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Methodenartikel

3D-Flipwell-Engineering für die Entwicklung asynchroner Systeme für toxikologische und immunmodulatorische Therapien in Bakterien-, Darm- und Immunzellen

649 Aufrufe

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DOI:

10.3791/68701

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17. Oktober 2025

 , 
1Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 2MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

Korrespondierende Autoren: Maria A. Beamer <mbeamer@med.umich.edu>, Saori Furuta <sxf494@case.edu>

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll mit den wichtigsten Schritten, um die Entwicklung und Nutzung von 3D-Flipwell zu unterstützen. Wir beschreiben und zeigen, wie die Co-Kultur-Einsatzstapel zusammengebaut und für die Co-Kultivierung geschichteter Schichten von Darmbakterien, Darmepithelien und Makrophagen verwendet werden, um die Darmschleimhautumgebung zu modellieren.

Zusammenfassung

Um die Rolle des bakteriellen Sekretoms bei der Polarisation von Immunzellen und der Homöostase der Darmschleimhaut zu untersuchen, haben wir ein 3-dimensionales Co-Kulturmodell mit kommerziell erhältlichen Inserts in einem Back-to-Back-Stacked-Format entwickelt. Wir nannten dieses System 3D-Flipwells und kultivierten erfolgreich Bakterien, Dickdarmepithel- und Immunzellen in geschichteten Schichten, um die Mikroumgebung der Darmschleimhaut zu rekapitulieren. Dieses Co-Kultursystem ermöglicht die Aussaat von Dickdarmepithelzellen auf der einen Seite der Membran und von undifferenzierten, nicht adhärenten Monozyten auf der anderen Seite und ermöglicht so das synchrone Fortschreiten der Polarisation des Dickdarmepithels, der Schleimbildung sowie der Differenzierung und Polarisation von Monozyten und Makrophagen innerhalb einer einzigen Co-Kultur, ohne dass vordifferenzierte Makrophagen abgelöst und neu beschichtet werden müssen. Dieses System ist einfach zu konstruieren und erfordert nur wenige leicht verfügbare Materialien und Werkzeuge. Wir testeten seinen Nutzen, indem wir die Reaktionen von Co-Kulturkomponenten auf Sepiapterin (SEP) analysierten, den endogenen Vorläufer von BH4 (Tetrahydrobiopterin) -- einem Cofaktor der Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS). Wir zeigten, dass die SEP-Behandlung von 3D-Flipwell die Biofilmbildung durch Darmbakterien, die Schleimproduktion durch das Dickdarmepithel und die pro-immunogene Polarisation von Makrophagen induzierte. Dies deutet darauf hin, dass SEP die Aktivierung eines mukosalen Abwehrmechanismus durch Crosstalk zwischen verschiedenen zellulären Komponenten auslöst. Weitere Experimente sind erforderlich, um die Rolle der mukosalen Kommunikation zu untersuchen, die zur Reprogrammierung von Immunzellen führt, und um den Nutzen dieses Co-Kultursystems für das Screening nach neuen immunmodulatorischen Therapien zu bewerten.

Einleitung

Die Wechselwirkung zwischen Immunzellen und Darmmikrobiom beeinflusst die Wirksamkeit verschiedener Krankheitsbehandlungen stark. Ein solches Crosstalk wird durch äußere Reize deutlich modifiziert, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Stoffwechselanomalien des Wirts, Ernährungsumstellungen, Krankheitsmanifestation und pharmakologische Behandlung. Diese Veränderungen können zu einem Ungleichgewicht in der Zusammensetzung der Mikroflora führen, ein Zustand, der als Dysbiose bezeichnet wird 1,2,3.

Um die Wechselwirkungen zwischen Mikroben und Immunzellen des Wirts im Darm besser zu verstehen, wurden von verschiedenen Gruppen ausgeklügelte Co-Kultursysteme entwickelt, um die Umgebung der Darmschleimhaut zu rekapitulieren. Von dem von Kim et al.4 entwickelten Gut-on-Chip-System bis hin zu einer komplexeren Anordnung unter Verwendung eines speziellen absorbierenden Substrats5 sind diese Co-Kultursysteme nicht einfach zu bauen und können aufgrund ihrer Absorption durch das Co-Kultursubstrat nicht das gesamte Spektrum der sezernierten Komponenten zurückhalten. Noel et al. entwickelten daher ein alternatives Co-Kultur-System zur Modellierung der Darmschleimhaut, das relativ einfacher herzustellen ist6. Dieses neue System verwendet einen einzigen Kultureinsatz, bei dem Dickdarmepithelzellen auf der einen Seite der Membran und vordifferenzierte Makrophagen auf der anderen Seite ausgesät werden6. Die Aussaat von vordifferenzierten Makrophagen erfordert jedoch ihre Vordifferenzierung an einem anderen Ort und ihre Dissoziation und Replattierung in eine Co-Kultur, was möglicherweise ihre zelluläre Integrität und Lebensfähigkeit beeinträchtigt.

Durch die Integration von Verbesserungen an diesen früheren Systemen haben wir ein neuartiges dreidimensionales (3D) mehrschichtiges Co-Kultursystem entwickelt, das wir als 3D-Flipwell-System 7,8 bezeichnet haben. Dieses System besteht aus Zellkultureinsätzen, die Rücken an Rücken gestapelt sind, was das synchrone Fortschreiten der Polarisation des Dickdarmepithels, der Schleimbildung, der Makrophagendifferenzierung und der Polarisation innerhalb einer einzigen Co-Kultur ermöglicht. Dieses System ermöglicht es uns, Veränderungen in der Darmschleimhaut und Wechselwirkungen zwischen Darmbakterien, Epithelzellen und Immunzellen zu untersuchen. Darüber hinaus kann dieses System verwendet werden, um die Auswirkungen äußerer Reize, einschließlich bakterieller Metaboliten, Toxine, Nahrungsnährstoffe und Pharmazeutika, auf die Darmschleimhaut und den Rest des Körpers zu untersuchen 7,8.

Unter Verwendung des neuartigen Co-Kultur-Insert-Systems untersuchten wir die Reaktionen verschiedener zellulärer Komponenten auf Sepiapterin (SEP), den endogenen Vorläufer von BH4 (Tetrahydrobiopterin)-einem Cofaktor der Stickstoffmonoxidsynthase (NOS). Wir haben bereits gezeigt, dass SEP pro-immunogene Aktivitäten auf die Mikroumgebung des Brusttumors ausübt, indem tumorassoziierte Makrophagen zu einem pro-immunogenen Typumprogrammiert werden 9,10,11,12. Wir zeigten, dass SEP synchrone Ereignisse der Biofilmbildung durch Darmbakterien, der Schleimproduktion durch das Dickdarmepithel und der pro-immunogenen Polarisation von Makrophagen in Co-Kulturen induziert, was auf die Aktivierung eines mukosalen Abwehrmechanismus hinweist7. Diese Ergebnisse unterstützen den Nutzen dieses neuen Co-Kultursystems bei der Modellierung der Mikroumgebung der Darmschleimhaut7.

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für den Aufbau dieser neuen Co-Kultur aus Darmbakterien, Darmepithelien, Schleim und Immunzellen bereitzustellen, um die Umgebung der Darmschleimhaut zu modellieren. Wir zeigen auch, wie wir das Crosstalk von co-kultivierten Zellen unter dem Einfluss eines externen Stimulus, z.B. einer SEP-Behandlung, visualisieren können. Weitere Forschungen unter Verwendung dieses Co-Kultursystems sind erforderlich, um sekretierte zelluläre Komponenten zu bestimmen, die die Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zellen in Co-Kulturen erleichtern, sowie um den Nutzen dieses Co-Kulturmodells für das Hochdurchsatz-Screening neuer Therapeutika zu testen. Darüber hinaus würde dieses Co-Kultursystem weitere Modifikationen erfordern, um den physiologischen Zustand der Darmschleimhaut zu erreichen. Um beispielsweise aerobe Säugetierzellen mit anaeroben Bakterien zu co-kultivieren, müssten diese Bakterien separat in anaeroben Medien kultiviert werden, die Sauerstoff entfernen, oder mit flüssigem Paraffin überlagert werden, das den Sauerstoffeintritt verhindert, wie an anderer Stelle berichtet wird. Ein solch fortgeschrittener Nutzen und eine solche Anwendung dieses Co-Kultursystems würden weitere Untersuchungen rechtfertigen.

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Protokoll

1. 3D Flipwell-Technik

  1. Alle Arbeiten sollten in einem Zellkulturschrank durchgeführt werden. Legen Sie alle Vorräte in den Schrank.
  2. Den Deckel der Petrischale öffnen und beiseite stellen. Öffnen Sie die Skalpellklinge aus dem Schutzgehäuse und legen Sie sie auf den Rand des Petrischalebodens. Stellen Sie die Sterilität sicher.
    ACHTUNG: Ein vorsichtiger Umgang mit der Skalpellklinge ist erforderlich. Verwenden Sie bei Bedarf schnittfeste, faserverstärkte Handschuhe, um die Hände zu schützen.
  3. Öffnen Sie die sterile Schutzverpackung des kommerziellen 12-Well-Einsatzes. Stellen Sie die Sterilität sicher. Nimm eine sterile Pinzette. Fassen Sie die Einlage vorsichtig an und nehmen Sie sie aus der Verpackung.
  4. Halten Sie den Einsatz so, dass die Unterseite nach oben zeigt. Nehmen Sie mit der anderen Hand die sterile Skalpellklinge und führen Sie sie bis zum Einsatz.
  5. Stechen Sie mit einer C-förmigen Bewegung in die Membran am Rand ein und schieben Sie die Skalpellklinge vorsichtig um den Einsatzboden herum, wobei Sie nahe an der Kunststoffwand bleiben.
  6. Schneiden Sie die PET-Membran aus und verwenden Sie die zweite Pinzette, um die Membran zu entfernen. Entsorgen Sie die Membran.
  7. Kratzen Sie mit der Skalpellklinge weiße Membranspäne ab, um den Rand und den Rand der Einlage zu reinigen. Setzen Sie den neu vorbereiteten Einsatz vorsichtig wieder in die sterile Originalverpackung ein.
  8. Nehmen Sie als nächstes den Silikonkleberschlauch und schneiden Sie mit der Skalpellklinge die Düsenspitze ab, um eine Öffnung zu machen. Diese Öffnung sollte 3 mm breit sein.
  9. Teste die Perlengröße, indem du den Kleber auf dem Papiertuch ausdrückst. Die Raupe sollte 2-3 mm dick sein. Stellen Sie die Düse ein, wenn die Raupe weniger als 2 mm beträgt und sich nur schwer aus dem Rohr herdrücken lässt.
    1. Eine andere Möglichkeit, die Kleberaupe aufzutragen und zu verteilen, besteht darin, eine 200-μl-Pipettenspitze zu verwenden, deren Spitze abgeschnitten ist. Schneiden Sie 3-4 mm mit einer Schere ab und verteilen Sie den Kleber mit einem Spachtel auf dem Rand der Einlage.
  10. Ziehen Sie die Schutzhülle von der zweiten Einlage ab und legen Sie sie beiseite. Nehmen Sie die sterile Pinzette und nehmen Sie den zweiten Einsatz mit der Membran nach oben aus der Verpackung.
  11. Verteilen Sie vorsichtig eine dünne Silikonperle von 2-3 mm um den Boden des Einsatzes herum und achten Sie darauf, die Membran nicht zu berühren.
  12. Nehmen Sie die zweite sterile Pinzette und heben Sie den ersten Einsatz (ohne Membran) vorsichtig aus der Schutzverpackung.
  13. Bringen Sie die beiden Einsätze von unten nach unten zusammen, so dass die unteren Ränder ausgerichtet sind. Überschüssiger Kleber kann aus der Fuge gedrückt werden. Lass den Kleber trocknen. Er kann abgeschnitten werden, nachdem der Kleber vollständig getrocknet ist (24-72 h). Dies ist optional.
    HINWEIS: Der endgültige Flipwell-Co-Kultureinsatz (FCI)-Stapel sollte nur eine PET-Membran in der Mitte haben. Am besten lassen Sie die L-förmigen Griffe der handelsüblichen Einsätze so positionieren, dass sie 180° voneinander entfernt sind (bei 3 und 6 Uhr). Befolgen Sie die Empfehlungen des Herstellers von Silikonkleber für die Trocknungszeit, die je nach Marke 24-72 Stunden betragen kann. Für die meisten Klebstoffe auf Silikonbasis wird eine Trocknungszeit von 72 h bevorzugt. Der Kleber kann auch nur 24 h mit UV-Sterilisation getrocknet werden.
  14. Wenn der FCI-Stapel verklebt ist, legen Sie ihn zum Trocknen in die sterile Originalverpackung oder in eine tiefe Petrischale. Verwenden Sie den Deckel der angegebenen Petrischale, um die Stapelbaugruppe abzudecken.
  15. Um die Stapelbaugruppen zu sterilisieren, öffnen Sie den Deckel der Petrischale. Reichen Sie den FCI-Stapel mit einer sterilen Pinzette auf den Rand des angegebenen tiefen Petrischalerandes.
  16. Schließen Sie den Glasflügel des BSC-Schranks. Schalten Sie das UV-Licht ein. Treten Sie aus Sicherheitsgründen aus dem Schrank heraus und sterilisieren Sie jede Seite der Membran 30 min-1 h. Schalten Sie das UV-Licht aus, wenn jeder Sterilisationszyklus abgeschlossen ist.
  17. Den Deckel der Petrischale (wie angegeben) mit den Einsatzstapeln über die Petrischale legen und beiseite stellen.

2. Prüfung auf Dichtheit vor der Kollagenbeschichtung

  1. Nehmen Sie den Deckel der Petrischale ab. Fügen Sie 500 μl steriles PBS oder steriles entionisiertes Wasser hinzu.
    HINWEIS: Als visuelle Hilfe wurde DMEM verwendet, um die Integrität der FCI-Stacks zu visualisieren.
  2. Decken Sie die Petrischale ab. Lassen Sie es über Nacht ruhen. Überprüfen Sie die FCI-Integrität am Morgen. Entsorgen Sie die FCIs, wenn ein Leck festgestellt wird. Erstellen Sie bei Bedarf neue Einfügestapel.
  3. Die für den Test verwendete Flüssigkeit (PBS oder Wasser) ist anzusaugen. Decken Sie die Petrischale mit einem Deckel ab.
  4. Lassen Sie die Stapel im BSC trocknen (1-2 h). Lagern Sie die FCIs bis zur Verwendung in einem BSC oder beschichten Sie sie mit Kollagen, um die anhaftenden Zellen auszusäen.

3. Kollagenbeschichtung der Flipwell-Membran

  1. Bereiten Sie einen Arbeitsstock der Kollagenlösung vor, indem Sie die mit 3 mg/ml gelieferte Kollagenlösung auf eine Verdünnung von 1:30 mit 100 μg/ml verdünnen. Geben Sie 33 μl kommerziell hergestellte Kollagenlösung zu 1 ml sterilem entionisiertem Wasser in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Durch Vortexen mischen.
    HINWEIS: Für ein größeres Volumen skalieren Sie auf und verwenden Sie ein konisches 15-ml-Röhrchen, abhängig von der Anzahl der Einsatzstapel, die auf beiden Seiten der Membran beschichtet werden sollen. Machen Sie es jedes Mal frisch. Verwenden Sie das Arbeitsmaterial nicht wieder.
  2. Öffnen Sie den Deckel der Petrischale. Lassen Sie den Flipwell am Rand der Petrischale hängen. Geben Sie vorsichtig 200 μl Kollagenlösung auf eine Seite des Einsatzstapels.
  3. Lassen Sie es 1 Stunde ruhen. Aspirieren Sie die Kollagenlösung. Fügen Sie 200 μl steriles PBS hinzu. PBS ansaugen.
  4. Decken Sie die Petrischale mit einem Deckel ab und lassen Sie die Membran 60 Minuten im Schrank trocknen. Wenn die Membran trocken ist, nehmen Sie die sterile Pinzette/Pinzette, klappen Sie den Flipwell auf die gegenüberliegende Seite und lassen Sie ihn am Rand der Petrischale hängen.
  5. Geben Sie 200 μl Kollagenlösung auf die unbeschichtete (jetzt obere) Seite der Membran. Lassen Sie es 1 Stunde ruhen.
  6. Aspirieren Sie die Kollagenlösung. Fügen Sie 200 μl steriles PBS hinzu. PBS ansaugen. Decken Sie die Petrischale mit einem Deckel ab und lassen Sie die Membran 60 Minuten im Schrank trocknen. Lassen Sie den FCI-Stapel über Nacht trocknen oder säen Sie ihn am selben Tag.
    HINWEIS: Die Unversehrtheit der Kollagenbeschichtung wurde nicht unter langen Lagerbedingungen getestet. Sobald die Flipwells vorbeschichtet sind, müssen sie innerhalb von 24 h verwendet werden.

4. Konstruktion der Bakterieneinlage für Bakterienkulturen

  1. Platzieren Sie zwei Sätze steriler Pinzetten und die 24-Well-Einsätze in der BSC. Öffnen Sie vorsichtig die Einsätze und lassen Sie sie in der sterilen Verpackung.
  2. Heben Sie den Einsatz mit einer sterilen Pinzette aus der sterilen Verpackung. Brechen Sie mit der zweiten Pinzette/Pinzette die kleinen Plastikfüße an der Unterseite des Einsatzes ab.
  3. Testen Sie den 24-Well-Einsatz, indem Sie ihn in einen der sterilen FCI-Stacks oder Original-12-Well-Einsätze einsetzen.
  4. Wenn der Einsatz nicht in die Vertiefung gleitet, verwenden Sie erneut eine Pinzette, um mehr Kunststoffmaterial von der Felge abzubrechen, wo sich Rand und Füße treffen.
  5. Testen Sie die Passung erneut, bis der 24-Well-Einsatz in der Lage ist, in die 12-Well-Einsatzmulde zu gleiten. Legen Sie den Einsatz entweder in die sterile Packung oder in eine sterile Petrischale.
  6. UV-Sterilisierung oder Ethanol des Einsatzes (optional). Decken Sie die Packung wieder ab oder decken Sie sie mit dem Deckel der Petrischale ab, bis sie gebrauchsfertig ist.

5. Konstruktion der Nadel

  1. Bringen Sie die Werkzeuge und alle Vorräte in einen BSC. Halten Sie eine Nadel vorsichtig mit der Eckzange fest.
  2. Messen Sie die Position jeder Biegung auf der Nadel mit einem Lineal. Fassen Sie mit der zweiten Spitzzange die Nadel an der ausgewählten Stelle und biegen Sie die Nadel.
  3. Erstellen Sie die zweite Biegung. Um die Nadel zu verdrehen, greifen Sie die Nadel mit einer Zange an der Basis und an der U-förmigen Biegung und drehen Sie sie in die entgegengesetzte Richtung, um eine Drehung von 4-5 mm zu erzeugen. Dieser Schritt ist entscheidend, um die Nadel zum Entfernen der Luftblase leicht in den Flipwell einzuführen.
  4. Befestigen Sie die Nadel an einer sterilen 3- oder 5-mm-Spritze. Sterilisieren Sie die Nadel und die Spritzenbasis in 20 ml 70%-95% Ethanol in einem konischen 50-ml-Röhrchen.
  5. Ziehen Sie Ethanol durch die Nadel und die Spritze, um sicherzustellen, dass die Nadel und der Boden der Spritze sterilisiert sind.
  6. Nehmen Sie die Spritze und die Nadel mit Ethanol aus dem konischen Röhrchen und lassen Sie es an der Luft trocknen, indem Sie es auf eine Petrischale legen. Spülen Sie die Nadel zum Trocknen mit Luft und lassen Sie sie einige Minuten trocknen.

6. Aussaat der dickdarmepithelialen Caco-2:HT29-MTX-E12-Zelllinien

  1. Beginnen Sie mit der Kultivierung von Caco-2- und HT29-MTX-Zelllinien 2-3 Wochen vor dem Experiment in separaten 100-mm-TC-beschichteten Schalen in ihren jeweiligen Wachstumsmedien.
    1. Verwenden Sie für HT-29-MTX-Medien 440 ml DMEM mit hohem Glukosegehalt (4,5 g/l) und 1 % (v:v) Glutamax-Medien mit 50 ml 10 % (v:v) hitzeinaktiviertem FBS, 5 ml 1 % (v:v) Pen Strepto und 5 ml HEPES 10 mM Endkonzentration.
    2. Verwenden Sie für Caco-2-Medien 440 ml DMEM mit hohem Glukosegehalt (4,5 g/l) und 1 % (v:v) Glutamax-Medien mit 50 ml 10 % (v:v) hitzeinaktiviertem FBS, 5 ml 1 % (v:v) Pen Strepto und 5 ml nichtessentielle Aminosäuren.
      HINWEIS: Bestimmen Sie die Aussaatdichte für die Caco-2-Zelllinie mit Hilfe von gewebekulturbeschichteten 12-Well-Plattenvertiefungen. Berechnen Sie die Anzahl der Tage bis zu 100 % Konfluenz, abhängig von der Anfangsdichte der Aussaat. Wir geben eine Aussaatdichte als Richtwert an; Dies hängt jedoch von der Formulierung des Wachstumsmediums, dem Anbieter und dem verwendeten FBS ab. Dieser Schritt ist entscheidend, um sicherzustellen, dass eine Monoschicht für die Darmepithelseite des Flipwells vorhanden ist, nachdem THP-1-Zellen plattiert und Bakterien-/SEP-Behandlungen durchgeführt wurden.
  2. Um Caco-2- und HT-29-Zellen zu passieren, aspirieren Sie das Kulturmedium. Mit 10 mL PBS waschen.
  3. Trypsinisieren Sie die Zellen durch Zugabe von 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA. 5-10 min bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubieren.
  4. Geben Sie 7 ml des zelltypischen Wachstumsmediums auf die Platten. Übertragen Sie die Zellen in separate sterile konische 15-ml-Röhrchen.
  5. Pellet durch Zentrifugation für 5 min bei 500 x g bei Raumtemperatur erhitzen. Saugen Sie den Überstand an, ohne das Zellpellet zu stören.
  6. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL vorgewärmtem HT-29-Medium auf DMEM-Basis. Zählen Sie Zellen mit einem Hämazytometer oder einem Zellzähler.
  7. Kombinieren Sie die beiden Zelltypen Caco-2:HT-29-Zellen mit einem Verhältnis von 9:1 in einem neuen konischen 15-ml- oder 50-ml-Röhrchen, je nachdem, wie viele Zellen für die gewünschte Anzahl von Flipwells benötigt werden.
  8. Verwenden Sie kollagenvorbeschichtete Flipwells für die folgenden Schritte. Hängen Sie die mit Kollagen vorbeschichteten FCI-Stapel an den Rand der tiefen Petrischale.
  9. 500 μl von 7,5 x 104 Zellen pro cm2 (2,6 x 105 Zellen/12-Well-Einsatz) pro apikaler Seite von Flipwell aussäen. Berechnen Sie die Anzahl der Startzellen basierend auf der Anzahl der verwendeten Stapel. Dazu gehören beide Zelltypen im Verhältnis 9:1.
  10. Decken Sie die Baugruppen mit einem Petrischalendeckel ab. Über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubieren, bis sich die Zellen anheften. Die Zellen beginnen nach etwa 7-10 Tagen in Kultur mit der Schleimproduktion. Wechseln Sie alle zwei Tage die Medien, um die Kultur zu erhalten.
    HINWEIS: Die Gesamtzahl der Tage in Kultur mit Behandlungen muss im Voraus berechnet werden. Das Flippen und die anfängliche Seeding-Dichte hängen von dieser Dauer ab.

7. Wenden des 3D-Flipwells zur Vorbereitung der Aussaat von THP-1-Zellen

  1. Wenn Caco-2:HT-29-Zellen sich anheften und zu proliferieren beginnen (die genaue Konfluenz muss auf der Grundlage des verwendeten Mediums/FBS und der Dauer der Kultur geschätzt werden), aber keine 100%ige Konfluenz erreicht haben, drehen Sie den Flipwell um, um THP-1-Zellen auf der anderen Seite der Membran zu säen.
    HINWEIS: THP-1-Zellen müssen bis zu diesem Zeitpunkt in einer separaten Kultur expandiert worden sein, und die genaue Anzahl der benötigten Zellen wird auf der Grundlage der Anzahl der verwendeten FCI-Stacks geschätzt.
  2. Öffnen Sie den Deckel der Petrischale und aspirieren Sie das DMEM-Medium von der apikalen (Darmepithel) Seite des FCI-Stacks.
  3. Nehmen Sie den Flipwell mit einer sterilen Pinzette vorsichtig am Haken auf und drehen Sie ihn um 180°. Fassen Sie mit der zweiten sterilen Pinzette den FCI-Stapel an dem anderen Haken, der nun nach oben zeigt.
  4. Senken Sie die Baugruppe wieder in die Petrischale ab und hängen Sie den Haken über den Rand der Petrischale. Wenn Sie noch nicht bereit sind, die THP-1-Zellen auszusäen, geben Sie genügend Medien in die tiefe Petrischale, um das Medium nach oben und knapp an den Rand der Membran zu bringen.
    HINWEIS: Der Flipwell sollte in dieser Position stabil sein, und das Seeding mit THP-1-Zellen und Medienzugabe sollte jetzt sofort in Betracht gezogen werden. Diese Schritte sind schnell erledigt. THP-1-Zellen müssen gezählt werden und bereit für die Platte sein. Die THP1-Zellen wurden zuerst ausgesät, um den FCI-Stack für mehr Stabilität und Endgewicht zu beschweren. Anschließend wurde das DMEM-Medium in die tiefe Petrischale gegeben, um das Medium auf die Unterseite der Membran zu bringen. Die speziell angefertigte Nadel wurde dann verwendet, um die Luftblase zu entfernen, was den FCI-Stack weiter stabilisierte und die letzten Volumenanpassungen ermöglichte.
  5. Verwenden Sie die Nadel, um die Luftblase zu entfernen, wie im folgenden Schritt beschrieben.

8. Entfernung von Luftblasen

  1. Nadel und Spritze vor der Verwendung in Ethanol vorsterilisieren und an der Luft trocknen lassen (siehe Schritt 5). Tauchen Sie den Spritzenkolben ein.
  2. Halten Sie den FCI-Stapel mit einer sterilen Pinzette am Arm. Senken Sie die Nadel vorsichtig in und unter die Einsatzgarnitur und platzieren Sie die weiche Spitze der Sondennadel sehr vorsichtig bis zur Luftblase.
  3. Ziehen Sie den Spritzenkolben vorsichtig und sehr langsam nach oben und beobachten Sie, wie die Luftblase langsam verschwindet. Stoppen Sie, wenn die Luftblase einen Durchmesser von etwa 2 mm hat, was ausreicht, um eine gute DMEM-Abdeckung für die Dickdarmepithelzellen zu erhalten.
  4. Entfernen Sie die Nadel und die Spritze vorsichtig aus dem Flipwell. Fahren Sie mit der anderen Einsatzanordnung in der tiefen Petrischale fort.

9. THP-1-Aussaat und PMA-Behandlung

  1. Stellen Sie THP1-Medien mit 420 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640-Medium, 50 ml 10 % (v:v) hitzeinaktiviertem FBS, 5 ml Glutamax 1 % (v:v), 5 ml HEPES (10 mM Endkonzentration), 11 ml Glukose (4,5 g/l Endkonzentration) und 5 ml Pen-Strep (1 % v:v) her.
    HINWEIS: THP-1-Zellen müssen mehrere Tage lang in RPMI-basiertem Kulturmedium gezüchtet werden, bevor sie in die Einsätze eingesät werden. Führen Sie Berechnungen der Zellzahl vor dem Seeding durch und skalieren Sie basierend auf der Anzahl der zu verwendenden FCI-Stacks hoch.
  2. Bereiten Sie die Zellsuspension auf der Grundlage eines Volumens von 500 μl und einer Dosis von 0,5 x 106 Zellen pro 500 μl THP-1-Medium vor. Wenn PMA zur Differenzierung und Polarisation verwendet werden muss, fügen Sie es dem RPMI-Medium mit 100 ng/μl hinzu.
    1. Um PMA herzustellen, rekonstituieren Sie 5 mg Phorbolmyristatacetat (PMA) in 1 ml DMSO, um 5 mg/ml Stammlösung herzustellen. Durch Vortexen mischen. In Mikrozentrifugenröhrchen à 20 μl aliquotieren und bei -20 °C lagern.
    2. Um PMA zu verwenden, stellen Sie ein Arbeitsmaterial mit 50 μg/ml her, indem Sie 1 μl von 5 mg/ml-Material in 99 μl (1:100) vollständiges Wachstumsmedium verdünnen. Geben Sie 1 μl Arbeitsmaterial auf 500 μl Medium oder 20 μl Arbeitsmaterial auf 10 mL Medien.
  3. THP-1 Zellen bei 94 x g für 5 min bei RT zentrifugieren, um sie zu pelletieren. Resuspendieren Sie in 5-10 ml RPMI-Medien. Zählen Sie THP-1-Zellen mit einer beliebigen Zählmethode.
  4. Erneut bei 94 x g für 5 min bei RT zentrifugieren. Bei 0,5 x 106 Zellen pro 500 μl THP-1-Medium resuspendieren.
  5. Geben Sie 500 μl THP-1-Zellsuspension auf die apikale Seite des Co-Kultur-Einsatzstapels. Passen Sie das HT-29-Medium für die Dickdarmepithelzellen an, indem Sie das Medium in die tiefe Petrischale geben.
  6. Entfernen Sie die Luftblase bei Bedarf mit einer Sondennadel gemäß Schritt 8. Kultivieren Sie beide Zelltypen im Zellkultur-Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2 und 100 % Luftfeuchtigkeit, bis sich die THP-1-Zellen anheften (über Nacht) und 1-2 Tage lang vermehren.
  7. Bereiten Sie sich entweder auf Behandlungen mit SEP oder anderen Medikamenten vor oder bereiten Sie sich auf bakterielle Insertionen vor (siehe Schritt 4). Beginnen Sie mit der Kultivierung von Bakterien 1 Tag vor dem nächsten FCI-Stack-Flip.

10. Zweiter Flipwell Flip und Luftblasenentfernung für SEP- und Bakterieneinlagen

  1. Öffnen Sie den Deckel der Petrischale. Aspirieren Sie das RPMI-Medium von der apikalen Seite. Halten Sie den Flipwell mit einer sterilen Pinzette am Arm fest und heben Sie den Stapel an.
  2. Drehen Sie den Stapel auf den Kopf. Halten Sie die Stapelbaugruppe mit der zweiten Pinzette an den verfügbaren Arm.
  3. Senken Sie den Stapel in eine neue, sterile, tiefe Petrischale ab und hängen Sie ihn über den Rand. Geben Sie 500 μl DMEM-Medium auf die nun epische/Darmepithelseite.
  4. Geben Sie genügend RPMI-Medien in die tiefe Petrischale, bis sich das Medium nur noch an der Oberseite der Membran befindet. Das RPMI-Volumen wurde auf etwa 40-55 ml geschätzt, ändert sich jedoch je nach Anzahl der verwendeten FCI-Stacks pro tiefer Petrischale.
  5. Entfernen Sie die Luftblase mit Schritt 8 und lassen Sie 2-3 mm Blase übrig. Passen Sie die RPMI-Medien bei Bedarf an. Decken Sie den Teller ab.
  6. Kultur, bis die Dickdarmepithelzellen beginnen, Schleim zu produzieren. Wechseln Sie das Medium teilweise jeden zweiten Tag.
    HINWEIS: Wenn die Dickdarmepithelzellen lange genug kultiviert wurden und bereits Schleim produziert haben, können sie mit dem Bakterieneinsatz oder den Behandlungen fortfahren. Lassen Sie das Medium im unteren Fach nicht unter die Unterseite der Membran des Einsatzes gelangen. Fügen Sie weitere DMEM-Medien hinzu, um das Medium waagerecht an der Membran zu halten. Die ideale Methode zum Wechseln des Mediums besteht darin, die Hälfte des Mediums aus dem basolateralen Kompartiment zu entfernen und ein kleines Volumen des Mediums im apikalen Kompartiment zu belassen, um das Eindringen von Luft zu verhindern.
  7. Für die SEP-Behandlungen geben Sie SEP in der Endkonzentration von 100 μM zu diesem Zeitpunkt in die Vertiefungen, wenn die Bakterienkultur nicht verwendet wird. Wenn eine Bakterienkultur und ein Einsatz verwendet werden, fügen Sie der Bakterienkultur SEP hinzu. Für die Bakterienkultur siehe Schritt 11.
    1. Um SEP herzustellen, fügen Sie 100 mg L-Sepiapterin zu 84,3 ml DMSO hinzu und mischen Sie es durch Vortexen. Aliquot in Mikrozentrifugenröhrchen mit je 100 μl. Bei -20 °C lagern. Verwenden Sie SEP-Aliquots in einer Menge von 1 μl pro 500 μl Medium pro Einsatzanordnung (Endkonzentration von 100 μM).

11. Starten der Bakterienkultur (optional)

  1. Um die Wirkung bakterieller Metaboliten auf die Immunzellen, den Schleim und das Dickdarmepithel zu untersuchen, fügen Sie ein bakterielles Insert an der apikalen Seite der Insert-Anordnung hinzu. Für die Konstruktion des Bakterieneinsatzes befolgen Sie Schritt 4. Wir haben Bacillus subtilis am Tag vor der Verwendung des Bakterieneinsatzes kultiviert.
  2. Stellen Sie den Miller LB 2 Tage vor der Verwendung des Bakterieneinsatzes her und autoklavieren Sie ihn. Zur Herstellung von LB werden 6,25 g Miller LB mit 250 ml entionisiertem Wasser in einem 500-ml-Glaskolben kombiniert. Mit Alufolie abdecken. Autoklavieren, auf RT abkühlen. Kann sterile LB entweder bei 4 °C oder RT lagern.
  3. Beginnen Sie mit der Zucht von Bacillus subtilis-Bakterien aus Glycerinvorräten am Tag vor der Verwendung des Bakterieneinsatzes.
  4. Um die Bakterienkultur zu starten, inokulieren Sie 10 ml Miller LB mit Bacillus subtilis aus einem gefrorenen Glycerinstamm in einem sterilen konischen 50-ml-Röhrchen. Lassen Sie die Glycerinbrühe nicht auftauen.
  5. Nehmen Sie mit einer sterilen 200-μl-Spitze eine kleine Menge Bakterien aus dem Glycerinvorrat auf. Werfen Sie die Spitze in 10 mL LB in das sterile konische 50-ml-Röhrchen aus.
  6. Wenn Sie SEP verwenden, beginnen Sie die Behandlung mit 20 μl SEP-Stamm (die Endkonzentration sollte 100 μM betragen). Direkt in die 10-ml-Bakterienkultur in der konischen 50-ml-Röhrchen-Starterkultur geben.
  7. Kultivieren Sie Bacillus subtilis für 8 h in einem Schüttelbrutkasten bei 220 U/min und 37 °C. Fügen Sie die zweite Behandlung mit SEP am Ende des Tages hinzu - fügen Sie 20 μl SEP zu der Endkonzentration von 100 μM zu den 10 mL LB mit Bakterien hinzu.
  8. Kultur über Nacht bei 220 U/min, 37 °C. Fügen Sie am nächsten Morgen die dritte Behandlung von 20 μl SEP zu 10 ml LB mit Bacillus subtilis hinzu und schütteln Sie weiter, bis die Bakterieneinsätze fertig sind.

12. Hinzufügen eines Bakterieneinsatzes zum Flipwell (optional)

  1. Führen Sie die Konstruktion des Bakterieneinsatzes wie in Schritt 4 beschrieben durch. Führen Sie die Bakterienkultivierung wie in Schritt 11 beschrieben durch.
    HINWEIS: Wenn ein separater Zellkulturschrank verfügbar ist, funktioniert dies am besten. Andernfalls teilen Sie den Arbeitsbereich in einem Zellkulturschrank in zwei Hälften. Halten Sie Bakterien- und Zellkulturen getrennt. Die Zellkulturen sollten nicht in den Zellkultur-Inkubator zurückgeschickt werden. Das BSC muss sterilisiert und nach Durchführung dieser Methode 24 Stunden oder länger der UV-Strahlung ausgesetzt werden.
  2. Verwenden Sie für die folgenden Schritte zwei Paar sterile Pinzetten. Alle unten aufgeführten Schritte sind in der BSC durchzuführen.
  3. Heben Sie mit einer Pinzette den vorgefertigten sterilen 24-Well-Einsatz aus der Verpackung. Legen Sie den Einsatz in eine sterile Petrischale und decken Sie den Deckel ab.
  4. Wiederholen Sie den Vorgang für die Anzahl der benötigten Bakterieneinsätze. Übertragen Sie die Petrischale mit den Flipwells aus dem Inkubator in den BSC und stellen Sie sie auf der gegenüberliegenden Seite der Schale mit Bakterieneinsätzen beiseite.
  5. Nehmen Sie 300 μl des DMEM-Mediums von der apikalen (oberen) Seite des Flipwells, um das Einsetzen des Bakteriums zu ermöglichen. Lassen Sie etwa 200 μl auf der Oberseite des FCI-Stacks. Setzen Sie den Deckel der Petrischale über die Einsatzbaugruppen.
  6. Geben Sie 50-100 μl B.subtilis-Kultur zu den 24-Well-Bakterieneinsätzen. Achten Sie darauf, dass die Außenwand und der Rand des Bakterieneinsatzes nicht verschüttet oder verunreinigt werden. OD600 kann eingenommen werden, um die Wachstumsphase der Kultur zu überwachen.
  7. Heben Sie mit einer sterilen Pinzette den Bakterieneinsatz mit Kultur an und führen Sie ihn vorsichtig in die Flipwell-Oberseite ein. Drehen Sie den Arm und hängen Sie ihn an den Rand des FCI-Stapels. Halten Sie den Stapel mit der zweiten sterilen Pinzette.
  8. Wiederholen Sie den Vorgang für den Rest der FCI-Stapel. Decken Sie die Petrischale ab und ruhen Sie 3 h in der BSC. Nicht in den Inkubator bringen.
  9. Entfernen Sie nach 3 Stunden mit einer sterilen Pinzette den Bakterieneinsatz aus dem Flipwell. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die restlichen Einsatzbaugruppen. Entsorgen Sie die Bakterieneinlagen.
    HINWEIS: Entsorgen Sie Bakterien und Bakterieneinsätze gemäß den Richtlinien der Institution zur Entsorgung biologischer Abfälle und den Sicherheits- und Gesundheitsrichtlinien. Bakterielle Bestandteile oder Bakterien selbst wurden nicht untersucht.
  10. Um Veränderungen der mukosalen, epithelialen und immunzellulären Kompartimente zu analysieren, fahren Sie mit dem Waschen der Membranen fort und bereiten Sie sie für die Bildgebung vor.
  11. Saugen Sie das DMEM-Medium von der Flipwell-Oberseite an. Mit 500 μl sterilem PBS waschen. Heben Sie den FCI-Stapel mit einer Pinzette aus der Petrischale und übertragen Sie ihn in eine neue Petrischale.
  12. Klappen Sie den Flipwell um und hängen Sie ihn über den Rand der Petrischale. Waschen Sie die Membran mit 500 μl sterilem PBS.
  13. Wenn eine Lagerung erforderlich ist, lagern Sie die FCI-Stapel kurzfristig (30 Minuten über Nacht) in sterilem PBS in einem konischen 50-ml-Röhrchen.
    HINWEIS: Es ist wichtig zu bestimmen, welches bildgebende Verfahren als nächstes verwendet wird und ob die Membran sowohl für die Elektronenmikroskopie als auch für die Fluoreszenzantikörpermarkierung in zwei Hälften geschnitten wird.

13. Demontage des Flipwells für die Rasterelektronenmikroskopie (REM)

HINWEIS: Um morphologische Veränderungen in Dickdarmepithelzellen und Makrophagen nach SEP/bakteriellen Behandlungen zu untersuchen, fixierten wir die Membranen in einem Fixationspuffer und zerlegten dann die Flipwells für die Rasterelektronenmikroskopie (REM). PFA wurde als Fixiermittel verwendet; Es kann aber auch Glutaraldehyd verwendet werden. Es ist wichtig, sich mit dem Microscopy Core über den bevorzugten Fixierungspuffer, die spezifischen Dehydratisierungsschritte und die anfänglichen Fixierungspufferkonzentrationen zu beraten. Membranen können im Fixierpuffer gelagert werden, wenn eine Lagerung erforderlich ist. Die Arbeit kann außerhalb des BSC erledigt werden. Wenn der Imaging Core die Membran festklebt, kann sie in zwei Hälften geschnitten und so positioniert werden, dass beide Seiten separat abgebildet werden.

  1. Beschriften Sie die Kunststoffseiten des FCI-Stapels mit einem lösungsmittelbeständigen Marker mit einem Symbol, das für den verwendeten Zelltyp codiert. Alternativ können Sie die Membran direkt mit einem Punkt, einem Häkchen oder einem x beschriften, um den verwendeten Zelltyp zu beschriften.
  2. Legen Sie den Flipwell ohne Demontage in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Fügen Sie 4 % PFA hinzu, um den Stapel zu untertauchen. Bewahren Sie 4% PFA über Nacht auf.
    1. Um 4% PFA (methanolfrei) herzustellen, lösen Sie 40 g Paraformaldehyd in 800 mL 1x PBS. Um 0,4 % PFA herzustellen, lösen Sie 4 g Paraformaldehyd in 800 ml 1x PBS oder verdünnen Sie 4 % PFA 1:10 mit 1x PBS, indem Sie 100 ml 4 % PFA zu 900 ml 1x PBS hinzufügen.
  3. Tauschen Sie PFA gegen 0,4 % für eine längere Lagerung aus. Konsultieren Sie den Microscopy Core für Lagerdauer und Puffer.
  4. Um den Flipwell zu zerlegen, halten Sie ihn mit beiden Händen fest und drehen Sie jeden verklebten Teil des Stapels ab. Der Stapel wird in zwei Teile zerlegt: Ein Teil hat die Membran und der andere ist der Einsatz ohne Membran. Entsorgen Sie den Einsatz ohne die Membran.
  5. Drehen Sie den Einsatz mit der Membran und setzen Sie ihn mit der Membran nach oben ab. Kann die Membran mit einem kleinen Punkt oder x am Rand der Membran markieren, um zu wissen, welche Seite welchen Zelltyp hat.
  6. Halten Sie den Einsatz mit einer Pinzette an der Wand. Schneiden Sie die Membran vorsichtig mit einer Skalpellklinge aus und legen Sie sie in ein 1,7-ml-Röhrchen oder eine kleine Glasflasche mit 500 μl-1 mL 0,4%-4%iger PFA-Lösung.
  7. Senden Sie es an den Mikroskopiekern für die Dehydratisierungsschritte und die Bildgebung. Die Schritte der Dehydrierung sind in Beamer et al. 7 beschrieben.
  8. Entsorgen Sie PFA oder andere Fixiermittel gemäß den von der Organisation vorgeschriebenen Richtlinien zur Entsorgung gefährlicher Abfälle sowie den Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien.

14. Methode mit großen Tröpfchen zum Zerlegen des Flipwells für die konfokale Mikroskopie

HINWEIS: Es wurde eine neue Methode entwickelt, um die Membranen zu färben und abzubilden. Der Co-Kultur-Einsatzstapel wurde durch anfängliche Fixations-, Permeabilisierungs- und Blockierungsschritte in einem konischen 50-ml-Röhrchen intakt gehalten. Immunfluoreszenzmarkierung und konfokale Mikroskopie wurden verwendet, um beide Seiten der Membran abzubilden. Für die Inkubationsschritte über Nacht wurde die neu bezeichnete 12-Well-Plattenmethode verwendet, und eine Methode mit großen Tröpfchen wurde verwendet, um den Boden des zerlegten Einsatzes zu färben. Der konfokale Z-Stack wurde für die Abbildung beider Seiten mit der Membran verwendet. Die gefärbten Membranen wurden zwischen zwei kreisförmigen Glasdeckgläsern eingeklemmt, und die Sandwich-Anordnung wurde in der Mitte zwischen zwei Metallringen der kommerziell hergestellten runden Kammer platziert, um sie abzubilden. Das konfokale Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskop wurde mit kommerzieller Bildgebungssoftware verwendet.

  1. Um die Membran zu waschen, legen Sie den Co-Kultureinsatzstapel direkt in ein konisches 50-ml-Röhrchen und fügen Sie 15 ml steriles PBS hinzu oder waschen Sie jede Seite separat (siehe unten).
  2. Aspirieren Sie das DMEM und geben Sie 300 μl steriles PBS auf die apikale Seite. Aspirieren Sie PBS und entfernen Sie den Stapel vorsichtig aus der Petrischale.
  3. Drehen Sie den Flipwell um und fügen Sie 300 μl PBS zu dem jetzt nach oben gerichteten RPMI des FCI-Stacks hinzu. Aspirieren Sie das PBS.
  4. Beschriften Sie mit einem lösungsmittelbeständigen Marker die Ober- und Unterseite des Stapels, um zu wissen, welche Seite welchen Zelltyp hat.
  5. Legen Sie den Flipwell in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen. Fügen Sie 15 ml steriles 4%iges PFA als anfänglichen Fixierungspuffer für 10 Minuten hinzu. Wenn eine Inkubation über Nacht erforderlich ist, tauschen Sie es gegen 15 ml 0,4 % PFA in PBS aus, decken Sie es ab und lassen Sie es über Nacht stehen.
  6. Um mit der Immunfärbung fortzufahren, schaffen Sie einen Platz für die Methode der großen Tröpfchen.
    Reißen Sie 10 x 14 Zoll große Stücke Plastikfolie ab und kleben Sie sie an den Ecken an die Bank, um eine glatte Oberfläche zu erhalten.
  7. Erzeugen Sie mit einer 200-μl-Pipette ein großes Tröpfchen mit 200 μl PBS. Drehen Sie die Einsatzbaugruppe ab, um sie in die Einsätze zu trennen.
  8. Platzieren Sie mit einem lösungsmittelbeständigen Marker einen kleinen Punkt nahe dem Rand einer Seite der Membran, um zu wissen, welcher Zelltyp für die Färbung und Bildgebung verwendet wird.
  9. Entfernen Sie alle Silikondichtungsreste von der Einsatzunterseite, wenn die Einlage mit der Membran noch Klebstoffreste aufweist. Dies geschieht, um sicherzustellen, dass die Einlage für die folgenden Schritte aufrecht bleibt.
  10. Positionieren Sie den FCI-Stack (mit THP-1-Zellen) vorsichtig auf dem 200 μl großen Tropfen PBS. 200 μl Permeabilisierungspuffer auf die Oberseite mit den Dickdarmepithelzellen geben und 10 Minuten aufbewahren.
    1. Zur Herstellung des Permeabilisierungspuffers verwenden Sie 0,1 % v/v Triton-X100 in PBS.
  11. Aspirieren und 200 μl PBS hinzufügen. Wiederholen Sie diese Wäsche 2x. Erstellen Sie ein neues Tröpfchen mit 250 μl Blockierungspuffer.
    1. Um Blockierungspuffer herzustellen, fügen Sie 250 μl normales Ziegenserum in 5 ml 1x PBS (letztes 5% Serum) hinzu. 15 μl Triton-X100 (endgültig 0,3 % v:v) zugeben, gut mischen und 1-2 Tage bei 4 °C lagern.
  12. Platzieren Sie den Einsatz auf dem Blockierungspuffer. 30 min bei Raumtemperatur blockieren. Aspirieren Sie PBS von der apikalen Seite und fügen Sie 200 μl Blockierungspuffer auf die Oberseite des Einsatzes hinzu. Beide Seiten der Membran sind nun bereit für die Antikörperfärbung über Nacht.

15. Immunfluoreszenz-Färbung (IF)

HINWEIS: Die Färbung erfolgt über Nacht mit einer 12-Well-Plattenmethode oder auf dem Tisch mit einer Methode mit großen Tröpfchen.

  1. Bereiten Sie die erforderlichen Antikörper vor, die für die Färbung beider Seiten der Membran über Nacht bei 4 °C oder auf der Bank bei RT verwendet werden sollen. Verdünnen Sie alle Antikörper 1:100 in 1 % BSA in PBS. Alternativ können Sie den Empfehlungen des Herstellers folgen und die Färbung optimieren, um die idealen Konzentrationen und den Antikörperverdünnungspuffer zu bestimmen.
  2. Methode der großen Tröpfchen
    1. Mache ein großes Rechteck mit einer Plastikfolie auf der Bank und klebe die Ecken fest. Pipettieren Sie 200 μl Antikörper, verdünnt auf den Kunststoff, um ein großes Tröpfchen zu erzeugen. Legen Sie die Einlegebahn nach unten auf das große Tröpfchen.
    2. Geben Sie 200 μl primäres Ab auf die Oberseite des Einsatzes. 2 Stunden bei RT inkubieren.
  3. 12-Well-Plattenmethode
    1. Wenn Sie eine 12-Well-Plattenmethode über Nacht verwenden, geben Sie 300 μl Primärantikörper auf die Oberseite des Einsatzes.
    2. Geben Sie 300 μl Primärantikörper in die Vertiefung der 12-Well-Platte. Legen Sie den Einsatz in die 12-Well-Plattenmulde auf das Tröpfchen. Decken Sie den Teller mit einem Deckel ab und stellen Sie ihn über Nacht bei 4 °C auf.
  4. Wenn die Färbung abgeschlossen ist, waschen Sie beide Seiten der Membran mit PBS. Spülen Sie mit einer Pipette und einer 200 μL Spitze die Unterseite des Einsatzes 3x vorsichtig mit 200 μl PBS ab. Waschen Sie für die Oberseite des Einsatzes, indem Sie 200 μl PBS auf die Oberseite geben, aspirieren und 3x waschen.
  5. Bereiten Sie alle Sekundärantikörper vor (siehe Materialtabelle für die verwendeten spezifischen Antikörper) gemäß den Empfehlungen des Herstellers oder 1:1000 Verdünnung in 1% BSA in PBS oder anderen. Die Färbung von Sekundärantikörpern muss im Dunkeln erfolgen. Verwenden Sie einen Pappkarton oder eine Schublade eines Schranks, um eine lichtfreie Umgebung zu schaffen.
  6. Bereiten Sie entweder mit einer Methode mit großen Tröpfchen oder einer 12-Well-Platte eine neue sterile Platte vor. Inkubieren Sie 2 Stunden lang bei RT in einer dunklen Umgebung. Waschen wie in 15.4 beschrieben.

16: Vorbereitung für die konfokale Bildgebung

  1. Wenn die Membran noch nicht wie in Schritt 14 beschrieben beschriftet wurde, beschriften Sie sie, um die Position des Zelltyps zu kennen. Platzieren Sie eine kleine Markierung (Punkt, x, Häkchen usw.) mit einem lösungsmittelbeständigen Marker an einer beliebigen Stelle (vorzugsweise Kante).
  2. Nehmen Sie die runden Abdeckschlüpfer vorsichtig aus dem Vorratsbehälter und legen Sie sie vorsichtig auf die Arbeitsfläche.
  3. Verdünnen Sie DAPI in PBS bei einer Verdünnung von 1:100. Für die Abgabe von DAPI mit dem Tröpfchenspender geben Sie 1-3 Tröpfchen in die Mitte des Deckglases. Andernfalls pipettieren Sie 1-3 Tröpfchen DAPI in die Mitte des Deckglases.
  4. Halten Sie den Einsatz mit einer Pinzette fest. Schneiden Sie die Membran vorsichtig mit einer Skalpellklinge in kreisenden Bewegungen rund um den Rand/die Unterkante aus. Lassen Sie die Membran nicht auf die Bank fallen. Legen Sie den Kunststoffeinsatz auf die Bank und halten Sie die Membran mit einer Pinzette fest, während Sie die letzten Fasern mit der Skalpellklinge abschneiden.
  5. Platzieren Sie den Einsatz nach unten auf dem DAPI. Geben Sie 1-3 Tröpfchen DAPI (1:100 Verdünnung) auf die Oberseite der Membran, so dass beide Seiten der Membran DAPI haben.
  6. Heben Sie den Deckschirm der zweiten Runde mit den Fingern an (tragen Sie PSA). Verwenden Sie keine Pinzette, da der Deckglas sehr zerbrechlich ist.
  7. Richten Sie den zweiten Abdeckschub über dem ersten Abdeckrahmen aus und senken Sie ihn vorsichtig auf die Membran ab.
  8. Beschriften Sie die Deckglasseite bei Bedarf vorsichtig mit einem lösungsmittelbeständigen Marker, um den Zelltyp/die Ausrichtung zu codieren (optional). Wenn die Membran beschriftet wurde, überspringen Sie diesen Schritt.
  9. Abhängig von der Anzahl der zu bebildernden Deckgläser und der Anzahl der verfügbaren Metallringe montieren Sie die Deckgläser entweder zwischen den kommerziell hergestellten Metallringen, um die runden Deckgläser für die Bildgebung zusammenzuhalten, oder lagern Sie sie bis zur Bildgebung im Dunkeln.
  10. Zum Abbilden montieren Sie das Deckglas mit der Membran zwischen den Metallringen der Zellkammer und legen Sie es in die konfokale Mikroskophalterung. Wenden Sie sich vorher an den konfokalen Mikroskopiekern, um zu sehen, welcher Halter möglicherweise benötigt wird, um die runden Abdeckfolien abzubilden.
  11. Wenn Sie bereit sind, ein Bild zu machen, wickeln Sie jedes Sandwich in eine Alufolie ein und bringen Sie es zur Anlage.
  12. Mit der Z-Stack-Funktion scannen Sie jede Seite der Membran einzeln mit der richtigen Wellenlänge, abhängig von den verwendeten Fluorophoren. Drehen Sie die zweite Seite um und stellen Sie ein Bild dar. Um die Deckgläser aufzubewahren, bewahren Sie sie im Dunkeln bei 4 °C auf.

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Ergebnisse

Um die biologische Relevanz von Flipwell-Cokulturen von Darmbakterien, Dickdarmepithelien und Makrophagen zu bestimmen, behandelten wir die Co-Kulturen mit Sepiapterin (SEP), einem Modulator des Argininstoffwechsels, um die Produktion von Stickstoffmonoxid 9,10,11 im Vergleich zum Kontroll-DMSO zu fördern. Wir bestimmten die Auswirkungen der SEP-Behandlung auf jede Komponente von Co-Kulturen mit...

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Diskussion

Um die Architektur der Darmschleimhaut in vitro nachzubilden, haben wir ein einfaches Co-Kultursystem entwickelt, das aus geschichteten Schichten von Darmbakterien, schleimproduzierenden Dickdarmepithelzellen und Makrophagen besteht. Dieses Multi-Co-Kultursystem hat es uns ermöglicht, die Auswirkungen des Crosstalks zwischen dem bakteriellen Sekretom, den Darmepithelien und den Makrophagen auf die Induktion immunogener Reprogrammierung und Schleimhautabwehrmechanismen zu untersu...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht. Die Autoren lehnen hiermit alle ausdrücklichen oder stillschweigenden Garantien ab, soweit dies gesetzlich zulässig ist. Unter keinen Umständen können die Autoren haftbar gemacht werden, sei es aufgrund eines Gesetzes, eines Vertrags, einer unerlaubten Handlung oder einer anderen Rechtstheorie, für besondere, zufällige, indirekte, strafbare, mehrfache oder Folgeschäden, die sich aus oder im Zusammenhang mit der Verwendung von Werkzeugen beim Bau der Flipwells, der Verwendung von BSL-Reagenzien, Zelllinien, Bakterienkulturen, der Verwendung des Flipwell-Systems unter anaerober Umgebung in einer anaeroben Kammer ergeben. Diese Haftungsbeschränkung umfasst, ist aber nicht beschränkt auf jede nicht näher spezifizierte Art der Flipwell-Nutzung, die hier nicht ausdrücklich beschrieben wird.

Danksagungen

Der Hauptautor bedankt sich aufrichtig bei Dr. Saori Furuta für ihre hervorragenden Mentoring-Fähigkeiten, ihre kontinuierliche Anleitung und Unterstützung über große Entfernungen hinweg und ihr geschicktes und kontinuierliches Projektdesign, das fantastische Lernmöglichkeiten fördert. Die Autoren danken auch Dr. Vandana Sharma für ihre mikrobiologische Expertise und Anleitung und Dr. Veani R. Fernando für die Herstellung von THP-1-Makrophagen.  Darüber hinaus danken die Autoren Dr. Andrew Kleinhenz und Dr. William T. Gunning von der Electron Microscopy Facility sowie Cassandra Zamora und Kristin Kirschbaum vom Instrumentation Center an der University of Toledo für konstruktive Vorschläge für die EM-Bildgebung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Startup-Fonds der University of Toledo Health Science Campus, College of Medicine and Life Sciences, Department of Cancer Biology to S.F; Ohio Cancer Research Grant (Projekt #: 5017) an S.F; Auszeichnung der Medical Research Society (Toledo Foundation, #206298) an S.F; Forschungsstipendienstipendium der American Cancer Society (RSG-18-238-01-CSM) an S.F; und National Cancer Institute Research Grant (R01CA248304) an SF.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,4 % PFA (siehe Rezept in Reagents and Solutions)im Text beschrieben
10-ml-serologische PipetteCorning4488
12 Brunnen TC-Platte,   CostarCorning3513
15-ml konische Röhren, SpectraTubeAlkali ScientificC2715
200 & Mikro; l tips USA Scientific1111-1700
24-Bohrloch-Einsätze – Kultur-Einsätze für 24-Bohrlochplatten, PET 0,4 & Mikro; m BrandTech Scientific782710
3D-Flipwells vorgefertigt, UV-sterilisiert Im Labor herstellen
4 % PFA (siehe Rezept in Reagents and Solutions)im Text beschrieben
50 mM Sepiapterin-Brühe (SEP, siehe Rezept in Reagenzien und Lösung)Karriere bei Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
50-ml-konische RöhrenGreiner Bio-One227261
5-ml serologische PipetteCorning4487
70–95 % Ethanol (Ethylalkohol)Decon Labs04-355-151
AlufolieFisher Scientific01-213-100
Tier-Fütterungsnadeln, 20 Kaliber 1,5" Länge, Einmalnutzung&NBSP;Fisher Scientific01-208-87
Antikörper-Verdünnungspuffer (siehe Rezept in Reagents and Solutions)im Text beschrieben
Attofluorzellkammer ThermoFisher ScientificA7816
AutoklavenbandFisher Scientific15-901-111
Bacillus subtilis wt (3A1T) Stämme im Glycerol-Bestand ()Bacillus Genetic Stock Center (https:// bgsc. org/
BioGrip Pink Nitrile pulverfreie latexfreie HandschuheHochwertige FertigungP2810
Blockpuffer (siehe Rezept in Reagenzien und Lösungen – 10 % normales Ziegenserum in PBS)im Text beschrieben
Blockpuffer (siehe Rezept in Reagents and Solutions)im Text beschrieben
Hellfeldmikroskop (Nikon oder äquivalent) Eclipse Ts2NikonTS2
Caco-2-ZellenATCCHTB-37
Zellkultur-Inkubator, 37°F; c, 5 % CO2 (Eppendorf CellXpert)Eppendorf6734010015
Zentrifuge (Eppendorf, Zentrifuge 5804/5804 R oder äquivalentEppendorf22622501
Zentrifugenröhren 50 ml SpectraTubeAlkali ScientificC2750
Kultureinsätze für 12-Well-Platten, PET, 0,4 & Mikro; m, sterilBrandTech Scientific, BRAND Insert 2in1, BIO-CERT782730
DAPI VectaShield MontagemediumVektorlaboreH-1000
Tiefe Petrischalenböden, 100 x 25 mm tiefe Polystyrol-Stapelbare Petrischale, steril;USA Scientific8609-0625
Drummond Pipet Aid XPDrummond 4-000-101
Eppendorf 5804 Zentrifuge mit Schwenkschaufelrotor für 50 ml konische RöhrenEppendorf22622501
Pinzette, Edelstahl, steril autoklaviert, 2x SetsVWR82027-438
Pinzette, Edelstahl, sterile Autoklaven, 2x-Sets, ProbenzangeVWR82027-438
Glasflasche 500 mlCorning 4980-500
Hämatozomometer (Neubauer mit Deckungsschlägern)Thermo Fisher Scientific50-312-90
HT-29-MTX-E12-ZellenMillipore Sigma12040401
ImmunoPen (optional)Fisher Scientific4021761EA
Kevlar-basierte oder andere schneidresistente Handschuhe (optional)Baumarkt oder Amazon
Laborband oder VersandbandFisher Scientific 159015R
Laminarstromhaube 1300 Serie A2 BSC Klasse IIThermoFisher Scientific1375
Laminarströmungshaube mit UV-Licht SterilGARDDie Baker-GesellschaftSG403A-HE
Marker LösungsmittelbeweisVWR52877-310 oder 95042-566
Medien für Caco-2-Zellen (DMEM High Glucose-basiert, siehe Rezept in Reagents and Solutions)beschrieben in  Text
Medien für HT-29-Zellen (DMEM High Glucose, siehe Rezept in Reagents and Solutions)im Text beschrieben
Medien für THP-1-Zellen (RPMI, siehe Rezept in Reagents and Solutions)im Text beschrieben
Mikrozentrifugenrohr, 1,7 ml, steril & nbsp;Alkali ScientificC3017-ST
MikrozentrifugenröhrenThermo Fisher3451
Miller LB Media (siehe Rezept in Reagents and Solutions)Sigma-Aldrich  L3522
Nadelzange, 2x SätzeBaumarkt oder Amazon
Nitrilpulverfreie latexfreie Handschuhe Aurelia AmazingMidSci92885
Petrischalendeckel, sterile Falcon Petri Dish steril 100x15 mm StyleCorning Inc351029
Phorbol-Myristatacetat (PMA) (100 ng/μ l, siehe Rezept in Reagents and Solutions) InvivoGenTlrl-pma
Pipetspitzen (10 & Micro; L, 200 & Mikro; l, 1000 & Mikro; l) PurePoint oder äquivalentAlkali Scientific ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS
FrischhaltefolieLebensmittelgeschäft
Purecol-Arbeitskollagenase-Lösung (100 & mikro; g/mL)Advanced BioMatrix5005-100ML
Runde Überdeckungsschlitze #1 1 oz (Corning Float Glass oder Fisherbrand)Corning oder Fisherbrand50143822 oder 12-546-2 25CIR-2
Skalpellklingen, steril, Einweg- Mopec oder Feder #10AJ136 oder 2975#10
Sepiapterin (SEP, 100 & Mikro; M, siehe Rezept in Reagents and Solution)Karriere bei Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
Schüttelinkubator eingestellt auf 220 U/min 37 Grad; CEppendorf, New Brunswick ScientificM12990080
Silikon-Klebstoff Loctite Clear Silikon IDH oder 3M Marine Grade Silikondichtmittel Klar mit NasenspitzeLoctite oder 3M1745658 oder PN08019
Einkanal-Pipet Eppendorf Research Plus, 200 & micro; lEppendorf
Einkanal-Pipetten (10 & Mikro; L, 200 & Mikro; l, 1000 & Mikro; l)Eppendorf2231001122
Spektrophotometer NanoDropOneCThermo Fisher Scientific13-400-519
Steriles, deionisiertes Wasser   
Steriles phosphatgepuffertes Serin (PBS) ohne Kalzium oder MagnesiumFisher Scientific  BSS-PBS-1X6
Spritze 3 ml oder 5 ml mit Luer-Lok-SpitzeBD309585 oder 309603
THP-1-ZellenATCCTIB-202
Transfer-Pipets, sterilFisherbrand13-711-20
Triton X-100Millipore SigmaX100
Trypan-blaue LösungVWR97063-702
Trypsin-EDTA 0,25 %Thermo Fisher Scientific25200-056
Wipes Kimwipes Professional mit LintGuard Anti-Stat PolyshieldKimberly-Clark34120
Primäre Antikörper: 
Anti-menschliche CD163Abcam156769
Anti-menschliches CD68Novus BiologicalsNB100-683-0,1 mg
Anti-menschlicher CD80, E3Q9VZell-Signalisierungstechnologien15416
Anti-menschlich CK20 LebenstechnologienPA5-82875
Anti-menschliches MUC2 (996/1)ThermoFisherMA5-12345
Sekundärantikörper:
Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (für CD80 und CK20)ThermoFisherA11008
Alexa Fluor 594 Ziegen-Anti-Maus-IgG (für MUC2 und CD68 oder CD163)ThermoFisherA11005
Reagenzien und Lösungen:   
Caco-2 Mittel:
DMEM mit hohem Blutzucker (4,5 g/L) und 1 % (v:v) GlutaMax Thermo Fisher Scientific35050061
FBS 10 % (v:v) hitzeinaktiviertSigmaF2242-500ML
Nicht-essentielle Aminosäuren 1 % für Caco-2-MedienThermo Fisher Scientific11140076
Pen Strep 1% (v:v)SigmaF2242-500ML
HT-29-MTX Medium
DMEM mit hohem Blutzucker (4,5 g/L) und 1 % (v:v) GlutaMax Thermo Fisher Scientific35050061
FBS 10 % (v:v) hitzeinaktiviertSigmaF2242-500ML
HEPES (10 mM Endkonzentration)Thermo Fisher Scientific15630080
Pen Strep 1% (v:v)SigmaF2242-500ML
THP-1 Mittel:
FBS (10% v:v) hitzeinaktiviertes fetales RinderserumSigma F2242-500ML
Glukose (4,5 g/L Endkonzentration)Thermo Fisher ScientificA249001
GlutaMax 1% (v:v)  2 mM EndkonzentrationThermo Fisher Scientific35050061
HEPES (10 mM Endkonzentration)Thermo Fisher Scientific15630080
Pen Strep 1% (v:v)SigmaF2242-500ML
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 MediumThermo Fisher Scientific11875119
Natriumpyruvat (1 mM Endkonzentration)Thermo Fisher Scientific11360070
Purecol arbeitende Kollagenase-Lösung (Verdünnung auf 1:30 100 & Mikro; g/ml):
Purecol 3 mg/ml 1:30 bis 100 & Mikro; g/ml Advanced BioMatrix5005-100ML
steriles, deionisiertes Wasser
L-Sepiapterin-Serienlösung (50 mM):
L-Sepiapterin (SEP)Karriere bei Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
Phorbol-Myristatacetat-Fondlösung (PMA, 5 mg/mL)InvivoGenTlrl-pma
BSA 1% Rinderserumalbumin Sigma-Aldrich5470
DMSO Sigma D2650
Miller LBSigma-Aldrich  L3522
Normales Serum derselben Spezies wie der sekundäre AntikörperSigma NS02L-1ML
ParaformaldehydSigma-Aldrich441244

Referenzen

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