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Erforschung von Protein-Glykan-Wechselwirkungen: Fortschritte in der Kernspinresonanz

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DOI:

10.3791/68674

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26. August 2025

 ,  , 
1Institute of Medical Biochemistry Leopoldo de Meis (IBqM), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2National Center for Structural Biology and Bioimaging (CENABIO), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 3Laboratory of Connective Tissue, Clementino Fraga Filho University Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses NMR-basierte Protokoll untersucht schwache Protein-Glykan-Wechselwirkungen unter Verwendung von Cyanovirin-N und D-Mannose. Durch die Kombination von Liganden- und Proteindetektionsmethoden kartiert es Bindungsstellen, detektiert allosterische Effekte und identifiziert Begegnungskomplexe. Der Ansatz umreißt die Probenvorbereitung und Datenanalyse und bietet strukturelle und dynamische Einblicke, die für glykanspezifische Diagnose- und Erkennungsmechanismen wertvoll sind.

Zusammenfassung

Protein-Glykan-Wechselwirkungen sind für viele biologische Prozesse von zentraler Bedeutung und werden zunehmend als vielversprechende Ziele für diagnostische Strategien bei infektiösen, entzündlichen und neoplastischen Erkrankungen anerkannt. Die Charakterisierung dieser Wechselwirkungen, insbesondere wenn sie schwach und vorübergehend sind, bleibt jedoch eine technische Herausforderung. Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) bietet einzigartige Vorteile für die Untersuchung solcher Wechselwirkungen unter nahezu physiologischen Bedingungen und bietet atomar aufgelöste Einblicke in strukturelle und dynamische Aspekte. In dieser Studie stellen wir ein integriertes NMR-Protokoll vor, das entwickelt wurde, um niedrig affine Protein-Glykan-Wechselwirkungen unter Verwendung des Mannose-spezifischen Lektins Cyanovirin-N und des Monosaccharids D-Mannose als Modellsystem zu untersuchen. Das Protokoll kombiniert liganden- und proteinbasierte NMR-Ansätze, um Bindungsstellen umfassend zu kartieren und subtile Bindungsereignisse zu erkennen, einschließlich potenzieller allosterischer Effekte oder Begegnungskomplexe. Zu den kritischen Schritten des Protokolls gehören die sorgfältige Probenvorbereitung, die präzise Kontrolle der Konzentrationen und die spektrale Standardisierung, um die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Daten zu gewährleisten. NMR in Lösung ermöglicht die Detektion von transienten Wechselwirkungen, die mit anderen Techniken oft nicht zugänglich sind. Obwohl schwache Wechselwirkungen für das Leben unerlässlich sind, gibt es in der Literatur eine Tendenz zu Komplexen mit höherer Affinität, obwohl Komplexe mit niedriger Affinität für viele wichtige biologische Funktionen relevant sind, wie z.B. Signaltransduktion und Zell-Zell-Kommunikation. Diese Technik bietet eine leistungsfähige Plattform für die Untersuchung der Protein-Glykan-Erkennung und kann als wertvolles Werkzeug für die Identifizierung neuartiger diagnostischer Marker auf der Grundlage von Glykan-spezifischen Wechselwirkungen dienen.

Einleitung

Protein-Glykan-Wechselwirkungen sind für eine Vielzahl biologischer Prozesse von grundlegender Bedeutung, einschließlich der Zell-Zell-Erkennung, der Modulation der Immunantwort und der Erreger-Wirt-Interaktionen 1,2. Diese molekularen Wechselwirkungen sind hochspezifisch und dynamisch und spielen sowohl bei physiologischen als auch bei pathologischen Mechanismen eine entscheidende Rolle 3,4,5. Ein klassisches Beispiel für solche Wechselwirkungen finden sich bei Lektinen, Proteinen, die Glykane spezifisch erkennen und an Glykane binden. Cyanovirin-N (CVN) zum Beispiel wurde aufgrund seiner Fähigkeit, in hoher Affinität mit hohen Mannose-Oligosacchariden zu interagieren, umfassend als experimentelles Modell untersucht 5,6,7.

Neben den Lektinen spielen auch viele glykosylierte Proteine, wie z. B. Integrine, eine wesentliche Rolle bei der Erkennung und zellulären Signalübertragung. Integrine sind Transmembranrezeptoren, die häufig einer Glykosylierung ihrer Untereinheiten unterzogen werden, was ihre Stabilität und Affinität zu Liganden, einschließlich Glykanen, beeinflusst 5,8,9,10. Die strukturelle Charakterisierung dieser Wechselwirkungen bleibt jedoch aufgrund der intrinsischen Heterogenität und Flexibilität der Glykane eine Herausforderung, was traditionelle Ansätze der Strukturbiologie erschwert. In diesem Zusammenhang ist die Entwicklung fortschrittlicher Methoden, die in der Lage sind, diese Wechselwirkungen in Lösung zu erfassen, für dieses Fachgebiet von großem Wert, insbesondere für die Glykobiologie11,12.

Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) hat sich zu einem leistungsfähigen Werkzeug für die Untersuchung von Protein-Liganden-Wechselwirkungen auf atomarer Ebene entwickelt. Im Gegensatz zu anderen Techniken wie der Röntgenkristallographie und der Kryo-Elektronenmikroskopie ermöglicht die NMR die Untersuchung biomolekularer Wechselwirkungen unter nahezu physiologischen Bedingungen und ermöglicht Einblicke in Struktur und Dynamik. Diese Flexibilität ermöglicht es den Forschern, Umgebungsparameter wie pH-Wert (typischerweise zwischen 4,0 und 8,0), Ionenstärke (z. B. 0-500 mM NaCl) und Temperatur (im Allgemeinen 273-330 K) zu modulieren und so die Bedingungen an die Spezifitäten von Protein-Glykan-Komplexen anzupassen. Darüber hinaus ist die NMR besonders vorteilhaft für die Analyse transienter und schwacher Wechselwirkungen, die häufig für Protein-Glykan-Erkennungsereignisse charakteristisch sind13,14.

Mehrere NMR-Techniken wurden eingesetzt, um Protein-Glykan-Wechselwirkungen zu untersuchen, wobei sowohl protein- als auch ligandenbasierte Ansätze verwendet wurden. Aus der Proteinperspektive wird die heteronukleare Einzelquantenkohärenz-Titration (HSQC) häufig verwendet, um Bindungsstellen zu kartieren, indem chemische Verschiebungsstörungen bei der Ligandenzugabe überwacht werden. Relaxationsdispersionsexperimente ermöglichen die Detektion von Konformations- und chemischen Austauschprozessen, die auf der Zeitskala von Mikro- bis Millisekunden stattfinden, und geben Einblicke in die dynamischen Aspekte der Glykanerkennung15,16. Diese proteinbasierten Techniken erfordern in der Regel Probenkonzentrationen im Bereich von 50 μM bis 2 mM, abhängig von der Proteinstabilität und der Markierungseffizienz17,18.

Ligandenbasierte NMR-Techniken bieten komplementäre Informationen, indem sie sich auf Glykanveränderungen während der Bindung konzentrieren. Die Sättigungstransferdifferenz (STD-NMR) ist besonders nützlich für die Identifizierung von Glykanepitopen, die an der Erkennung beteiligt sind, da sie die NMR-Signale von Ligandenregionen, die in engem Kontakt mit dem Protein stehen, selektiv sättigt19,20. Wasser-Liganden, die mittels Gradientenspektroskopie (WaterLOGSY)21,22 und übertragener nukleärer Overhauser-Effekt-Spektroskopie (Tr-NOESY) beobachtet wurden, bieten zusätzliche Mittel zur Beurteilung der Ligandenbindung und Konformationsänderungen während der Wechselwirkungen23. Darüber hinaus helfen Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)-Relaxationsexperimente bei der Identifizierung schwacher und transienter Wechselwirkungen, die mit herkömmlichen Methoden schwer zu detektieren sind24. Ligandenbasierte Experimente werden häufig bei Proteinkonzentrationen von 10-50 μM durchgeführt und erfordern möglicherweise eine Optimierung der Mischzeiten und Sättigungsparameter25. Insbesondere können diese Methoden durch die geringe Löslichkeit von Glykanen oder das schlechte Signal-Rausch-Verhältnis bei der Arbeit mit kleinen Liganden eingeschränkt sein.

Zusammen bieten diese NMR-Methoden einen umfassenden Rahmen für die Aufklärung der strukturellen und dynamischen Eigenschaften von Protein-Glykan-Wechselwirkungen. Mit den kontinuierlichen Fortschritten in den Bereichen Sensitivität und Isotopenmarkierung wird diese Technik in der Glykobiologie immer wichtiger und bietet neue Perspektiven auf molekulare Erkennungsmechanismen mit potenziellen Anwendungen in der Arzneimittelentwicklung und Biomarkerforschung. Nichtsdestotrotz hängt der Erfolg dieser Ansätze von Faktoren wie der Homogenität der Proben, der Glykankomplexität und dem Vorhandensein flexibler oder ungeordneter Regionen ab, die die NMR-Signale verbreitern oder die Interpretation behindern können26. Die NMR ist eine leistungsfähige Methode zur Untersuchung transienter Ereignisse, was eine große Herausforderung in der Strukturbiologie darstellt.

CVN erkennt α(1,2)-verknüpfte Mannosylreste, die in Oligosacchariden mit hohem Mannosegehalt mit nanomolaren Affinitäten vorhanden sind 27,28,29. Das Monosaccharid D-Mannose erkennt es jedoch schlecht. In der vorliegenden Arbeit haben wir die Interaktion von CVN mit D-Mannose untersucht, um zu veranschaulichen, wie wichtig NMR für das Verständnis transienter Wechselwirkungen ist.

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Protokoll

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte, die Bakterienkulturen und Pufferpräparate betreffen, in Übereinstimmung mit den institutionellen Biosicherheitsprotokollen durch. Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA) und arbeiten Sie beim Umgang mit offenen Kulturen oder Chemikalien bei Bedarf in einer Biosicherheitswerkbank oder einem chemischen Abzug.

1. Expression von Cyanovirin-N

  1. Transformieren Sie E. coli BL21-Zellen mit einem Plasmid, das für das CVN-Gen kodiert, das in den pET26a-Vektor eingefügt wurde.
  2. Kultivieren Sie die Zellen in 1 l Superbrühe (32 g Trypton, 20 g Hefeextrakt, 5 g NaCl pro l), ergänzt mit Kanamycin (50 μg/ml), 0,5 % (w/v) Glukose und 1,6 mM MgSO4. Unter kontinuierlichem Rühren bei ~250 U/min bei 37 °C inkubieren.
  3. Für die Herstellung von 15N-markiertem CVN züchten Sie die Zellen in modifiziertem M9-Minimalmedium unter Verwendung von 15NH4Cl als einzige Stickstoffquelle.
    1. Bereiten Sie 1 l M9-Minimalmedium vor, indem Sie 200 ml sterile 5x M9-Salzlösung mischen, die 64 g/l Na2HPO4, 15 g/l KH2PO4, 2,5 g/l NaCl und 5 g/l NH4Cl enthält.
    2. Fügen Sie 2 ml 1 M MgSO4 (0,22 μm filtersterilisiert), 0,1 ml 1 M CaCl2 (0,22 μm filtersterilisiert) und 4 g Glukose (Endkonzentration 0,4 %, gelöst in sterilem destilliertem Wasser und 0,22 μm filtersterilisiert) hinzu.
    3. Bringen Sie das Endvolumen mit sterilem destilliertem Wasser auf 1 l.
      HINWEIS: Nahrungsergänzungsmittel wie Aminosäuren oder Vitamine können je nach Bedarf hinzugefügt werden.
  4. Überwachen Sie die Kultur, bis sie eine optische Dichte (OD600) von ca. 1,2 erreicht. Fügen Sie dann Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 1,0 mM hinzu, um die Proteinexpression zu induzieren.
  5. Nach der Induktion 20 h bei 37 °C inkubieren.
  6. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 7.000 × g für 10 min bei 4 °C.
  7. Die periplasmatische Fraktion wird wie folgt isoliert:
    1. Die Zellpellets werden in 0,4 Volumina 30 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) mit 20 % Saccharose und 1 mM EDTA resuspendiert und 10 min bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert.
    2. Bei 10.000 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
    3. Die resultierenden Pellets in 0,4 Volumen eiskaltem destilliertem Wasser resuspendieren und 10 Minuten lang unter Schütteln auf Eis inkubieren.
    4. Erneut bei 10.000 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
    5. Sammeln Sie den Überstand, der der periplasmatischen Fraktion entspricht, für die Proteinextraktion.
      HINWEIS: Alle Puffer müssen einen Proteaseinhibitor-Cocktail enthalten, um einen Proteinabbau zu verhindern.

2. NMR-Experimente

HINWEIS: Alle Experimente wurden bei 14,1 T mit einer 1H/15N/13C Dreifachresonanz-Inversektionssonde (siehe Materialtabelle) bei 298 K aufgenommen.

  1. Ligandenbasierte Experimente
    1. Probenvorbereitung
      1. Bereiten Sie zwei Proben vor: eine mit CVN und eine ohne CVN (reine Ligandenkontrolle). Jede Probe enthält 600 μl 80 μM CVN in Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) mit 50 mM NaCl.
      2. D-Mannose bis zu einer Endkonzentration von 4 mM zugeben.
      3. 5 % (v/v) D2O zu jeder Probe hinzufügen.
      4. Übertragen Sie die Probe in ein 5-mm-NMR-Röhrchen.
      5. Verwenden Sie einen 50-fachen molaren Überschuss des Liganden relativ zum Protein.
        HINWEIS: Ein Ligandenüberschuss im Bereich des 10- bis 1000-fachen wird in der Regel empfohlen, wobei niedrigere Überschüsse für kleine Proteine bevorzugt werden.
    2. Spektrale Erfassung für die D-Mannose-Zuordnung
      1. Erfassung von 2D TOCSY und 2D 1 H-13C HMBC Spektren mit Standard-Pulssequenzen:
        2D TOCSY: Phasensensitive Totalkorrelationsspektroskopie (TOCSY) mit Anregungsformung zur Wasserunterdrückung (DIPSI2ESGPPH).
        2D HMBC: 1 H-13C Heteronukleare Mehrfachbindungskorrelation mit Gradientenselektion und nicht-entkoppelter Akquisition (HMBCGPNDQF).
        HINWEIS: Diese Experimente wurden zum Zwecke der D-Mannose-Zuordnung durchgeführt, sind aber nicht dargestellt, da die Zuordnung chemischer Verschiebungen nicht in den Rahmen dieser Studie fällt.
    3. Kartierung der Ligandenbindung durch chemische Verschiebungsstörung (CSP) des Liganden
      1. Für die Probenvorbereitung und die Aufnahme von ¹H-¹³C HSQC-Spektren wird eine 4 mM Lösung von D-Mannose in Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) mit 50 mM NaCl und 5 % D2O hergestellt. Die Lösung wird in zwei Proben aufgeteilt: eine mit 80 μM CVN und eine ohne CVN (nur Ligandenreferenz).
        HINWEIS: Diese Spektren werden verwendet, um den CSP von D-Mannose bei Wechselwirkung mit CVN zu bestimmen.
      2. Für die Einstellung von 1 H-13C HSQC-Erfassungsparametern verwenden Sie die Standard-Pulssequenz HSQCETGPSI (Gradientenauswahl und empfindlichkeitsverstärkte 1 H-13C HSQC). Legen Sie die folgenden Parameter für die Erfassung fest:
        Zeitbereich (TD): 1024 × 128 komplexe Punkte (¹H × ¹³C Dimensionen)
        Spektrale Breite (SW): 10,0171 ppm (6009,615 Hz) für ¹H, 80 ppm (12069,106 Hz) für ¹³C
        Trägerfrequenzen: 4,7 ppm für ¹H, 75 ppm für ¹³C
        - Anzahl der Scans: 448.
      3. Berechnen Sie den CSP mit der folgenden Gleichung:
        figure-protocol-1
        wobei figure-protocol-2 und figure-protocol-3 die chemischen Verschiebungsunterschiede zwischen D-Mannose in Gegenwart von CVN (Abbildung 1A, rot markiert) und freier D-Mannose (Abbildung 1B) darstellen.
    4. Kartierung der Ligandenbindung über die Sättigungstransferdifferenz (STD)
      1. Erstellen Sie einen neuen Datensatz und konfigurieren Sie Parameter für STD-NMR-Experimente. Zwei experimentelle Strategien können angewendet werden: (i) Abschirmung verschiedener Sättigungsfrequenzen zur Optimierung des Signal-Rausch-Verhältnisses; ii) Festlegen der Sättigungsfrequenz und Variieren der Sättigungszeit zur Bewertung des Aufbaus.
      2. Richten Sie 1D ¹H NMR-Experimente mit der zgpr-Pulssequenz ein. Stellen Sie das Spektrometer auf ¹H ein, führen Sie Shimming durch und messen Sie einen harten 90°-Impuls (z. B. ~10 μs bei -10,6 dB Dämpfung, entspricht ~11,482 W).
      3. Zentrieren Sie die ¹H-Trägerfrequenz bei ca. 4,7 ppm, entsprechend dem Wassersignal.
      4. Wählen Sie die Impulssequenz STDDIFFESGP.3 aus und konfigurieren Sie die Erfassungsparameter wie folgt:
        Stellen Sie die spektrale Breite entsprechend den Anforderungen der Probe ein.
        Stellen Sie die Interscan-Verzögerung (d1) auf 4 s ein.
        Definieren Sie die Sättigungszeit (d20) basierend auf dem gewünschten Experiment.
        Laden Sie den FQ2LIST mit der Sättigungsfrequenz der Nebenresonanz (-40 ppm) und den Einresonanzfrequenzen, um nur das Proteinsignal zu sättigen.
        HINWEIS: Die On-Resonance-Frequenzen müssen den Proteinprotonen entsprechen und mindestens 1000 Hz von jedem Ligandensignal entfernt sein, um eine direkte Sättigung zu vermeiden.
      5. Testen Sie die folgenden On-Resonance-Sättigungsfrequenzen, um optimale Bedingungen zu bestimmen: -0,59 ppm, 0,73 ppm und 8,1 ppm (siehe Abbildung 2A).
        HINWEIS: Als On-Resonance-Sättigungsfrequenz wurde 0,73 ppm gewählt, da sie das beste Signal-Rausch-Verhältnis bietet. Unter Verwendung dieser Frequenz wurde der STD-Verstärkungsfaktor (ASTD) in Abhängigkeit von der Sättigungszeit quantifiziert. Zu diesem Zweck wurden STD-Spektren zu unterschiedlichen Sättigungszeiten (0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 und 4 s) aufgenommen, um die STD-Aufbaukurve zu konstruieren (Abbildung 2B). Die entsprechendenA-STD-Werte wurden dann als Funktion der Sättigungszeit aufgetragen (Abbildung 2C), was die Bewertung der Effizienz des Sättigungstransfers ermöglicht, die proportional zur Zeit und Nähe des Liganden Wasserstoff zum Protein ist. EinSTD-Faktor ist definiert als:
        figure-protocol-4
        ISTD ist die Differenz in der Signalintensität zwischen dem Ein- und dem Off-Resonanz-Spektrum, I0 ist die Signalintensität im Off-Resonanz-Spektrum, [L]T ist die Gesamtligandenkonzentration und [P] ist die Proteinkonzentration. Diese Normalisierung berücksichtigt Konzentrationseffekte und ermöglicht einen Vergleich zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen. STD beruht auf Spindiffusion und langsamem molekularem Taumeln, um die Sättigung effizient vom Protein auf den gebundenen Liganden zu übertragen. Größere Proteine (langsames Taumeln) ermöglichen eine effizientere Sättigung und Ausbreitung der Magnetisierung innerhalb des Proteins 19,30,31,32.
      6. Stellen Sie die Anzahl der Scans (ns) auf 64 ein und mitteln Sie das Experiment l4 (Schleife 4) mal.
      7. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Scans wie folgt: Gesamtzahl der Scans = ns × l4. Verwenden Sie 32.768 komplexe Punkte in der direkten Dimension (TD) mit einer spektralen Breite (SW) von 10,0171 ppm (6.009,615 Hz).
      8. Stellen Sie die Interscan-Verzögerung (d1) auf 4 s und die Erfassungszeit (AQ) auf 2,7262976 s ein. Die Gesamtrelaxationsverzögerung beträgt d1 + AQ.
      9. Konfigurieren Sie den Sättigungsimpuls wie folgt: Dauer 50 ms; Form Gauß (S. 42); gesteuert über das Formprogramm 9 (SP9).
      10. Verwenden Sie eine STD-Pulssequenzvariante, die einen T1ρ-Filter enthält, um verbleibende Proteinsignale zu unterdrücken. Stellen Sie die Spin-Lock-Zeit (d29) basierend auf dem Molekulargewicht des Proteins ein. Verwenden Sie für größere Proteine kleinere Spin-Lock-Zeiten (~20 ms) und für kleinere Proteine größere (> 40 ms).
        HINWEIS: Alle STD-Spektren wurden bei 599,93 MHz (BF1) aufgenommen. Die Anpassung von d29 ist entscheidend, um den Proteinhintergrund zu minimieren und gleichzeitig die Integrität des Ligandensignals zu erhalten. Optimieren Sie diesen Parameter bei Bedarf empirisch.
    5. Kartierung der Ligandenbindung über 1H-R2
      1. Wählen Sie das CPMG_ESGP2D Pulsprogramm aus der Bruker Standardbibliothek aus. Diese Sequenz basiert auf dem Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)-Experiment, das Anregungsformung zur Wasserunterdrückungbeinhaltet 33.
      2. Legen Sie das Experiment als 2D-Erfassung fest.
        HINWEIS: Hierbei handelt es sich um ein Pseudo-2D-Experiment, bei dem nur die direkte Dimension für die Informationen über die chemische Verschiebung verwendet wird.
      3. Konfigurieren Sie die Erfassungsparameter wie folgt:
        Zeitbereich (TD): 32.768 komplexe Punkte in der direkten ¹H-Dimension.
        (TD1): 2 Punkte.
        Spektrale Breite (SW): 7,9932 ppm (4.795,396 Hz).
        Verzögerung zwischen den Bildern (d1): 4 s.
        Trägerfrequenz (o1): 4,7 ppm (zentriert auf Wassersignal).
        Anzahl der Scans (ns): 8.
        Anzahl der Dummy-Scans (ds): 4.
        CPMG-Verzögerung (d20): ≤1 ms (d. h. kürzer als 1⁄3 J_HH).
        Anzahl der Durchschnittswerte (TDav): 200.
      4. Führen Sie das Experiment für 200 Zyklen mit jeweils 8 Scans durch, was zu einer Gesamtakkumulation von 1.600 Scans führt. Passen Sie die variable Zählerliste (vclist) entsprechend der gewünschten Gesamtzeit des CPMG-Zyklus (TCPMG) an. Hier wurden 2 Zyklen für einen TCPMG = 8 ms und 200 Zyklen für einen TCPMG = 800 ms gewählt.
      5. Führen Sie zwei1-H-CPMG-Experimente durch, eines für die Probe, die das Protein enthält (4 mM D-Mannose und 80 μM CVN) und das andere für die freie D-Mannose (4 mM D-Mannose).
      6. Plotten Sie die 1H-Spektren für jedes TCPMGmit dem Befehl efp (Exponentialmultiplikation gefolgt von Fourier-Transformation und Phasenkorrektur) oder sinm (Sinusmultiplikation um 90° verschoben, SSB=2) gefolgt von fp (Fourier-Transformation und Phasenkorrektur). Passen Sie die Fensterfunktion entsprechend der besten Verarbeitungsstrategie an.
        HINWEIS: In diesem Experiment wurden sinm und fp verwendet. Die 1. Seriennummer ist das Spektrum mit einem TCPMG von 8 ms (erste in der vclist), und die 2. Seriennummer ist 800 ms (zweite in der vclist). Die verarbeiteten 1H-Spektren sind in Abbildung 3 dargestellt.
      7. Berechnen Sie den CPMG-Quotienten (Q) über Gleichung 3.
        ​figure-protocol-5
  2. Proteinbasierte Experimente
    1. Probenvorbereitung
      1. Bereiten Sie 600 μl einer Probe vor, die 436 μM gleichmäßig 15N-markiertes CVN in Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) enthält, ergänzt mit 50 mM NaCl und 5 % Deuteriumoxid (D2O). Titrieren Sie D-Mannose in die Probe bis zu einer Endkonzentration von 60 mM. Für die Titration verwenden Sie einen 5 mm NMR-Schlauch.
    2. Resonanzzuweisung (optionaler Validierungsschritt)
      1. Bestätigen Sie die Zuweisung von freiem CVN in Lösung unter Verwendung der zuvor gemeldeten chemischen Verschiebungswerte34. Erfassen Sie die folgenden Dreifachresonanzspektren: HNCO, HNCA, HNCACB und CBCACONH 35,36,37.
        HINWEIS: Diese Experimente dienen nur zur Validierung der Zuordnung und werden nicht gezeigt, da die Zuordnung chemischer Verschiebungen nicht das primäre Ziel dieses Protokolls ist.
    3. Kartierung der Bindung von D-Mannose an CVN durch chemische Verschiebungsstörung des Proteins
      1. Erfassen Sie 1 H-15N HSQC-Spektren von 15N-markiertem CVN bei 298 K. Führen Sie eine Titration durch Zugabe von D-Mannose durch, um die folgenden Endkonzentrationen zu erreichen: 0, 1, 2, 5, 10, 20, 40 und 60 mM.
      2. Richten Sie das 1 H-15N Fast-HSQC-Experiment mit der phasenempfindlichen FHSQCF3GPPH-Pulssequenz aus der Bruker-Standardbibliothek ein. Verwenden Sie die folgenden Parameter:
        Zeitbereich (TD): 1024 × 140 komplexe Punkte in den Dimensionen 1H und 15N.
        Spektrale Breite (SW): 16,0274 ppm (9615,385 Hz) in der 1H-Dimension und 34 ppm (2067,119 Hz) in der 15N-Dimension.
        Trägerfrequenz: 4,7 ppm (1H) und 119 ppm (15N).
        Anzahl der Scans: 128.
      3. Berechnen Sie die chemische Verschiebungsstörung (Δδ) mit der folgenden Gleichung:
        figure-protocol-6
        wobei figure-protocol-7 und figure-protocol-8 die chemischen Verschiebungsunterschiede zwischen dem CVN in Gegenwart und Abwesenheit von D-Mannose sind (Abbildung 4A).
        HINWEIS: Der Faktor 10 erklärt die Differenz in der spektralen Breite zwischen den Protonen- und Stickstoffdimensionen.
      4. Berechnen Sie die Dissoziationskonstante (KD), indem Sie die CSP-Werte für jeden Rückstand als Funktion der D-Mannose-Konzentration darstellen. Passen Sie die resultierenden Daten mit der folgenden Gleichung (5) an eine Single-Site-Bindungsisotherme an.
        figure-protocol-9Gleichung 5
        wobei [PT] die Proteinkonzentration ist, die bei der Titration (CVN) verwendet wird, [P T] die Ligandenkonzentration (D-Mannose) und CSPmax das CSP bei der Sättigungskonzentration des Liganden und CSPmin in Abwesenheit des Liganden.
    4. Kartierung der Bindung von D-Mannose an CVN über die 15N-R2-Position des Proteins.
      1. Messen Sie die 15N-R2-Werte der einzelnen Rückstände von CVN in Abwesenheit und Gegenwart von 60 mM D-Mannose. Führen Sie alle Experimente bei 298 K durch.
      2. Richten Sie das 15N-R2-Experiment mit der phasensensitiven CPMG-basierten Pulssequenz ein, die aus der Bruker-Standardbibliothek HSQCT2ETF3GPSI3D. Verwenden Sie die folgenden Parameter:
        Zeitbereich (TD): 1024 × 128 komplexe Punkte in den Dimensionen 1H und 15N, mit 8 Punkten in der Pseudodimension.
        Spektrale Breite (SW): 16,0274 ppm (1H; 9615,385 Hz) und 34 ppm (15N; 2067,119 Hz).
        Trägerfrequenz: 4,7 ppm (1H) und 119 ppm (15N).
        Anzahl der Scans: 32. (v) Liste variabler Zähler: 1, 8, 2, 6, 3, 5, 4 und 7, entsprechend den Relaxationsverzögerungen (T Relax) von 16,96, 135,68, 33,92, 101,76, 50,88, 84,96, 67,84 bzw. 118,72 ms.
      3. Verarbeiten Sie die Pseudo3D-Spektren als eine Reihe von HSQC-ähnlichen 1H/15N Korrelationsrelaxationsspektren mit NMRPipe38, indem Sie dem Software-Tutorial folgen (siehe Materialtabelle für einen Link zum Tutorial).
      4. Importieren Sie die verarbeiteten Spektren in eine geeignete NMR-Analyseplattform (z. B. CCPNMR39). Wählen Sie alle Spektren aus und wenden Sie das Werkzeug "Intensitätsänderungen folgen" an. Plotten Sie die Intensität jedes Cross-Peaks als Funktion derT-Relaxation und passen Sie den Zerfall an eine monoexponentielle Funktion an, um 15N-R2-Werte für jeden Rest zu extrahieren.
      5. Berechnen Sie den experimentellen Fehler aus dem Signal-Rausch-Verhältnis der HSQC-ähnlichen Spektren bei 67,84 ms. Verarbeiten Sie einen Bereich des Spektrums, der nur Rauschen enthält, und konvertieren Sie ihn mit dem folgenden Befehl in eine Textdatei:
        pipe2txt.tcl ./PROCs/ft/R2_67_84.ft2 > noise67_84.txt"
      6. Bestimmen Sie die Standardabweichung des Rauschbereichs mit Hilfe einer Statistiksoftware (z. B. Origin(Pro), Version 2021). Definieren Sie diesen Wert als die Rauschintensität IRauschen.
      7. Berechnen Sie den experimentellen Fehler für jeden Rest mit der folgenden Gleichung:
        figure-protocol-10
        HINWEIS: Es ist wichtig, den experimentellen Fehler anstelle des Anpassungsfehlers zu verwenden. Der experimentelle Fehler definiert die Interpretationsgrenzen beim Vergleich von 15N-R2 in Abwesenheit und Anwesenheit von D-Mannose.

figure-protocol-11
Abbildung 1: Chemische Verschiebungsstörung von D-Mannose in Gegenwart von CVN. (A) 1 H-13C-HSQC-Spektrum von D-Mannose in Gegenwart von CVN. (B) 1 H-13C-HSQC-Spektrum von freier D-Mannose. Die Markierungen in den Spektren zeigen jede der chemischen Verschiebungszuordnungen und die jeweilige anomere Konfiguration (α oder β). Die Beschriftungen in Rot sind diejenigen, die der gebundenen Konformation zugeordnet sind, und die Beschriftungen in Schwarz sind diejenigen, die der freien Konformation zugeordnet sind. (C) Überlagerung der 1 H-13C-HSQC-Spektren in Gegenwart (grün) und Abwesenheit (blau) von CVN. (D) Chemische Struktur von α- und β-D-Mannose unter Hervorhebung des beobachteten CSP, der gemäß Gleichung (1) berechnet wurde. Die CSP-Werte werden unterhalb der grünen Kreise dargestellt. Der rote Kreis stellt den β-anomeren Wasserstoff dar, der in Gegenwart von CVN verschwunden ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Sättigungstransferdifferenzspektren (STD) von D-Mannose in Gegenwart von CVN. (A) STDs, die bei unterschiedlichen Sättigungsfrequenzen aufgenommen wurden: -0,59, 0,73 und 8,1 ppm. (B) STD, die zu unterschiedlichen Sättigungszeiten erworben wurde: 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 und 4 s. (C) STD-Verstärkungsfaktor (ASTD), berechnet gemäß Gleichung 2 in Abhängigkeit von der Sättigungszeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: 1H-R2 von D-Mannose in Gegenwart und Abwesenheit von CVN. (A) Darstellung der erwarteten D-Mannose 1H-CPMG-Spektren für ein Binder und ein Nichtbinder, die mit R 2-Relaxationszeiten von 8 und 800 ms in Abwesenheit (unten) und Anwesenheit (oben) von CVN aufgenommen wurden. Q wurde nach Gleichung 3 berechnet. In Ermangelung einer Wechselwirkung (Q ≈ 1) bleiben die Signalintensitäten zu beiden Relaxationszeiten des Liganden mit oder ohne Protein ähnlich. Nach der Bindung (Q < 1) nehmen die Signalintensitäten mit zunehmender Relaxation für die Probe, die das Protein enthält, ab. (B) Schematische Darstellung des chemischen Austauschs zwischen freien und gebundenen Zuständen von D-Mannose. Abhängig von den relativen Werten der chemischen Verschiebungsdifferenz (Δω) und der Wechselkurskonstante (kex = kein + kaus) fällt das System in langsame, mittlere oder schnelle Austauschregime. (C)1H NMR-Spektren von freier D-Mannose und D-Mannose in Gegenwart von CVN, die Unterschiede in den Signalintensitäten bei 8 ms und 800 ms Relaxationszeiten zeigen. Die berechneten Q-Faktoren für spezifische Wasserstoffatome (H6β, H3β, H5α, H4β) sind dargestellt, wobei niedrigere Q-Werte auf stärkere Wechselwirkungen mit CVN hinweisen und die Regionen des Zuckers identifizieren, die an der Bindung beteiligt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: CSP-Analyse (Chemical Shift Perturbation), die CVN-Reste aufdeckt, die an der D-Mannose-Bindung beteiligt sind. (A) Balkendiagramme, die die Rückgratamid-CSPs (15 N-1H) von CVN nach Titration mit D-Mannose bei Konzentrationen von 10 mM (oben) und 60 mM (unten) zeigen. Die horizontalen Linien zeigen den durchschnittlichen CSP zuzüglich einer oder zwei Standardabweichungen (av + sd, av + 2 sd), die als Schwellenwerte zur Identifizierung signifikant gestörter Rückstände verwendet wurden. (B) Kartierung von signifikant gestörten Resten auf die Struktur von CVN, die mit dem Disaccharid Manα1-2Manα komplexiert sind (PDB-ID: 1IIY40). Rückstände mit CSPs über dem av + 2 sd-Schwellenwert sind rot hervorgehoben, Rückstände zwischen av + sd und av + 2 sd sind blau dargestellt. Die Disaccharid-Moleküle Manα1-2Manα sind orange dargestellt, um ihre Bindungsstelle anzuzeigen. (C) Ausgewählte Bindungskurven, die CSPs in Abhängigkeit von der D-Mannose-Konzentration darstellen. Die Daten wurden gemäß Gleichung 5 als Single-Site-Bindungsmodell zur Schätzung von KD angepasst, wobei eine Reihe von Affinitäten aufzeigte, wobei D44 die stärkste Wechselwirkung (KD = 1,1 ± 0,35 mM) und E41 die schwächste (KD = 35 ± 29 mM) zeigte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Analyse von 15N-R2 für CVN, frei und an D-Mannose gebunden. (A, B) Transversale Relaxationsraten (15N-R2), gemessen für jeden Rest von CVN in seinem (A) freien und (B) D-Mannose-gebundenen Zustand. (C) Differenz derR2-Werte (ΔR2 =R2-gebunden−R2-frei), aufgetragen pro Rückstand. Die blauen und roten Linien stellen eine bzw. zwei Standardabweichungen vom Durchschnitt dar (av ± sd und av ± 2 sd). Rückstände mit signifikanten ΔR2-Werten werden gekennzeichnet. (D) Kartierung der ΔR2-Werte für die Struktur von CVN, das mit dem Disaccharid Manα1-2Manα komplexiert ist (PDB-ID: 1IIY40). Rückstände mit ΔR2 über oder unter av± 2 sd sind rot dargestellt; Diejenigen zwischen AV± SD und AV± 2 SD werden blau dargestellt. D-Mannose-Moleküle werden orange dargestellt, um ihre Bindungsstelle anzuzeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Ergebnisse

In der vorliegenden Arbeit haben wir NMR-Experimente vorgestellt, um Protein-Glykan-Wechselwirkungen zu untersuchen. Die molekulare Protein-Glykan-Erkennung liegt zahlreichen biologischen Prozessen zugrunde, an denen die extrazelluläre Matrix (ECM) beteiligt ist, einschließlich der Regulation der Zelladhäsion, Migration, Proliferation und verschiedener anderer Formen der zellulären Kommunikation.

Hier haben wir uns für das Monosaccharid D-Mannose entschieden, das als schwaches Bindemittel besc...

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Diskussion

Die NMR-Spektroskopie stellt einen vielseitigen Ansatz zur Untersuchung von Protein-Glykan-Wechselwirkungen dar, insbesondere aufgrund ihrer Fähigkeit, schwache und transiente Wechselwirkungen, wie sie zwischen CVN und D-Mannose beobachtet werden, zu detektieren. Das hier beschriebene Protokoll kombiniert liganden- und proteinbasierte NMR-Methoden, was eine umfassendere Charakterisierung der Interaktionsschnittstelle ermöglicht.

Zu den kritischen Schritten des...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken dem Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear Jiri Jonas (CNRMN) für den Einsatz der NMR-Spektrometer. Wir danken Dr. Carole Bewley, dass sie mit uns die chemischen Shift-Aufgaben von CVN im Komplex mit Manα1-2Manα geteilt hat. Wir danken auch den Förderorganisationen FAPERJ und CNPq.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
13C GlukoseCambrige Isotopenlabor.CLM-481
15N AmmoniumchloridCambrige Isotopenlabor.NLM-467
CalciumchloridSigma-AldrichNr. C4901
Coquetel hemmen die ProteaseSigma-Aldrich4693159001
D2OCambrige Isotopenlabor.DLM-4
D-MannoseSigma-AldrichM2069-5G
MagnesiumchloridSigma-AldrichM8266
NMRPipeLink zum Software-Tutorial: https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/demo.html
Kaliumchlorid (K2HPO4)Sigma-AldrichNr. P3786
Kaliumchlorid (KCl)Sigma-AldrichNr. P3911
Kaliumchlorid (KH2PO4)Sigma-AldrichNr. P0662
Shigemi-RöhreBrukerZ1Z10684A
Natriumchlorid (NaCl)Sigma-AldrichNr. S9625
Natriumphosphat (Na2HPO4)Sigma-Aldrich567545
Natriumphosphat (NaH2PO4)Sigma-AldrichNr. S97263
Spektrometer Bruker 600 MHzBruker
Spektrometer Bruker 800 MHzBruker
TiaminSigma-AldrichNr. T1270
Dreifachresonanz-TXI-SondeBruker
TryptonSigma-Aldrich93657
HefeextraktSigma-AldrichNr. Y1625

Referenzen

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NMR Spektroskopiechemische VerschiebungsperturbationS ttigungstransferdifferenzLigandenbindungs MappingD Mannose BindungCyanovirin NRelaxationsratenanalysestrukturelle Dynamik

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