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Knochenschützende Rolle von Bupleurum in einem Rattenmodell für postmenopausale Osteoporose

DOI:

10.3791/68675

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August 22nd, 2025

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1YouJiang Medical University for Nationalities, 2Affiliated Hospital of YouJiang Medical University for Nationalities, 3ShenZhen International Travel Health Care Center (ShenZhen Customs Port Clinic)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dieser Studie verwendeten wir ein ovariektomiertes Rattenmodell der postmenopausalen Osteoporose, um zu zeigen, dass die orale Flüssigkeit von Bupleurum (Chai hu) die Knochenmikrostruktur verbessert, indem sie entzündungsfördernde Faktoren unterdrückt und entzündungshemmende Faktoren verstärkt. Dies deutet darauf hin, dass sein entzündungshemmender Mechanismus die durch Östrogenmangel induzierte Osteoporose teilweise abschwächt.

Abstract

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Ziel des Protokolls ist es, die Auswirkungen der Verabreichung von Chai Hu auf die postmenopausale Osteoporose bei ovariektomierten (OVX) Ratten zu untersuchen. Acht Wochen alte weibliche Sprague-Dawley-Ratten wurden einer bilateralen Ovariektomie mit dem dorsalen Zugang unterzogen, um ein postmenopausales Osteoporosemodell zu erstellen. Unterschiedliche Dosen von Chai Hu Flüssigkeit zum Einnehmen wurden 12 aufeinanderfolgende Wochen lang durch eine orale Sonde verabreicht, gefolgt von Bewertungen der Knochenmikrostruktur und Messungen der entzündlichen Zytokinspiegel. Die Behandlung mit mittel- und hochdosiertem Chai Hu hemmte teilweise den Knochenabbau, reduzierte die entzündungsfördernde Zytokinexpression und erhöhte die entzündungshemmenden Zytokinspiegel bei OVX-Ratten. Es gab eine signifikante Verringerung des Schweregrads der Knochenzerstörung von niedrigen zu hohen Dosen, und es wurden dosisabhängige Verbesserungen bei der mikrostrukturellen Knochenrekonstruktion beobachtet. Chai hu milderte den durch Östrogenmangel induzierten Knochenverlust und die mikrostrukturelle Verschlechterung und unterdrückte dadurch das Fortschreiten der OP in diesem OVX-Modell. Dies war wahrscheinlich auf die entzündungshemmende Wirkung der beteiligten Signalwege zurückzuführen.

Introduction

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Osteoporose (OP) ist eine häufige metabolische Knochenerkrankung, die durch verminderte Knochenmasse, verminderte Knochenstärke und Zerstörung der Knochenmikroarchitektur gekennzeichnetist 1. Die OP kann sich entweder primär oder sekundär manifestieren, und die primäre OP wird als postmenopausale OP (PMOP), senile OP und idiopathische OP (die häufig bei Jugendlichen auftritt) klassifiziert. Unter ihnen tritt PMOP Typ I hauptsächlich bei PM-Frauen auf, bei denen es nach der Menopause aufgrund reduzierter zirkulierender Östrogenspiegel2 zu einer deutlichen Abnahme der Knochendichte kommt. Es handelt sich um eine systemische metabolische Knochenerkrankung, die zu einer erhöhten Osteoklastenaktivität und einer intensiven Differenzierung führt3. Darüber hinaus ist die Intensität des Knochenabbaus viel größer als seine Bildung, was zu einer verminderten Knochenmasse sowie einer erhöhten Knochenbrüchigkeit und einem erhöhten Frakturrisikoführt 4.

Aktuelle Forschungen haben ergeben, dass viele chronisch entzündliche Erkrankungen wie Osteoarthritis und Parodontitis mit einem signifikanten Knochenverlust verbunden sind, was darauf hindeutet, dass Entzündungen eng mit OP5 zusammenhängen könnten. Mit zunehmendem Alter nehmen neben endokrinen Veränderungen auch die physiologischen und Immunfunktionen ab, und der Körper befindet sich über lange Zeiträume in einem Zustand chronischer Entzündungen. Viele dieser entzündungsfördernden Faktoren und T-Zell-abgeleitete Zytokine spielen eine wichtige Rolle beim Knochenschwund. Daher wird PMOP auch als chronisch entzündliche Erkrankung anerkannt 6,7.

Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) hat eine lange Geschichte und reiche klinische Erfahrung in der Prävention und Behandlung von PMOP, wobei sie sich auf ein ganzheitliches Management und eine individualisierte Diagnose und Behandlung konzentriert und gleichzeitig das endokrine System und das Immunsystem regulieren kann, was ein Segen für postmenopausale Frauen ist8. Sie ermöglicht einem großen Teil der Frauen den Zugang zu medizinischer Behandlung. Moderne pharmakologische Studien und klinische Studien haben gezeigt, dass TCM die Vorteile von Multi-Targeting, geringer Toxizität und Nebenwirkungen hat und kostengünstig ist. Das Risiko von Komplikationen kann bei der TCM-Behandlung von PMOP9 stark reduziert werden.

Chai Hu selbst hat entzündungshemmende10 und antidepressive11Eigenschaften, und es kann die Hormonsekretion im Körper regulieren12 sowie die Gesundheit fördern13. Chai Hu ist der Hauptbestandteil, der eine wichtige Rolle in der TCM-Verbindungsformel Xiaoyao Pills spielt, die die Wirkung hat, Emotionen zu beruhigen, die Verdauung und die Aufnahme in Magen und Darm zu fördern. Es ist auch dafür bekannt, das Qi und die Blutenergie wieder aufzufüllen sowie die Symptome des Menstruationszyklus und die damit verbundenen Beschwerden zu regulieren14. Der Hauptbestandteil von Chai Hu ist Chai Hu Saponin, das eine starke entzündungshemmende Wirkung hat, die sich hauptsächlich in der Hemmung der Expression von entzündungsfördernden Zytokinen wie Tumornekrosefaktor α (TNF-α), Interleukin 1β und IL-615 manifestiert. Darüber hinaus erhöht es die Expression des entzündungshemmenden Zytokins IL-10 und lindert dadurch Entzündungen wie Kolitis, Endometritis undHepatitis 16.

Im Vergleich zu Standard-OP-Behandlungen (einschließlich der Verwendung von Bisphosphonaten17, selektiven Östrogenrezeptormodulatoren18 und Denosumab19) hat Chai Hu als häufig verwendete TCM den potenziellen Vorteil eines Mehrkomponenten- und Multi-Target-Wirkmechanismus. Standardtherapien zielen in der Regel auf spezifische Stoffwechselwege des Knochensab 20 (Hemmung der Osteoklastenaktivität), die mit bestimmten Nebenwirkungen wie Magen-Darm-Beschwerden, einem erhöhten Risiko für Osteonekrosen des Kiefers und grippeähnlichen Symptomen sowie langfristig hohen Arzneimittelkosten verbunden seinkönnen 21.

Eine Überprüfung der einschlägigen Literatur ergab, dass die Anwendung von Chai Hu zur Intervention bei PM-Ratten mit OP therapeutische lindernde Wirkungen haben könnte22. Basierend auf bioinformatischen und pharmakologischen Analysen sowie molekularen Docking-Simulationen zur Vorhersage von Andockstellen23 stellten wir die Hypothese auf, dass Chai Hu in den Entzündungsprozess eingreifen, den Immunstatus des Körpers modulieren und die Immunhomöostase der Knochen wiederherstellen könnte. Diese begünstigen die Stabilität des Knochenrekonstruktionszustands und erzielen den gewünschten therapeutischen Effekt der Linderung der OP.

In dieser Studie wurde Chai Hu Flüssigkeit zum Einnehmen (Konzentration: 1 g/ml) über 12 aufeinanderfolgende Wochen verabreicht. Das Dosierungsschema wurde auf der Grundlage klinisch üblicher Dosen in TCM- und pharmakokinetischen Studien entwickelt24.

Das übergeordnete Ziel dieser Verabreichungsmethode ist es, ein stabiles und klinisch relevantes Dosierungsprotokoll zu etablieren und damit die anhaltende Interventionswirkung von Chai Hu im Zielmodell (einem Rattenmodell der postmenopausalen Osteoporose) systematisch zu bewerten. Dieser Verabreichungsansatz stellt sicher, dass das Medikament während des gesamten Versuchszeitraums eine wirksame Plasmakonzentration beibehält, und bietet eine zuverlässige Interventionsgrundlage für nachfolgende Bewertungen (wie z. B. Knochenstoffwechselindikatoren und Entzündungsfaktoren). Darüber hinaus hilft es, die Rolle von Chai Hu bei verwandten Krankheiten sowie seine Dosis-Wirkungs-Beziehung zu klären und bietet gleichzeitig ein Referenzparadigma für die standardisierte Verabreichung traditioneller chinesischer Arzneimittel in der experimentellen Forschung.

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Protocol

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Alle Versuchsverfahren mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (8. Auflage) durchgeführt und von der Tierethikkommission der Youjiang Medical University for Nationalities speziell genehmigt (Zulassung Nr. 2024071001).

1. Analyse der Netzwerkpharmakologie

HINWEIS: Die Cyberpharmakologie ist ein Ansatz, der Systembiologie, Computerbiologie und Pharmakologie kombiniert und darauf abzielt, den Wirkmechanismus von Arzneimitteln und Arzneimittelwechselwirkungen durch die Analyse biomolekularer Netzwerke zu verstehen25.

  1. Screening von Wirkstoffen mit guter oraler Bioverfügbarkeit (OB) und Wirkstoffähnlichkeit (DL) unter Verwendung von Tools wie der Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP: http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php). Legen Sie den OB auf ≥30 % und den DL auf ≥0,1826 fest. Suchen Sie nach Chai hu und klicken Sie auf Kräuterdetails und laden Sie alle Verbindungsdaten herunter. Nennen Sie die heruntergeladene Datei Chaihu.
  2. Rufen Sie den Zielnamen des Kernbestandteils ab, indem Sie die MOL-ID des Kernbestandteils in die TCMSP-Datenbank einfügen. Fügen Sie es in die TCMSP-Batch-Suche ein, wählen Sie Zielvorhersage aus und klicken Sie dann auf Senden.
  3. Öffnen Sie die UniProtsh-Datenbank, kopieren Sie die Spalte Zielname in die Suche und suchen Sie den fett formatierten Proteinnamen, der genau mit dem eingefügten Zielproteinnamen übereinstimmt. Nachdem Sie den entsprechenden Proteinnamen gefunden haben, sammeln Sie die entsprechenden Gennamen in der Spalte dahinter.
  4. Filtern Sie die Osteoporose-bezogenen Gene in der GeneCards (https://www.genecards.org)-Datenbank nach dem Relevanz-Score ≥ 1 und erhalten Sie alle (5741) Gene27.
    HINWEIS: Die Gründe für die Auswahl von Genen mit einem Relevanz-Score ≥ 1 aus der GeneCards-Datenbank sind wie folgt: Ein Score ≥ 1 zeigt an, dass das Gen dokumentierte Assoziationen mit der Zielkrankheit aufweist, was es klar von Genen ohne berichtete Assoziationen unterscheidet (Score = 0). Dieser Schwellenwert gewährleistet den Erhalt von Genen mit glaubwürdiger Krankheitsrelevanz und vermeidet gleichzeitig eine übermäßige Interferenz durch nicht verwandte Gene. Ein niedrigerer Schwellenwert (<1) kann Gene ohne validierte Assoziationen einschließen, wodurch die Anzahl falsch positiver Ergebnisse steigt.
  5. Erhalten Sie die sich überschneidenden Gene nach der Kombination krankheitsbezogener Gensätze mit Wirkstoffzielen für die Schnittmenge. Basierend auf den Wechselwirkungen zwischen Krankheitszielen und Wirkstoffen konstruieren Sie mit der Cytoscape-Software ein traditionelles chinesisches Arzneimittel-Wirkstoff-Ziel-Krankheits-Schnittbereichsnetzwerk.
  6. Beziehen Sie Informationen zur Protein-Protein-Interaktion (PPI) über die String-Datenbank (https://cn.string-db.org/) und erstellen Sie ein PPI-Netzwerk. Öffnen Sie Cytoscape (https://www.cytoscape.org), laden Sie die heruntergeladene TSV-Datei im Upload-Netzwerk, wählen Sie dann > TOP10 oder TOP20 berechnen und klicken Sie auf Senden.
  7. Erstellen Sie zwei Tabellen für den Import in Cytoscape. Erstellen Sie eine elektronische Tabellenkalkulationsdatei mit dem Namen Netzwerk. Geben Sie in Spalte A die gleichen MOL-IDs (CH1, CH2...) ein, die durch das Kürzel der Traditionellen Chinesischen Medizin ersetzt wurden. Beschriften Sie Spalte B als MOL-ID und sortieren Sie sie in aufsteigender Reihenfolge nach MOL-IDs. Beschriften Sie Spalte C als Symbol. Kopieren Sie Komponenten-IDs (MOL-IDs) und Gennamen aus Chaihu-bezogenen Dateien in die Spalten B bzw. C. Löschen Sie dann Spalte B, und benennen Sie Spalte A in MOL-ID um.
  8. Erweitern Sie die Tabelle bis zum Ende des Textes. Geben Sie in der Spalte Symbol die MOL-IDs (CH1, CH2...) ein, die durch die Abkürzung der traditionellen chinesischen Medizin ersetzt wurden. Geben Sie in der Spalte MOL-ID das Kürzel der traditionellen chinesischen Medizin ein: CH. Mit den oben genannten Schritten ist die Informationsergänzung und der Aufbau des Netzwerks Traditionelle Chinesische Medizin - Komponente - Ziel abgeschlossen.
  9. Führen Sie als Nächstes das zweite Formular aus, die TYPE-Datei. Erstellen Sie eine neue Tabelle, und nennen Sie sie TYPE. Beschriften Sie Spalte A als Begriff und Spalte B als TYP. Kopieren Sie den Gennamen in die Spalte "Begriff" und geben Sie ihm das Attribut "Gen" in der Spalte "Typ" (der Zweck besteht darin, nach dem Gen zu suchen; es werden alle Gennamen ausgewählt, damit es einfach zu bedienen ist). Geben Sie die Inhaltsstoffe in die Spalte Begriff ein, und geben Sie dem Inhaltsstoff das Attribut drug1.
  10. Import in die Cytoscape-Software. Netzwerk importieren, um die Netzwerkdatei hochzuladen, und Tabelle importieren, um die Typdatei hochzuladen. Geben Sie im Suchfeld gene ein, drücken Sie die EINGABETASTE, sodass alle Gene ausgewählt sind, ziehen Sie die ausgewählten Gene nach links, und klicken Sie dann auf Layout > Attribute() > Selected (wählen Sie in den Klammern rund oder quadratisch aus).
  11. Kombinieren Sie die Ergebnisse der netzwerkpharmakologischen Analyse mit experimentellen Daten, um die Schlüsselverbindungen und molekularen Mechanismen der Arzneimittelwirkung zu identifizieren.

2. Molekulares Andocken

HINWEIS: Molekulares Docking ist eine Berechnungstechnik zur Vorhersage des optimalen Bindungsmodus und der Affinität zwischen einem kleinen Molekül (Liganden) und einem Zielprotein oder Biomolekül28.

  1. Rezeptor- und Ligandenvorbereitung
    1. Rezeptor (Protein)-Quelle: Beziehen Sie die PDB-Datei der Zielproteine aus der RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org). Suchen Sie nach 3Q4B (Beispiel für einen IL-6-Rezeptor) und klicken Sie auf Dateien > PDB-Format herunterladen.
    2. Entfernen Sie kristallographische Wassermoleküle, indem Sie auf Bearbeiten klicken > > Wasser, Fremdionen und nicht essentielle Liganden löschen (kritische Cofaktoren wie Metallionen beibehalten), indem Sie auf Bearbeiten klicken > > Heteroatome löschen. Fügen Sie fehlende Wasserstoffatome hinzu, indem Sie auf Bearbeiten > Wasserstoffatome > Hinzufügen klicken. Speichern Sie als protein.pdbqt. indem Sie auf Edit > Charges > Compute Gasteiger und dann auf Grid > Macromolecule > Select > Save as PDBQT klicken.
    3. Quelle für Liganden (Small Molecule): Laden Sie die Ligandenstruktur von PubChem herunter (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). Suchen Sie nach Saikosaponin A (CID:6443568), klicken Sie auf 3D-Konverter > SDF herunterladen.
    4. Verwenden Sie die Open Babel-Software, um die Saikosaponin A-Datei im SDF-Format in eine Datei im PDB-Format mit niedrigenergetischen dreidimensionalen Konformationen umzuwandeln, und nennen Sie sie saikosaponinA.
  2. Einrichten von Docking-Parametern (AutoDock-Werkzeuge)
    1. Laden Sie Rezeptor- und Ligandendateien. Importieren Sie die niedermolekulare Datei saikosaponin A und speichern Sie sie als PDBQT-Datei. Laden Sie anschließend den Rezeptor und den Liganden: Klicken Sie auf Andocken > Makromolekül > Öffnen, wählen Sie IL6_receptor.pdbqt; Klicken Sie dann auf Andocken > Ligand > Öffnen die Option saikosaponinA.pdbqt.
    2. Konfigurieren Sie die Grid-Box: Klicken Sie auf Grid > Grid Box, passen Sie die Box-Größe so an, dass sie die aktive Site vollständig umfasst (verwenden Sie den Drehregler auf der linken Seite zur Feinabstimmung), speichern Sie dann die aktuellen Einstellungen, indem Sie auf Datei klicken > Speichern von aktuell schließen und die Datei grid.gpf nennen.
    3. Richten Sie das laufende AutoGrid-Programm ein: Klicken Sie auf AutoGrid ausführen, wählen Sie die Datei grid.gpf aus, und klicken Sie dann auf Starten. Konfigurieren Sie als Nächstes die Docking-Parameter: Klicken Sie nacheinander im Menü Docking auf Makromolekül und wählen Sie die Proteindatei IL6_receptor.pdbqt aus. Klicken Sie auf Ligand und wählen Sie die niedermolekulare Datei saikosaponin A.pdbqt aus. Stellen Sie den genetischen Algorithmus ein und bestätigen Sie ihn. Docking-Parameter anpassen und bestätigen. Wählen Sie abschließend in Ausgabe den Lamarckschen Algorithmus (4,2) aus, nennen Sie die Datei dock.dpf, und speichern Sie sie.
    4. AutoGrid ausführen und Ergebnisse speichern: Klicken Sie auf AutoDock ausführen, wählen Sie die Datei dock.dpf aus und starten Sie die Simulation. Klicken Sie nach Abschluss des Vorgangs auf Write Complex, benennen Sie die komplexe Struktur, und speichern Sie sie im PDBQT-Format.
  3. Ergebnisanalyse mit PyMOL
    1. Konvertieren Sie die Datei im PDBQT-Format, die Sie aus dem vorherigen molekularen Docking-Schritt erhalten haben, mit der Open Babel-Software in das PDB-Format. Importieren Sie dann die Datei im PDB-Format in die PyMOL-Software, um nachfolgende Visualisierungsvorgänge durchzuführen.
    2. Suchen Sie den Liganden und trennen Sie ihn einzeln: Nachdem Sie den Liganden ausgewählt haben, ändern Sie seine Farbe, indem Sie auf Auswählen klicken und dann eine Farbe aus Farbe auswählen. Klicken Sie in der Spalte Sele unter Aktion auf Objekt extrahieren , um den Liganden als neues unabhängiges Objekt zu extrahieren.
    3. Messung des Wasserstoffbrückenabstands: Klicken Sie in der Spalte sele auf Aktion, suchen Sie nach Polaren Kontakten und klicken Sie auf Zu anderen Atomen im Objekt; Wasserstoffbrückenbindungen werden als gelbe Linien dargestellt. Klicken Sie in der Spalte Assistent auf die Option Messung , klicken Sie nacheinander auf die Atome an beiden Enden der Wasserstoffbrücke , und klicken Sie dann auf Fertig , um die Messung abzuschließen.
  4. Bild exportieren: Klicke auf "Bild als PNG in Datei exportieren". Wenn High-Definition-Rendering erforderlich ist, geben Sie ray 300 (Pixel einstellbar) ein und drücken Sie die Eingabetaste.

3. Mikro-CT-Analyse

  1. Injizieren Sie weiblichen SD-Ratten (32 Wochen alt, 320-350 g) intraperitoneal Pentobarbital-Natrium (40 mg/kg) für eine tiefe Anästhesie, bestätigt durch das Fehlen eines Hornhautreflexes (kein Blinzeln bei Berührung mit Wattestäbchen) und eines Schmerzreflexes (keine Kontraktion der Hintergliedmaßen zum Einklemmen der Zange).
    1. Führen Sie eine Operation zur Isolierung der Hintergliedmaßen durch. Euthanasieren Sie die Ratten durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium in einer Dosis, die das 3-5-fache der chirurgischen Anästhesiedosis (40 mg/kg) beträgt, legen Sie sie in Rückenlage und machen Sie einen 3 cm langen Querschnitt, 1 cm über der Schambeinfuge entlang des Leistenbandes. Präparieren Sie den Spalt zwischen dem Musculus gracilis und dem Musculus sartorius, um die Arteria femoralis freizulegen (pulsierende tubuläre Struktur). Ligattieren Sie beide Enden der Oberschenkelarterie mit 4-0-Nähten und lassen Sie einen unligierten Abschnitt dazwischen, bevor Sie das Gefäß mit einer Augenschere abschneiden und durchschneiden.
    2. Drehen Sie die untere Extremität nach innen, um den Hüftkopf aus der Hüftpfanne zu verrenken und die Gelenkkapsel und das runde Band zu durchtrennen, um die Integrität des Hüftkopfes zu erhalten. Tauchen Sie die intakte Hintergliedmaße in vorgekühlte Kochsalzlösung und fixieren Sie sie dann 24-48 h lang in 4%iger Formaldehydlösung.
  2. Bildgebungsaufbau: Liefern Sie den fixierten Oberschenkelknochen für die Mikro-CT-Untersuchung in die Einrichtung. Schalten Sie das Micro-CT-Gerät ein und wählen Sie das voreingestellte Programm "Small Animal Bone Scanning ". Verwenden Sie die folgenden Scan-Parameter: Röntgenspannung = 90 kV, Röntgenstrom = 80 μA, Sichtfeld (FOV) = 36 mm, Pixelgröße = 72,0 μm, Rotation = 360°, Scandauer = 14 min.
  3. Legen Sie den Femur des linken Beins der fixierten Ratte in den Probenhalter, fixieren Sie die zu fotografierende Femurepiphyse, starten Sie das Gerät und warten Sie, bis der Selbsttest abgeschlossen ist. Starten Sie einen Vorschau-Scan (schneller Scan mit niedriger Auflösung), um zu bestätigen, dass die Probe zentriert ist, und passen Sie dann den interessierenden Bereich so an, dass er den gesamten Oberschenkelknochen abdeckt.
  4. Wenn das Scannen und Fotografieren abgeschlossen ist, wird die Röntgenlichtquelle automatisch ausgeschaltet. Zu diesem Zeitpunkt überschreitet der Strahlungswert im Inneren des Geräts die Norm, und es ist strengstens verboten, die Probe ohne Schutzausrüstung zu entnehmen.
  5. Bildanalyse: Analysieren Sie Knochenparameter (Knochenmineraldichte [BMD], Trabekelzahl) mit der integrierten Software des Scanners. Speichern und exportieren Sie rekonstruierte Bilder zur weiteren Auswertung.

4. Quantitative real-time PCR zur RNA-Extraktion aus Knochengewebe von Ratten

  1. Entfernen Sie anhaftende Muskeln und Faszien am rechten Oberschenkelknochen. Schneiden Sie 100-200 mg Knochengewebe in kleine Stücke. Fügen Sie 2-3 Mahlkugeln und 500 μl RNA-Extraktionspuffer hinzu. Mit einer Tissuemühle bei 70 Hz für 5 min bei 4 °C homogenisieren.
  2. Phasentrennung: Nach der Zentrifugation trennt sich die Lösung in eine obere wässrige Phase (enthält RNA) und einen unteren dunklen Niederschlag (enthält Proteine, DNA und Polysaccharide). Übertragen Sie vorsichtig 500 μl des Überstands in ein neues RNase-freies 1,5-ml-Röhrchen.
  3. Die aus der Isolierung gewonnene obere Lösung für die Gesamt-RNA-Extraktion wird gemäß den Anweisungen des Herstellers verarbeitet.
  4. Nachdem Sie der Lyselösung Isopropanol zugesetzt haben, drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um, um die Lösung zu mischen, und lassen Sie es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen. Führen Sie an dieser Stelle eine Sichtprüfung durch. Wenn weiße flockige RNA-Ausfällungen beobachtet werden (die an der Röhrenwand haften), deutet dies darauf hin, dass die RNA effektiv ausgefällt wurde.
  5. Verwenden Sie eine 200-μl-Pipettenspitze, um die Restflüssigkeit abzusaugen. Halten Sie das weiße RNA-Pellet am Boden/an der Wand des Röhrchens fest. RNA in 50-100 μl RNase-freiem Wasser resuspendieren und bei -80 °C lagern.
  6. Mischen Sie 2 μl RNA-Template, 10 μl Mastermix, 2 μl DNase und 5 μl nukleasefreies Wasser in einem nukleasefreien Röhrchen. Vorsichtig durch Pipettieren mischen.
  7. 2 Minuten lang bei 37 °C inkubieren, um genomische DNA-Kontaminationen zu entfernen. Bei 55 °C 15 min inkubieren. Am Ende der Reaktion 5 Minuten lang bei 85 °C inkubieren, um die Reaktion abzubrechen.
  8. Konfigurieren Sie das quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-System, indem Sie die reverse-transkribierte DNA auf Eis legen. Alle Komponenten vormischen: 10 μl qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox), je 0,4 μl Forward Primer und Reverse Primer sowie 8,2 μl RNase-freies Wasser, teilen und 1 μl DNA hinzufügen, auf Eis manipulieren und vor Licht schützen.
  9. Führen Sie das qPCR-Programm wie folgt durch: Vordenaturierung bei 95 °C für 5 Minuten, 1 Zyklus, gefolgt von einer Denaturierung bei 95 °C für 10 s für 40 Zyklen. Führen Sie Glühen, Dehnung und Fluoreszenzerfassung bei 60 °C für 30 s für 40 Zyklen im SYBR Green-Kanal durch. Erhalten Sie eine Schmelzkurve für Temperaturen von 65-95 °C mit 0,5 °C Schritten/Schritt und 5 s/Schritt. Die verwendeten Grundierungen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

5. Vorbereitung der Tiere

  1. Es werden 48 weibliche nullipare SD-Ratten (LSF-Qualität, 8 Wochen alt, Körpergewicht 200-220 g) erhalten.
  2. Vor den experimentellen Eingriffen sind alle Ratten mit einer 7-tägigen Quarantänezeit in einer Isolationseinrichtung mit Lichtschutzfaktor zu akklimatisieren und in einer Laborumgebung mit Lichtschutzfaktor (Temperatur: 22-24 °C, Luftfeuchtigkeit: 45 %-55 %) unterzubringen.

6. Vorbereitung des Testmedikaments

  1. Besorgen Sie sich Chai Hu Oral Liquid (China National Medical Product Approval No. Z41021539). Die Formulierung enthält Chai Hu (nördliche Quelle) als Wirkstoff mit Hilfsstoffen wie Aromastoff, Saccharose und Propylenglykol. Jedes 10-ml-Fläschchen enthält einen Extrakt, der 10 g rohem Kraut entspricht.

7. Vorbereitung eines ovariektomierten Rattenmodells

  1. Präoperative Vorbereitung: Schnelle Ratten für 12 Stunden mit ad libitum Zugang zu Wasser. Führen Sie die Sterilisation von Instrumenten durch, indem Sie alle chirurgischen Instrumente autoklavieren.
  2. Anästhesie und Vorbereitung: Verabreichen Sie Pentobarbital-Natrium durch intraperitoneale Injektion (40 mg/kg). Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie das Fehlen des Hornhautreflexes (kein Blinzeln bei Berührung der Hornhaut mit einem Wattestäbchen) und das Fehlen des Zehenquetschreflexes (kein Zurückziehen der Hintergliedmaßen beim Einklemmen) beurteilen. Nach 15-20 Minuten die Operationsstelle rasieren, mit Jod desinfizieren und mit einem Fenstertuch abdecken. Tragen Sie während der Operation eine Vitamin-A-Augensalbe (mit 15.000 IE/g) auf, um ein Austrocknen der Augen des Tieres zu verhindern (Tabelle 2).
  3. Ovariektomiertes Rattenmodell: Führen Sie die Operation in einem speziellen sterilen Operationssaal durch. Das gesamte Personal trug vollständige Isolationskittel. Wischen Sie die Arbeitsplatte und die umgebenden Geräte vor der Operation mit 75 % Ethanol ab (Tabelle 2) und schalten Sie die UV-Lampen mindestens 30 Minuten lang ein, um Mikroben in der Luft und auf Oberflächen zu beseitigen.
    1. Machen Sie einen 1 cm langen Schnitt in der Rückenhaut, präparieren Sie stumpf das Unterhautgewebe, drücken Sie die Muskelschicht zusammen und machen Sie einen 1 cm langen Schnitt. Lokalisieren Sie das Fettpolster und zeigen Sie es nach außen, um den Eierstock (leuchtend rot) zu identifizieren. Lilizieren Sie den Eileiter mit einer 4-0-Naht, entfernen Sie das Eierstockgewebe und legen Sie es in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit 4 % Paraformaldehyd (Tabelle 2).
  4. Wundverschluss und Desinfektion: Streuen Sie vor dem Nähen Penicillinpulver in die Wunde. Vernähen Sie die Muskelschicht mit dem nicht resorbierbaren Nahtmaterial Nr. 6 und schließen Sie die Haut mit dem Nahtmaterial Nr. 2. Desinfizieren Sie den geschlossenen Schnitt mit Jod und tragen Sie topisches Penicillinpulver auf.
  5. Postoperative Pflege: Setzen Sie Ratten in frische Käfige mit warmen Wasserflaschen und Handtüchern, um die Körpertemperatur zu halten. Schnelle (wassererlaubte) Tiere für 24 Stunden nach der Operation, um einen Darmverschluss zu verhindern. Tragen Sie an 3 aufeinanderfolgenden Tagen täglich Penicillinpulver auf die Inzisionsstelle auf.
    1. Injizieren Sie Lidocain (1%-2% Konzentration, maximal 5 mg/kg) um den chirurgischen Schnitt herum, um die unmittelbaren postoperativen Schmerzen zu reduzieren. Führen Sie eine kontinuierliche Analgesie für 3-5 Tage ein und verjüngen Sie die Dosis allmählich je nach Schmerzstärke, um ein abruptes Absetzen zu vermeiden.
    2. Halten Sie das Tier vor dem Aufwachen in der Seitenlage oder mit dem Kopf nach unten, um ein Herunterfallen der Zunge und eine Obstruktion der Atemwege zu vermeiden. Ermöglichen Sie eine autonome, komfortable Positionierung nach dem Aufwachen. Isolieren Sie postoperative Tiere bis zur vollständigen Genesung von anderen, um Kämpfe oder Kreuzinfektionen zu vermeiden (Abbildung 1).

8. Experimentelle Gruppierung und Verabreichung von Arzneimitteln

  1. Gruppenzuordnung: Teilen Sie insgesamt 40 SD-Ratten in fünf Gruppen (n = 8 pro Gruppe) auf, nämlich normale Kontrolle, Modellkontrolle, Chai hu mit niedriger Konzentration, Chai hu mit mittlerer Konzentration und Chai hu mit hoher Konzentration.
  2. Für die Gruppe mit mittlerer Dosis (5 ml/kg) wählen Sie die Dosierung basierend auf den Richtlinien in29,30. Befolgen Sie ein Konzentrationsgradientenverhältnis von 1:2:4 für die Gruppe mit niedriger Konzentration: 2,5 ml/kg, die Gruppe mit mittlerer Konzentration: 5 ml/kg und die Gruppe mit hoher Konzentration: 10 ml/kg.
  3. Verabreichung des Arzneimittels: Verwenden Sie eine orale Sonde und verabreichen Sie das Medikament einmal täglich. Bei der normalen Kontrollgruppe und der Modellkontrollgruppe (Tiere, die einer bilateralen Ovariektomie unterzogen wurden) ist eine orale Sonde mit der gleichen Menge Kochsalzlösung durchzuführen. Beginnen Sie die Behandlung in Woche 1 nach der Operation und setzen Sie sie 12 Wochen lang fort.

9. Analyse und Datenerhebung nach dem Experiment

  1. Führen Sie die folgenden Analysen an fünf Tiergruppen durch: Mikro-CT der Knochenstruktur und Bestimmung der inflammatorischen Zytokin-mRNA-Expression in Femurgeweben von Ratten.
  2. Sammeln von Daten, die visualisierte Bilder der femoralen trabekulären Mikrostruktur enthalten; quantitative Knochenparameter (einschließlich Knochenmineraldichte, Knochenvolumenanteil, Standardabweichung der Trabekeldicke, Trabekelabstand, Trabekelzahl und Konnektivitätsdichte); und relative mRNA-Expressionsniveaus von proinflammatorischen Zytokinen (IL-6, IL-17) und entzündungshemmenden Zytokinen (IL-4, IL-10) im Femurgewebe.
  3. Führen Sie Datenanalysen mit der Software GraphPad Prism 10.1.2 durch unidirektionale Varianzanalyse (ANOVA) durch. Die statistische Signifikanz für die Unterschiede der Mittelwerte zwischen den Gruppen wurde mit p < 0,05 definiert. Post-hoc-Mehrfachvergleiche wurden mit dem Tukey-Test durchgeführt.

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Results

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GO-Funktion und Analyse der KEGG-Signalanreicherung

Wir stützten uns auf GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen in der Bioinformatik, um den potenziellen Wirkmechanismus von Chai Hu auf PMOP vorherzusagen. Die GO-Anreicherungsanalyse von Zielgenen, die sich mit den Wirkstoffen von Chai hu für Krankheiten überschneiden, ergab 2138 signifikante Einträge, und die zehn wichtigsten Ergebnisse sind für jede Gruppe aufgelistet (Abbildung 2D<...

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Discussion

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PMOP ist eine systemische Störung des Knochenstoffwechsels, die häufig bei PM-Frauen auftritt und durch einen Östrogenmangel verursacht wird, der zu einer Störung des Osteoblasten-Osteoklasten-Gleichgewichts führt, was zu einer verstärkten Knochenresorption von Osteoklasten und einer verminderten Knochenproduktion von Osteoblasten führt31. Eine wachsende Zahl von Studien hat gezeigt, dass die Konzentrationen von Entzündungsfaktoren im Körper auch die Unterscheidun...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde vom Baise City Scientific Research and Technology Development Program und dem 2025 Guangxi Universities Young and Middle-aged Teachers Scientific Research Basic Ability Enhancement Project (Projekt-Nr.: 2025KY0549) unterstützt. Die Autoren danken Dr. Dev Sooranna vom Imperial College London und YMUN für die Bearbeitung des Manuskripts. ZY und LYR haben zu gleichen Teilen zu dieser Arbeit beigetragen.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,9% Natriumchlorid-Injektion HuarenpharmaceuticalNr. H1712059
1&mal; PBS Thermofischer10010023
75% Alkohol NanjingreagenzC069156931
95% Ethanol  NanjingreagenzC0691520075
Wasserfreies EthanolMacklinE809056
Bupleurum chinense Henan Baiquan Apotheke Co.Z41021539
Lösung zur Entkalkung Solarbio GmbHNr. E1171
Erythromycin Salbe Guangzhou Baiyunshan Pharmaceutical Group Company Limited Baiyunshan Hejigong Pharmazeutische FabrikH44023088
Isopropylalkohol Jinan Jinrihe Chemical Co.23727-29-9
Penicillin V Kalium KapselnSichuan PharmazieH20103156
Polyformaldehyd (CH2O)nBeyotimeNr. P0099
Povidon-Jod-Desinfektionsmittel Guangdong Hengjian Pharmazeutische Co.H44023924
Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-KitYeasen BiotechnologieArtikel-Nr.: 11201ES03
RNA-ExtraktionskitMonadbiotechMI20201S
RNA-Reverse-TranskriptionskitYuGongBiotechEG15123S
Natrium-Pentobarbital Shanghai Jixiang Biotechnologie Co.JX082085
Trizol ThermofischerArtikel-Nr.: 15596026CN

References

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Postmenopausal OsteoporosisOvariectomized RatsBone MicrostructureChai Hu TreatmentBone Loss InhibitionInflammatory CytokinesAnti Inflammatory PathwaysEstrogen DeficiencyBone DestructionDose Response

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