Methodenartikel

FRET-Verdünnungsassay zur Analyse des dynamischen Austauschs zwischen Proteinanordnungen

DOI:

10.3791/68678

⸱

19. September 2025

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology and the Institute for Collaborative Biotechnologies, University of California, Santa Barbara

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt die Aufreinigung und kovalente Markierung von Reflektin A1 sowie einen FRET-Verdünnungsassay zur Charakterisierung des dynamischen Austauschs von Reflektinprotein zwischen Proteinanordnungen in Abhängigkeit vom Alter.

Zusammenfassung

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Als molekularer Treiber für das einstellbare Schillern bei Kopffüßern ist das einstellbare Phasenverhalten des Reflektin-A1-Proteins nach wie vor ein Schwerpunkt der Biomaterialtechnik. Die Modulation der Salzkonzentration und der Nettoladungsdichte des Proteins von Reflektin A1 treibt das Protein an, dynamische Anordnungen als Zwischenprodukte für die Flüssig-Flüssig-Phasentrennung zu bilden. Obwohl Reflektin-Anordnungen in ihrer Größe durch das Ausmaß der Ladungsneutralisation der kationischen, coulombischen Abstoßung des Proteins begrenzt sind, stehen sie zunächst in dynamischem Austausch mit Monomeren oder Oligomeren aus der umgebenden Lösung. Ein neuartiger FRET-Verdünnungsassay (Fluoreszenzresonanz-Energietransfer) wurde in Verbindung mit dynamischer Lichtstreuung (DLS) und Proteinkonzentrationsassays verwendet, um den Zwei-Wege-Fluss des Proteins zwischen Reflectin-A1-Anordnungen und einer verdünnten Phase in Abhängigkeit vom Assemblierungsalter zu charakterisieren. Dieser FRET-Verdünnungsassay unterscheidet zwischen einem unidirektionalen und einem bidirektionalen Fluss von Proteinanordnungen in und aus Proteinanordnungen und kann daher während der Assemblierungsbildung angewendet werden. Die Unterscheidung zwischen dynamischen und kinetisch gesperrten Proteinanordnungen ist entscheidend für das Verständnis ihrer biophysikalischen Ursprünge, und dieser neuartige FRET-Verdünnungsassay kann angepasst werden, um biophysikalische Untersuchungen anderer Proteinanordnungen zu ergänzen.

Einleitung

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Das einstellbare Schillern bei Loliginiden-Tintenfischen wird durch Reflektinproteine in Iridozytenzellen vermittelt 1,2,3. Iridozyten enthalten ausgedehnte und regelmäßige Membraneinstülpungen, die Stapel von proteindichten Bragg-Lamellen bilden, die das Licht winkel- und wellenlängenabhängig reflektieren 1,4,5,6. Eine durch Acetylcholin ausgelöste Signalkaskade gipfelt in der Phosphorylierung von kationischen Reflektinproteinen 1,2,7, wodurch die elektrostatische Abstoßung innerhalb und zwischen Proteinen reduziert und die Kondensation von Reflektinen in Bragg-Lamellen von Partikeln mit hydrodynamischem Radius von 10 bis 50 nm zu einem dichten flüssigen Kondensatangetrieben wird 3,8,9. Reflektin A1 bildet in vitro größenstabile Anordnungen mit einem Radius von 10+ nm, deren Größen genau durch die Nettoladungsdichtedes Proteins abgestimmt sind 10,11,12, und dieses einstellbare kolloidale Verhalten hat großes biotechnologisches Interesse an der Entwicklung von abstimmbaren biophotonischen Materialien auf Reflektinbasis geweckt 13,14,15,16,17,18. Kürzlich wurde gezeigt, dass NaCl die Reflektin-A1-Assemblierung und LLPS (Flüssig-Flüssig-Phasentrennung) antreibt, indem es den energetischen Beitrag des hydrophoben Effekts entropisch erhöht und die abstoßenden Ladungen der alternierenden kationischen Linker19 abschirmt.

Bei proteindichten flüssigkeitsähnlichen Kondensaten kann der dynamische Austausch zwischen der dichten Phase und der verdünnten Phase leicht mit Hilfe von Ganztröpfchen-FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)20 analysiert werden. Ein analoger Assay für Proteinanordnungen im Nanometerbereich wird benötigt. Jüngste Berichte über physiologisch relevante Proteinanordnungen als Zwischenprodukte zu LLPS 19,21,22 deuten auf die Notwendigkeit äquivalenter Methoden hin, um die Assemblierungsdynamik und den dynamischen Austausch zwischen Assemblierungen und der koexistierenden verdünnten Phase zu untersuchen. Proteincluster können kinetisch verhaftete glasartige Kolloide umfassen, die durch arrestierte spinodale Zersetzung erzeugt werden, dynamische Gleichgewichtsanordnungen, die Monomere oder Oligomere aus der verdünnten Phase austauschen, und metastabile Cluster 23,24,25,26,27. Die altersabhängige Dynamik der Proteinassemblierung ist daher der Schlüssel zum Verständnis der physikalischen Prozesse, die die Bildung von Proteinanordnungen im Kontext eines komplexeren Phasenverhaltens antreiben.

FRET-basierte Ansätze, die die Interaktion zwischen Assemblierungen von Donor-Fluorophor-markierten Proteinen und Assemblierungen von Akzeptor-Fluorophor-markierten Proteinen analysieren, wurden verwendet, um die Dynamik metastabiler Proteincluster zu charakterisieren21. Beim Mischen dieser Cluster zeigt das Auftreten von FRET den Austausch und Transport von Protein in die Cluster21. Bei einigen Proteinen, wie z. B. Reflektin A1, bilden sich jedoch kontinuierlich Cluster und wachsen über die Dauer des Experiments19. Für solche Proteine ist ein Ansatz erforderlich, der den Einwegtransport von Protein in Cluster, wie er bei der kontinuierlichen Bildung dynamisch verhafteter Cluster auftreten könnte, und den bidirektionalen Transport von Protein zwischen Anordnungen dekonvolutiert.

Ein FRET-Verdünnungsansatz erreicht dies durch Fluorophorverdünnung (Abbildung 1), bei der eine Abnahme der FRET einen bidirektionalen Transport des Proteins zwischen den Anordnungen bedeutet. Es wurden Proteinanordnungen des Reflektinproteins hergestellt, die gleiche Mengen an Protein enthielten, das entweder mit Akzeptor-Fluorophor oder Donor-Fluorophor markiert war. Diese co-markierten Reflektin-Anordnungen wurden mit einer Lösung verdünnt, die unmarkierte Reflektin-Anordnungen enthielt, und der dynamische Austausch von Proteinen zwischen Anordnungen wurde in Abhängigkeit vom Assemblierungsalter analysiert. Diese Methode unterscheidet die kontinuierliche Bildung von kinetisch fixierten Proteinclustern von dynamischen Clustern, einschließlich, aber nicht beschränkt auf metastabile Cluster, Cluster, die aufgrund der Ostwald-Reifung oder ähnlicher Vergröberungsprozesse wachsen, Cluster, die durch Fusion wachsen, und Cluster, die keine Zwischenprodukte von LLPS sind. Es wird nicht nur zwischen diesen verschiedenen Mechanismen des dynamischen Austauschs unterschieden, was orthogonale Methoden wie dynamische Lichtstreuung, Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) und Bradford-Assays erfordert19,21. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Aufreinigung von Reflektin A1-Wildtyp und der einzelnen Cystein-haltigen Mutante A1-C232S, die kovalente Markierung von A1-C232S und die FRET-Verdünnungsanalyse.

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Protokoll

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Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Proteinaufreinigung und kovalente Markierung

  1. Transformation
    1. Klonen Sie die Gene Reflektin A1 und A1 C232S (GenBank KF661517.1) in die pj411-Plasmide.
    2. Transfektieren Sie Rosetta 2 (DE3)-Zellen mit Plasmiden mittels Hitzeschockbehandlung28.
    3. Plattentransfizierte Zellen auf Agar mit 50 μg/ml Kanamycin.
    4. Wählen Sie eine isolierte Kolonie aus und geben Sie sie zu 5 mL TB (Terrific Broth) mit 50 μg/mL Kanamycin und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37° C auf einem Shaker bei 250 U/min.
    5. Isolieren Sie Plasmide mit dem Plasmid-Isolationski-Protokoll für die Sequenzierung.
  2. Proteinexpression, Lyse und Einschluss Körperreinigung
    1. 5 ml Kultur zu 1 l LB (Lysogeny Broth) mit 50 μg/ml Kanamycin geben und unter Schütteln bei 37° C inkubieren. Bei A600 von 0,6-0,7 wird die Expression durch Zugabe von IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) zu einer Endkonzentration von 5 mM induziert.
    2. Nach 16 h wurden die Pelletzellen bei 12.000 x g für 10 min zentrifugiert. Überstand dekantieren und Zellpellets in einem -80° C Gefrierschrank einfrieren.
    3. Lyse von Zellen und Reinigung von Einschlusskörpern unter Verwendung eines Einschlusskörper-Reinigungsreagenzes gemäß dem Herstellerprotokoll, einschließlich einer 20-minütigen Behandlung mit 1 μl (25-29 Einheiten) Benzonase und 3-5 KU Lysozym pro ml Einschlusskörper-Reinigungsreagenz nach anfänglicher Resuspension des Zellpellets. Gereinigte Einschlusskörper erscheinen als dunkelbraune Pellets.
  3. FPLC (Schnelle Protein-Flüssigchromatographie)
    1. Bereiten Sie 2 l 8 M Harnstoff: 5 % v/v Essigsäurelösung (Puffer A) und 1 l 8 M Guanidiniumhydrochlorid: 5 % v/v Essigsäurelösung (Puffer B) vor. Filtrieren Sie beide mit einem 0,22 μm Vakuumkolbenfilter.
      ACHTUNG: Vermeiden Sie das Einatmen, den Kontakt mit Augen und Haut mit Guanidiniumhydrochlorid und tragen Sie bei der Handhabung geeignete PSA (Persönliche Schutzausrüstung). In einem dafür vorgesehenen Abfallbehälter entsorgen.
    2. Resuspendierung von Einschlusskörperpellets in 8 M Harnstoff: 5%ige Essigsäurelösung durch kräftiges Rühren mit einem Magnetrührstab. Die Lösung erscheint trüb. Zentrifuge auf 4 °C vorkühlen, bei 18.000 x g bei 4 °C für 70 min zentrifugieren und Überstand für FPLC auffangen. Der Überstand erscheint braun und transparent.
    3. Bei einer Flussrate von 2 ml/min für alle folgenden Schritte werden 10 mL der Kationenaustauschsäule mit 5 Säulenvolumina (CVs) von 95 % Puffer A und 5 % Puffer B äquilibriert und die Probe geladen. Waschen Sie die ungebundene Probe mit 5 CVs aus und führen Sie dann den Stufengradienten durch: 5 CVs mit 94 % Puffer A/6 % Puffer B, dann 5 CVs mit 10 % Puffer B. Reflectin A1 eluiert bei 10 % Puffer B.
    4. Bewerten Sie die Reinheit der Fraktionen, die dem anfänglichen Schritt auf 10 % Puffer B entsprechen, durch SDS-PAGE und poolen Sie, falls ähnlich. Eine Zentrifuge wird auf 4 °C vorgekühlt und die Fraktionen mit einem 15 mL 10 kDa MWCO-Spin-Konzentrator auf ein Endvolumen von 4-5 ml konzentriert.
  4. HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie)
    1. Bereiten Sie 2 l 18 mΩ Wasser mit 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) und 2 l Acetonitril mit 0,1 % TFA vor. Filtrieren Sie beide mit einem 0,22 μm Vakuumkolbenfilter.
      ACHTUNG: TFA ist eine stark rauchende Säure. Schieben Sie einen Abzug an, tragen Sie geeignete PSA und übertragen Sie ihn nur mit Glas. Vermeiden Sie das Einatmen, den Kontakt mit Augen und Haut mit Acetonitril und tragen Sie bei der Handhabung die richtige PSA. In einem dafür vorgesehenen Abfallbehälter entsorgen.
    2. Bei einer Flussrate von 1 ml/min für alle folgenden Schritte äquilibrieren Sie die C4-Säule mit 5 CVs von 85 % 18 mΩ Wasser, 0,1 % TFA und 15 % Acetonitril, 0,1 % TFA.
    3. Beginnen Sie mit dem Fließen und injizieren Sie die Probe. Fließen Sie 2 CVs, dann beginnen Sie einen konstanten Gradienten auf 80 % Acetonitril, 0,1 % TFA über 5 CVs. Reflektin A1 eluiert typischerweise bei 73 % Acetonitril.
    4. Gefrieren Sie Fraktionen, die Reflektinprotein enthalten, in 5-ml-Röhrchen unter Verwendung eines Ethanol- und Trockeneisbads. Lyophilisieren und bei - 80 °C lagern. Protein erscheint als dünne weiße Blätter.
  5. Zubereitung von unmarkierten Proteinbrühen
    1. Bereiten Sie 4 l pH 4, 25 mM Essigsäurepuffer (21,05 mM Essigsäure, 3,95 mM Natriumacetattrihydrat) mit Eisessig und Natriumacetattrihydrat vor. Passen Sie den pH-Wert bei Bedarf mit 4 M HCl oder 4 M NaOH an. Filtern Sie mit einem 0,22 μm Vakuumfilter.
      ACHTUNG: Greifen Sie mit starken Säuren/Basen und tragen Sie geeignete PSA. Fügen Sie niemals Wasser zu konzentrierten starken Säuren oder Basen hinzu.
    2. Tauen Sie das Röhrchen mit dem lyophilisierten Reflektinprotein auf und lösen Sie es mit dem Röhrchen in einem Eisbad mit pH 4, 25 mM Essigsäurepuffer auf. Eine vollständig resolubilisierte Proteinlösung erscheint farblos ohne sichtbare Trübungen oder Ausfällungen.
      1. Unter Verwendung einer Dialysekassette mit einem Molekulargewicht von 10 kDa dialysiert das resolubilisierte Reflektinprotein in einem 1000-fachen Probenvolumen von pH 4, 25 mM Essigsäurepuffer, der mit zwei 12-stündigen Änderungen bei 4 °C auf 4 °C vorgekühlt wurde.
    3. Die Probe wird mit einem Essigsäurepuffer von pH 4, 25 mM verdünnt, um eine endgültige Proteinkonzentration von 100 μM und ein Endvolumen von mindestens 150 μl zu erhalten. Messen Sie mit einem UV-VIS-Spektrometer die Extinktion bei 280 nm und verwenden Sie den molaren Absorptionskoeffizienten29 von Reflektin A1 (123.685 M-1 cm-1), um die Proteinkonzentration zu bestimmen.
    4. Übertragen Sie die Reflektin-Proteinbrühe in ein 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schnappverschluss und lagern Sie sie bis zu 7 Tage bei 4 °C. Unmittelbar vor den Experimenten wird der Reflektinproteinbestand bei 4 °C in einer vorgekühlten Mikrozentrifuge bei 18.000 x g für 15 min zentrifugiert. Bereiten Sie Reflectin A1 C232S auf ähnliche Weise mit dem molaren Absorptionskoeffizienten von 123.540 M-1 cm-1 her.
  6. Protein-Markierung
    1. Bereiten Sie separat 10 mg/ml-Bestände an FMTS (Fluorescein-Methansthiosulfonat) und SRMT (Sulforhodamin-Methansthiosulfonat) vor, indem Sie 1 ml trockenes Dimethylsulfoxid (DMSO) in ein Fläschchen mit 10 mg Fluoreszenzsonde geben und mit der Pipette mischen.
      ACHTUNG: Vermeiden Sie das Einatmen, den Kontakt mit Augen und Haut mit Methanethiosulfonat-Reagenzien.
    2. 7,7 μl des 10 mg/ml-FMTS-Stammes oder 10,4 μl des 10 mg/ml-SRMT-Stammes werden in einen Essigsäurepuffer mit einem pH-Wert von 4, 25 mM mit einem Endvolumen von 150 μl und einer Endkonzentration von 500 μM FMTS oder SRMT gegeben. Die Lösung erscheint trüb. Der Rest der Fluoreszenzsonden wird aliquotiert und bei -80 °C eingefroren.
    3. Mit 150 μl 100 μM Reflektin-Proteinfond kombinieren und gründlich pipettieren. Die endgültige Proteinkonzentration beträgt 50 μM und die endgültige Konzentration der Fluoreszenzsonde 500 μM. Die Trübung der Lösung nimmt ab.
    4. In Folie einwickeln und aufrecht unter leichtem Orbitalrühren 4 Stunden lang bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 4 °C inkubieren. Die Trübung der Lösung sollte sich nicht ändern.
    5. Falls Niederschlag vorhanden ist, durch kräftiges Mischen mit der Pipette resuspendieren. Die Lösung wird trüb sein. Reflektin mit einem 10.000 kDa MWCO-Zentrifugalfilter auf ein Zielvolumen von 100 μl und eine Konzentration von 150 μM konzentrieren.
    6. Verwenden Sie die gleiche HPLC- und Lyophilisationsmethode wie bei der Proteinreinigung, um ungebundene Fluoreszenzsonden zu entfernen und das Protein bei - 80 °C in Folie zu lagern. Resolubilisieren Sie das markierte Protein mit der gleichen Methode für das unmarkierte Protein. Bestimmen Sie den Grad der Beschriftung.
      HINWEIS: Resolubilisiertes, fluoreszenzmarkiertes Reflektinprotein erscheint gelbgrün (C199-F) oder dunkelrot (C199-R) ohne Trübung oder Ausfällung.
  7. Zubereitung von Co-markierter Proteinbrühe
    1. Geben Sie 27 μl 100 μM A1-Proteinstamm in eine 0,5-ml-Mikrozentrifuge mit Schnappverschluss.
    2. Geben Sie 1,5 μl Fluorescein-markiertes Reflektin A1-C232S (als C199-F bezeichnet, um die Aminosäureposition von Fluorescein zu bezeichnen) in dasselbe Röhrchen.
    3. Geben Sie 1,5 μl Sulforhodamin-markiertes Reflektin A1-C232S (als C199-R bezeichnet, um die Aminosäureposition von Fluorescein zu bezeichnen) in dasselbe Röhrchen. Die Endkonzentrationen betragen 90 μM A1, 5 μM C199-F und 5 μM C199-R.
    4. In Folie einwickeln und bis zu 7 Tage bei 4 °C lagern.

2. FRET-Zeitreihen

  1. Vorbereitung von Puffern und Filtration
    1. Bereiten Sie 500 ml 25 mM 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS)-Puffer vor. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf 7 ein, indem Sie langsam 4 M Natriumhydroxid hinzufügen. Filtrieren Sie 10 mL mit einer 10 mL Spritze und einem 0,22 μm Spritzenfilter.
  2. Zentrifugieren von Protein
    1. Tisch-Mikrozentrifuge auf 4 °C vorkühlen. Zentrifugieren Sie unmarkierte und co-markierte Reflektin-A1-Bestände bei 18.000 x g für 15 min bei 4 °C.
  3. Vorbereiten von beschrifteten A1-Baugruppen
    1. Um drei Replikate vorzubereiten, pipettieren Sie 9,6 μl MOPS-Puffer (pH 7, 25 mM) in drei 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schnappverschluss.
    2. Geben Sie 0,4 μl markierten Proteinstamm in jedes Röhrchen, das bereits 9,6 μl MOPS-Puffer enthält, bis zu einer endgültigen Proteinkonzentration von 4 μM. Mischen Sie langsam zweimal, indem Sie das gesamte Probenvolumen aspirieren und dispensieren.
    3. Sofort in Alufolie wickeln und bei 25 °C in den Inkubator stellen. Dieser und allen folgenden Lösungen von Baugruppen fehlt es an scheinbarer Trübung oder Ausfällung vor oder nach der Inkubation.
  4. Vorbereiten von unbeschrifteten A1-Baugruppen
    1. Um drei Replikate vorzubereiten, pipettieren Sie 38,4 μl MOPS-Puffer in drei 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schnappverschluss.
    2. Geben Sie 1,6 μl Reflektin-A1-Proteinbestand in jedes Röhrchen, das bereits 38,4 μl MOPS-Puffer enthält, bis zu einer endgültigen Proteinkonzentration von 4 μM. Pipettieren Sie die Mischung zweimal, indem Sie das gesamte Probenvolumen aspirieren und dispensieren.
    3. Sofort in Alufolie wickeln und bei 25 °C in den Inkubator stellen.
  5. Timing und Mischen von co-labeled und unmarkierten A1-Baugruppen
    1. Ordnen Sie die Vorbereitung von Baugruppen wie folgt an: Bereiten Sie gleichzeitig und getrennt Baugruppen aus einem experimentellen Co-markierten Reflektin und einem experimentellen nicht markierten Reflektin vor. Wiederholen Sie die Schritte 2.3 und 2.4.
    2. Mischen Sie, indem Sie 40 μl unmarkierte A1-Assemblierung experimentell zu 10 μl der jeweiligen co-markierten experimentellen A1-Assemblierung hinzufügen, und pipettieren Sie die Mischung vorsichtig, indem Sie das gesamte Volumen zweimal aspirieren und dispensieren. Die Messungen werden 24 Stunden nach diesem Schritt durchgeführt.
    3. Die Zeit zwischen der Ansteuerung der Assemblierung von Reflektin A1 durch Verdünnung in MOPS-Puffer (pH 7, 25 mM) und dem Mischen von markierten und unmarkierten Assemblierungen ist das Assemblierungsalter. Das Alter der Baugruppen, die für diese Daten verwendet wurden, betrug 0 min, 1 min, 10 min, 30 min, 60 min, 120 min, 180 min, 540 min, 1080 min und 1620 min.
  6. Steuerung
    1. Positive Kontrolle
      1. Bereiten Sie aus dem A1 und den markierten Proteinbrühen 20 μl Proteinbrühe vor, d. h. 80 μM A1 und 20 μM co-markierte Proteinbrühe.
      2. Geben Sie 38,4 μl MOPS-Puffer in ein 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schnappverschluss, fügen Sie dann 1,6 μl 80 μM A1/20 μM markiertes Protein hinzu und pipettieren Sie zweimal, indem Sie das gesamte Volumen langsam aspirieren und abgeben. Sofort mit Folie abdecken und bei 25 °C in den Inkubator stellen. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt 9 Proben.
    2. Negativkontrolle
      1. Geben Sie 0,4 μl markiertes Material in ein 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schnappverschluss, das bereits 9,6 μl MOPS-Puffer enthält. Pipettieren Sie die Mischung langsam zweimal pipettieren, indem Sie das gesamte Probenvolumen ansaugen und dosieren.
      2. Fügen Sie 40 μl MOPS-Puffer hinzu und pipettieren Sie die Mischung zweimal, indem Sie das gesamte Probenvolumen aspirieren und dispensieren. Sofort mit Folie abdecken und bei 25 °C in den Inkubator stellen. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt 9 Proben.
  7. Küvette und Pufferrohling
    1. Stellen Sie das Fluorimeter so ein, dass es bei 488 nm anregt und kontinuierliche Spektren von 520 bis 700 nm aufzeichnet.
    2. Füllen Sie eine saubere Quarz-Submikrofluorimeter-Küvette mit 50 μl MOPS-Puffer (pH 7, 25 mM) und messen Sie.
    3. Puffer entfernen.
  8. Experimentelles Vorgehen
    HINWEIS: Alle Experimente sollten 24 Stunden nach dem Mischen von co-markierten und unmarkierten Reflektin-A1-Anordnungen aufgezeichnet werden. 50 μl der experimentellen Lösung vorsichtig in die Küvette pipettieren und messen.
    1. Entnehmen Sie die Probe, spülen Sie sie mit 500 μl Essigsäurepuffer und dann mit 500 μl 0,22 μm gefiltertem 18 mΩ Wasser. Puffer leer ausführen.
  9. Steuerung
    1. Messen Sie bei 1440 Minuten, 1960 Minuten und 3060 Minuten nach der Vorbereitung der Kontrollen (entsprechend einem Montagealter von 0 Minuten, 520 Minuten und 1620 Minuten). Mit diesen Messungen wird der experimentelle Teil des Protokolls abgeschlossen.

3. Datenanalyse

  1. Subtrahieren Sie die Spektren des Pufferrohlings von den experimentellen Spektren.
  2. Das Verhältnis von Em588/Em520 bestimmen.
  3. Bestimmen Sie dann für jedes Replikat den Mittelwert und die Standardabweichung jeder Gruppe von drei Replikaten. Diagramm Em588/Em520 in Abhängigkeit vom Alter der Baugruppe.

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Ergebnisse

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Nach Verdünnung von Reflektin-A1-Anordnungen, die sowohl Donorfluorophor-markiertes Protein als auch Akzeptor-Fluorophor-markiertes Protein enthielten, mit unmarkierten Reflektin-A1-Anordnungen wurde eine anfängliche Abnahme der FRET-Emission bei 588 nm im Vergleich zu unverdünnten Anordnungen beobachtet (Abbildung 2A). Die FRET für Assemblys mit einem Alter von 0 min war ähnlich wie bei der Positivkontrolle, und die FRET für Assemblys mit einem Alter von 1620 min (die Zeit zwischen der Bild...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein häufiger Punkt für den Proteinverlust während der Reinigung ist die unvollständige Resuspension von Einschlusskörperpellets für alle Schritte des Einschlusskörperreinigungsprotokolls und die abschließende Resuspension von gereinigten Einschlusskörpern in 8 M Harnstoff 5 % v/v Essigsäure. Die Resolubilisierung des Einschlusskörpers kann bis zu 24 Stunden kräftiges Rühren mit einem kleinen magnetischen Rührstab in einem konischen 40-ml-Röhrchen dauern. Um signifikante Proteinverluste a...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Forschung wurde vom Institute for Collaborative Biotechnologies durch die Zuschüsse W911NF-19-2-0026 und W911NF-23-1-0330 des U.S. Army Research Office unterstützt. Der Inhalt der Informationen spiegelt nicht unbedingt die Position oder die Politik der Regierung wider, und es sollte keine offizielle Billigung abgeleitet werden.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 μ Mikropipette mit L-Kapazität
2 μ Mikropipette mit L-Kapazität
2-[(5-Fluoresceinyl)aminocarbonyl]ethylmethanethiosulfonatSanta Cruz BiotechnologiesSC-216155CAS  351330-42-2
20 μ Mikropipette mit L-Kapazität
200 μ Mikropipette mit L-Kapazität
3-(N-Morpholino)propansulfonsäure, 4-MorpholinpropansulfonsäureSigma-AldrichM1254CAS 1132-61-2
EssigsäureSigma-AldrichNr. A6283CAS 64-19-7
AcetonitrilSigma-Aldrich34851-1LCAS 75-05-8
Agar-PulverCarolina Biologisch842133CAS 9002-18-0
Alufolie
Amicon Ultra Zentrifugalfilter, 10 kDa MWCOMillipore SigmaUFC5010080,5 ml Fassungsvermögen
Amicon Ultra Zentrifugalfilter, 10 kDa MWCOMillipore SigmaUFC90100815 ml Kapazität
Analysenwaage
BenzonaseMillipore-Sigma70664-3CAS 9025-65-4
BugBuster Proteinextraktions-ReagenzMillipore Sigma70584-3
Cary Eclipse Fluoreszenz-SpektrometerCary-Finsternis
Cary Eclipse Software
Corning 50 ml ZentrifugenröhrchenMillipore-SigmaCLS430829
Einmalspritzen, Luer-Lok 10 mLCole-ParmerNr. UX-12915-02
DMSOSigma-AldrichNr. D8418CAS 67-68-5
Trockeneis
FPLC-System mit zwei Pumpen
HPLC-System mit zwei Pumpen
EthanolMillipore SigmaEX0280-3CAS-Nr. 64-17-5
Bodenstehender Zentrifugenrotor mit einem Fassungsvermögen von 500 ml
Bodenstehende Zentrifuge 
Gefrierschrank, -80°; C
Abzug
GuanidinhydrochloridThermo ScientificAAA135430B50-01-1
HiTrap SP HP Kationenaustauscher-Chromatographie-SäuleCytiva17115101
SalzsäureSigma-AldrichArtikel-Nr.: 258148-25MLCAS-Nr. 7647-01-0
Brutkasten
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosidSigma-AldrichI6758-1G
KanamycinsulfatSigma-AldrichNr. K1637CAS 25389-94-0
Lyophilisierer
LysozymThermo Scientific90082
Magnetischer Rührstab
Magnetische Rührplatte
Mikro-pH-Elektrode S7Metler Toledo51343160
Mikrozentrifuge mit Temperaturregelung
Millex PVDF-SpritzenvorsatzfilterMilliporeSLGVR33RS0,22 μm m, Ø 33 mm
Milli-Q Millipak FilterMillipore SigmaMPGP002A1
Milli-Q Reinstwasser-ReinigungssystemMillipore Sigma
NaClThermo ScientificAA12314A9CAS-Nr. 7647-14-5
Nalgene Zentrifugenflaschen, Typ 3120Millipore-SigmaB1283-4EAZur Pelletierung von Bakterien
Orbital-Labor  Schüttler mit Inkubator
PC
PetrischalenSigma-AldrichP5731-500EA
PJ411 PlasmidDie DNA 2.0
Eiweiß LoBind  Konische RohreEppendorfEP301083025 ml Fassungsvermögen
Eiweiß LoBind  Mikrozentrifugen-RöhrchenEppendorfEP0224311020,5 ml Fassungsvermögen
Pyrex Erlenmeyerkolben mit Schallwand 1.000 mlMillipore-SigmaCLS44501Zur Inkubation von Bakterienkulturen
Pyrex Griffin Becher 2.000 mLMillipore-SigmaCLS10002LFür alle Puffer- und Lösungsvorbereitungen
Pyrex Vorratsflaschen rund 1.000 mlMillipore-SigmaCLS13951LZur Lagerung aller Puffer und Lösungsvorbereitungen mit Vakuumkolbenfiltern verwenden
Qiaprep Spin Miniprep BausatzQiagen27104
Kühlschrank
Rosetta 2(DE3) Kompetente ZellenNovagen71397-3
Slide-a-lyzer Dialysekassetten 10K MWCOThermo ScientificPI663830,5 ml Fassungsvermögen
Natriumacetat-TrihydratSigma-AldrichNr. S8625CAS 6131-90-4
NatriumhydroxidSigma-AldrichArtikel-Nr.: 567530-250GMCAS 1310-73-2
Steritop Vakuum-Filter mit FlaschenaufsatzMillipore SigmaS2GPT05RE0,22 μm M Sterilfilter
Submikroküvette, 50 μl FassungsvermögenStarna-Zellen16.40F-Q-10/Z15
Sulforhodamin MethanethiosulfonatSanta Cruz BiotechnologiesSC-220172CAS  386229-71-6
TrifluoressigsäureSigma-AldrichArtikel-Nr.: 106232-25GCAS 407-25-0
TryptonSpectrum Chemical Nr. T1333
HarnstoffThermo ScientificAAA123600ECAS 57-13-6
UV-VIS-Spektrometer
HefeextraktGibco211929

Referenzen

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