Regulation des epithelial-mesenchymalen Übergangs bei Eierstockkrebs durch LncRNA MALAT1 über SNAI2 und MiR-200c-3p

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Bewertung der Rolle von MALAT1 bei der Förderung des epithelial-mesenchymalen Übergangs bei epithelialem Ovarialkarzinom durch seine Regulation der miR-200c-3p/SNAI2-Achse.

Zusammenfassung

Die lange nicht-kodierende RNA MALAT1 reguliert den epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) und die Metastasierung bei epithelialem Ovarialkarzinom (EOC) durch einen konkurrierenden endogenen RNA (ceRNA)-Mechanismus, der miRNA-Modulation beinhaltet. Ziel dieser Studie war es, den molekularen Signalweg aufzuklären, über den MALAT1 das EMT- und Metastasierungsverhalten über die Interaktion mit miR-200c-3p und SNAI2 beeinflusst. Die MALAT1-Expression wurde in der EOC-Zelllinie SK-OV-3 entweder durch Überexpression oder durch Knockdown genetisch manipuliert. Die funktionellen Auswirkungen auf die EMT-bezogenen Proteinspiegel, die Zellmigration und die Invasion wurden mit Western Blotting, Wundheilung bzw. Transwell-Assays bewertet. Bioinformatische Analysen identifizierten miR-200c-3p als gemeinsames Ziel von MALAT1 und SNAI2. Die MALAT1/miR-200c-3p/SNAI2-Achse wurde durch Dual-Luciferase-Reporter-Assays und Immunfluoreszenzfärbung weiter validiert, um direkte molekulare Wechselwirkungen zu bestätigen. Die Überexpression von MALAT1 erhöhte die SK-OV-3-Zellmigration um 20% und die Invasion um 5%, begleitet von einem signifikanten Anstieg der SNAI2-Expression (P < 0,01). Umgekehrt unterdrückte der MALAT1-Knockdown diese Phänotypen. Dual-Luciferase-Assays bestätigten, dass miR-200c-3p direkt an MALAT1 und SNAI2 bindet (P < 0,001). Die Überexpression von miR-200c-3p reduzierte die MALAT1-gesteuerte EMT durch Herunterregulierung von SNAI2 (P < 0,05), während die Wiederherstellung von SNAI2 die inhibitorischen Effekte des MALAT1-Silencings auf die Metastasierung umkehrte. Dieses Protokoll zeigt, dass MALAT1 EMT und Metastasierung in EOC fördert, indem es als ceRNA fungiert, die miR-200c-3p sequestriert, was zu einer Derepression von SNAI2 führt. Die Ergebnisse liefern einen neuen mechanistischen Einblick und identifizieren die MALAT1/miR-200c-3p/SNAI2-Achse als potenzielles therapeutisches Ziel zur Hemmung der Metastasierung von Eierstockkrebs.

Einleitung

Eierstockkrebs (OvCa) ist eine sehr heimtückische und spät diagnostizierte bösartige Erkrankung. Sie schreitet in der Regel asymptomatisch fort, bis sie spätere Stadien erreicht, die durch aggressives Wachstum vor allem in der Bauchhöhle gekennzeichnet sind. Dieser pathologische Prozess zeigt sich typischerweise mit Aszites, vermindertem therapeutischem Ansprechen und einer schlechten Prognose¹. Epidemiologische Statistiken aus dem Jahr 2018 zeigten weltweit etwa 295.000 neu diagnostizierte Fälle mit 185.000 Todesfällen, was einen anhaltenden Aufwärtstrend bei der Krankheitslast widerspiegelt². Obwohl moderne Behandlungsprotokolle chirurgische Eingriffe und pharmakologische Schemata beinhalten, halten die anhaltenden Einschränkungen bei der Früherkennung in Kombination mit Metastasen und therapeutischer Resistenz die Langzeitüberlebensraten unter 45 %³. Ein Rezidiv innerhalb von 12-18 Monaten wird häufig bei vielen Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung beobachtet⁴. Diese klinischen Realitäten unterstreichen die dringende Notwendigkeit, klinisch relevante diagnostische Marker und therapeutische Überwachungsstrategien zu identifizieren. Daher ist es wertvoll für die Identifizierung klinisch relevanter diagnostischer Marker.

Aktuell haben Forscher herausgefunden, dass ein erheblicher Teil des menschlichen Genoms lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs) ^erzeugt5. LncRNAs kodieren nicht für Proteine, sondern liegen ausschließlich in RNA-Form vor und spielen eine regulatorische Rolle bei verschiedenen biologischen Funktionen von Zellen. LncRNAs weisen eine Nichtkonservierung auf und weisen hochgradig gewebespezifische Expressionsmuster auf⁶. Bemerkenswert ist, dass eine spezifische Überexpression von lncRNAs in mehreren Krebsgeweben beobachtet^{wurde 7}. Der konkurrierende endogene RNA (ceRNA)-Mechanismus hat einen neuen Modus der RNA-Interaktion aufgedeckt. Es ist allgemein bekannt, dass microRNAs (miRNAs) Gene durch sequenzspezifische Wechselwirkungen mit 3'untranslatierten Regionen (UTR) der mRNA zum Schweigen bringen können. In der Zwischenzeit können nicht-kodierende RNAs (ncRNAs) kompetitiv an miRNA binden, wodurch ihre Fähigkeit, sich an Zielgene zu binden, behindert und die Genexpression beeinflusst^{wird 8}. Der ceRNA-Mechanismus ist derzeit die am weitesten verbreitete Hypothese für die regulatorische Rolle von lncRNAs. Die dreigliedrige Wechselwirkung zwischen kodierenden Transkripten, miRNAs und regulatorischen RNAs konstruiert komplizierte molekulare Netzwerke, die die Tumorinitiierung und -progression beeinflussen⁹.

MALAT1 wurde erstmals in nicht-kleinzelligen Lungenkrebsmetastasen identifiziert und hat sich als stark überexprimierte lncRNA bei zahlreichen Malignomen erwiesen¹⁰. In unseren früheren Studien haben wir eine erhöhte Expression von MALAT1 in OvCa-Geweben identifiziert, die direkt mit dem OvCa-Staging assoziiert^{ist 11}. Hier stellen wir ein Protokoll zur genetischen Modulation der MALAT1-Expression in der epithelialen OvCa (EOC)-Zelllinie SK-OV-3 vor und bewerten deren Einfluss auf die epithelial-mesenchymale Transition (EMT)-bezogene Proteinexpression, die Migrationskapazität und das invasive Potenzial mittels molekularer Assays wie qPCR, Western Blotting, Dual-Luciferase-Reporter-Assays und funktionellen Assays wie Wundheilungsassays und Transwell-Assays. Ziel ist es, den molekularen Mechanismus aufzuklären, durch den MALAT1 die EMT und die Metastasierung in EOC durch Wechselwirkungen mit miR-200c-3p und SNAI2 reguliert.

Bestehende Methoden zur Untersuchung von lncRNA-miRNA-Wechselwirkungen verwenden oft nur In-silico-Vorhersagewerkzeuge , die möglicherweise nicht experimentell validiert sind. Für EMT-Regulationsstudien liefern traditionelle histologische Methoden möglicherweise keine detaillierten molekularen Einblicke. Durch den Einsatz von Dual-Luciferase-Reporter-Assays zur experimentellen Validierung überwindet unsere Studie diese Einschränkungen und bietet eine zuverlässigere Bestätigung der vorhergesagten Wechselwirkungen. Darüber hinaus ermöglicht die Kombination mehrerer funktioneller Assays, wie z. B. Scratch- und Transwell-Assays, neben molekularen Techniken ein umfassendes Verständnis von EMT sowohl auf zellulärer als auch auf molekularer Ebene und übertrifft die Tiefe von Single-Assay-Ansätzen.

Protokoll

Zellkultur und Transfektion

Die humane OvCa-Zelllinie SK-OV-3 wurde unter Standardbedingungen kultiviert. Die Zellen wurden in einem Kulturmedium aufbewahrt, das zu 89 % aus McCoy's 5A, zu 10 % aus fötalem Rinderserum und zu 1 % aus Penicillin-Streptomycin-Lösung bestand, in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂. Das Medium wurde alle 2-3 Tage ausgetauscht und die Zellen wurden bei Erreichen einer Konfluenz von 80-90 % mit 0,25 % Trypsin-EDTA passageiert. Lentivirale Konstrukte für MALAT1-Überexpression und MALAT1-Knockdown (shRNA) sowie miR-200c-3p-Mimik-, Inhibitor- und Negativkontrollen wurden zusammen mit SNAI2-targeting-siRNA und der entsprechenden Kontroll-siRNA aus kommerziellen Quellen gewonnen. Für die Transfektion wurden SK-OV-3-Zellen in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen/Well in 500 μl vollständigem Medium ausgesät und über Nacht haften gelassen. Die Transfektionen wurden mit einem lipidbasierten Transfektionsreagenz (RRID: AB_2548650) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, Nukleinsäuren (miRNA-Mimics/Inhibitoren oder siRNAs) und ein lipidbasiertes Transfektionsreagenz wurden separat in reduziertem Serummedium verdünnt, 5 Minuten lang inkubiert, dann miteinander vermischt und weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um eine Komplexierung zu ermöglichen. Die Komplexe wurden tropfenweise in die Zellen gegeben. Nach 6 h wurde das Medium durch frisches vollständiges Medium ersetzt. Die Zellen wurden 24-48 Stunden nach der Transfektion für nachgelagerte Analysen geerntet.

Quantitative Fluoreszenz-PCR in Echtzeit (qPCR)

Die Gesamt-RNA wurde aus kultivierten SK-OV-3-Zellen unter Verwendung des RNA-Extraktionsreagenzes gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Kurz gesagt, die Zellen wurden in 1 ml Reagenz pro Vertiefung einer 6-Well-Platte lysiert, und die RNA wurde mit einem kommerziellen RNA-Extraktionskit nach dem bereitgestellten Protokoll isoliert. Die RNA-Konzentration und -Reinheit wurden mit einem Spektralphotometer bestimmt, und Proben mit einem A₂₆₀/A_{280-Verhältnis} zwischen 1,8 und 2,0 wurden für Downstream-Anwendungen verwendet. Die reverse Transkription wurde unter Verwendung des RT Master Mix (RRID: SCR_018597) mit 500 ng Gesamt-RNA in einem Reaktionsvolumen von 20 μl durchgeführt. Die thermischen Zyklusbedingungen waren wie folgt: 37 °C für 15 min, gefolgt von 85 °C für 5 s, um die reverse Transkriptase zu inaktivieren. Die resultierende cDNA wurde bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert. Die quantitative real-time PCR wurde unter Verwendung eines kommerziellen miRNA qRT-PCR-Nachweiskits auf einem real-time PCR-Instrument durchgeführt. Jede Reaktion wurde in einem 20-μl-Volumen durchgeführt, das 10 μl 2x qPCR-Mastermix, 1 μl spezifische Primer (vorwärts und rückwärts, 10 μM), 2 μl cDNA-Template und 7 μl RNase-freies Wasser enthielt. Die Temperaturwechselbedingungen waren: 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen von 95 °C für 10 s und 60 °C für 30 s. Zur Überprüfung der Produktspezifität wurde eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt. Die Expressionsniveaus wurden mit der ΔΔCt-Methode berechnet, wobei GAPDH (für mRNA) oder U6 (für miRNA) als interne Kontrollen dienten. Alle Reaktionen wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, und die Daten werden als mittlere ± SD dargestellt.
HINWEIS: Das RNA-Extraktionsreagenz ist eine gefährliche Chemikalie. Es sollte in einem Abzug gehandhabt werden, da es ätzend ist und Haut- und Augenreizungen verursachen kann. Abfälle, die das Reagenz enthalten, sollten gemäß den örtlichen Vorschriften zur Entsorgung gefährlicher Abfälle entsorgt werden.

Scratch-Assay

SK-OV-3-Zellen wurden in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen/Well ausgesät und kultiviert, bis sie eine Konfluenz von etwa 90-100 % erreichten und eine einheitliche Monoschicht bildeten. Eine sterile 10-μl-Pipettenspitze wurde dann verwendet, um einen linearen Kratzer durch die Zellmonoschicht in der Mitte jeder Vertiefung zu erzeugen. Um die Konsistenz zu gewährleisten, wurde bei der Kratzbildung in allen Vertiefungen der gleiche Winkel und Druck ausgeübt. Nach dem Kratzen wurde PBS zugegeben, um abgelöste Zellen mit zwei sanften Wäschen zu entfernen. Die Zellen wurden dann in serumfreiem McCoy's 5A-Medium kultiviert, um Proliferationseffekte zu minimieren. Die Bilder des Kratzbereichs wurden sofort (0 h) und erneut nach 24 h und 48 h mit einem inversen Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung aufgenommen. Die Breite des Kratzers zu jedem Zeitpunkt wurde mit der ImageJ-Software gemessen und der Prozentsatz des Wundverschlusses im Vergleich zur ursprünglichen Breite, die zur Berechnung der Migrationsrate verwendet wurde.

Transwell-Assay

SK-OV-3-Zellen wurden in die oberen Kammern der Transwell-Inserts ausgesät (die obere Kammer enthält 200 μl 1 % vollständiges Medium, die untere Kammer enthält 1 ml 5 % vollständiges Medium) mit einer Dichte von 5 × 10³ Zellen pro Insert, inkubierten bei 37 °C und 5 % CO₂ -befeuchteter Umgebung für 24 Stunden, bevor die weitere Analyse fortgesetzt wurde. Nach einer Inkubation von 24 h wurden die Einlagen entfernt und 3x mit PBS gewaschen, gefolgt von einer Fixierung in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 15 min. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit einer 1%igen kristallvioletten Lösung gefärbt. Nach der Färbung wurden die Zellen mit PBS gespült und unter einem inversen Mikroskop betrachtet.
HINWEIS: Kristallviolett ist ein biologischer Fleck und kann schädlich sein, wenn es verschluckt wird oder mit der Haut in Berührung kommt. Er sollte sorgfältig behandelt werden, und der Abfall sollte ordnungsgemäß gemäß den örtlichen Vorschriften entsorgt werden.

Dual-Luciferase-Reporter-Assay

Die transfizierten Zellen werden vor der Lyse unter Standardkulturbedingungen (37 °C, 5 % CO₂ -befeuchtete Umgebung) 48 Stunden lang inkubiert. Nach 48 Stunden Inkubation wurden die Zellen lysiert und bei 5.000 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Ein 50 μl Aliquot des Überstands wurde auf eine 96-Well-Platte übertragen, gefolgt von der sequentiellen Zugabe von 100 μl Glühwürmchen-Luziferase-Reagenz und 100 μl Renilla-Luziferase-Reagenz in jede Vertiefung. Die Aktivitäten von Firefly und Renilla Luciferase wurden mit dem Dual-Luciferase Reporter Assay System auf einem Luminometer gemessen. Die Renilla-Luziferase-Aktivität wurde auf die Firefly-Luziferase-Aktivität normalisiert, um Schwankungen in der Transfektionseffizienz zu berücksichtigen.

Immunfluoreszenz-Assay

SK-OV-3-Zellen wurden 15 min lang bei Raumtemperatur in 4% PFA fixiert und anschließend 3x mit PBS gewaschen. Um die unspezifische Bindung zu blockieren, wurden die Zellen mit 5% Ziegenserum in PBS für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Blockierung wurden die Zellen über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern gegen E-Cadherin (RRID: AB_2833860), N-Cadherin (RRID: AB_2837725) und Vimentin (RRID: AB_2835318) inkubiert, die jeweils 1:200 verdünnt wurden. Am nächsten Tag wurden die Zellen 3x mit PBS gewaschen und mit geeigneten Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern [Anti-Maus-IgG-FITC (RRID: AB_2843438) und Anti-Kaninchen-IgG-FITC (RRID: AB_2843439)] inkubiert, verdünnt 1:500 für 1 h bei 37 °C im Dunkeln.
HINWEIS: Paraformaldehyd ist giftig und potenziell krebserregend. Es sollte mit Vorsicht behandelt werden und geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) wie Handschuhe und Schutzbrille tragen. PFA-haltige Abfälle sollten als Sondermüll entsorgt werden.

Statistische Analyse

Für Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurde ein t-Test und für mehrere Gruppenvergleiche eine ANOVA angewendet. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde auf *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 festgelegt. Alle Experimente wurden mit drei biologischen Replikaten (n = 3) durchgeführt.

Ergebnisse

Migrations- und invasive Kapazitäten von SK-OV-3-Zellen, die durch MALAT1 moduliert werden

Der experimentelle Arbeitsablauf ist in Abbildung 1 dargestellt. Um die Rolle von MALAT1 bei der Migration und Invasion von OvCa-Zellen zu untersuchen, haben wir seine Expression in SK-OV-3-Zellen moduliert. Nach dem Knockdown von MALAT1 bestätigte d...

Diskussion

OvCa, die fünfthäufigste gynäkologische Krebserkrankung, ist nach wie vor ein großes Problem für die Gesundheit von Frauen². Die meisten Fälle werden jedoch in fortgeschrittenen Stadien identifiziert, was die wirksamen Behandlungsmöglichkeiten erheblich einschränkt, was zu einer minimalen Verbesserung der Gesamtüberlebensraten führt¹². Krebsmetastasen tragen in EOC¹³ wesentlich zur Patientensterblichkeit bei. Neue Er...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,22 μm m PVDF-Membranen	Beyotime	FFP32
All-in-One miRNA qRT-PCR Nachweiskit	FulenGen	QP115
Rinderserumalbumin	Beyotime	ST025
Chemilumineszenz-Substrat	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	TCH-C335
Chemilumineszenz-Substrat	Millipore	WBKLS0100
Duales Luciferase-Reporter-Gen-Assay-Kit	Beyotime	Nr. RG027
Fötales Rinderserum	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	FBP-C550
Ziege Anti-Maus IgG FITC	Affinität	Nr. S0007
Ziege Anti-Kaninchen IgG FITC	Affinität	Nr. S0008
Lipofectamin 2500	Guangzhou Yingxin Biotechnology Co., Ltd.	SJ-LIPPE-2500
MALAT1-Interferenz-Lentivirus	SHANGHAI GENECHEM Co., Ltd.	LV-MALAT1-sh
MALAT1-Überexpressions-Lentivirus	SHANGHAI GENECHEM Co., Ltd.	LV-MALAT1-OE
McCoy's 5A	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	GUMD-B305
miR-200c-3p Nachahmung	SHANGHAI GENECHEM Co., Ltd.	Mikrofon-HASS-200C-3P
Multifunktionaler Enzym-Immunoassay-Analysator	Perkin Elmer	Envision 2100
Penicillin-Streptomycin-Lösung	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	GUSA-R002
Phosphatase-Hemmer-Cocktail	GSbioth	GS1439A
Primärer Antikörper E-Cadherin	Affinität	BF0219
Primärer Antikörper N-Cadherin	Affinität	Nr. AF5239
Primärer Antikörper Vimentin	Affinität	Nr. AF7013
PrimeScript RT Mastermix	Takara	RR036A
Echtzeit-PCR-Nachweissystem	Bio-Rad	CFX96
Gekühlte Zentrifuge	Eppendorf	5810R
RIPA-Lysepuffer	GSbioth	GS504A
SDS-Polyacrylamid-Gele	Beyotime	P0012A
Sekundärer Antikörper Ziege Anti-Maus IgG FITC	Affinität	Nr. S0007
Sekundärer Antikörper Ziege Anti-Kaninchen IgG FITC	Affinität	Nr. S0008
SNAI2 siRNA	Guangzhou Yingxin Biotechnology Co., Ltd.	si-has-schnecke2
StarBase-Datenbank	Sun Yat-sen Universität	http://starbase.sysu.edu.cn
Das BCA-Assay-Kit	Dingguo Biotech	BCA02
Der Zellkultur-Inkubator	Heraeus	Hera-Zelle 150
Das bildgebende Analysesystem	Bio-Rad	GEL DOC 1000
Das inverse Mikroskop	Mshot	MI152-N
Das RNA-Extraktionskit	ECOTOP	EK-1328-50T
TRIzol-Reagenz	Guangzhou Yingxin Biotechnology Co., Ltd.	T751379
Universelles Elektrophorese-Netzteil	wixwissenschaftlich	WIX-EP600