Ein Mausmodell der neonatalen kontinuierlichen positiven Atemwegsdruckgabe und die präzise Lungenschnittmethode zur Messung der Kontraktilität der Atemwege

Zusammenfassung

Wir demonstrieren eine nicht-invasive Methode zur Verabreichung unterschiedlicher CPAP-Mengen an unbefriedigte neonatale Mäuse. Die Technik soll die Verabreichung von CPAP bei vielen Frühgeborenen teilweise nachahmen, um deren Auswirkungen auf die Lungenentwicklung zu bewerten. Wir zeigen außerdem die Auswirkungen von CPAP auf die Kontraktilität der Atemwege mit der Präzisions-Lungenschnitt-Methode.

Zusammenfassung

Mechanische Kräfte, die mit der positiven Atemunterstützung in der Intensivpflege von Frühgeborenen verbunden sind, können sowohl positive als auch unbeabsichtigte Folgen für die Lungenentwicklung haben. Positive Druck-Unterstützung verbessert den Lungengasaustausch, begrenzt die Atelektase und verbessert die systemische Sauerstoffversorgung, aber auch die schädlichen Auswirkungen invasiver Methoden wie der mechanischen Beatmung auf die Lungenentwicklung sind gut bekannt. Allerdings gibt es große Lücken in unserem Verständnis der negativen Auswirkungen weniger invasiver Beatmungsmethoden. Hier ist der kontinuierliche positive Atemwegsdruck (CPAP) eine der gebräuchlichsten Atemunterstützungsmodalitäten und stellt die am wenigsten invasive des positiven Druckspektrums dar. Eine wesentliche Einschränkung bei der Untersuchung der menschlichen Atemwegsentwicklung ist das Fehlen altersgerechter Modelle und die Möglichkeit, CPAP kleinen Neugeborenen zu verabreichen. Wir lösten dieses Problem, indem wir ein Mausmodell von neonatalem CPAP entwickelten, das täglich an wache, nicht narkosisierte Neugeborene verabreicht wurde – ein Modell, das klinisch relevante CPAP-Werte in einem Stadium der Mauslungenentwicklung nutzt, das mit Frühgeborenen korrespondiert, wenn sie wahrscheinlich CPAP auf der Intensivstation erhalten. Hier demonstrieren wir unser CPAP-Modell, das ein praktisches, maßgeschneidertes System beinhaltet, das CPAP nicht-invasiv an das nicht betäubte Neugeborene mit leicht einstellbaren Werten liefern kann. Wir bieten außerdem eine Demonstration der Methode des präzisen Lungenschnitts zur Messung der Atemwegshyperreaktivität ex vivo. Das PCLS wird hier beschrieben, weil es eine bequeme funktionale Auslesung des Lungensystems bietet, was in kleinen (neonatalen) Tiermodellen technisch anspruchsvoll sein kann, und zudem auf andere Modelle anwendbar ist, die nicht mit CPAP verwandt sind. Wir zeigen Daten, die zeigen, dass CPAP eine Hyperreaktivität der Atemwege hervorruft, was wichtige klinische Auswirkungen auf die Wahl der Atemunterstützungsmodalität in der Intensivpflege von Frühgeborenen haben könnte.

Einleitung

Atemwegsbedingte Beschwerden wie Apnoe und Atemnot erfordern bei vielen Frühgeborenen lebensrettende Atemunterstützungsmethoden, die leider zur Morbidität des Säuglings und zu längeren Krankenhausaufenthalten beitragen. Ergänzende_O2- und positive Atemunterstützung, einschließlich mechanischer Beatmung (MV) und weniger invasiver CPAP, sind gängige Atemunterstützungsmethoden. Das größte kurz- und langfristige Problem für Überlebende der kritischen Phase der Frühgeburt bleibt jedoch die chronische Bronchial-Atemwegserkrankung ^1,2,3,4, die sich in lebenslangem Keuchen/Asthma, schlechter Lungenfunktion und verminderter Bewegungskapazität äußert. Obwohl die schädlichen Auswirkungen von zusätzlichem _O2 und MV seit Jahrzehnten weitgehend in Verbindung mit der Pathogenese der bronchopulmonalen Dysplasie (BPD) und langfristigen respiratorischen Morbiditäten in Verbindung gebracht ^werden, deuten einige Hinweise darauf hin, dass ^{nicht-invasive} Formen der Atemunterstützung wie CPAP ebenfalls unbeabsichtigte Auswirkungen auf die sich entwickelnde Lunge haben könnten^{.11, 12}. Über die Nebenwirkungen von CPAP ist jedoch nur sehr wenig bekannt, vor allem aufgrund der technischen Herausforderungen bei der nicht-invasiven Verabreichung an Neugeborenen.

Angesichts der insgesamt steigenden Rate von pädiatrischem Asthma¹³ und der erhöhten Überlebensraten von Frühgeborenen nach dem Aufenthalt auf der Neugeborenenstation, um die Mechanismen zu bewirken, die nachteilige strukturelle und funktionelle Veränderungen der unreifen tracheobronchialen Atemwege auslösen und wie sie unabhängig von ergänzendem_O2 zu lebenslangen Lungenerkrankungen beitragen ist ein wichtiger, unerfüllter klinischer und forschungsbezogener Bedarf. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass neonatales CPAP langfristig negative Auswirkungen auf die Atemwegsfunktion haben und zu Keuchen-Störungen beitragen kann, was bedeutsam ist, da CPAP zur bevorzugten Atemunterstützungsmethode geworden ist, um O-2-Toxizität durch zusätzliches_{O2-Medikament} zu vermeiden. Die technischen Herausforderungen bei der Verabreichung von CPAP an kleine und altersgerechte Neugeborenentiere haben den Fortschritt im Verständnis der CPAP-Effekte (ob vorteilhaft oder schädlich) auf die Lungenentwicklung behindert. Wir lösten dieses Problem, indem wir das erste neonatale Mausmodell von CPAP 10,11,12,14,15 entwickelten, das täglich (mit unterschiedlichen CPAP-Werten für 3 Stunden/Tag) an wachen, nicht anästhesierten Mäuse ab der Geburt geliefert wurde, wodurch die Untersuchung klinisch relevanter CPAP-Niveaus in einer Lungenentwicklungsphase ermöglicht wurde, die mit sehr frühgeborenen (~24-28 Wochen Fötus) vergleichbaren Säuglingen, die wahrscheinlich CPAP¹⁶ erhalten^{, 17}. Wir haben MRT-Scans im neonatalen Mausmodell durchgeführt und bestätigt, dass CPAP zu einer Lungeninflation¹¹ führt und dass CPAP in der ersten postnatalen Woche eine langfristige (3 Wochen) Erhöhung der Atemwegsreaktivität (d. h. 2 Wochen nach CPAP^{) verursacht, was} mit Keuchen bei Kleinkindern (3–4 Jahre alt) übereinstimmt. Hier bieten wir eine detaillierte Demonstration unseres maßgefertigten CPAP-Systems für Neugeborene und beschreiben eine praktische Methode zur Beurteilung der Atemwegskontraktilität mit der ex vivo Precision Lung Slice Method (PCLS).

Das PCLS bietet eine ausgezeichnete und bequeme Gelegenheit, die Mechanismen der Atemwegshyperreaktivität und deren jeweiligen Wege zu untersuchen. Mit der PCLS-Methode werden einzelne Atemwege in Echtzeit abgebildet, um die Verengung der Atemwege als Reaktion auf einen Bronchokonstriktor wie Methacholin zu messen, nachdem die Atemwege mit bestimmten Rezeptor-/Kanalinhibitoren vorbehandelt wurden. Diese Studien sind wichtig, um die pathophysiologischen Folgen von CPAP im Frühgeburt zu verstehen und zielgerichtete und umsetzbare Interventionen bereitzustellen, die eine Optimierung der notwendigen klinischen Versorgung ermöglichen und gleichzeitig potenzielle lebenslange Folgen mindern.

Protokoll

Experimente werden an zeitschwangeren Mäusen durchgeführt, die täglich überwacht werden, um den Geburtstag zu bestimmen. Mäuse werden in der ersten Woche nach der Geburt mit oder ohne CPAP in 21%_O2 behandelt. Typischerweise werden die Lungen zur Vorbereitung auf die Messung der AW-Reaktivität mit der Präzisionslungenschnitt-(PCLS)-Methode zwei Wochen nach CPAP entfernt, obwohl solche Messungen bereits ab P8 Tagen (unmittelbar nach CPAP) oder bis ins Erwachsenenalter möglich sind. Alle Verfahren wurden gemäß den Richtlinien des National Institute of Health (NIH) für die Pflege und Nutzung von Labortieren durchgeführt und vom Animal Care and Use Committee der Case Western Reserve University genehmigt.

1. Zusammenstellung der CPAP-Maske

1. Bauen Sie eine einzelne Maske aus dem abgeschnittenen Ende einer 5-mL-Spritze, die den Luer-Lock-Abschnitt enthält, um die Verbindung von Rohren zu ermöglichen, um Luftstrom und positiven Druck in die Atemwege der Maus zu ermöglichen (Abbildung 1A).
2. Bohren Sie die Spritzenkomponente der Maske vor, um eine mit Gewinde verbundene Luer-Lock, Luer-zu-Schlauch-Barb-Fitting und Standard-Aquarienschlauch (3/8" Durchmesser) aufzunehmen.
3. Verwenden Sie das Seitenanschlussrohr, um den ausströmenden Luftstrom durch ein stromabwärts einstellbares Leck zu lassen, um den Gegendruck in die Lunge der Maus zu setzen, sowie ein maßgefertigtes Manometer, um den CPAP-Pegel in Echtzeit zu überwachen.

2. Kragendesign

1. Baue den Kragen aus abgeschnittenen Fingerspitzenabschnitten kleiner Standard-Laborhandschuhe. Benutze es, um die Maus mit der Maskeneinheit zu verbinden.
2. Verwenden Sie einen Lochstanzer (1/4 Zoll), um ein Loch an der Spitze der abgeschnittenen Fingerspitze zu schaffen, das eine gleichmäßige und gleichmäßige Öffnung bildet, um Gesicht und Kopf der Maus aufzunehmen.
   HINWEIS: Der Lochstanzer sorgt für eine konstante Maskengröße, aber größere Lochstanzer werden um P4 benötigt, um das Wachstum der Maus aufzunehmen.

3. Bau des Manometers

1. Bauen Sie ein Manometer aus zwei einweggefährden serologischen Pipets, die über gebogenen Aquarienschlauch verbunden sind (Abbildung 1A). Stellen Sie sicher, dass das Manometer halb mit Wasser gefüllt ist, das einen Tropfen farbigen Farbstoffs enthält, um die Visualisierung des CPAP-Niveaus zu erleichtern.
2. Verbinden Sie das Manometer in Reihe mit und stromabwärts von einem Durchflussregler (Durchflussrate ~600-700 mL/min) und der Maske.

4. Anbringen von Halsband und Maske an der Maus

1. Um das Halsband an der Maus (1 Tag alt) anzubringen, wird es zuerst auf das offene Ende der Maske gelegt, das durch vorsichtiges Manövrieren gestreckt werden muss, damit es Gesicht und Kopf der Maus aufnehmen kann.
2. Führe das Gesicht der Maus durch die Öffnung des Halsbands, das sanft aus seiner gestreckten Position über Gesicht/Kopf entspannt wird. Im Alter von ~4 Tagen schneiden Sie kleine Schlitze in die Öffnung des Kragens, um Wachstum und den größeren Mauskopf aufzunehmen, wobei auch ein größerer Ganzschlag empfohlen wird.

5. CPAP gleichzeitig an mehrere Mäuse verabreichen

1. Ein System bauen, das CPAP an mehrere (bis zu 10) Neugeborenenmäuse liefern kann, indem man eine Reihe von Durchflussreglern und Manometern verwendet (Abbildung 1B). Stellen Sie den Luftstrom stromaufwärts durch einen normalen Lufttank mit einem Standardregler bereit und leiten Sie ihn durch einen Durchflussregler, der den Gesamtstrom an alle CPAP-Geräte und Masken-/Halsbandeinheiten liefert.
2. Blasen Sie die Luft in einem Wasserreservoir zur Befeuchtung, bevor Sie sie direkt an die CPAP-Einheiten leiten, und geben Sie jedem Tier unabhängig davon CPAP.
   HINWEIS: Eine Steuermaus erhält eine Maske, denselben Luftstrom, aber ohne Gegendruck oder CPAP.
3. Führen Sie alle Experimente auf einer Wärmeplatte mit rezirkuliertem Wasser bei ~38 ^°C durch, um eine stabile Körpertemperatur zu halten.

6. Zeitleiste

1. Überwachen Sie die trächtigen Mäuse täglich, um das Geburtsdatum zu bestimmen, und führen Sie dann am folgenden Tag (P1 Tage im Lebensalter) die erste CPAP-Sitzung für 2 Stunden durch (Abbildung 2), um die Zeit zu minimieren, in der die Welpen von einer säugenden Mutter getrennt sind.
2. Für die folgenden Tage (P2-P7) führen Sie jede CPAP-Sitzung für eine Dauer von 3 Stunden durch. Führen Sie CPAP länger als 7 Tage durch, falls nötig, und auf einem bestimmten CPAP-Niveau, obwohl 7 Tage CPAP bei 6 cmH₂O routinemäßig verwendet werden.
3. Anschließend werden die Tiere auf die Auswirkungen von CPAP auf die Atemwegsreaktivität untersucht, entweder unmittelbar nach (P8) nach dem Ende von CPAP (P7) oder längerfristigen Effekten (z. B. P21 oder im Erwachsenenalter) mit der präzisen Lungenschnitt-Vorbereitung (Abschnitt 8).

7. Gewebeentnahme und Atemwegskontraktilität

1. Lungen werden für molekulare oder physiologische Techniken entnommen (z. B. Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Western Blots, Immunhistochemie, RNASeq, Proteomik, Metabolomik usw.).
   HINWEIS: Der Hauptfokus liegt auf den Auswirkungen von CPAP auf die Kontraktilität der Atemwege, die in vivo (betäubt und mechanisch beatmet, P21 Tage oder älter) für die Atmungsmechanik oder ex vivo mit dem PCLS (P8 Tage oder älter) bewertet werden kann. Letzteres hat große Vorteile bei der Untersuchung von Verbindungen oder Wirkstoffen, die bestimmte Signalwege anvisieren, die möglicherweise nicht für den Einsatz in vivo-Studien geeignet sind.

8. Ganzlungenextraktion/-vorbereitung für die Präzisionslungenschnittmethode (PCLS)

1. Die Maus wird durch eine Anästhesie-Überdosis (intraperitoneale Injektion einer Ketamin/Xylazin-Mischung; 100 mg/kg/10 mg/kg) eingeschläfert, um die Lunge auf ex-vivo-Messungen der Atemwegsreaktivität auf im Bad aufgetragenes Methacholin vorzubereiten.
2. Legen Sie die Mauslehne zur Kanüle der Luftröhre mit einer mit Agarose gefüllten Spritze hin. Führe die Kanüle durch einen kleinen ventralen Halsschnitt ein und schiebe sie ~3 mm vor, bevor sie mit einer Naht befestigt wird.
3. Injizieren Sie vorsichtig verflüssigte Agarose (40 °C), um die Lunge aufzublasen (0,4 ml bei P8-Mäusen; 0,8 ml für P21-Mäuse), und stellen Sie die Maus für 30 Minuten in den Kühlschrank, damit die Agarose abkühlen und gelieren kann.

9. Lungenschnitt für die PCLS-Methode

1. Sobald das Agarose abgekühlt ist, sollte ein Lungenlappen (nach Wahl) in 2 % Agarose eingebettet werden, auf ein Vibratom gelegt werden, in 300 μm große Abschnitte zerschneiden und in DMEM + Pen/Strep-Lösung für die Übernachtung eingetaucht werden (5 % CO2_, 37 °C).
2. Am folgenden Tag spülen Sie die Lungenscheiben in HBSS und bringen Sie sie in eine Aufzeichnungskammer an, um Live-Aufnahmen der Atemwegsreaktionen auf Methacholin-Herausforderungen zu ermöglichen.
   HINWEIS: Die präsentierten Ergebnisse zeigen naive (Kontroll, d. h. kein CPAP) und nur CPAP-Behandlung, und es werden keine Agonisten oder Antagonisten/Inhibitoren verwendet.
   1. Führen Sie Atemwegsbildgebung durch.
      1. Legen Sie die Lungenscheiben auf eine maßgefertigte Perfusionskammer und bedecken Sie sie mit einem dünnen, leichten Netz und einem Deckglied, die mit Silikonfett fixiert werden.
      2. Anschließend wird die Aufzeichnungskammer mit dem Schnitt auf ein Mikroskop montiert und (7 mL/min) kontinuierlich mit HBSS bei Raumtemperatur mit einer Perfusionspumpe perfuziert.
      3. Verwenden Sie ein Mikroskop, das mit einer Kamera montiert ist, um einzelne Atemwege zu identifizieren. Nach einer anfänglichen 3-minütigen Phase der Basiserfassung wird die Kammer mit steigenden Methacholinkonzentrationen (jeweils 2 Minuten pro Konzentration) perfundiert und Veränderungen im Lumenbereich der Atemwege kontinuierlich erfasst.
   2. Quantifizieren Sie die Atemweggröße.
      1. Identifizieren Sie ein einzelnes Bild (ImageJ-Software) eines Atemwegs für eine bestimmte Methacholinkonzentration (und Basis) und quantifizieren Sie die Lumenfläche, indem Sie den Anpassungsschwellenwert auswählen, um sicherzustellen, dass die Lumenfläche vollständig erfasst wird (Abbildung 3A).
      2. Dann wenden Sie diese Einstellungen auf nachfolgende Bilder derselben Atemwege bei unterschiedlichen Konzentrationen an (d. h. der gleiche Schwellenwert wird für einen bestimmten Atemweg verwendet).
      3. Wählen Sie dann die Lumenfläche zur Messung mit dem Wand-Tracing-Tool (Abbildung 3B) aus und drücken Sie Strg + M (Abbildung 3C), um die Lumenfläche automatisch in Pixeln zu quantifizieren. Wiederhole dies für jede Methacholinkonzentration; die Daten sind numerisch für eine grafische Darstellung verfügbar, wobei die Atemwegsreaktivität als Bruchteil der Ausgangslumengröße angegeben wird (Abbildung 3).
   3. Stichprobengröße
      1. Wählen Sie die Atemwege zufällig aus und führen Sie die Methacholin-Reaktion an einem AW/Lungenabschnitt durch, wobei typischerweise mehrere Schnitte pro Tier bewertet werden können. Daher können Behandlungsgruppen aus mehreren Atemwegen/Tieren aus mehreren Würfen bestehen.
      2. Kategorisieren Sie Atemwege in große (>0,05 mm²) oder kleine (<0,05 mm²), da bereits festgestellt wurde, dass CPAP Atemwege unterschiedlicher Größe betrifft.

10. Medikamentenabgabe

1. Analysieren Sie mit Schnitten, die mit siRNAs, die bestimmte Signalwege anvisieren oder inkubiert sind, 48 Stunden nach der Entfernung und Sektionierung.
   HINWEIS: Agonisten und Antagonisten, die spezifisch für verschiedene Rezeptoren sind, können ebenfalls bequem akut auf die Lungenabschnitte angewendet werden, was ein Vorteil ist, wenn solche Verbindungen nicht geeignet oder sicher für die In-vivo-Anwendung sind.
2. Alternativ können Lungen bei standardisierten Inflationsdrücken (25 cmH₂O) fixiert werden, erhalten und für die Immunhistochemie und Färbung für spätere Analysen mittels Konfokalmikroskopie vorbereitet werden.

Ergebnisse

MRT-Analyse des Lungenvolumens während neonataler CPAP
MRT-Analysen wurden verwendet, um Veränderungen des Lungenvolumens bei dreitägigen, nicht betäubten, spontan atmenden Mäusen zu visualisieren (n = 4 Mäuse). Das Lungenvolumen stieg mit steigenden Inflationsdrücken (d. h. CPAP) bis zu 9 cmH₂O (Abbildung 4A). Repräsentative Bilder einer 3 Tage alten Maus bei 0 und 6 cmH₂O CPAP sind ebenfalls zu sehen (

Diskussion

CPAP ist eine notwendige Atemunterstützungsmethode für Frühgeborene mit Atemnot. CPAP wird auf die spontane Atmung gelegt und dient dazu, die systemische Sauerstoffversorgung zu verbessern, indem es das Lungenvolumen erhöht hält und Alveolarkollaps und Atelektase verhindert. Daher gibt es erhebliche lebensrettende Vorteile von CPAP, und es wurde gezeigt, dass es die Alveolarentwicklung verbessert, obwohl die Vorteile von der Schwere und Dauer von CPAP

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
5-mL-Spritze	Fisher Scientific	149556458
1-mL-Spritze	Fisher Scientific	309659	Agarose durch die Kanüle injizieren
1/4" Lochlochstanzer	McMaster Carr	3427A57
22 x 22 x 20 Einbettungsformen	Fisher Scientific	22-19
23-G-Nadeln	Fisher Scientific	305193	Um die Kanüle an die Spritze zu befestigen, wären für andere Altersgruppen als P21  andere Größen erforderlich;
2-mL serologische Pipetten	Fisher Scientific	13-678-12c	Zur Herstellung von Moanometer
Verstellbare Leckventile	Irgendein Zoofachgeschäft		https://www.petco.com/shop/ en/petcostore/product/imagi Tarium-Luftsteuerungsventil
Aquarienschlauch	Irgendein Zoofachgeschäft		https://www.petsmart.com/fish/ Filter-und-Pumpen/Luft-und-Wasser -Pumpen/Top-Fin-Aquarium-Luftgesellschaft -tubing-5291863.html
Kamera	Amscope	MU300
Kanülschläuche	Fisher Scientific	427411	Für P21-Mäuse. Andere Größen werden für andere Altersgruppen benötigt.   Der Schlauch sollte eng in die Luftröhre passen
Deckzettel	Fisher Scientific	12-541-014	18 mm x 18 mm
DMEM:F12	Invitrogen	11039-021
Durchflussregler	Wichtige Instrumente	GS10510AVB	Für den Luftstrom zu einzelnen Mäusen
Durchflussmesser	Avantor	MFLX68560-04	Für den Luftstrom zum gesamten System
Gaymar T-Pumpe	Braintree Scientific	TP-700	Zur Erhaltung der Körpertemperatur während CPAP
Hanks ausgewogene Salzlösung	Fisher Scientific	MT-20023cv	Verdünnen auf 1x für die Verwendung
ImageJ	NIH	Kostenloser Download	https://imagej.net/ij/download.html
Latexhandschuhe Größe klein	Fisher Scientific	MF-300-S	Zum Anfertigen von CPAP-Masken
Niedriger Metlingpunkt-Agarose	Invitrogen	165200-100
Mesh	Amazon		https://www.amazon.com/Top- Trimming-Polyester-Horsehair -selling/dp/B01AC93LJ0/ref=sr _1_fkmr2_1?keywords=dritz%2 Bpolyester%2Bhorsehair%2Bbr aid& qid=1562072725& s=gatew ay& sr=8-1-fkmr2& th=1
Methacholin	Millipore	A2251
Mikroskop	Leica	DMLFS
Pen/Streptokokken	Invitrogen	15140-148
Perfusionspumpe	Harvard-Apparat	70-2027
Aufnahmekammer	Warner-Instrumente	RC-27	Oder ähnlich
Wiederverwendbares Heizkissen	Braintree Scientific	TP-R	Zur Verwendung mit der Gaymar T-Pumpe
Silikonfett (Molykote111)	Amazon		https://www.amazon.com/Molykote -Schmierstoffkomponenten-Resistent- Flüchtigkeit/dp/B0DYDFLXGZ/ref=sr_1 _1_sspa?crid=2D4LQC7SRX07P& dib=eyJ2IjoiMSJ9.HcWWXlt8ThxcB eGCZ6iH5jwumyClyFGkW141klcjnn OH3hc60r0hy53Ji-9HDW0TtH33nJ- 7UmalEzJGg59qB2gzsGNzFMelw
Sterile 6-Wellplatten	Fisher Scientific	3516	Zum Kultivieren von Scheiben
Nahtfaden 3-0	Fisher Scientific	sp117	Um die Kanüle in die Luftröhre zu binden
Rohranschlüsse	Harvard-Apparat	72-1406
Vibratom (Becken-Easylislicer)	Ted Pella	11000	Oder äquivalent