Maus-mesenteriale Lymphadenektomie zur selektiven Störung der lymphatischen Kommunikation mit dem regionsspezifischen Darm

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Überlebensverfahren für eine sichere und gut verträgliche musinare mesenterine lymphadenektomyat an jeder der vier Stationen entlang der mesenterischen Lymphknotenkette. Dieses Verfahren ist anpassungsfähig, um eine selektive Unterbrechung der lymphatischen Kommunikation mit dem distalen Dickdarm, dem proximalen Dickdarm und/oder dem Dünndarm zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Immunüberwachung versus Antigen-Toleranz ist ein feines Gleichgewicht im Darmmikroumfeld, in dem die entscheidende Rolle der zirkulierenden T-Zell-Priming in lokalen Lymphknoten gut bekannt ist. Nach dem Priming von T-Zellen zeigt neuere Literatur eine einzigartige, nicht-redundante Rolle nicht-zirkulierender T-Zellen, die sich im drainierenden Lymphknoten eines Organs befinden. Dies gilt besonders im Darm, wo der Lymphabfluss als sehr spezifisch bekannt ist. Um jedoch den einzigartigen Einfluss dieser lokalen Zellen im Vergleich zur systemischen funktionellen Redundanz wirklich zu verstehen, benötigt die wissenschaftliche Gemeinschaft ein gut beschriebenes Verfahren, um diese Knoten zu isolieren und selektiv zu stören. Hier wird ein Überlebensverfahren für eine sichere und gut verträgliche musinale mesenteriale Lymphadenektomie an jeder der vier Stationen entlang der mesenterischen Lymphknotenkette beschrieben. Dieses Verfahren ist anpassungsfähig, um eine selektive Unterbrechung der lymphatischen Kommunikation mit dem distalen Dickdarm, dem proximalen Dickdarm und/oder dem Dünndarm zu ermöglichen. Enthalten sind detaillierte Anleitungen, visuelle Hilfsmittel, hilfreiche Tipps für besseren Erfolg und Fehlerbehebung für suboptimale Überlebensmaßnahmen. Resezierte Lymphknoten sind bei Bedarf sofort für eine weitere Nachbearbeitung bereit. Diese Technik eignet sich am besten für Studien, die eine selektive Störung des Lymphabflusses aus dem distalen Dickdarm, dem proximalen Dickdarm und/oder dem Dünndarm erfordern.

Einleitung

T-Zellen gehören zu den wichtigsten Effektor-Zelltypen in der adaptiven Immunität und haben beschriebene Rollen in verschiedenen Krankheitskategorien, darunter Infektionen, Autoimmunität und Malignität ^1,2,3. Ein entscheidender Schritt für die Funktionalität von T-Zellen ist das dreiphasige Priming durch antigenpräsentierende Zellen in sekundären Lymphorganen, wie lokalen Lymphknoten^. In der modernen Medizin gehört eine Grundpfeilung einer ordnungsgemäßen onkologischen Resektion über mehrere Organsysteme aus einem gewissen Maß an lokaler Probenahme oder en-bloc-Lymphknotenresektion 5,6,7,8. Zum Beispiel empfehlen Konsensrichtlinien bei Darmkrebs, 12 Lymphknoten zu entfernen und in der kurativen Absichtsresektion untersucht zu werden, da eine klare Korrelation mit verbessertem Langzeitüberleben ^6,7 besteht. Aber können lokale Lymphknoten wirklich ungestraft entfernt werden? Jüngste Studien an Mäusen haben gezeigt, dass der tumordrainierende Lymphknoten ein Reservoir antitumorartiger T-Zell-Vorläufer enthält, die möglicherweise vor der terminalen Differenzierung und T-Zell-Erschöpfung geschützt sind, die im Tumormikroumfeld^{stattfinden 9,10,11}. Dies würde darauf hindeuten, dass die Entfernung einer so kritischen Population die laufenden Immunüberwachungsfähigkeiten schwächen könnte.

Das Lymphdrainagemuster im Darm bei Mäusen ist bekannt dafür, entlang der mesenterischen Lymphknotenkette sehr spezialisiert zu sein; zum Beispiel wird der proximale Dickdarm fast ausschließlich von der ersten Lymphknotenstation entwässert, der Dünndarm von der zweiten/dritten Station und der distale Dickdarm überwiegend von der vierten Lymphknotenstation¹² (Abbildung 1, ergänzende Abbildung 1). So kann die direkte Kommunikation zwischen Segmenten des Darms und den Lymphatics durch gezielte Ablation dieser Knoten unterbrochen werden. Zur Blockierung des Transports zwischen Lymphknoten und Geweben werden häufig S1P-Rezeptoragonisten wie FTY720 und Integrinblockade verwendet; Diese Medikamente hemmen jedoch im Großen und Ganzen den Handel und können daher nicht zur Untersuchung des Beitrags spezifischer Lymphknoten^13,14 verwendet werden. Die Fähigkeit der breiteren wissenschaftlichen Gemeinschaft, die lokale Wirkung von Immuninteraktionen in den Darmlymphknoten zu untersuchen, ist jedoch durch das Fehlen einer gut beschriebenen chirurgischen Resektion für jede Station begrenzt. Vor diesem Hintergrund wurde an jeder Knotenstation ein Überlebensverfahren für die musinare mesenteriale Lymphadenektomie entwickelt, das hier beschrieben wird. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine sichere und zuverlässige Exzision der mesenterischen Lymphknotenstation(en) bei Mäusen mit hoher postoperativer Überlebensrate und Toleranz zu erreichen.

Dieses Verfahren wurde getestet und lässt sich leicht bei jungen und erwachsenen Mäusen über mehrere Stämme hinweg durchführen (z. B. Balb/c, C57BL/6J, 129S4), ist jedoch durch den Bedarf an zugänglichen und leicht identifizierbaren Lymphknoten eingeschränkt. Daher eignet es sich möglicherweise nicht gut für die Kombination mit Mausmodellen oder Genotypen mit kleineren als üblichen oder nicht wahrnehmbaren Lymphknoten (z. B. lymphotoxin-alpha-defizienten Mäuse)¹⁵. Außerdem haben ältere Mäuse (>15 Wochen) tendenziell eine stärkere viszerale Fettleibigkeit, was die Identifizierung und Isolierung von Lymphknoten erschwert, und obwohl dies keine Gegenwirkung ist, kann es den Erfolg oder das Verfahren einschränken. Abgesehen von diesen Einschränkungen bietet die mesenterische Lymphadenektomie eine hochkontrollierte und stark selektive Störung der Lymphknoten. Dieses Verfahren eignet sich am besten, um Fragen zur lokalen Wirkung von Lymphknoten und deren zugehörigen residenten Immunzellen sowie zu den Wechselwirkungen auf Segmente des Darms (z. B. proximaler Dickdarm, distaler Dickdarm, Dünndarm) zu klären.

Abb. 1: Anatomische Orientierungspunkte von Stationen in der mesenterischen Lymphknotenkette. (A) Unbeschriftete und (B) beschriftete Darstellung von vier großen mesenterischen Lymphknotenstationen vor Ort. Die proximale Darmdrainage erfolgt überwiegend über Station 1, der Dünndarm überwiegend über Station 2/3 und der distale Dickdarm überwiegend über Station 4. (DC= distaler Dickdarm, ICV= ileokolische Gefäße, PC= proximaler Darm, CEC= Dekum, IV/JV= Ilealgefäße/Jejunalgefäße, SI= Dünndarm). Maßstabsbalken: 1,5 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Protokoll

Alle Verfahren werden in Übereinstimmung mit den Protokollen des Yale Institutional Animal Care and Use Committee durchgeführt. Um dieses Verfahren zu entwickeln, wurden 8-12 Wochen alte C57BL/6-Stamm, Wildtyp-Mäuse sowie alters-/geschlechts-/genotypabgestimmte Scheinkontrollen eingesetzt. Sowohl männliche als auch weibliche Mäuse wurden eingeschlossen. Das Körpergewicht lag zwischen 18 und 25 g. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung von Instrumenten, Tieren und dem Operationssaal

1. Sterilisiere alle chirurgischen Instrumente. Stellen Sie sicher, dass die Operationsfläche und der Anäsenkegel mit 70 % Ethanol gereinigt sind.
2. Richte den inhalierten Anästhetiker-Verdampfer mit Nasenkegel und Saugung ein, um überschüssige Anästhetikum-Reinigung zu sammeln. Richten Sie eine Arbeitsfläche mit einer warmen Wasser-Zirkulationsplattform ein, um die Körpertemperatur und Vorräte der Tiere an einem bequemen, sterilen Ort zu erhalten.
   HINWEIS: Dieses Verfahren erfordert kein Operationsmikroskop; Erwägen Sie jedoch, dieses Instrument einzubauen, um die Visualisierung zu verbessern.
3. Anästhesie induzieren Sie durch Verabreichung von 2%–3 % inhaliertem Isofluran mit einer Sauerstoffflussrate von 2 L/min über den Nasenkegel aus einer inhalierten Anästhetiker-Vaporizermaschine (nach institutionell genehmigten Protokollen).
   1. Stellen Sie eine angemessene Anästhesieebene sicher, indem Sie eine Atemfrequenz von etwa 30–40 Atemzügen pro Minute und das Ausbleiben einer Reaktion auf den Hinterfußkneifen bestätigen. Überprüfen Sie regelmäßig die geeignete Anästhesieebene und passen Sie die Isofluran-Durchflussrate entsprechend an.
      HINWEIS: Alternativ ist auch ein injizierbares Anästhetikum geeignet.
4. Befolgen Sie die Richtlinien des Instituts für angemessene Analgesie und Lokalanästhesie. Zum Beispiel sollten Sie ein langwirksames Schmerzmittel wie 3,25 mg/kg Buprenorphin XR subkutan verabreichen und bis zu 0,04 mL/5g Körpergewicht von 1 mg/mL Lidocainlösung subkutan an der geplanten Schnittstelle.
5. Bereiten Sie das Tier auf den Eingriff vor, indem Sie liegend positionieren, Augenschmiermittel auftragen, das Bauchfell zupfen oder schneiden und den Bauch mit Povidon/Jod-Lösung sterilisieren, gefolgt von 70 % Ethanol (Abbildung 2A).
6. Verwenden Sie sterile Handschuhe und legen Sie sterile Vorhänge über das Tier mit einem Fenster zum Operationsfeld. Halten Sie während des gesamten Eingriffs die Sterilität aufrecht.

Abb.2: Repräsentative Bilder wichtiger prozeduraler Schritte bei der mesenterischen Lymphadenektomie. (A) Abgerissene und sterilisierte Bauchfenster. (B) 0,5 cm Schnitt durch Haut und Linea alba. (C) Exposition der mesenterischen Lymphknotenkette durch Ausrichtung des Ileums nach rechts, proximalem Dickdarm links und des Blinddarms unterhalb. Der erste mesenterische Lymphknoten liegt entlang der Arteria ileokolica (weißer Pfeil). (D) Entfernter mesenterischer Lymphknoten (verblasster Pfeil). Schuppenbalken: 0,5 cm. (E) ex vivo mesenterischer Lymphknoten (weißer Pfeil; 2,5 mm x 3 mm). Ticks = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Vorbereitung auf eine mesenterische Lymphadenektomie

1. Mach einen Schnitt in der Mitte von 0,5–1 cm durch die Haut. Schneide die Haut stumpf von der Bauchwand weg und identifiziere die Linea alba. Machen Sie einen Schnitt von 0,5–1 cm durch die Linea alba, um Zugang zur Bauchfeuchhöhle zu erhalten (Abbildung 4B).
   HINWEIS: Um den Zugang zu den Knoten der Station 2/3/4 zu verbessern, sollten Sie die Verlängerung des Schnitt-Cephalad in Betracht ziehen, jedoch nicht den knorpelhaltigen Xiphoid-Prozess überschreiten.
2. Geben Sie 1 ml steriles Kochsalzlösungsmittel bei Körpertemperatur über eine stumpfe Gavage-Nadel in die Bauchhöhle und befeuchten Sie die sterilen Vorhänge zur Vorbereitung auf die Darmpositionierung. Verwenden Sie sterile, feuchte, mit Baumwollspitzen bedeckte Wattestäbchen, um das Fäderum durch den Schnitt zu identifizieren und zu entweiden.
   1. Vermeiden Sie die Verwendung scharfer Instrumente zur Behandlung, da dies zu Verletzungen führen kann. Befeuchten Sie regelmäßig Vorhänge und Darm erneut, um das Austrocknen zu verhindern.
      HINWEIS: Das Maus-Dekum befindet sich in der Regel im linken unteren Quadranten des Abdomens, kann aber in jedem beliebigen Quadranten untergebracht werden.
3. Erläutern Sie die Ziel-mesenterischen Lymphknotenstation(en) für die Resektion und folgen Sie den spezifischen Anweisungen unten (d. h. 3.1–3.4). Siehe Abbildung 1A,B für anatomische Orientierungspunkte und Identifikation.

3. Dissektion und Exzision von mesenterischen Lymphknotenstationen

1. Erste Lymphknotenstation (proximaler Darmdrainage; ergänzende Abbildung 1A,B').
   1. Orientieren Sie den äußeren Darm auf feuchte Vorhänge mit dem Dekum unten, dem proximalen Dickdarm oben und dem terminalen Ileum zur rechten Seite des Chirurgen (linke Seite des Tieres; Abbildung 1A, Abbildung 2C).
   2. Identifizieren Sie die mesenterische Lymphknotenkette, die längs entlang des Dickdarms verläuft. Mit schräg, feinspitzen Pinzetten können Sie die erste Lymphknotenstation stumpf von den ileokolischen Gefäßen entfernen, indem Sie geschlossene Zangen in den Raum zwischen diesen Strukturen setzen und die Zange sanft öffnen lässt.
      1. Entfernen Sie die Pinzette und wiederholen Sie dieses Manöver 2-3 Mal oder bis eine ausreichende Ebene für eine sichere Exzision erstellt wurde. Vermeiden Sie Schäden an großen Darmblutgefäßen (Abbildung 3A, B).
         HINWEIS: Wenn erhebliche Blutungen auftreten, brechen Sie den Eingriff ab und lassen Sie das Tier human einschläfern (gemäß institutionell genehmigten Protokollen).
   3. OPTIONAL: Um das theoretische Risiko von Kollateralen an benachbarten Knoten zu verringern, führen Sie eine optionale Nahtligation mit einzelnen unterbrochenen Nähten entlang der Lymphknotenkette durch (eine 1 mm distal und eine 1 mm proximal zur ersten Lymphknotenstation) mit 9-0 schwarzer Monofilament-Nylonnaht und einer feinspitzen Zange zum Treiben der Nadel durch (Abbildung 3C,D).
   4. Ziehen Sie vorsichtig die ligaierte Lymphstation caudad zurück und entfernen Sie mit einer feinen Schere die Ziellymphknotenstation von Cephalad bis Caudad (Abbildung 3E).
      HINWEIS: Oft haben Mäuse ein kleines, aber sichtbares Nahrungsgefäß, das von der ileokolischen Arteria in die hintere Seite des Lymphknotens führt. Die Blutung aus diesem Gefäß kann durch sanften Druck mit einem wattebesetzten Tupfer kontrolliert werden, bis eine Hämostase erreicht ist.

Abb.3: Annotierte Standbilder und Kommentare zur mesenterischen Lymphadenektomie (erste Station). (A) Die richtige Ausrichtung des Darms zeigt die erste mesenterische Lymphknotenstation (weißer Pfeil). (B) Zwischen der ileokolischen Arteria (Bluearrow) und dem Knoten entsteht eine Ebene. (C) Die Nahtligierung der Nahrungsgefäße, die in die Spitze des Lymphknotens eintreten (blauer Pfeil), wird durchgeführt, wobei die ileokolischen Gefäße durch das Verlassen des Raums zwischen diesen Strukturen ausgeschlossen werden (weißer Pfeil). (D) Die Nahtligation der Basis des Lymphknotens wird durchgeführt, wobei erneut die distalen Äste der Ileokolarterie vermieden werden. (E) Der Knoten wird entlang der zuvor entstandenen Gewebeebene entfernt, bleibt hoch zum Lymphknoten hin und hinterlässt Nahtligaturen (schwarze Pfeile). (F) Die Hämostase ist bestätigt, distale Äste der Arteria ileokolica werden beobachtet, um eine ordnungsgemäße Durchblutung zu gewährleisten, und der leere Raum (verblasster Pfeil), in dem der zuvor gelebte Knoten war, ist frei von Restknoten. Maßstabsbalken: 0,5 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Zweite Lymphknotenstation (mittler-distaler Dünndarmabfluss)
   1. Schneiden Sie auch vorsichtig den Dünndarm auf. Orientieren Sie den äußeren Darm auf feuchte Vorhänge mit dem Dekum unten, dem proximalen Dickdarm oben und dem Dünndarm zur rechten Seite des Chirurgen (linke Seite des Tieres; Abbildung 1A).
   2. Identifizieren Sie die mesenterische Lymphknotenkette, die längs entlang des Dickdarms verläuft. Die zweite Station beginnt am Zusammenfluss von ileal/jejunalen Gefäßen (Abbildung 1B).
      1. Mit schräg, feinspitzen Pinzetten sezieren Sie die zweite Lymphknotenstation stumpf von den Darmgefäßen entfernt, indem Sie geschlossene Pinzetten in den Raum zwischen diesen Strukturen setzen und die Pinzette sanft öffnen lassen.
      2. Entfernen Sie die Pinzette und wiederholen Sie dieses Manöver 2-3 Mal oder bis eine ausreichende Ebene für eine sichere Exzision erstellt wurde. Vermeiden Sie Schäden an großen Darmgefäßen. Achten Sie außerdem besonders auf die ilealen und jejunalen Gefäße, die bei Verletzungen schädlich wären.
         HINWEIS: Bei starker Blutung wird der Eingriff abgebrochen und das Tier human eingeschläfert.
   3. OPTIONAL: Um das theoretische Risiko von Kollateralen an nahegelegenen Knoten zu verringern, führen Sie eine optionale Nahtligation mit einzelnen unterbrochenen Nähten entlang der Lymphknotenkette durch (eine 1 mm distal und eine 1 mm proximal zur zweiten Lymphknotenstation) mit einer 9-0 schwarzen Monofilament-Nylonnaht und einer fein spitzen Zange zum Treiben der Nadel durch (ergänzende Abbildung 2A).
   4. Ziehen Sie die ligaierte Lymphstation vorsichtig zurück und entfernen Sie mit einer feinen Schere die Ziellymphknotenstation von Cephalad bis Caudad (ergänzende Abbildung 2B).
      HINWEIS: Oft haben Mäuse ein kleines, aber sichtbares Nahrungsgefäß, das von der ileokolischen Arteria in die hintere Seite des Lymphknotens führt. Die Blutung aus diesem Gefäß kann durch sanften Druck mit einem wattebesetzten Tupfer kontrolliert werden, bis eine Hämostase erreicht ist.
3. Zweite und dritte Lymphknotenstation (prox-mittel-distal Dünndarmdrainage; Ergänzende Abbildung 1C,D'
   1. Entfernen Sie vorsichtig den gesamten Dünndarm bis zu einem Punkt der hinteren Befestigung (Band des Treitz). Orientieren Sie den äußeren Darm auf feuchte Vorhänge mit dem Dekum unten, dem proximalen Dickdarm oben und dem Dünndarm zur rechten Seite des Chirurgen (linke Seite des Tieres; Abbildung 1A).
   2. Identifizieren Sie die mesenterische Lymphknotenkette, die längs entlang des Dickdarms verläuft. Die zweite Station beginnt am Zusammenfluss von ileal/jejunalen Gefäßen (Abbildung 1B).
      1. Mit schräg, feinspitzen Pinzetten sezieren Sie die zweite und dritte Lymphknotenstation stumpf von den Darmgefäßen weg, indem Sie geschlossene Zangen in den Raum zwischen diesen Strukturen legen und die Pinzette sanft öffnen lassen.
      2. Entfernen Sie die Pinzette und wiederholen Sie dieses Manöver 2-3 Mal oder bis eine ausreichende Ebene für eine sichere Exzision erstellt wurde. Vermeiden Sie Schäden an großen Darmgefäßen. Achten Sie außerdem besonders auf die ilealen und jejunalen Gefäße, die bei Verletzungen schädlich wären.
         HINWEIS: Bei starker Blutung wird der Eingriff abgebrochen und das Tier human eingeschläfert.
   3. OPTIONAL: Um das theoretische Risiko von Kollateralen an benachbarten Knoten zu verringern, führen Sie eine optionale Nahtligation mit einzelnen unterbrochenen Nähten entlang der Lymphknotenkette durch (meist eine 1 mm distale, zwei 1 mm laterale und eine 1 mm proximal zur zweiten/dritten Lymphknotenstation) mit 9-0 schwarzer Monofilament-Nylonnaht und einer feinspitzen Pinzette zum Eintreiben der Nadel durch (ergänzende Abbildung 3B, C).
      1. Beachten Sie die afferenten lymphatischen Bahnen, die nur oberflächlich zu den ileal/jejunalen Gefäßbündeln liegen (ergänzende Abbildung 3B). Seien Sie vorsichtig, dass Nähte tief in den Lymphaten und oberflächlich zu den großen Gefäßstrukturen liegen, da Schäden an ilealen/jejunalen Gefäßbündeln nachteilig wären.
   4. Ziehen Sie vorsichtig die ligierten Lymphstationen Cephalad zurück und entfernen Sie mit einer feinen oder extrafeinen Schere die Ziellymphknotenstationen von Caudad zu Cephalad.
      HINWEIS: Bevor Sie fortfahren, stellen Sie sicher, dass der Dünndarm rosa und gut durchströmt bleibt. Eine zufällige Ligierung der ileal-/jejunalen Gefäße führt zu ischämischem Dünndarm.
4. Vierte Lymphknotenstation (distale Darmdrainage; Ergänzende Abbildung 1E,F')
   1. Entfernen Sie vorsichtig den gesamten Dünndarm bis zu einem Punkt der hinteren Befestigung (Band des Treitz). Orientieren Sie den äußeren Darm auf feuchte Vorhänge mit dem Dekum unten, dem proximalen Dickdarm oben und dem Dünndarm zur rechten Seite des Chirurgen (linke Seite des Tieres; Abbildung 1A).
   2. Identifizieren Sie die mesenterische Lymphknotenkette, die längs entlang des Dickdarms verläuft. Die vierte Station befindet sich direkt medial zum distalen Dickdarm und lateral zur dritten Station (Abbildung 1B, Abbildung 4A).
      1. Mit schräg, feinspitzen Zangen oder einer besonders feinen Schere seziert man die vierte Lymphknotenstation stumpf von den Darmgefäßen und der umliegenden Fettsäure, indem man geschlossene Pinzette/Schere in den Raum zwischen diesen Strukturen legt und die Zange sanft öffnen lässt.
      2. Entfernen Sie die Pinzette/Schere und wiederholen Sie dieses Manöver 2-3 Mal oder bis eine ausreichende Ebene für eine sichere Entfernung erstellt wurde. Vermeiden Sie Schäden an großen Darmgefäßen.
         HINWEIS: Bei starker Blutung wird der Eingriff abgebrochen und das Tier human eingeschläfert.
   3. OPTIONAL: Um das theoretische Risiko von Kollateralschäden an nahegelegenen Knoten zu verringern, führen Sie eine optionale Nahtligierung mit einzelnen unterbrochenen Nähten an jedem identifizierbaren Lymphknoten (meist einen 1 mm vom Knoten entfernt) mit 9-0 schwarzem Monofilament-Nylon und einer feinspitzigen Pinzette zum Eintreiben der Nadel durch (Abbildung 4B - D).
   4. Ziehen Sie die ligierten Lymphstationen Cephalad vorsichtig zurück und entfernen Sie mit einer extra-feinen Schere die Ziellymphknotenstation von Caudad zu Cephalad (Abbildung 4D,E).

Abb. 4: Annotierte Standbilder und Kommentare zur mesenterialen Lymphadenektomie (vierte Station). (A) Die korrekte Darmorientierung zeigt die vierte mesenterische Lymphknotenstation (weiße Pfeile) medial zum distalen Dickdarm und lateral zur dritten Station. (B,C) Nach der stumpfen Dissektion der Knotenstation wird an jedem identifizierbaren Knoten eine Nahtligatur (schwarzer Pfeil) durchgeführt, wobei alle Lymphknoten-Feeding-Gefäße (blaue Pfeile) einbezogen werden. (D) Der Knoten wird entlang der zuvor entstandenen Gewebeebene entfernt, bleibt hoch in Richtung der Lymphknoten und hinterlässt Nahtligaturen (schwarze Pfeile). (E) Nach der Exzision der Knotenstation (weiße Pfeile) wird die Hämostase bestätigt, Nahtligaturen sind sichtbar (schwarze Pfeile), und der leere Raum (verblasste Pfeile), in dem der zuvor befundene Knoten lebte, ist frei von Restknoten. Maßstabsbalken: 0,2 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

4. Abschluss der mesenterischen Lymphadenektomie

1. Beobachten Sie die distalen Äste der ileokolischen Gefäße, Ilealgefäße und/oder Jejunalgefäße, um sicherzustellen, dass die Blutversorgung intakt ist. Gut durchströmter Darm ist leuchtend und rosa mit sichtbaren Pulsationen.
   1. Mit Baumwollspitzen-Tupfern wird der Bauchinhalt in die Bauchhöhle zurückgeführt. Achten Sie darauf, vor der Rückkehr alle Baumwoll-, Fussel-, Drapier- oder Nahtfragmente aus dem Darm zu entfernen, da dies zu zusätzlicher chirurgischer Entzündung führen kann.
   2. Stellen Sie sicher, dass der Darm am Mesenterium nicht verdreht ist, indem Sie prüfen, dass der Darm hell/rosa (perfundiert) bleibt statt stumpf/grau/violett (ischämisch).
2. Gib 1 ml steriles Kochsalzlösungsmittel bei Körpertemperatur kurz vor dem Verschluss in den Bauch, um einen unnötigen Flüssigkeitsverlust/Verdunstung zu verhindern. Schließen Sie den Bauch in zwei Schichten (Bauchwand und Haut) mit einer 6-0 Monofilament-Polypropylennaht in laufender Form.
3. Tragen Sie sterilen chirurgischen Kleber auf die Wunde auf.
   HINWEIS: Alternativ können unterbrochene Nähte oder Wundklammern zum Hautverschluss verwendet werden.

5. Postoperative Versorgung

1. Bring das Tier in einen sauberen Käfig, der halb auf und halb neben einer warmwasser-Zirkulationsplattform mit Ad-lib-Zugang zu Futter und Wasser ist.
2. Lassen Sie das Tier sich von der Narkose erholen und beobachten Sie genau Anzeichen von Belastung. Wenn Tiere sich nicht schnell von der Anästhesie mit angemessenen Verhaltensweisen erholen (z. B. erhöhte Atemfrequenz, Selbstaufrichten, Gangulieren, Pflegen), sollten Sie das Tier human einschläfern.
3. Wenn alle Tiere von der Anästhesie genesen sind, bringen Sie die Käfige in die Tierpflegeeinrichtung zurück, mit Zugang zu Wasser, Futter, Einstreu und Anreicherungsmaterialien ad libium.
4. Untersuchen Sie die Mäuse postoperativ alle 12 Stunden über 3 Tage auf Anzeichen von Schmerzen oder Belastung (z. B. gekrümmte Haltung, verminderte Aktivität, vermindertes Engagement, schlechte Pflege). Humane Euthananzierung von Mäusen, die Anzeichen von Stress zeigen.
5. Bei Verwendung von permanenter Naht (wie 6-0 Monofilament-Polypropylen) untersuchen Sie die Schnitte am postoperativen Tag 10 und entfernen Sie das restliche Nahtmaterial.

6. Handhabung des Lymphknotens

1. Führen Sie sofort einen Auftriebstest durch, indem Sie das entfernte Gewebe in ein 1,5-mL Mikrozentrifugenrohr mit 500 μL phosphatgepuffertem Kochsalzlösungsgerät (PBS) legen. Bestätigen Sie die Exzision der Lymphknoten, indem Sie Gewebeabsinkung im PBS im Vergleich zu unbeabsichtigt reseziertem Fett beobachten, das schwimmen wird (Abbildung 5A).
   HINWEIS: Die entfernten Lymphknotenstation(en) sind sofort bereit für die weitere Downstream-Verarbeitung.
2. Für Lebendzelltechniken werden entfernte Lymphknotenstation(en) in Zellkulturmedien (z. B. DMEM, RPMI) oder PBS auf Eis gelegt. Für die geplante Histologie werden entfernte Lymphknotenstation(en) in das Fixativ gelegt (z. B. 10 % neutrales gepuffertes Formalin, 4 % Paraformaldehyd).

Ergebnisse

Um die Genauigkeit dieses Verfahrens zu bestätigen, wurden mesenterische Lymphadenektomien an elf 4-6 Wochen alten, alt-, geschlechts- und genotyp-passenden C57BL/6J-Stammgeschwistern durchgeführt. Die Verfahrenszeiten lagen zwischen 5 und 15 Minuten pro Maus. Alle Mäuse haben den Eingriff gut vertragen und hatten 100 % perioperatives Überleben. Entfernte Proben wurden in PBS auf Eis gelegt. Alle Proben sanken sofort, was einen niedrigen Fettgehalt bestätigte. Entnommene Proben (und vier...

Diskussion

Hier wird ein Überlebensverfahren für eine sichere und gut verträgliche musinare mesenteriale lymphadenektomie an jeder der vier Knotenstationen beschrieben. Die größte Einschränkung dieses Verfahrens ist die indirekte Beziehung zwischen der Exposition und dem Fortschreiten der Lymphknoten entlang der mesenterischen Kette. Die erste Lymphknotenstation ist leicht und vollständig freigelegt. Die zweite Lymphknotenstation ist oft sichtbar, und die Exposition an der^{zweiten bis} vie...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anästhesie-Kreislauf	Irgendeine		Oder injizierbares Anästhetikum
BD LSRII-Durchflusszytometer (oder gleichwertig)	BD Biosciences		Ausgestattet mit FACS Diva Software (für Durchflusszytometrie)
Buprenorphin XR	Irgendeine		Bei Analgesie
Zellkulturmedien	Irgendeine		(für Lebendzelltechniken; d.h. DMEM oder RPMI)
DAPI	Biolegende	422801	Arbeitskonzentration: 15 μG/mL
Ethanol (70 % im Wasser)	Irgendeine		Zum Reinigen
FITC-konjugierte Antimaus-CD45.2 (104)	Biolegende	109806	Arbeitskonzentration: 5 ug/mL
Pinzette: Geneigte, fein gespitzte Zange	Roboz	RS-5058	Material: Dumoxel; Muster #5, 45-Grad-Winkel; Spitzengröße 0,1 x 0,06 mm
Pinzette: Fein gespitzte Pinzette	Roboz	RS-4960	Material: Dumostar; Muster #1; Spitzengröße: 0,20 x 0,12 mm
Pinzette: Fein gespitzte Pinzette	Roboz	RS-4966	Material: Dumostar, Biologie-Tipp; Muster #3; Spitzengröße: 0,08 x 0,04 mm
Lidocain	Irgendeine		Bei Analgesie
Metall-Stagnadel	Irgendeine		20/22 Gauge wiederverwendbare, gerade orale Gavage-Nadel, Edelstahl.
Nadeltreiber	Roboz	RS-6410	Castroviejo-Nadelhalter; Geradeaus
OPTIONAL:      LED-LEDs mit Doppel-/Doppel-Ganzenhalsmikroskop	Irgendeine
OPTIONAL: Evans Blue Farbstoff	Sigma	E2129-10G	Für optionale Lymphverfolgung.
OPTIONAL: Betriebsmikroskop	Leica	MZ9.5	Leica Mz9.5 Stereo-Kopf-Operationsmikroskop
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Irgendeine
Povidon/Jod-Lösung	Irgendeine		Für die Hautvorbereitung/Sterilisation
Schere: Schere mit extra feiner Spitze	Roboz	RS-5605	McPherson-Vannas; 3 mm Schneidkante; gebogene (für Station 3/4-Knoten)
Schere: Schere mit feiner Spitze	Roboz	RS-5650SC	Surecut Castroviejo Schere (für Station 1/2/3 Knoten)
Schere: Mittlere Schere	Roboz	RS-5676	Noyes; 13 mm Schneide; geradeaus
Chirurgischer Kleber	Irgendeine		3M Vetbond-Gewebeklebstoff
Naht: 6-0 blaue Monofilament-Polypropylenex	Irgendeine
Naht: 9-0 schwarze Monofilament-Nylonnaht	Irgendeine		(optional) Man kann auch das etwas größere 8-0 verwenden Nahtgröße.
Gewebefixativ	Irgendeine		(für geplante Histologie; d.h. 10 % neutral gepuffertes Formalin oder 4 % Paraformaldehyd)
Warmwasser-Umlauf-Heizpolster	Irgendeine