Erzeugung von maternalen Mutanten mit zpc:cas9 Knock-in-Zebrafisch

Yizhuang Zhang; Ziping Fu; Boya Yang; Jiasheng Wang; Tong Lu; De-Li Shi; Ming Shao

doi:10.3791/68642

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Methodenartikel

Erzeugung von maternalen Mutanten mit zpc:cas9 Knock-in-Zebrafisch

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DOI:

10.3791/68642

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22. Juli 2025

Yizhuang Zhang¹ , Ziping Fu¹ , Boya Yang¹ , Jiasheng Wang¹ , Tong Lu¹ , De-Li Shi²^,³ , Ming Shao¹^,⁴^,⁵^,⁶

¹Shandong Provincial Key Laboratory of Animal Cell and Developmental Biology, School of Life Sciences Qilu Hospital (Qingdao), Cheeloo College of Medicine, Shandong University, ²Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), UMR CNRS 8263, INSERM U1345, Development, Adaptation and Ageing, Sorbonne Université, ³College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, ⁴Key Laboratory for Experimental Teratology of the Ministry of Education, Shandong University, ⁵State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, ⁶Shandong University-Yuanchen Joint Biomedical Technology Laboratory

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Generierung einer maternalen Mutante, das eine stabile zpc: cas9-Knock-in-Linie mit der Tol2-vermittelten Verabreichung von sgRNA-Expressionskassetten koppelt.

Zusammenfassung

Die Oogenese und die frühe Embryonalentwicklung sind entscheidend von mütterlichen mRNAs und Proteinen abhängig. Die Eliminierung dieser mütterlichen Faktoren erfordert homozygote Mutationen im weiblichen Zebrafisch, die oft zu letalen oder unfruchtbaren Phänotypen führen, die den Erwerb von mütterlichen mutierten Embryonen verhindern. Unsere früheren Arbeiten führten einen schnellen Ansatz zur Umgehung der zygotischen Letalität durch eizellspezifische Genomeditierung ein. Das zuvor beschriebene Cas9-Transgen weist jedoch eine Instabilität auf und erfährt über aufeinanderfolgende Generationen hinweg eine allmähliche Stilllegung. Darüber hinaus behindert das Vorhandensein von Tol2-transponierbaren Elementen, die die zpc:cas9-Kassette in dieser Linie flankieren, das Potenzial für eine weitere sgRNA-Transgenese unter Verwendung des Tol2-Systems, das derzeit das effizienteste transgene System im Zebrafisch ist. Folglich besteht ein dringender Bedarf an einer Tol2-freien Zebrafischlinie, die eine stabile und robuste Eizell-spezifische Cas9-Expression gewährleistet. Hier stellen wir eine Leitung mit zpccas9 Knock-in am rbm24a-Locus vor, die diese Anforderung erfüllt. Mit diesem verbesserten Werkzeug stellen wir eine Pipeline für die schnelle Generierung von maternalen Mutanten von Genen mit zygotisch letalen Mutanten-Phänotypen innerhalb des Zebrafischmodells zur Verfügung.

Einleitung

Die frühe Embryonalentwicklung von Wirbeltieren hängt stark von der RNA und den Proteinen ab, die in der Eizelle gespeichert sind und zusammen als maternale Faktoren bezeichnet werden. Diese Maternalprodukte werden überwiegend während des Diplotin-Stadiums der Meiose I^{synthetisiert I} ^1,2,3. Um ihre funktionelle Rolle zu untersuchen, ist es wichtig, homozygote mutierte weibliche Individuen zu erzeugen, da nur homozygote Mutationen in den Eizellen diese mütterlichen Faktoren vollständig abbauen können. Die Gewinnung solcher homozygoten mutierte....