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Methodenartikel

Erzeugung von maternalen Mutanten mit zpc:cas9 Knock-in-Zebrafisch

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DOI:

10.3791/68642

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22. Juli 2025

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1Shandong Provincial Key Laboratory of Animal Cell and Developmental Biology, School of Life Sciences Qilu Hospital (Qingdao), Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), UMR CNRS 8263, INSERM U1345, Development, Adaptation and Ageing, Sorbonne Université, 3College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, 4Key Laboratory for Experimental Teratology of the Ministry of Education, Shandong University, 5State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, 6Shandong University-Yuanchen Joint Biomedical Technology Laboratory

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Generierung einer maternalen Mutante, das eine stabile zpc: cas9-Knock-in-Linie mit der Tol2-vermittelten Verabreichung von sgRNA-Expressionskassetten koppelt.

Zusammenfassung

Die Oogenese und die frühe Embryonalentwicklung sind entscheidend von mütterlichen mRNAs und Proteinen abhängig. Die Eliminierung dieser mütterlichen Faktoren erfordert homozygote Mutationen im weiblichen Zebrafisch, die oft zu letalen oder unfruchtbaren Phänotypen führen, die den Erwerb von mütterlichen mutierten Embryonen verhindern. Unsere früheren Arbeiten führten einen schnellen Ansatz zur Umgehung der zygotischen Letalität durch eizellspezifische Genomeditierung ein. Das zuvor beschriebene Cas9-Transgen weist jedoch eine Instabilität auf und erfährt über aufeinanderfolgende Generationen hinweg eine allmähliche Stilllegung. Darüber hinaus behindert das Vorhandensein von Tol2-transponierbaren Elementen, die die zpc:cas9-Kassette in dieser Linie flankieren, das Potenzial für eine weitere sgRNA-Transgenese unter Verwendung des Tol2-Systems, das derzeit das effizienteste transgene System im Zebrafisch ist. Folglich besteht ein dringender Bedarf an einer Tol2-freien Zebrafischlinie, die eine stabile und robuste Eizell-spezifische Cas9-Expression gewährleistet. Hier stellen wir eine Leitung mit zpccas9 Knock-in am rbm24a-Locus vor, die diese Anforderung erfüllt. Mit diesem verbesserten Werkzeug stellen wir eine Pipeline für die schnelle Generierung von maternalen Mutanten von Genen mit zygotisch letalen Mutanten-Phänotypen innerhalb des Zebrafischmodells zur Verfügung.

Einleitung

Die frühe Embryonalentwicklung von Wirbeltieren hängt stark von der RNA und den Proteinen ab, die in der Eizelle gespeichert sind und zusammen als maternale Faktoren bezeichnet werden. Diese Maternalprodukte werden überwiegend während des Diplotin-Stadiums der Meiose Isynthetisiert I 1,2,3. Um ihre funktionelle Rolle zu untersuchen, ist es wichtig, homozygote mutierte weibliche Individuen zu erzeugen, da nur homozygote Mutationen in den Eizellen diese mütterlichen Faktoren vollständig abbauen können. Die Gewinnung solcher homozygoten mutierten Weibchen wird jedoch schwierig, wenn zygotische homozygote Mutationen zu Letalität oder Sterilität führen 4,5. Dies stellt ein erhebliches Hindernis für die Aufklärung der Funktionen von mütterlichen Produkten dar, die von zygotischen, letalen oder sterilen Genen kodiert werden. Um diese technische Einschränkung zu überwinden, wurden mehrere innovative Ansätze entwickelt 6,7,8. Dennoch leiden diese Techniken oft unter verlängerten experimentellen Zeiträumen oder erheblichen technischen Herausforderungen.

In unseren früheren Arbeiten haben wir auch eine bedingte Knockout-Strategie entwickelt, die die Erzeugung von maternalen Mutanten innerhalb einer einzigen Generationermöglicht 9,10. Das System besteht aus zwei Schlüsselkomponenten: Tg(zpczcas9) transgenem Zebrafisch und einem I-SceI transgenen Plasmidsystem mit 3-4 sgRNA-Expressionskassetten. Mit diesem System ist es uns gelungen, einen bedingten Knockout von maternalen Faktoren in den Eizellenzu erreichen 9,10, aber es gibt noch Raum für Verbesserungen. Erstens war die Genom-Editing-Effizienz der zuvor berichteten transgenen Tg(zpczcas9)-Linie bei der Aufrechterhaltung der transgenen Expression von Cas9 nicht stabil. Da diese transgene Linie unter Verwendung des Tol2-Transposon-Systems erzeugt wurde, kann die Tol2-Transposition nicht weiter für die Integration der sgRNA-Expressionskassette verwendet werden. Stattdessen ist eine I-SceI-vermittelte Transgenese erforderlich. Dieser Ansatz ist jedoch weniger effizient als Tol2 und auch anfälliger für transgenerationales Silencing.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir versucht, eine Knock-in-Linie zu etablieren, die eine robuste und stabile eizellspezifische Cas9-Expression ermöglicht. Diese Linie ermöglicht den Einsatz des Tol2-Transposon-Systems für die hocheffiziente Verabreichung von sgRNA-Expressionsplasmiden im Zebrafisch. Unter Verwendung einer Intron-basierten Genom-Editing-Strategie11 erzeugten wir erfolgreich eine zpccas9-Knock-in-Linie mit der integrierten Stelle im letzten Intron des rbm24a-Gens (Abbildung 1A,B). Wir haben diesen Locus auf der Grundlage von zwei unabhängigen Beobachtungen als kandidatischen genomischen Safe Harbor für die maternale Transgenexpression ausgewählt. 1) Harmlose Integration: In unserer aktuellen Studie12 blieben homozygote Knock-in-Fische, die an dieser Stelle exogene DNA trugen, voll lebensfähig und fruchtbar. 2) Robuste Expression: Wenn eine zpccas9-Kassette am selben Locus eingesetzt wurde, wurde Cas9 in hohen Konzentrationen exprimiert, was zu einer gleichbleibend starken Genom-Editing-Effizienz über Generationen hinweg führte (Abbildung 1C). Als Kernkomponente des Keimplasmas arbeitet das RNA-bindende Protein Rbm24a mit Buc zusammen, um Keimplasma-RNAs in Keimgranulate einzubauen. Folglich führt ein mütterlicher Rbm24a-Mangel zu einem völligen Fehlen von primordialen Keimzellen (PGCs)12. Indem wir in unserer jüngsten Arbeit auf rbm24a als Beispiel abzielen, stellen wir ein verbessertes Videoprotokoll zur Generierung und Charakterisierung mütterlicher Mutanten für zygotische letale Gene zur Verfügung.

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Protokoll

Die Versuche wurden in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt und vom Institutional Animal Care Committee der Universität Shandong ethisch genehmigt (Zulassungs-Nr. SYDWLL-2021-15). Die Übersicht über dieses Protokoll ist in Abbildung 2 dargestellt.

1. Generierung der rbm24a-RFP zpc:cas9 Knock-In Line

  1. Screening von sgRNA für den Knock-in
    1. Selektion und Synthese von Knock-in-sgRNA-Kandidaten
      1. Übermitteln Sie die Sequenz des letzten Introns von rbm24a an den CRISPRscan (http://www.crisprscan.org), um optimale sgRNA-Kandidaten zu identifizieren, die sowohl hohe CRISPRscan-Scores (ein Hinweis auf On-Target-Effizienz) als auch niedrige CFD-Scores (die Off-Target-Effekte widerspiegeln) aufweisen. Synthetisieren Sie das lange Oligo für jede sgRNA (sgRNA-Oligo).
        HINWEIS: CRISPRscan generiert sgRNA-Oligos, die wesentliche funktionelle Elemente enthalten, einschließlich der T7-Promotorsequenz, der 20-Nukleotid-sgRNA-Zielsequenz und einer 16-Nukleotid-sgRNA-Gerüstsequenz. Hier wählten wir eine sgRNA mit der folgenden Sequenz aus: 5′-taatacgactcactataGGGCTGCTGTCATGTTGG
        GTgttttagagctagaa-3′ (T7-Promotor in Kleinbuchstaben, 20-nt-Leitfaden in Großbuchstaben, Teilgerüst in Kleinbuchstaben).
      2. Um das DNA-Template für die sgRNA-Synthese zu erhalten, bereiten Sie 50 μl Fill-in-PCR-Reaktion vor: 2x Taq Master Mix 25 μl; sgRNA-Primer (10 μM) 2 μL; Universeller Primer (10 μM) 2 μL; Deionisiert H2O 21 μL.
        HINWEIS: Die Sequenzen aller Grundierungen sind in der Materialtabelle aufgeführt.
      3. Mischen Sie gründlich und übertragen Sie das Reaktionsgemisch in einen vorprogrammierten Thermocycler und starten Sie das Amplifikationsprotokoll unter Verwendung der Zyklusparameter wie folgt: 1 Zyklus bei 94 °C für 3 min, 35 Zyklen (94 °C für 15 s, 50 °C für 15 s, 72 °C für 30 s) und 1 Zyklus bei 72 °C für 5 min.
      4. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch für die sgRNA-Synthese in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor. Kombinieren Sie alle Komponenten bei Raumtemperatur in der folgenden Reihenfolge: 11 μl destilliertes Wasser, 2 μl ATP/GTP/CTP/UTP (je 10 mM), 10 μl PCR-Produkt, 4 μl 10x RNA-Polymerase-Reaktionspuffer, 2 μl T7-RNA-Polymerase und 1 μl RNase-Inhibitor. Das Gesamtreaktionsvolumen beträgt 40 μl. Durch Schnippen gründlich mischen und kurz zentrifugieren.
      5. 1,5 h bei 37 °C inkubieren. 1 μl DNase I zugeben, durch Schnippen mischen und kurz zentrifugieren. 15 Minuten lang bei 37 °C inkubieren, um eine vollständige Entfernung der DNA-Matrize zu gewährleisten.
      6. Fügen Sie 5 μl magnetische Siliziumdioxidkügelchen hinzu, gefolgt von 120 μl (4x Volumen) RNA-Bindungspuffer (Gu-HCl 1 M 9,55 g, Tween-20 0,05 %, Ethanol 100 mL). Durch Pipettieren gründlich mischen. Auf einem Thermomischer bei 1.500 U/min für 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
      7. Stellen Sie das Röhrchen auf einen Magnetständer und entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette oder einem Vakuumsystem.
      8. Fügen Sie 400 μl 90%iges Ethanol hinzu und wirbeln Sie es ein, um die Kügelchen zu resuspendieren. Legen Sie das Rohr auf den Magnetständer und entsorgen Sie den Überstand.
      9. Wiederholen Sie die Ethanol-Waschschritte, um insgesamt zwei Waschgänge abzuschließen.
      10. Entfernen Sie den restlichen Überstand und trocknen Sie das offene Rohr 10 min lang an der Luft auf einem 50 °C Heizblock.
      11. Fügen Sie 15 μl nukleasefreies Wasser hinzu und inkubieren Sie auf einem Thermomixer bei 1.500 U/min für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
      12. Stellen Sie das Röhrchen auf den Magnetständer und geben Sie das Eluat in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen.
      13. Bestätigen Sie die 98 bp sgRNA-Bande durch Agaroseelektrophorese. Quantifizierung der RNA-Konzentration durch Mikrospektrophotometer und Agaroseelektrophorese, klare Markierung und Lagerung bei -20 °C.
    2. Testen der sgRNA-Effizienz
      1. Um die tatsächliche Wirksamkeit von sgRNAs zu bestimmen, bereiten Sie den Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex für die Mikroinjektion vor. Mischen Sie 1 μl jeder sgRNA (50 ng/μl Endkonzentration) mit 1 μl Cas9-Protein (100 ng/μl Endkonzentration) auf Eis durch Pipettieren. Geben Sie 2 nL des RNP-Komplexes durch Mikroinjektion in jeden Embryo im Einzelzellstadium.
      2. 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) entnehmen Sie 10 Embryonen für jedes injizierte Cas9 RNP in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und entfernen Sie vorsichtig überschüssiges Medium. 100 μl 50 mM NaOH (10 μl pro Embryo) zugeben und 15 Minuten lang bei 95 °C mit einem Heizblock oder Thermocycler inkubieren. Neutralisieren Sie das Lysat durch Zugabe von 10 μl 1 M Tris-HCl (pH 7,0).
      3. Verwenden Sie das neutralisierte Embryolysat direkt als Template für die PCR-Amplifikation. Entwerfen Sie Primer zur Amplifikation eines Fragments, das die Zielstelle enthält, mit flankierenden Sequenzen von ≥100 bp auf beiden Seiten. Verifizieren Sie PCR-Produkte durch Agarose-Gelelektrophorese und reinigen Sie sie bei Bedarf durch Gelextraktion. Führen Sie eine Sanger-Sequenzierung der amplifizierten Produkte durch.
      4. Quantifizierung der Effizienz der CRISPR-Bearbeitung: Analysieren Sie Sequenzierungschromatogramme mit dem Analysetool ICE (Inference of CRISPR Edits) (https://ice.synthego.com/#/). Normalisieren Sie die Bearbeitungseffizienz bei nicht injizierten Kontrollproben gemäß den von der Website empfohlenen Protokollen.
  2. Aufbau eines Spenderplasmids für den Knock-in
    1. Verwenden Sie die etablierte TEDA-Methode (T5-Exonuklease-DNA-Assemblierung), um die Ligationsreaktiondurchzuführen 13.
    2. Verwenden Sie eine Gibson-Assemblierungsstrategie mit drei Fragmenten für die Konstruktion des rbm24a-RFP KIzpc:cas9-Knock-in-Donorplasmids . Das erste Fragment enthält einen 1.704 bp 5' Homologiearm, der die genomische Region unmittelbar stromaufwärts des rbm24a-Stoppcodons umfasst. Die zweite ist die GFP-Codierungssequenz. Die dritte enthält einen 2.274 bp 3'-Homologiearm stromabwärts des rbm24a-Stoppcodons , gefolgt von der zpccas9-Expressionskassette , die in 3'-Richtung distal des rbm24a 3'-UTR positioniert ist.
    3. Assemblieren Sie die drei Fragmente mit der Gibson-Assemblierung in die ApaI-Stelle des pBluescript SK-Vektors.
    4. Verifizieren Sie das endgültige Plasmid durch Restriktionsverdau und Sanger-Sequenzierung.
  3. Mikroinjektion und Selektion von Embryonen mit früher Integration
    1. Bereiten Sie die Injektionsmischung vor, die 12 pg rbm24a-RFP KIzpc:cas9 knock-in-Donorplasmid, 200 pg sgRNA und 600 ng rekombinantes Cas9-Protein in nukleasefreiem Wasser enthält. Geben Sie 1-2 nL der Mischung in die Blastoscheibe von Embryonen im Einzelzellstadium unter Verwendung von Standard-Mikroinjektionstechniken. Bei 30 hpf werden die Embryonen auf RFP-Expressionsmuster untersucht, die die endogene Expression von rbm24a nachahmen, was auf eine Integration des Spenderplasmids bereits im Spaltstadium hinweist. Wählen Sie diese Embryonen mit früher Integration für die Zucht aus, die ein RFP-Signal in den Zellen der Linse, des Herzens, der Skelettmuskulatur und der Haarzellen des Innenohrs zeigten (Abbildung 3A, B).
      HINWEIS: Reinigen Sie das Plasmid vor der Injektion durch Phenol-Chloroform-Extraktion, um alle verbleibenden RNasen zu entfernen, die während der Plasmidvorbereitung eingeführt wurden.
    2. Analysieren Sie die Expressionsmuster von mütterlichem Rbm24a-RFP in Embryonen der F1-Generation, die von rbm24a-RFP KIzpc:cas9-Inkreuzungen abstammen (Abbildung 4A,B).
  4. Bewertung der Cas9-Proteinexpression und der Editierungseffizienz
    1. Um die Effizienz der Cas9-Editierung zu beurteilen, mikroinjizieren Sie 200 pg bmp2b sgRNA in 1-zellige rbm24a-RFP KI zpc:cas9-Embryonen (Abbildung 1C,D).
    2. Um die Stabilität der Cas9-Editierung zu bewerten, quantifizieren Sie die Anzahl der Embryonen mit Dorsalisierungsphänotypen und führen Sie eine Sanger-Sequenzierungsanalyse durch, um die Effizienz der Editierung zu beurteilen (Abbildung 5A-D).
      HINWEIS: Obwohl wir über drei Generationen hinweg keine Verringerung der Cas9-Expression festgestellt haben, empfehlen wir dennoch, die Bearbeitungseffizienz in jeder Generation dieser Knock-in-Linie zu überprüfen.

2. sgRNA-Transgenese in der rbm24a-RFP KI zpc cas9-Linie

  1. Selektion und Synthese von sgRNAs für den rbm24a-Knockout .
    1. sgRNA-Kandidaten auswählen und synthetisieren, wie in Schritt 1.1.1 beschrieben.
      HINWEIS: Es ist entscheidend, sgRNAs auszuwählen, die auf die vordere Hälfte der kodierenden Region abzielen, um einen hocheffizienten Funktionsverlust zu gewährleisten. Wenn kritische Proteindomänen in der C-terminalen Region identifiziert werden, sind sgRNAs, die auf das 3'-Ende der kodierenden Sequenz abzielen, ebenfalls akzeptabel. CRISPRscan erzeugt sgRNA-Oligos, die essentielle funktionelle Elemente enthalten, einschließlich der T7-Promotorsequenz, der 20-Nukleotid-sgRNA-Zielsequenz und einer 16-Nukleotid-sgRNA-Gerüstsequenz. Um einen effektiven maternalen Gen-Knockout zu erreichen, ist es ratsam, 6-8 Kandidaten zu designen, um 3-4 hocheffiziente sgRNAs zuverlässig zu identifizieren. Ein detailliertes Protokoll findet sich in einer früheren Arbeit9.
    2. Testen Sie die sgRNA-Effizienz in frühen Zebrafischembryonen, wie in Schritt 1.1.2 beschrieben.
      HINWEIS: sgRNAs mit einer Editierungseffizienz von mehr als 50% werden bevorzugt.
  2. Konstruktion eines sgRNA-exprimierenden transgenen Plasmids
    HINWEIS: Um die Editiereffizienz zu maximieren, empfehlen wir die Verwendung von vier unterschiedlichen, nicht überlappenden sgRNAs, die jeweils mindestens 36 bp voneinander entfernt sind. Diese sgRNAs werden einzeln in pU6x:sgRNA-Vektoren (pU6x:sgRNA #1, #2, #3, #4) ligiert, die jeweils einen einzigartigen U6-Promotor zusammen mit dem 3'-Gerüst beherbergen14. Anschließend werden diese vier U6-Vektoren, die jeweils eine sgRNA-Expressionskassette enthalten, über eine Golden-Gate-Ligation zum pGGDestISceIEB-4sgRNA-Zielvektor assembliert.
    Die pU6x:sgRNA-Vektoren sollten nacheinander ausgewählt werden. Wenn Sie beispielsweise drei sgRNAs klonen, verwenden Sie die Vektoren #1 bis #3; Wenn Sie vier sgRNAs klonen, verwenden Sie die Vektoren #1 bis #4.
    1. Subklonierung der sgRNA-Zielsequenz in pU6x:sgRNA-Vektoren
      1. Entsprechend der Sequenz der ausgewählten sgRNA werden die Annealing-Primer synthetisiert: Vorwärtsprimer: TTCGN(19); Umgekehrte Grundierung: AAAC[N(19)]*. Dabei ist GN(19) die 20-nt-Zielsequenz der sgRNA. [N(19)]* stellt die umgekehrte Komplementsequenz des 19 nt des sgRNA-Ziels in 3'-Richtung dar.
      2. Um die Primer zu glühen, bereiten Sie die Mischung wie folgt vor: 1 μl Forward-Primer (100 μM), 1 μL Reverse-Primer (100 μM), 2 μL 10x Puffer und 16 μL deionisiertes H2O, um ein Gesamtvolumen von 20 μL zu erreichen.
        HINWEIS: Die Sequenzen aller Primer wurden in der Materialtabelle angezeigt.
      3. Geben Sie die Mischung in einen Thermocycler und führen Sie das Programm wie folgt aus: 1 Zyklus bei 95 °C für 15 Minuten, dann allmählich auf 50 °C bei einer kontrollierten Rampengeschwindigkeit von 0,1 °C/s abkühlen und diese Temperatur 10 Minuten lang halten; 10 min bei 4 °C halten.
      4. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch für die Klonierung der gehöhlten sgRNA-Zielsequenz in pU6x-sgRNA-Vektoren vor, wie beschrieben: 1 μl 10x Restriktionsenzympuffer, 1 μl 10x T4-Ligase-Puffer, 0,3 μl T4-Ligase, 0,3 μl BsmBI, 0,2 μl PstI, 0,2 μl SalI, 1 μl geglühter sgRNA-Primer, 5 μl pU6x:sgRNA#x (20 ng/μl) und 1 μl deionisiertes H2O, wobei das endgültige Reaktionsvolumen auf 10 μl eingestellt wird.
      5. Mischen Sie die Reaktionskomponenten gründlich und führen Sie das folgende Thermocycler-Programm durch: 6 Zyklen (37 °C für 20 min, 16 °C für 15 min), 1 Zyklus bei 37 °C für 10 min, 1 Zyklus bei 55 °C für 15 min, 1 Zyklus bei 80 °C für 15 min.
      6. Für die Transformation tauen Sie DH5α-kompetente Zellen auf Eis auf, mischen Sie vorsichtig 50 μl der Zellen mit der Ligationsmischung, indem Sie das Röhrchen schnippen, und inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang auf Eis. Führen Sie einen Hitzeschock bei 42 °C für 60 s durch und stellen Sie das Rohr sofort wieder für 2 Minuten auf Eis. Die transformierten Zellen werden auf eine LB-Platte mit 100 μg/ml Spectinomycin verteilt und die Platte mindestens 16 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, um die Koloniebildung zu ermöglichen.
      7. Für die Kolonie-PCR entnehmen Sie jede Bakterienkolonie mit einer Pipettenspitze und überführen Sie sie in 10 μl deionisiertes H2O. Resuspendieren Sie die Kolonie gründlich, indem Sie auf und ab pipettieren, um eine vollständige Dispersion für die nachgeschaltete PCR-Analyse zu gewährleisten. Bereiten Sie das PCR-Reaktionsgemisch vor, indem Sie 5 μl 2x Taq Mix, 2 μl Kolonieflüssigkeit, je 0,4 μl M13 Forward Primer (10 μM) und Reverse Primer (10 μM) sowie 2,2 μl deionisiertes H2O kombinieren, was ein Gesamtreaktionsvolumen von 10 μl ergibt.
      8. Führen Sie das Programm wie folgt aus: 1 Zyklus bei 94 °C für 3 min, 23 Zyklen (94 °C für 15 s, 55 °C für 15 s, 72 °C für 30 s) und 1 Zyklus bei 72 °C für 5 min.
      9. Unterziehen Sie die PCR-Produkte einer Elektrophorese. Wählen Sie die positive Kolonie mit der erwarteten Größe von 482 bp aus (Abbildung 6).
      10. Die restliche Kolonieflüssigkeit wird in 3 ml LB-Medium geimpft, das mit 100 μg/ml Spectinomycin ergänzt wird. Inkubieren bei 37 °C und Schütteln bei 200 U/min für 14 h.
      11. Extrahieren Sie Plasmide aus der Bakterienkultur mit dem Plasmid Miniprep Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Messen Sie die Plasmidkonzentration mit einem Mikrospektrophotometer.
      12. Die extrahierten Plasmide werden einer Sanger-Sequenzierung mit dem M13-Forward-Primer unterzogen. Richten Sie die Sequenzierungsergebnisse mit der erwarteten U6-Vektorkarte aus, um die korrekte Insertion des sgRNA-Ziels zu überprüfen.
    2. Assemblierung des pGGDestEB-4sgRNA-Vektors
      HINWEIS: Wie in Abbildung 7 dargestellt, können vier U6-gesteuerte sgRNA-Expressionskassetten unter Verwendung der Golden-Gate-Assemblierung effizient in den pGGDestEB-4sgRNA-Backbone-Vektor ligiert werden. Die Anzahl der zu ligierenden sgRNAs bestimmt die Verwendung von Vektoren. Wenn Sie beispielsweise vier sgRNA-Kassetten assemblieren, verwenden Sie pU6a:sgRNA#1, pU6a:sgRNA#2, pU6b:sgRNA#3, pU6c:sgRNA#4 und pGGDestEB-4sgRNA.
      1. Bereiten Sie das 20-μl-Golden-Gate-Reaktionsgemisch vor, das Folgendes enthält: 2 μl 10× Restriktionsenzympuffer, 2 μl 10x T4-DNA-Ligase-Puffer, 100 ng jedes pU6x:sgRNA#x-Konstrukts, 50 ng pGGDestIEB-4sgRNA-Zielvektor, 1 μl BsaI, 1 μl T4-DNA-Ligase und deionisiertes Wasser, um das endgültige Volumen auf 20 μl einzustellen.
      2. Die Golden-Gate-Assemblierungsreaktion durchläuft 3 Zyklen von 20 Minuten bei 37 °C, gefolgt von 15 Minuten bei 16 °C und schließt dann mit einer abschließenden 15-minütigen Inkubation bei 80 °C zur Enzyminaktivierung ab.
      3. Zur Umwandlung werden 5 μl des Reaktionsgemisches in kompetente Zellen überführt und auf Ampicillin-supplementiertes LB-Medium aufgetragen.
      4. Führen Sie eine Kolonie-PCR durch, indem Sie die Kolonien mit Dest-Vorwärts- und Rückwärtsprimern (siehe Materialtabelle) screenen, um das Vorhandensein des Inserts zu bestätigen (Abbildung 8).
        HINWEIS: Das Hauptband von 2.415 bp und ein Laddering-Muster sollten für einen positiven Klon vorhanden sein.
      5. Extrahieren Sie Plasmide aus positiven Kolonien und sequenzieren Sie mit Dest-Forward- und Reverse-Primern für jedes sgRNA-Ziel.
      6. Richten Sie die Sanger-Sequenzierungsergebnisse zur Verifizierung mit der vorhergesagten Vektorsequenz ab.
  3. Mikroinjektion und Prescreening von transgenen Gießern
    1. Sammeln Sie Embryonen, die von homozygoten rbm24a-RFP KIzpc:cas9-Fischen abgelaicht wurden.
    2. Bereiten Sie die Injektionsmischung vor, indem Sie 1 μl pGGDestEB-rbm24a-4sgRNA (12 ng/μl) mit 1 μl Tol2-Transposase-mRNA (50 ng/μl) kombinieren.
      HINWEIS: Reinigen Sie das Plasmid vor der Injektion durch Phenol-Chloroform-Extraktion, um alle RNase-Reste zu entfernen, die möglicherweise während des Plasmidextraktionsprozesses eingebracht wurden. Das Plasmid und die Tol2-mRNA wurden direkt in reinem Wasser verdünnt.
    3. Legen Sie ein Deckglas in eine 15 cm große Schale. Richten Sie die Embryonen am Rand des Deckglases aus und entfernen Sie überschüssiges Wasser vorsichtig mit einer Pipette. Injizieren Sie 2 nL der Mischung in die Blastodisc jedes Embryos im 1-Zell-Stadium. Spülen Sie die Embryonen nach der Injektion vorsichtig mit blauem Wasser ab und geben Sie sie in eine frische Schüssel. Zum Schluss stellen Sie die Schale zur Kultivierung in einen 28 °C heißen Inkubator.
      HINWEIS: Bereiten Sie Methylenblau-Arbeitslösung (blaues Wasser) wie folgt vor: 180 g Meersalz in 2,7 l destilliertem Wasser auflösen und sterilisieren, um das 100-fache der Meerwasserbrühe herzustellen. Verdünnen Sie diese Brühe 200-fach mit sterilem destilliertem Wasser, um 1/100x Meerwasser zu erhalten. 10 μl 5%ige (m/v) Methylenblau-Stammlösung zu 1 l dieses 1/100x Meerwassers geben, um die endgültige Arbeitslösung herzustellen.
    4. Bei 24 hpf zeigen ausgewählte Embryonen eine robuste und ubiquitäre BFP-Expression. Bei 4 dpf sind nur diejenigen anzuheben, die starke transgene Fluoreszenzsignale aufrechterhalten (Abbildung 9).

3. Charakterisierung von doppelt transgenen Embryonen

  1. Phänotypisierung von doppelt transgenen Embryonen
    1. Sammeln Sie Embryonen von mosaik-transgenen Gründerweibchen, die sich mit Wildtyp-Männchen paaren.
    2. Entnehmen Sie die BFP-positiven (BFP+) Embryonen im Einzelzellstadium unter einem Fluoreszenz-Steromikroskop.
    3. Identifizieren Sie Entwicklungsstörungen, die bei BFP+ -Embryonen, aber nicht bei BFP-Embryonen auftreten.
    4. Fixieren Sie die Embryonen über Nacht in 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C. Führen Sie bei Bedarf eine In-situ-Hybridisierung , Immunfluoreszenzfärbung oder andere histologische Analysen durch.
      HINWEIS: Nur defekte Phänotypen, die ausschließlich in GFP- oder BFP-positiven sgRNA-exprimierenden Embryonen auftreten, sind zuverlässig. Schlussfolgerungen sollten mit Vorsicht gezogen werden, und maternale Mutanten-Phänotypen müssen durch mehr als 10 Fälle belegt werden.
  2. Genotypisierung von maternalen mutierten Embryonen
    HINWEIS: Zur Identifizierung von Mrbm24a Embryonen können sie durch das Fehlen von Rbm24a-RFP unter einem Fluoreszenzmikroskop leicht aufgenommen werden. Im Gegensatz dazu beruht die Identifizierung maternaler Mutanten anderer Gene hauptsächlich auf einer Zellaspirationsstrategie vor der Aktivierung des zygotischen Genoms, gefolgt von der RT-PCR-Analyse mütterlicher mRNAs in den gesammelten Zellen (Abbildung 10).
    1. Aspiration der Zellen
      1. Bereiten Sie eine 1,5%ige Agaroselösung vor, indem Sie sie in 1/3x Ringer-Puffer auflösen und kochen, bis sie geschmolzen ist. Gießen Sie die Lösung in eine 90 mm Petrischale und setzen Sie eine Form (WPI, z-Formen) in die geschmolzene Agarose ein. Sobald sie erstarrt ist, entfernen Sie die Form vorsichtig, so dass eine gebrauchsfertige Platte entsteht.
      2. Verwenden Sie Glaskapillaren und einen Abzieher, um schmelzversiegelte Nadeln herzustellen. Für eine optimale Zellaspirationsnadel stellen Sie zwei leichte Gewichte und die Heizleistung auf Lv1: 60 und Lv2: 90 ein und wählen Sie das Verfahren Step2. Schneiden Sie die Kapillarspitzen mit einer spitzen Pinzette (siehe Materialtabelle) ab, um einen Öffnungsdurchmesser von 30-40 μm zu erreichen. Erstellen Sie anschließend mit einer Mikroschmiede einen Dorn an der Nadelspitze, der die Penetration erleichtert und die Schädigung des Embryos minimiert.
      3. Verpaaren Sie vermeintliche Gründerinnen mit Wildtyp-Zebrafischen und sammeln Sie die Embryonen. Isolieren Sie BFP-positive Embryonen im Einzelzellstadium.
      4. Bei 3 hpf dechorionieren Sie die Embryonen durch Inkubation in 1 mg/ml Pronase in 1/3x Ringer-Puffer für 10 Minuten und sanftes Pipettieren und legen Sie die Embryonen vorsichtig auf die Agaroseplatte, die mit 1/3x Ringer-Puffer geflutet und mit 1x Penicillin-Streptomycin ergänzt wurde. Richten Sie die Embryonen so aus, dass das Blastomer in Richtung Kapillarspitze gerichtet ist.
        HINWEIS: Es ist wichtig, die Embryonen mit Vorsicht zu übertragen, da sie ohne den Schutz des Chorions extrem zerbrechlich sind. Lassen Sie sie nicht die Oberfläche des Mediums berühren!
      5. Verwenden Sie einen Mikroinjektor, um 20-40 Zellen von jedem Embryo zu aspirieren, indem Sie den Gleichgewichtsdruck, der die Aspirationskraft der Kapillarwirkung kompensiert, sorgfältig reduzieren15. Geben Sie diese Zellen an der Öffnungskante von PCR-Röhrchen in 2 μL deionisiertes H2O ab, indem Sie den Gleichgewichtsdruck erhöhen.
        HINWEIS: Um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, sollte die Glasnadel vor jeder Aspiration durch Absaugen und Ausstoßen von deionisiertem H2O 3x gereinigt werden.
      6. Fügen Sie 200 μl RNA-Extraktionsreagenz hinzu, um die Zellen zu waschen, und lagern Sie die Röhrchen vorübergehend auf Eis. Analysieren Sie anschließend die Genotypen von Zellen von Embryonen mit oder ohne Entwicklungsstörungen.
        HINWEIS: Zellen, die im Extraktionsreagenz konserviert werden, können bei -20 °C gelagert werden, bis die entsprechenden Embryonen abweichende Phänotypen aufweisen.
      7. Lassen Sie die Embryonen nach der Zellaspiration in der Agaroseplatte oder legen Sie sie einzeln in 24-Well-Platten, die mit 1/3x Ringer-Lösung geflutet sind, die 1x Penicillin-Streptomycin enthält.
        HINWEIS: Beim Transfer der dechorionierten Embryonen ist Vorsicht geboten! In der Regel untersuchen wir 20-40 Embryonen in einem Experiment, das etwa 1 Stunde dauert.
    2. Analyse von maternaler mRNA von Interesse in aspirierten Zellen
      1. Geben Sie 40 μl Chloroform zu den Zellen im Extraktionsreagenz und mischen Sie es vorsichtig. Die Mischung bei 12.000 × g 1 min bei 4 °C zentrifugieren.
      2. Den Überstand vorsichtig einsammeln. Fügen Sie 1 μl Glykogenlösung (20 mg/ml) und ein gleiches Volumen Isopropanol hinzu (wenn das Volumen des Überstands 100 μl beträgt, fügen Sie 100 μl Isopropanol hinzu) und mischen Sie gut. Die Mischung wird 30 Minuten lang bei -20 °C inkubiert, um die Ausfällung zu erleichtern.
        HINWEIS: Aufgrund der geringen Menge an Gesamt-RNA in den aspirierten Zellen muss Glykogen hinzugefügt werden, um die Fällungseffizienz zu verbessern und die Visualisierung des Niederschlags zu erleichtern.
      3. Die Probe wird bei 12.000 × g 10 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand verworfen.
      4. Waschen Sie das Pellet 2x unter Zugabe von 500 mL 70%igem Ethanol und zentrifugieren Sie es 1 Minute lang bei 12.000 × g .
      5. Entsorgen Sie die Flüssigkeit und öffnen Sie den Deckel, um das Pellet 5 Minuten lang bei Raumtemperatur trocknen zu lassen.
      6. Fügen Sie 7 μl Wasser hinzu, um das Pellet aufzulösen. Führen Sie die reverse Transkription mit dem Erststrang-cDNA-Synthesekit gemäß dem detaillierten Protokoll in der Bedienungsanleitung durch.
      7. Amplifizieren Sie die gesamte kodierende Region mit geeigneten Primern (siehe Materialtabelle) und führen Sie eine Agaroseelektrophorese durch.
      8. Klonieren Sie die PCR-Produkte und sequenzieren Sie mindestens 30 Klone für jeden Embryo, um die in mRNAs aufgetretene Mutation zu analysieren.
        HINWEIS: Um zu bestätigen, dass das Vorhandensein eines defekten Phänotyps durch eine gezielte Mutation des interessierten mütterlichen Faktors verursacht wurde, sollten alle Embryonen (n > 5) mit defekten Phänotypen das Fehlen von Wildtyp-Muttertranskripten aufweisen. Umgekehrt sollten maternale Wildtyp-mRNAs in allen sich normal entwickelnden sgRNA-exprimierenden Embryonen vorhanden sein (n > 5). Gleichzeitig sind in sgRNA-negativen Embryonen nur Wildtyp-mRNAs nachweisbar (n > 5).

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Ergebnisse

Schnelle Generierung von rbm24a-Maternalmutanten
Wir haben einen transgenen Vektor konstruiert, der die Expression eines maternalen BFP-Markers und von vier hocheffizienten sgRNAs ermöglicht, die auf die rbm24a-kodierende Sequenz abzielen. Nach der Einführung dieses Vektors in homozygote rbm24a-RFP KIzpc:cas9-Embryonen mittels Tol2-Transposition konnte Mrbm24a aufgrund des Fehlens des Rbm24a-RFP-Proteins unter d...

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Diskussion

Letale zygotische Mutationen behindern die Analyse des mütterlichen Beitrags eines Gens. Alternative Strategien, vor allem Keimbahnersatz und Eizell-Mikroinjektion in situ (OMIS), sind technisch anspruchsvoll 6,8. Bei der Zelltransplantation des Keimbahnersatzes erhält der Empfängerembryo nur sehr wenige PGCs, was oft die normale Entwicklung des Weibchens verhindert 16,17,18.

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Offenlegungen

Dieses Protokoll wurde von der China National Intellectual Property Administration als Patent erteilt, die die eingeschränkte Verwendung des Verfahrens nach Einholung der Erlaubnis der Autoren aufheben wird. Die Autoren erklären, dass sie keine anderen konkurrierenden oder finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken Jianlin Shen, Yiteng Xu und Qingqing Wei von der Core Facility and Service Platform der School of Lifesciences. Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (Stipendien 32170816, 32370860, 32450630 und 31871451), dem Program of Outstanding Middle-aged and Young Scholars der Shandong University und den Taishan Scholars of Shandong Province.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2x M5 HiPer Taq PCR-MischungMei5bioKat#MF001-BD-100
AgaroseMDbioKat#A006L
AxyPrep Plasmid Miniprep KitAxygenKat#AP-MN-P-4
Instrument zur Kapillarelektrophorese (Qsep400)BiOptikN/A
DIG-EtikettiermischungRocheKatze#11277073910
DNase IRocheKatze#4716728001
DVB-TThermo Fisher ScientificKat#R0861
Erststrang-cDNA-SynthesekitTransGen BiotechKat#AT301
GenCrispr NLS-Cas9-NLS NukleaseGenScriptKat#Z03389
Glaskapillaren (1,0 x 100 mm)Fabrik für Bildungsausrüstung in RantaiKat#OS-2B
GlykogenBBI LebenswissenschaftenKat#28985
GraphPad Prism 9GraphPadhttps://www.graphpad.com/
BildJQuelloffenhttps://imagej.net/software/fiji/
Niedrigschmelzende AgaroseBiotechKat#CA1351
Mikroschmiede (MF2)NARISHIGEN/A
Mikro-Spektralphotometer (Nano-300)ALLSHENGN/A
OlyVIAOLYMPN/A
Penicillin-StreptomycinGibcoKatze#15140122
Pico-Liter-Injektor (PLI-100A)Harvard-ApparaturN/A
Spitze PinzetteWPIKatze#500341
Spitze Pinzette  WPI 500341
Abzieher (PC-100)NARISHIGEN/A
RiboLock RNase HemmerThermo Fisher ScientificKat#EO0381
rNTPThermo Fisher ScientificKat#R0481
Silizium-Hydroxyl-MagnetkügelchenSangon BiotechKat#B518720-0001
T7-RNA-PolymeraseSCHNABELKat#M0251L
ZoldWPICat# Z-Formen

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Genomeditierung beim Zebrab rfishoozytenspezifischer KnockoutTol2 freie Zebrab rfishDeletion maternaler FaktorenEmbryonen MikroinjektionZellaspirationfluoreszierender ProteinmarkerReverse Transkriptions PCR
Erzeugung von maternalen Mutanten mit zpc:cas9 Knock-in-Zebrafisch
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