Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die kardioprotektiven Effekte des NRG1/ErbB4-Signalwegs in einem Rattenmodell für Ischämie-Reperfusionsschäden zu bewerten, indem oxidativer Stress und apoptotische Signalwege untersucht werden.
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Forschungsartikel
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Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die kardioprotektiven Effekte des NRG1/ErbB4-Signalwegs in einem Rattenmodell für Ischämie-Reperfusionsschäden zu bewerten, indem oxidativer Stress und apoptotische Signalwege untersucht werden.
Die myokardiale Ischämie-Reperfusions-Schädigung (MIRI) stellt nach wie vor ein wesentliches Hindernis für die Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen dar. Die Pathophysiologie der MIRI ist komplex und umfasst oxidativen Stress, Kalziumüberladung, Entzündungen und Apoptose. Der NRG1/ErbB4-Signalweg wurde mit der Modulation oxidativer Stressreaktionen im Herzen in Verbindung gebracht, wodurch möglicherweise zelluläre Schäden durch freie Radikale reduziert werden. Ziel dieser Studie war es, die molekularen Mechanismen aufzuklären, durch die der NRG1/ErbB4-Signalweg in einem Rattenmodell Schutz vor Myokardischämie-Reperfusionsschäden (MIRI) bietet. Es wurde ein Ratten-MIRI-Modell etabliert, an dem 30 erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten teilnahmen, die nach dem Zufallsprinzip in fünf Gruppen eingeteilt wurden: Kontrolle, Scheinoperation, MIRI, rekombinante NRG1 und AG1478. Die NRG1-Konzentrationen im Herzgewebe wurden mittels ELISA gemessen, während die p-ErbB4- und ErbB4-Proteinspiegel mittels Western Blot bestimmt wurden. Die Apoptose der Kardiomyozyten und die Spiegel der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) wurden mittels Durchflusszytometrie untersucht. In der MIRI-Gruppe waren die NRG1-Spiegel im Vergleich zur Kontroll- und Scheinoperationsgruppe signifikant reduziert (p < 0,05). Die rekombinante NRG1-Behandlung führte zu einem deutlichen Anstieg der NRG1-Spiegel im Herzgewebe und einem verbesserten p-ErbB4/ErbB4-Expressionsverhältnis (p < 0,05). Die AG1478-Gruppe wies im Vergleich zur rekombinanten NRG1-Gruppe niedrigere NRG1-Spiegel und ein reduziertes p-ErbB4/ErbB4-Verhältnis auf (p < 0,05). In Bezug auf Apoptose und ROS-Spiegel zeigte die MIRI-Gruppe signifikant höhere Raten als die Kontroll- und Scheinoperationsgruppen (p < 0,05). Die rekombinante NRG1-Behandlung reduzierte die Apoptose der Myokardzellen und die ROS-Spiegel signifikant (p < 0,05), während AG1478 diese Effekte ebenfalls abschwächte, jedoch in geringerem Maße. Der NRG1/ErbB4-Signalweg spielt eine zentrale schützende Rolle bei MIRI bei Ratten. Die Supplementierung mit exogenem NRG1 erhöht effektiv die NRG1-Spiegel im Herzen, aktiviert den ErbB4-Signalweg, reduziert die Apoptose der Myokardzellen und senkt die ROS-Spiegel, wodurch MIRI-induzierte Schäden gemildert werden.
Die myokardiale Ischämie-Reperfusions-Schädigung (MIRI) stellt eine entscheidende Herausforderung bei der Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungendar 1. Obwohl die Wiederherstellung des Blutflusses des ischämischen Myokards für die Behandlung des Myokardinfarkts unerlässlich ist, kann die Reperfusion selbst die Schädigung des Herzgewebes verschlimmern und somit die therapeutische Wirkung einschränken. Die Mechanismen, die der MIRI zugrunde liegen, sind komplex und umfassen verschiedene pathophysiologische Prozesse, darunter oxidativer Stress, Kalziumüberladung, Entzündungsreaktionen und Apoptose 2,3,4.
Der Nervenwachstumsfaktor 1 (NRG1) und sein Rezeptor Erb-B2-Rezeptor Tyrosinkinase 4 (ERBB4) spielen eine zentrale Rolle in der kardialen Physiologie und Pathologie. NRG1, ein extrazellulärer Ligand, interagiert mit dem ErbB4-Rezeptor, um eine Kaskade von Signalwegen zu aktivieren, die für die Herzentwicklung, die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität und die Reaktion auf Herzverletzungen entscheidend sind5. Neue Erkenntnisse unterstreichen die Rolle, die der NRG1/ErbB4-Signalweg bei Herzerkrankungen spielt. Unter den Bedingungen einer myokardialen Ischämie-Reperfusion können die Expression und Funktion von NRG1 verändert sein6. Frühere Studien haben gezeigt, dass NRG1 das Überleben von Myokardzellen fördert und eine übermäßige Apoptose hemmt, indem es ErbB4 aktiviert. Darüber hinaus kann der NRG1/ErbB4-Signalweg die oxidative Stressantwort im Herzen regulieren und Zellschäden durch freie Radikale abschwächen. Daher ist die Aufklärung der Funktion des NRG1/ErbB4-Signalwegs in MIRI von entscheidender Bedeutung, um die biologischen Grundlagen dieser Schädigung zu verstehen und neue therapeutische Strategien zu entwickeln 7,8.
Diese Studie spekuliert, dass der NRG1/ErbB4-Signalweg eine schützende Rolle bei MIRI spielt. Daher wurde in dieser Studie ein Rattenmodell der myokardialen Ischämie-Reperfusion konstruiert, um den Mechanismus des NRG1/ErbB4-Signalwegs bei MIRI systematisch zu untersuchen. Durch die Regulierung der Konzentration von NRG1 und die Beobachtung der Veränderungen des ErbB4-Aktivierungsstatus, der Apoptoserate der Myokardzellen und des oxidativen Stressniveaus. In dieser Arbeit wird versucht, den molekularen Mechanismus aufzudecken, durch den der NRG1/ErbB4-Signalweg eine schützende Wirkung bei MIRI ausübt. Die Neuheit dieser Studie liegt darin, die Bedeutung des NRG1/ErbB4-Signalwegs bei myokardialen Ischämie-Reperfusionsschäden aufzuzeigen und eine neue Perspektive für die Behandlungsstrategien von Herzerkrankungen auf der Grundlage dieses Signalwegs zu eröffnen.
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Versuchstiere
Dreißig erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten (SD) im Alter von 8 Wochen und mit einem Gewicht von 180-200 g wurden von einem kommerziellen Anbieter bezogen. Diese Ratten wurden vor den Experimenten 1 Woche lang unter spezifischen erregerfreien Bedingungen untergebracht. Die Experimente wurden von der Ethikkommission des Ersten Krankenhauses Nanping (Nr. NPSY202208010) genehmigt.
Tiermodelle für myokardiale Ischämie-Reperfusionsschäden
Die Ratten wurden durch intraperitoneale Injektion von 3% Pentobarbital-Natrium in einer Dosis von 50 mg/kg anästhesiert. Nach Bestätigung des Fehlens von Reflexen wurden die Tiere in Rückenlage gebracht, der Hals- und Brustbereich rasiert und mit 75%igem Ethanol desinfiziert. Ein zervikaler Schnitt in der Mittellinie (~2 cm) wurde vorgenommen, um die Luftröhre freizulegen, gefolgt von einer oralen Intubation mit einem 16-G-Katheter, um die Durchgängigkeit der Atemwege während der Operation aufrechtzuerhalten. Anschließend wurde der Musculus pectoralis major des linken Brustmuskels sorgfältig präpariert, um den dritten und vierten Interkostalraum freizulegen. Eine Thorakotomie wurde durchgeführt, indem ein Schnitt zwischen diesen Räumen gemacht wurde, und das Perikard wurde geöffnet, um das Herz vollständig freizulegen. Um eine Ischämie zu induzieren, wurde die linke anteriore absteigende Koronararterie (LAD) mit einem 8-0 Nylon-Naht. Zwischen dem LAD und der Ligatur wurde ein Polyethylenschlauch (PE-10) eingeführt, um einen reversiblen Verschluss zu ermöglichen. Die Ischämie wurde 45 Minuten lang aufrechterhalten und visuell durch Myokardblanchieren und EKG-Veränderungen bestätigt. Die Reperfusion wurde durch Lösen der Ligatur eingeleitet, so dass der Blutfluss für 3 Stunden wieder aufgenommen werden konnte. Die Ligatur wurde 45 min später entfernt.
Experimentelle Gruppierung
Die Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in fünf Gruppen (jeweils n = 6) eingeteilt. (1) Kontrollgruppe: Ratten erhielten eine Standardversorgung ohne chirurgischen Eingriff oder Behandlung. (2) Scheinoperationsgruppe: Ratten wurden einer Thorakotomie und einem Einfädeln der linken vorderen absteigenden Koronararterie (LAD) ohne Ligatur unterzogen, die als chirurgische Kontrolle dienten. (3) MIRI-Gruppe: Ratten unterzogen sich einer Induktion einer myokardialen Ischämie-Reperfusionsverletzung und erhielten normale Kochsalzlösung intragastrisch als Vehikelkontrolle. (4) Rekombinante NRG1-Gruppe: Ratten erhielten 30 Minuten vor der Thorakotomie eine intravenöse Injektion von rekombinantem humanem NRG1 (rh-NRG1) in einer Dosis von 5 mg/kg, gefolgt von einem MIRI-Verfahren. (5) AG1478-Gruppe: Ratten erhielten 30 Minuten vor der Thorakotomie intravenös rh-NRG1 (5 mg/kg) in Kombination mit AG1478 (20 mg/kg), einem ErbB-Rezeptor-Kinase-Inhibitor, und unterzogen sich dann dem MIRI-Verfahren.
Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Die Tiere wurden durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium (150 mg/kg) euthanasiert. Das Herzgewebe wurde unmittelbar nach der Reperfusion entnommen und auf Eis in einem geeigneten Volumen eiskaltem PBS homogenisiert. Die Homogenate wurden dann bei 1200 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, um den Überstand zu trennen. Die Konzentration von NRG1 im Überstand wurde mit einem kommerziell erhältlichen NRG1-ELISA-Kit quantifiziert, wobei die Anweisungen des Herstellers genau befolgt wurden. Kurz gesagt, Proben und Standards wurden in die ELISA-Plattenvertiefungen gegeben, für die empfohlene Zeit bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von Waschen und Zugabe von Nachweisantikörpern. Die Extinktion wurde bei der angegebenen Wellenlänge mit einem Mikroplatten-Reader gemessen, und die NRG1-Niveaus wurden auf der Grundlage der Standardkurve berechnet. Das Probenvolumen betrug 100 μL, die Verdünnung des Antikörpers 1:100 und die Wellenlänge für die Messung der Absorption wurde auf 450 nm eingestellt.
Western-Blot-Analyse
Herzgewebe wurde aus anästhesierten Ratten herausgeschnitten und in eiskaltem PBS gespült, um Blutreste zu entfernen. Für jedes Herz wurden etwa 0,5 g linksventrikuläres Gewebe gewogen und in 500 μl frisch zubereiteten RIPA-Lysepuffer gegeben. Das Gewebe wurde dann mit einer mechanischen Gewebemühle auf Eis homogenisiert, bis es vollständig lysiert war, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation auf Eis, um eine vollständige Proteinextraktion zu gewährleisten. Die Lysate wurden bei 12.000 × g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert, um Ablagerungen zu entfernen. Die Proteinkonzentrationen wurden mit einem BCA-Assay-Kit bestimmt. Gleiche Mengen an Gesamtprotein (z.B. 30 μg pro Spur) wurden geladen und mittels SDS-PAGE getrennt. Die Proteine wurden dann mit einem Nasstransfersystem bei 100 V für 90 min auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % fettfreier Trockenmilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween-20 (TBST) für 1 h bei Raumtemperatur blockiert. Anschließend wurden Membranen über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern gegen phosphoryliertes ErbB4 (p-ErbB4) und GesamterbB4 inkubiert, jeweils 1:1000 verdünnt. Nach dem Waschen wurden die Membranen 1 h lang bei Raumtemperatur mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörpern inkubiert. Die Proteinbanden wurden mit Hilfe eines Substrats der verstärkten Chemilumineszenz (ECL) sichtbar gemacht und mit einem Gel-Imaging-System erfasst. Die Bandenintensitäten wurden mit der ImageJ-Software quantifiziert und das Verhältnis von p-ErbB4 zu GesamterbB4 berechnet, um die Phosphorylierungsniveaus zu bewerten.
Durchflusszytometrie
Die Apoptose der kardialen Myozyten wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Das Herzgewebe wurde fein zerkleinert und enzymatisch mit einer Mischung aus Kollagenase Typ II (1 mg/ml) und Protease (z. B. Trypsin, 0,25%) bei 37 °C unter sanftem Rühren für 20-30 Minuten verdaut. Die enzymatische Verdauung wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens an fötalem Rinderserum (FBS) beendet. Die Zellsuspension wurde durch ein 70-μm-Nylonnetz filtriert und bei 300 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Das Zellpellet wurde in Bindungspuffer resuspendiert und dann gemäß dem Protokoll des Herstellers mit Annexin V-FITC und Propidiumiodid (PI) inkubiert. Nach einer 15-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln wurden die Proben sofort mittels Durchflusszytometrie analysiert. Frühe apoptotische Zellen wurden als Annexin V-positiv und PI-negativ identifiziert, während späte apoptotische oder nekrotische Zellen für beide Marker positiv waren. Die Apoptoseraten wurden quantifiziert und zwischen den Versuchsgruppen verglichen. Die Gating-Strategie verwendet eine Cross-Gate-/Rechteck-Gate-Einstellung. Bei der Erkennung an der Maschine wurde das Kreuztor als gestrichelte Linie eingestellt, und alle Parameter wurden angewendet, um die Konsistenz des Datenscreenings zu gewährleisten. Die Durchflussrate wurde entsprechend der Zellkonzentration angepasst (gehalten bei 1000 Zellen/s), und eine langsame Probenbeladung kann ein Verstopfen der Düse vermeiden.
Nachweis des Gehalts an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)
Kardiomyozyten wurden aus Herzgewebe isoliert, gefolgt von einer Zentrifugation bei 300 × g für 5 Minuten und zweimaligem Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Die Zellen wurden dann mit 10 μM 2',7'-Dichlorfluoresceindiacetat (DCFDA)-Farbstoff bei 37 °C für 30 min im Dunkeln inkubiert, wobei die Anweisungen des Herstellers befolgt wurden. Nach der Färbung wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, um überschüssigen ungebundenen Farbstoff zu entfernen. Die intrazellulären ROS-Spiegel wurden sofort mittels Durchflusszytometrie gemessen, wobei die bei der Oxidation von DCFDA emittierte Fluoreszenzintensität nachgewiesen wurde. Die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) jeder Probe wurde mit der FlowJo-Software quantifiziert, um die ROS-Niveaus zwischen den Versuchsgruppen zu vergleichen. Die Gating-Strategie ist wie oben beschrieben (Abschnitt Durchflusszytometrie).
Statistische Analyse
Die Datenanalyse wurde mit Hilfe der SPSS-Software durchgeführt, die als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt wird. Eine unidirektionale Varianzanalyse mit dem Post-hoc-Test von Tukey wurde durchgeführt, um mehrere Gruppen zu vergleichen, und der t-Test von Student wurde für paarweise Vergleiche verwendet. Ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
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NRG1 übt eine schützende Wirkung gegen die MIRI-induzierte Kardiomyozyten-Apoptose aus
Die durchflusszytometrische Analyse zeigte eine bemerkenswerte Erhöhung der Apoptoseraten in der MIRI-Gruppe im Vergleich zur Kontroll- und Scheingruppe (P < 0,05). Sowohl die rekombinante NRG1- als auch die AG1478-Gruppe wiesen im Vergleich zur MIRI-Gruppe signifikant reduzierte Apoptoseraten auf (P < 0,05). Im Gegensatz dazu zeigte die rekombinante NRG1-Gruppe eine reduzierte Apoptoserate im Vergleich zur AG...
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MIRI stellt nach wie vor ein erhebliches Hindernis für die Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen dar, da die Wiederherstellung der Durchblutung des ischämischen Herzgewebes paradoxerweise die Myokardschädigung verstärken kann. Das Auftreten von MIRI ist multifaktoriell und geht mit oxidativem Stress, Kalziumüberladung, Entzündungsreaktionen und mitochondrialer Dysfunktioneinher 9,10.
NRG1, ein ext...
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.
Diese Arbeit wurde unterstützt von der Natural Science Foundation der Provinz Fujian (Fördernummer 2024J011604,2023J011877) und dem Jugendforschungsprojekt der Herdkommission der Provinz Fujian (Fördernummer 25.9.2019).
BEITRAG DES AUTORS:
Maozhi Huang leitete die Konzeption und das Design des Forschungsprojekts, plante und detaillierte das Versuchsprotokoll, nahm an wichtigen Experimenten teil und schrieb den ersten Entwurf des Manuskripts. Jianping Zheng trug gleichermaßen zur Gesamtforschung bei, einschließlich des Designs, der Datenerfassung und der Erstellung von Manuskripten. Xianlu Cheng trug zum Forschungsdesign bei, sammelte Proben und analysierte Daten. Chaoqun: Sie haben beim Schreiben und Strukturieren des Manuskripts mitgewirkt. Ziguo Chen überprüfte die Daten und half bei der Verbesserung des Abschnitts über Methoden und Materialien. Ling Jiang sorgte während des gesamten Forschungsprozesses für die akademische Kontrolle und Anleitung. Shanghua Xu leitete die Gesamtrichtung des Projekts, koordinierte die Ressourcen und überprüfte und überarbeitete das endgültige Manuskript.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Nr. AG1478 | BioLab-Technologie | WD102925 | Interventionsmedikament AG1478 |
| Annexin V-FITC/PI Apoptose-Detektionskit | Meilune | MA0220 | Apoptose der Durchflusszytometrie |
| BCA-Protein-Assay-Kit | Meilunbio | MA0082-2 | Quantifizierung von WB-Proteinen |
| Chemilumineszenz-Bildgebungssystem | Bio-Rad (USA) | ChemiDoc Berührung | Western-Blot-Bildgebung |
| Cyamemazin-Hydrochlorid | Huamu Tiergesundheit | 20220601 | Anästhetikum für die Modellierung von Tieren |
| ECL-Nachweis-Kit | Meilunbio | Nr. MA0186-1 | WB-Chemilumineszenz |
| ERbB4 | Proteintech-Technologie | Artikel-Nr.: 19943-1-AP | WB-Primärantikörper |
| Durchflusszytometer | BD | FACSCalibur | Apoptose-Nachweis durch Durchflusszytometrie |
| GAPDH | Proteintech-Technologie | 60004-1-IG | Antikörper zur Kontrolle der WB-Beladung |
| HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG(H+L) | Proteintech-Technologie | SA00001-1 | Immunhistochemie |
| HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen IgG(H+L) | Proteintech-Technologie | SA00001-2 | Immunhistochemie |
| Mikroplatten-Reader | Thermo | K3 | ELISA-Nachweis |
| PAGE Gel Vorbereitungsset 15% | Meilunbio | Nr. MA0384 | WB-Elektrophorese |
| p-ERbB4 | Affinität | Nr. AF3445 | WB-Primärantikörper |
| Vorgefärbter Proteinmarker | Meilunbio | MA0342 | WB-Elektrophorese |
| Ratten-Neuregulin-1 (NRG-1) ELISA-Kit | Meimian | MM-61434R2 | ELISA-Nachweis |
| Assay-Kit für reaktive Sauerstoffspezies (ROS) | Meilune | MA0219 | WB-Assay |
| rhNRG1 | BioLab-Technologie | WD091127 | Interventionsmedikament NRG1 |
| RIPA-Lysepuffer | Meilunbio | MA0151 | Proteinextraktion für Western Blot |
| SDS-PAGE Ladepuffer (5x) | Beyotime | P0015L | WB-Elektrophorese |
| Natriumdodecylsulfat | Sigma | 151-21-3 | WB-Elektrophorese |
| Su Tai 50 | Virbac (Frankreich) | 8X22A | Anästhetikum für die Modellierung von Tieren |
| Vertikales Proteinelektrophorese-System | Bio-Rad (USA) | POWER PAC 200 | Western-Blot-Elektrophorese |
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