 °C.
    4. Schneiden (wie in Schritt 6.1.7 gemacht): Die eingebetteten Blöcke bei 0,8 μm Dicke halbdünn schneiden, bei 25 °C 5 min lang mit Aminotoluolblau färben. Bereiche mit dicht gepackten Neuronen mit einem Lichtmikroskop lokalisieren und auswählen. Machen Sie ultradünne Schnitte mit einer Dicke von 90 nm. Legen Sie die Proben auf Kupfergitter.

7. Immunogold-Etikettierung

  1. 2x mit PBS und 1x mit Glycinpuffer bei 25 °C für jeweils 5 min spülen, dann 2% Phosphatpuffer aus Rinderserumalbumin (PBS-BSA) zugeben und 30 min inkubieren.
  2. In der Lösung des Primärantikörpers (polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen Cytochrom C) bei 37 °C für 2 h inkubieren. Der Primärantikörper wird mit PBS-BSA im Verhältnis 1:50 verdünnt.
  3. Mit PBS bei 25 °C 5x für je 5 min spülen. In der kolloidalen, goldmarkierten Sekundärantikörperlösung (Gold-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG) bei 25 °C 1 h inkubieren. Der Sekundärantikörper wird mit PBS-BSA im Verhältnis 1:20 verdünnt (siehe Materialtabelle).
  4. Mit PBS bei 25 °C 5x für je 5 min spülen. Mit destilliertem Wasser bei 25 °C 5x für je 5 min spülen (siehe Materialtabelle).
  5. Nach der Färbung: Gitter in Uranylacetat bei 25 °C für 10 min färben, dann Gitter in Bleicitrat bei 25 °C für 2 min färben (siehe Materialtabelle).
  6. Nehmen Sie das Bild des ultradünnen Schnitts auf und machen Sie Fotos mit einem Transmissionselektronenmikroskop bei 80 kV.

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Ergebnisse

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Die Neuroscore-Auswertung bestätigt den Erfolg von MCAO, laut Longa Score Scale zeigten Ratten in der MCAO-Gruppe zumindest nach links kreisend (Neuroscore 2). Ratten der Schein-OP-Gruppe zeigten keine offensichtliche neurologische Dysfunktion (Neuroscore 0). Während des Operationstages wurde keine Mortalität beobachtet. Der Neuroscore der Tiere ist in Tabelle 1 aufgeführt.

Die IEM-Analyse der MCAO-Gruppe zeigte Neuronen mit geschrumpften Kernen und erhöhter zytoplasmatischer ...

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Diskussion

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Primäres Ziel der Reperfusionstherapie bei akutem ischämischem Schlaganfall ist die Wiederherstellung der Durchblutung der ischämischen Region. Jetzt können wir dieses Ziel durch intravenöse Thrombolyse, endovaskuläre Behandlung und antithrombotische Therapie erreichen. Die Wiederherstellung der Blutdurchblutung führt jedoch zu Ischämie-Reperfusionsschäden, verschlimmert die neuronale Nekrose und Apoptose und führt zu neurologischen Beeinträchtigungen. Während der Ischämie-Reperfusion fü...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch das spezielle wissenschaftliche Forschungsprojekt für Traditionelle Chinesische Medizin der Provinzverwaltung für Traditionelle Chinesische Medizin in Sichuan (2021MS414) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,9% normale KochsalzlösungSichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.
200 Mesh Formvar beschichtete KupfergitterZhongjingkeyi Technology Co., Ltd.BZ10262a
220-230g MCAO MonofilamenteBeijing Cinontech Co., Ltd.A4-243250
Absolutes EthanolChengdu Kelong  Chemischer Lieferant Co.,Ltd.
Aceton Chengdu  Kelong  Chemischer Lieferant Co.,Ltd.
Anästhesiesystem für TiereRayward Life Technology Co., Ltd.R500
Temperaturhalter für TiereRayward Life Technology Co., Ltd.69020
BacktischShenzhen Bangqi Chuangyuan Technology Co., Ltd.CT-946
KnochenschereFine Science Tools16102-11
KapseleinbettungsformenZhongjingkeyi Technology Co., Ltd.GP130-B
ZentrifugeSCILOGEXD3024R
Konventionelle optische HellfeldmikroskopieZeiss (Deutschland)Primo Star
Gebogene Augenzange (10 cm)Shanghai Medical Equipment Co., Ltd.
DiamantmesserDiatomee (Schweiz)DU4530
PräparierzangeRayward Life Technology Co., Ltd.F12018-10
PräparierzangeRayward Life Technology Co., Ltd.F12010-10
Elektrischer StrahltrockenofenShanghai YiHENG Scientific Instrument Co., Ltd.DHG-9030A
ElektrorasiererYiwu Kemei Electric Appliances Co., Ltd.KM-PG5002
FixierflüssigkeitSichuan Scientist Biotechnology CO., Ltd.SC0001
GlasobjektträgerNantong Mevid Life Science Co., Ltd.
Gold-konjugierte Ziege Anti-Kaninchen lgGSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Hämostatische Pinzette (12,5 cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL068
Hämostatische Zange (14 cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL002
IsofluranRayward Life Technology Co., Ltd.
L. R. Weißes HarzTianjin Tainuo Wissenschaft und Technologie Co., Ltd.
BleicitratSPI (US)GA10701
Nadelhalter Verifizierter Lieferant - Jiachi Medical Technology Co., Ltd.
OsmiumtetroxidTED PELLA (US)4008-220501
PBSServicebioG4202
Kaninchen polyklonaler Antikörper gegen Cytochrom c   Verifizierter Lieferant - Affinity Biosciences, Ltd.AF0146
RattenBeijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd.
SPI-Pon 812 Einbettungsharz-KitSPI(US)GS02660
StereomikroskopSunny Optical Technology Co., Ltd.Soptop SZMN
Schere mit geradem Kopf (10 cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL063
Gerade Augenzange (10cm)Shanghai Medical Equipment Co., Ltd.
Chirurgische SchereRayward Life Technology Co., Ltd.S14001-10
TransmissionselektronenmikroskopieHitachi (Japan), Ltd.HT7800
UltramikrotomLeica (Deutschland)UC7
UranacetatSPI (US)GS02624
H20083400Verifizierter Lieferant - 20231012012023120501211001220518001D1110942024071201Verifizierter Lieferant -AGR1281A10044036898028110322241102187881211001

Referenzen

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