Hier stellen wir eine Methode zur Entnahme eines großen Volumens Blut von Schweinen mit Hilfe einer perkutanen intrakardialen Kanüle vor, die an eine Vakuumpumpe angeschlossen ist, als terminales Verfahren.
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Methodenartikel
Großvolumige Blutentnahme von Schweinen für In-vitro-Anwendungen : Verwendung einer intrakardialen Kanülierung und einer Vakuumpumpe als terminales Verfahren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die routinemäßige Blutentnahme ist in vielen Grundlagen- und angewandten Forschungsstudien erforderlich. Mehrere Methoden zur Blutentnahme von Schweinen sind gut beschrieben. Dazu gehören die Verwendung der Ohrvenen für die Entnahme kleiner Blutmengen und der Halsvenen oder der Schädelvene für die Entnahme größerer Blutvolumina. Einige Experimente erfordern große Mengen Blut von einem einzelnen Tier auf einmal für die Analyse oder die Verwendung in primären Zellkulturen, was am besten durch Exsanguination erreicht werden kann. Blut, das für die primäre Zellkultur entnommen wird, muss frisch und sorgfältig verarbeitet werden, um die zelluläre Integrität zu erhalten. Wir beschreiben eine Methode zur aseptischen Entnahme von Schweineblut unter einer chirurgischen Anästhesieebene, bei der ein intravaskuläres Katheter-Stilett mit großer Bohrung, das perkutan in das Herz eingeführt wird, und eine Vakuumpumpe, die effizient ist, eine große Ausbeute bietet und die Zelllyse minimiert. Diese Technik wird einmal an einem Tier in einer chirurgischen Anästhesieebene als terminaler Eingriff durchgeführt, der ein minimales Risiko für Schmerzen oder Leiden bietet.
Einleitung
Schweine wurden in der Forschung in Studien eingesetzt, die von kardiovaskulären Studien über Wundheilung und Toxikologie bis hin zu landwirtschaftlicher Forschung, Immunologie und Krankheitsstudien reichten1. In der Forschung gesammeltes Blut kann zur Untersuchung von Krankheiten, Pharmakologie, Genetik, Immunsystemforschung und Biomarkerforschung verwendet werden. Die Zellkultur ist eines der grundlegendsten Verfahren in der Forschung und ermöglicht es Forschern, das Verhalten und die Funktion von Zellen sowie Krankheitsmodelle und die Entwicklung von Impfstoffen zu untersuchen2. Die Kultivierung von krankheitserregenden Krankheitserregern, wie z. B. dem Afrikanischen Schweinepestvirus, erfolgt häufig in einem vorgegebenen Nährmedium unter strengen aseptischen Laborbedingungen. Die Ausbreitung der Krankheit kann durch Invasion, Ausbreitung oder Anheftung erfolgen, was gesunde, stabile Zellen erfordert3. Untersuchte Krankheitserreger können einen spezifischen Zelltropismus haben, in dem sie vermehrt werden können, und ein großes Blutvolumen führt zu größeren Mengen an Zellen, die verwendet werden können.
Um eine hohe Ausbeute an Zellen eines einzelnen Tieres zu erzielen, muss für die zelluläre Differenzierung eine große Menge Blut schonend entnommen werden, um die Zellintegrität vor der Zelltrennung zu erhalten. Bei Schweinen kann das Gesamtblutvolumen mit 65 ml/kg 4,5 berechnet werden. Nach unserer Erfahrung mit der großvolumigen Entnahme kann etwa die Hälfte des gesamten Blutvolumens eines Tieres gewonnen werden. Daher ist bei großen erwachsenen Schweinen mit einem Gewicht von bis zu 600 Pfund (273 kg) eine Ausbeute von 6-8 L möglich. Bei Schweinen können große Mengen Blut perkutan aus der Schädelvene, der Vena jugularis externa, der Vena saphena saphena durch Kanülierung oder dem Herzen entnommen werden 4,5,6. Die intrakardiale Blutentnahme mit einer Großkanüle ermöglicht jedoch die effiziente Entnahme des größten Blutvolumens bei minimalem Risiko für die Zelllyse. Als terminaler Eingriff muss dies unter einer chirurgischen Ebene der Anästhesie5 durchgeführt werden. In diesem Artikel wird ein Verfahren zur Verwendung einer Vakuumpumpe zur Entnahme mehrerer Liter Blut von Schweinen unter Verwendung eines perkutanen Zugangs zum Herzen mit einem großvolumigen IV-Katheter-Stilett beschrieben, das mit einer Vakuumpumpe verbunden ist 7,8.
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Protokoll
Diese Studie wurde vom Tierpflege- und Verwendungsausschuss der Midwest Veterinary Services Inc. genehmigt. Da die von der IACUC zugelassene, primäre Methode der Euthanasie während dieses Verfahrens die Entblutung ist, ist zu erwarten, dass einige Schweine aufgrund von Blutverlust einen Herzstillstand erleiden. In diesem Fall wird eine sekundäre Euthanasiemethode, wie z. B. eine bilaterale Thorakotomie, durchgeführt. Nach der Entnahme des erforderlichen Blutvolumens wird bei tastbarem Herzschlag eine Spritze mit Euthanasielösung auf das Stilett aufgesetzt und intrakardial als primäre Euthanasiemethode verabreicht, gefolgt von einer sekundären physikalischen Methode. Schweine werden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von landwirtschaftlichen Tieren in Forschung und Lehre, dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren und dem Tierschutzgesetz gehalten.
1. Vorbereitung von Materialien und Tieren (Materialtabelle und Abbildung 1A-C)
- Montieren Sie den Schlauch an Edelstahlhalmen und befestigen Sie das Schlauchende am Luftpolsterschlauch.
- Befestigen Sie den Schlauch mit einem Gummistopfen mit zwei unebenen Metallhalmen und einer Glasflasche an der Rollflasche.
HINWEIS: Das Glas verhindert das Zusammenfallen des Behälters, das durch die Vakuumpumpe erzeugt wird, aber es kann jedes Material verwendet werden, das nicht unter Druck zusammenbricht. - 10 ml Natriumheparin (1.000 USP/ml) aseptisch durch den Saugschlauch und das Katheter-Stilett instillieren, um eine Gerinnung zu verhindern. Geben Sie aseptisch 50 ml Natriumheparin (1.000 USP/ml) in jede Rollerflasche, um eine Endkonzentration von 50 IE/ml pro Liter Blut zu erreichen und eine Blutgerinnung während der Entnahme zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass die Vakuumpumpe auf einen Zug von nicht mehr als 7 Pfund eingestellt ist, um Schäden an den Zellen zu vermeiden.
2. Anästhesie und Tierlagerung
- Wiegen Sie das Tier nicht mehr als 24 Stunden vor dem Eingriff, um die erforderliche Dosis der Anästhesie-Kombinationsmedikamente zu berechnen.
- Injizieren Sie Telazol (3,0-5,0 mg/kg), Ketamin (8-12 mg/kg) und Xylazin (4,0-6,0 mg/kg) intramuskulär in den Nacken oder andere große Muskelbäuche (z. B. epaxiale Muskeln) mit einem 30-Zoll-Verlängerungsset und einer 18 G x 1,5-Zoll-Nadel, um eine tiefe Anästhesie einzuleiten.
HINWEIS: Bei großen Schweinen beträgt das maximal empfohlene IM-Injektionsvolumen 10 ml, so dass ein Ortswechsel nach jeweils 10 ml Verabreichung erforderlich sein kann9. Obwohl wir uns für diesen Cocktail entschieden haben, kann dieses Verfahren unter jedem von der IACUC zugelassenen Anästhesieprotokoll durchgeführt werden, das eine chirurgische Anästhesieebene erzeugt. - Sobald bestätigt wurde, dass sich das Tier in einer chirurgischen Anästhesieebene (~5-8 Minuten) befindet und keinen Lidreflex, einen lockeren Kiefertonus und keine Reaktion auf Schmerzreize zeigt, legen Sie das Schwein auf einen Hubtisch, Boden oder eine andere ebene Fläche in der rechten seitlichen Liege.
- Schneiden Sie die Haare am Thorax über dem Herzen, falls erforderlich, in der Nähe des vierten und fünften Interkostalraums, nur kaudal bis zur Spitze des Ellbogens.
- Falls verfügbar, verwenden Sie einen Ultraschall (Abbildung 2A), um den linken Ventrikel zu identifizieren. Wenn nicht verfügbar, befindet sich der linke Ventrikel am nächsten des vierten oder fünften Interkostalraums medial bis zum Punkt des maximalen Impulses8.
- Schrubben Sie den Bereich aseptisch mit 4 Zoll x 4 Zoll großen Mullschwämmen, die in 2 % Chlorhexidin-Peeling getränkt sind, und 4 Zoll x 4 Zoll großen Mullschwämmen, die in 70 % Isopropylalkohol getränkt sind. Bereiten Sie die Haut vor, indem Sie mindestens 3x lang kreisförmig schrubben, beginnend an der Injektionsstelle und nach außen rotierend, wobei Sie zwischen den beiden Desinfektionsmitteln wechseln.
3. Intrakardiale Blutentnahme
- Stellen Sie sicher, dass das Tier in einer chirurgischen Anästhesieebene geblieben ist, indem Sie den Lidreflex, den Kiefertonus und den Pedalreflex überprüfen.
HINWEIS: Überprüfen Sie während des gesamten Eingriffs die Anästhesietiefe sowie die Herz- und Atemfrequenz, um sicherzustellen, dass das Tier in einer chirurgischen Anästhesieebene bleibt. - Entfernen Sie das Mandrin aus dem IV-Katheter. Platzieren Sie das Mandrin über dem linken Ventrikel und schieben Sie es senkrecht zur Haut, um das Mandrin in den linken Ventrikel einzuführen (Abbildung 2B). Wenn das Blut aus dem Mandrin zu pulsieren beginnt, befestigen Sie es an dem Schlauchendstecker, der an der Rollflasche befestigt ist, und schalten Sie dann die Vakuumpumpe ein (Abbildung 1A und Abbildung 2C).
- Vergewissern Sie sich, dass das Blut in einem stetigen Strom fließt. Während das Blut in die Rollflasche gezogen wird, schwenken Sie die Flasche vorsichtig, um das Blut mit dem Antikoagulans zu vermischen und die Bildung von Blutgerinnseln zu verhindern.
- Sobald 1 l Blut entnommen ist, klemmen Sie den Blasenschlauch mit Hämostaten in die Nähe der Rollflasche. Trennen Sie den Gummistopfen und kleben Sie ihn auf die nächste Rollflasche. Entfernen Sie das Blutstillungsmittel und lassen Sie das Blut frei fließen, während Sie die Rollerflasche vorsichtig schwenken.
- Setzen Sie diesen Vorgang fort, bis das benötigte Blut entnommen wurde. Wenn Sie fertig sind, klemmen Sie den Schlauch fest, um ein übermäßiges Verschütten von Blut zu verhindern, und schalten Sie die Pumpe aus.
- Entfernen Sie den Schlauchverbinder vom Katheter-Mandrin und befestigen Sie die Natrium-Pentobarbital-Spritze am Mandrin. Ziehen Sie die Spritze zurück, um sicherzustellen, dass ein Blutblitz vorhanden ist, und injizieren Sie dann die Euthanasielösung. Bestätigen Sie den Tod durch das Fehlen von Herzschlag, Atmung, Muskeltonus und Reflexen. Sobald der Tod bestätigt ist, entfernen Sie die Nadel aus dem Herzen und geben Sie sie in einen Behälter für scharfe Gegenstände.
- Entsorgen Sie die Luftpolsterschläuche in einem Behälter für biologische Abfälle. Entfernen Sie mit einer Rohrbürste grobes Blut von den restlichen Edelstahlteilen (z. B. Edelstahlstrohhalme, Schlauchendanschlüsse) und autoklavieren Sie sie dann für die zukünftige Verwendung.
- Legen Sie die gereinigten Gummistopfen, Strohhalme, Schlauchendanschlüsse und Hämostate in einen neuen Autoklavenbeutel und sterilisieren Sie sie vor dem nächsten Gebrauch.
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Ergebnisse
Vor der Blutentnahme wurden die Sauen vorab auf Mycoplasma hyopneumoniae, porzine Adenoviren, porzine Parvoviren, Schweine-Coronaviren (übertragbare Gastroenteritis, epidemischer Durchfall bei Schweinen), hämoagglutinierende Schweineenzephalomyelitis, porzines reproduktives und respiratorisches Syndrom, Influenzagruppe A, Circovirus 1 und 2 und Seneca-Virus A untersucht. Wir haben dieses Verfahren mehrmals bei weiblichen Yorkshire-Kreuzungssauen mit einem Gewicht von 300-600 Pfu...
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Diskussion
Das hier beschriebene Verfahren beschreibt eine Katheter-Stilett-zu-Vakuum-Pumpen-Anordnung zur Entnahme eines einmalig großen Volumens Blut aus dem Herzen von Sauen. Aufgrund des Potenzials für Schmerzen und Leiden darf dieses Verfahren nur bei Tieren durchgeführt werden, die sich in einer chirurgischen Anästhesieebene befinden. Durch die Immobilität durch die Narkose kann dieses Verfahren von Anfängern erlernt und schnell gemeistert werden. Mehrere Venen können verwendet werden, um Blu...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Wir möchten uns insbesondere bei der Animal Resource Branch des Plum Island Animal Disease Center, sowohl bei Animal Health Techs als auch bei Animal Care für die hervorragende technische Unterstützung bedanken. Die Finanzierung des Projekts bei der Auftragsforschungsorganisation wurde von der USDA, ARS, Animal Resources Unit bei NBAF, bereitgestellt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1/8 PS Labor Modell Membranpumpe & Armaturendash; 115 VAC, 60 maximal PSI  | Base Supply Center | 80058845 | |
| 10 G x 6 Zoll Katheter-über-Nadel | Covetrus North American Veterinary Supplies | 024616 | |
| 50 mL Spritze, Luer Lock | Fisher Scientific | 13-689-8 | |
| Aquasonic 100 Ultraschall Gel Blue | Midwest Veterinary Supply | 001.02109.2 | |
| Argyl-Blasenrohr, nicht leitend (¼ ") | Fisher Scientific | NC2282605 (Händlerkatalog # 8888280412) | |
| Chlorhexidin Q Scrub 2% oon; | Midwest Veterinary Supply | 562.30804.3 | |
| Corning Einwegrollen-Flaschen. | Fisher Scientific | 06-413 | |
| Corning, PYREX, schmaler Mund, schweres Glas, Erlenmeyer-Kolben oder Ähnliches, wodurch Saugkraft erzeugt | Fisher Scientific | 10-040F | |
| Eisco Nylon-Reagenzglasbürste | Fisher Scientific | S13962 | |
| Fisherbrand Zweiloch-Gummistopfen | Fisher Scientific | Abhängig von Größe | |
| Ketamin (10 mg/mL) | Midwest Veterinary Supply | 275.22100.3 | |
| MLL bis 6 mm Schlauchende (Edelstahl) | Cadence Science | 6547IND | |
| MLL bis 8 mm Schlauchende (Edelstahl) | Cadence Science | 6549IND | |
| MVet Mullschwamm ohne Gewoben 4 x 4 Stück 4 Sperrholz; | Midwest Veterinary Supply | 000.30156.2 | |
| MVet-Isopropylalkohol 70% | Midwest Veterinary Supply | 000.50054.3 | |
| MVet Kelly hämostatische Zange gerade 5,5" | Midwest Veterinary Supply | 000.36800.2 | |
| Natriumheparin (1000 U/mL) | Midwest Veterinary Supply | 191.46701.3 | |
| Natrium-Pentobarbital (390 mg/mL) | Midwest Veterinary Supply | 749.20000.3 | |
| Edelstahlstrohhalme | Hobby Lobby | 1893635 | |
| Telazol (100 mg/mL) | Midwest Veterinary Supply | 275.40000.3 | |
| Xylazin (100 mg/mL) | Midwest Veterinary Supply | 310.01150.3 |
Referenzen
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- Stærk, K., Langhorn, L., Palarasah, Y., Andersen, T. E. A method for collecting high numbers of blood samples in standard vacuum tubes from non-heparinized pigs. Lab Anim. 57 (3), 336-340 (2023).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
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- Velazquez-Salinas, L., et al. Confirming the absence of parental African swine fever virus as a potential contaminant of recombinant live attenuated ASF vaccines. Biologicals. 83, 101685(2023).
- Soleimani, S. A review of the establishment of the seed lot system in the production of biological products and its importance. Arch Razi Inst. 77 (6), 2023-2035 (2022).
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