Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll mit den wichtigsten Schritten, um die Entwicklung und Nutzung von 3D-Flipwell zu unterstützen. Wir beschreiben und zeigen, wie die Co-Kultur-Einsatzstapel zusammengebaut und für die Co-Kultivierung geschichteter Schichten von Darmbakterien, Darmepithelien und Makrophagen verwendet werden, um die Darmschleimhautumgebung zu modellieren.
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Methodenartikel
3D-Flipwell-Engineering für die Entwicklung asynchroner Systeme für toxikologische und immunmodulatorische Therapien in Bakterien-, Darm- und Immunzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Um die Rolle des bakteriellen Sekretoms bei der Polarisation von Immunzellen und der Homöostase der Darmschleimhaut zu untersuchen, haben wir ein 3-dimensionales Co-Kulturmodell mit kommerziell erhältlichen Inserts in einem Back-to-Back-Stacked-Format entwickelt. Wir nannten dieses System 3D-Flipwells und kultivierten erfolgreich Bakterien, Dickdarmepithel- und Immunzellen in geschichteten Schichten, um die Mikroumgebung der Darmschleimhaut zu rekapitulieren. Dieses Co-Kultursystem ermöglicht die Aussaat von Dickdarmepithelzellen auf der einen Seite der Membran und von undifferenzierten, nicht adhärenten Monozyten auf der anderen Seite und ermöglicht so das synchrone Fortschreiten der Polarisation des Dickdarmepithels, der Schleimbildung sowie der Differenzierung und Polarisation von Monozyten und Makrophagen innerhalb einer einzigen Co-Kultur, ohne dass vordifferenzierte Makrophagen abgelöst und neu beschichtet werden müssen. Dieses System ist einfach zu konstruieren und erfordert nur wenige leicht verfügbare Materialien und Werkzeuge. Wir testeten seinen Nutzen, indem wir die Reaktionen von Co-Kulturkomponenten auf Sepiapterin (SEP) analysierten, den endogenen Vorläufer von BH4 (Tetrahydrobiopterin) -- einem Cofaktor der Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS). Wir zeigten, dass die SEP-Behandlung von 3D-Flipwell die Biofilmbildung durch Darmbakterien, die Schleimproduktion durch das Dickdarmepithel und die pro-immunogene Polarisation von Makrophagen induzierte. Dies deutet darauf hin, dass SEP die Aktivierung eines mukosalen Abwehrmechanismus durch Crosstalk zwischen verschiedenen zellulären Komponenten auslöst. Weitere Experimente sind erforderlich, um die Rolle der mukosalen Kommunikation zu untersuchen, die zur Reprogrammierung von Immunzellen führt, und um den Nutzen dieses Co-Kultursystems für das Screening nach neuen immunmodulatorischen Therapien zu bewerten.
Einleitung
Die Wechselwirkung zwischen Immunzellen und Darmmikrobiom beeinflusst die Wirksamkeit verschiedener Krankheitsbehandlungen stark. Ein solches Crosstalk wird durch äußere Reize deutlich modifiziert, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Stoffwechselanomalien des Wirts, Ernährungsumstellungen, Krankheitsmanifestation und pharmakologische Behandlung. Diese Veränderungen können zu einem Ungleichgewicht in der Zusammensetzung der Mikroflora führen, ein Zustand, der als Dysbiose bezeichnet wird 1,2,3.
Um die Wechselw....
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Protokoll
1. 3D Flipwell-Technik
- Alle Arbeiten sollten in einem Zellkulturschrank durchgeführt werden. Legen Sie alle Vorräte in den Schrank.
- Den Deckel der Petrischale öffnen und beiseite stellen. Öffnen Sie die Skalpellklinge aus dem Schutzgehäuse und legen Sie sie auf den Rand des Petrischalebodens. Stellen Sie die Sterilität sicher.
ACHTUNG: Ein vorsichtiger Umgang mit der Skalpellklinge ist erforderlich. Verwenden Sie bei Bedarf schnittfeste, faserverstärkte Handschuhe, um die Hände zu schützen. - Öffnen Sie die sterile Schutzverpackung des kommerziellen 12-Well-Einsatzes. Stellen Sie die S....
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Ergebnisse
Um die biologische Relevanz von Flipwell-Cokulturen von Darmbakterien, Dickdarmepithelien und Makrophagen zu bestimmen, behandelten wir die Co-Kulturen mit Sepiapterin (SEP), einem Modulator des Argininstoffwechsels, um die Produktion von Stickstoffmonoxid 9,10,11 im Vergleich zum Kontroll-DMSO zu fördern. Wir bestimmten die Auswirkungen der SEP-Behandlung auf jede Komponente von Co-Kulturen mit.......
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Diskussion
Um die Architektur der Darmschleimhaut in vitro nachzubilden, haben wir ein einfaches Co-Kultursystem entwickelt, das aus geschichteten Schichten von Darmbakterien, schleimproduzierenden Dickdarmepithelzellen und Makrophagen besteht. Dieses Multi-Co-Kultursystem hat es uns ermöglicht, die Auswirkungen des Crosstalks zwischen dem bakteriellen Sekretom, den Darmepithelien und den Makrophagen auf die Induktion immunogener Reprogrammierung und Schleimhautabwehrmechanismen zu untersu.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht. Die Autoren lehnen hiermit alle ausdrücklichen oder stillschweigenden Garantien ab, soweit dies gesetzlich zulässig ist. Unter keinen Umständen können die Autoren haftbar gemacht werden, sei es aufgrund eines Gesetzes, eines Vertrags, einer unerlaubten Handlung oder einer anderen Rechtstheorie, für besondere, zufällige, indirekte, strafbare, mehrfache oder Folgeschäden, die sich aus oder im Zusammenhang mit der Verwendung von Werkzeugen beim Bau der Flipwells, der Verwendung von BSL-Reagenzien, Zelllinien, Bakterienkulturen, der Verwendung des Flipwell-Systems unter anaerober Umgebung in einer anaeroben Kammer ergeben. Diese Haftungsbeschränkung umfasst, ist aber nicht beschränkt auf jede nicht näher spezifizierte Art der Flipwell-Nutzung, die hier nicht ausdrücklich beschrieben wird.
Danksagungen
Der Hauptautor bedankt sich aufrichtig bei Dr. Saori Furuta für ihre hervorragenden Mentoring-Fähigkeiten, ihre kontinuierliche Anleitung und Unterstützung über große Entfernungen hinweg und ihr geschicktes und kontinuierliches Projektdesign, das fantastische Lernmöglichkeiten fördert. Die Autoren danken auch Dr. Vandana Sharma für ihre mikrobiologische Expertise und Anleitung und Dr. Veani R. Fernando für die Herstellung von THP-1-Makrophagen. Darüber hinaus danken die Autoren Dr. Andrew Kleinhenz und Dr. William T. Gunning von der Electron Microscopy Facility sowie Cassandra Zamora und Kristin Kirschbaum vom Instrumentation Center ....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,4 % PFA (siehe Rezept in Reagents and Solutions) | im Text beschrieben | ||
| 10-ml-serologische Pipette | Corning | 4488 | |
| 12 Brunnen TC-Platte, Costar | Corning | 3513 | |
| 15-ml konische Röhren, SpectraTube | Alkali Scientific | C2715 | |
| 200 & Mikro; l tips | USA Scientific | 1111-1700 | |
| 24-Bohrloch-Einsätze – Kultur-Einsätze für 24-Bohrlochplatten, PET 0,4 & Mikro; m | BrandTech Scientific | 782710 | |
| 3D-Flipwells vorgefertigt, UV-sterilisiert | Im Labor herstellen | ||
| 4 % PFA (siehe Rezept in Reagents and Solutions) | im Text beschrieben | ||
| 50 mM Sepiapterin-Brühe (SEP, siehe Rezept in Reagenzien und Lösung) | Karriere bei Henan Chemical Co | CAS#: 17094-01-8 | |
| 50-ml-konische Röhren | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 5-ml serologische Pipette | Corning | 4487 | |
| 70–95 % Ethanol (Ethylalkohol) | Decon Labs | 04-355-151 | |
| Alufolie | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Tier-Fütterungsnadeln, 20 Kaliber 1,5" Länge, Einmalnutzung  | Fisher Scientific | 01-208-87 | |
| Antikörper-Verdünnungspuffer (siehe Rezept in Reagents and Solutions) | im Text beschrieben | ||
| Attofluorzellkammer | ThermoFisher Scientific | A7816 | |
| Autoklavenband | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Bacillus subtilis wt (3A1T) Stämme im Glycerol-Bestand () | Bacillus Genetic Stock Center (https:// bgsc. org/ | ||
| BioGrip Pink Nitrile pulverfreie latexfreie Handschuhe | Hochwertige Fertigung | P2810 | |
| Blockpuffer (siehe Rezept in Reagenzien und Lösungen – 10 % normales Ziegenserum in PBS) | im Text beschrieben | ||
| Blockpuffer (siehe Rezept in Reagents and Solutions) | im Text beschrieben | ||
| Hellfeldmikroskop (Nikon oder äquivalent) Eclipse Ts2 | Nikon | TS2 | |
| Caco-2-Zellen | ATCC | HTB-37 | |
| Zellkultur-Inkubator, 37°F; c, 5 % CO2 (Eppendorf CellXpert) | Eppendorf | 6734010015 | |
| Zentrifuge (Eppendorf, Zentrifuge 5804/5804 R oder äquivalent | Eppendorf | 22622501 | |
| Zentrifugenröhren 50 ml SpectraTube | Alkali Scientific | C2750 | |
| Kultureinsätze für 12-Well-Platten, PET, 0,4 & Mikro; m, steril | BrandTech Scientific, BRAND Insert 2in1, BIO-CERT | 782730 | |
| DAPI VectaShield Montagemedium | Vektorlabore | H-1000 | |
| Tiefe Petrischalenböden, 100 x 25 mm tiefe Polystyrol-Stapelbare Petrischale, steril; | USA Scientific | 8609-0625 | |
| Drummond Pipet Aid XP | Drummond | 4-000-101 | |
| Eppendorf 5804 Zentrifuge mit Schwenkschaufelrotor für 50 ml konische Röhren | Eppendorf | 22622501 | |
| Pinzette, Edelstahl, steril autoklaviert, 2x Sets | VWR | 82027-438 | |
| Pinzette, Edelstahl, sterile Autoklaven, 2x-Sets, Probenzange | VWR | 82027-438 | |
| Glasflasche 500 ml | Corning | 4980-500 | |
| Hämatozomometer (Neubauer mit Deckungsschlägern) | Thermo Fisher Scientific | 50-312-90 | |
| HT-29-MTX-E12-Zellen | Millipore Sigma | 12040401 | |
| ImmunoPen (optional) | Fisher Scientific | 4021761EA | |
| Kevlar-basierte oder andere schneidresistente Handschuhe (optional) | Baumarkt oder Amazon | ||
| Laborband oder Versandband | Fisher Scientific | 159015R | |
| Laminarstromhaube 1300 Serie A2 BSC Klasse II | ThermoFisher Scientific | 1375 | |
| Laminarströmungshaube mit UV-Licht SterilGARD | Die Baker-Gesellschaft | SG403A-HE | |
| Marker Lösungsmittelbeweis | VWR | 52877-310 oder 95042-566 | |
| Medien für Caco-2-Zellen (DMEM High Glucose-basiert, siehe Rezept in Reagents and Solutions) | beschrieben in Text | ||
| Medien für HT-29-Zellen (DMEM High Glucose, siehe Rezept in Reagents and Solutions) | im Text beschrieben | ||
| Medien für THP-1-Zellen (RPMI, siehe Rezept in Reagents and Solutions) | im Text beschrieben | ||
| Mikrozentrifugenrohr, 1,7 ml, steril & nbsp; | Alkali Scientific | C3017-ST | |
| Mikrozentrifugenröhren | Thermo Fisher | 3451 | |
| Miller LB Media (siehe Rezept in Reagents and Solutions) | Sigma-Aldrich | L3522 | |
| Nadelzange, 2x Sätze | Baumarkt oder Amazon | ||
| Nitrilpulverfreie latexfreie Handschuhe Aurelia Amazing | MidSci | 92885 | |
| Petrischalendeckel, sterile Falcon Petri Dish steril 100x15 mm Style | Corning Inc | 351029 | |
| Phorbol-Myristatacetat (PMA) (100 ng/μ l, siehe Rezept in Reagents and Solutions) | InvivoGen | Tlrl-pma | |
| Pipetspitzen (10 & Micro; L, 200 & Mikro; l, 1000 & Mikro; l) PurePoint oder äquivalent | Alkali Scientific | ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS | |
| Frischhaltefolie | Lebensmittelgeschäft | ||
| Purecol-Arbeitskollagenase-Lösung (100 & mikro; g/mL) | Advanced BioMatrix | 5005-100ML | |
| Runde Überdeckungsschlitze #1 1 oz (Corning Float Glass oder Fisherbrand) | Corning oder Fisherbrand | 50143822 oder 12-546-2 25CIR-2 | |
| Skalpellklingen, steril, Einweg- | Mopec oder Feder #10 | AJ136 oder 2975#10 | |
| Sepiapterin (SEP, 100 & Mikro; M, siehe Rezept in Reagents and Solution) | Karriere bei Henan Chemical Co | CAS#: 17094-01-8 | |
| Schüttelinkubator eingestellt auf 220 U/min 37 Grad; C | Eppendorf, New Brunswick Scientific | M12990080 | |
| Silikon-Klebstoff Loctite Clear Silikon IDH oder 3M Marine Grade Silikondichtmittel Klar mit Nasenspitze | Loctite oder 3M | 1745658 oder PN08019 | |
| Einkanal-Pipet Eppendorf Research Plus, 200 & micro; l | Eppendorf | ||
| Einkanal-Pipetten (10 & Mikro; L, 200 & Mikro; l, 1000 & Mikro; l) | Eppendorf | 2231001122 | |
| Spektrophotometer NanoDropOneC | Thermo Fisher Scientific | 13-400-519 | |
| Steriles, deionisiertes Wasser | |||
| Steriles phosphatgepuffertes Serin (PBS) ohne Kalzium oder Magnesium | Fisher Scientific | BSS-PBS-1X6 | |
| Spritze 3 ml oder 5 ml mit Luer-Lok-Spitze | BD | 309585 oder 309603 | |
| THP-1-Zellen | ATCC | TIB-202 | |
| Transfer-Pipets, steril | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | X100 | |
| Trypan-blaue Lösung | VWR | 97063-702 | |
| Trypsin-EDTA 0,25 % | Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | |
| Wipes Kimwipes Professional mit LintGuard Anti-Stat Polyshield | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Primäre Antikörper: | |||
| Anti-menschliche CD163 | Abcam | 156769 | |
| Anti-menschliches CD68 | Novus Biologicals | NB100-683-0,1 mg | |
| Anti-menschlicher CD80, E3Q9V | Zell-Signalisierungstechnologien | 15416 | |
| Anti-menschlich CK20 | Lebenstechnologien | PA5-82875 | |
| Anti-menschliches MUC2 (996/1) | ThermoFisher | MA5-12345 | |
| Sekundärantikörper: | |||
| Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (für CD80 und CK20) | ThermoFisher | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Ziegen-Anti-Maus-IgG (für MUC2 und CD68 oder CD163) | ThermoFisher | A11005 | |
| Reagenzien und Lösungen: | |||
| Caco-2 Mittel: | |||
| DMEM mit hohem Blutzucker (4,5 g/L) und 1 % (v:v) GlutaMax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| FBS 10 % (v:v) hitzeinaktiviert | Sigma | F2242-500ML | |
| Nicht-essentielle Aminosäuren 1 % für Caco-2-Medien | Thermo Fisher Scientific | 11140076 | |
| Pen Strep 1% (v:v) | Sigma | F2242-500ML | |
| HT-29-MTX Medium | |||
| DMEM mit hohem Blutzucker (4,5 g/L) und 1 % (v:v) GlutaMax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| FBS 10 % (v:v) hitzeinaktiviert | Sigma | F2242-500ML | |
| HEPES (10 mM Endkonzentration) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| Pen Strep 1% (v:v) | Sigma | F2242-500ML | |
| THP-1 Mittel: | |||
| FBS (10% v:v) hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum | Sigma | F2242-500ML | |
| Glukose (4,5 g/L Endkonzentration) | Thermo Fisher Scientific | A249001 | |
| GlutaMax 1% (v:v) 2 mM Endkonzentration | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES (10 mM Endkonzentration) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| Pen Strep 1% (v:v) | Sigma | F2242-500ML | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Natriumpyruvat (1 mM Endkonzentration) | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Purecol arbeitende Kollagenase-Lösung (Verdünnung auf 1:30 100 & Mikro; g/ml): | |||
| Purecol 3 mg/ml 1:30 bis 100 & Mikro; g/ml | Advanced BioMatrix | 5005-100ML | |
| steriles, deionisiertes Wasser | |||
| L-Sepiapterin-Serienlösung (50 mM): | |||
| L-Sepiapterin (SEP) | Karriere bei Henan Chemical Co | CAS#: 17094-01-8 | |
| Phorbol-Myristatacetat-Fondlösung (PMA, 5 mg/mL) | InvivoGen | Tlrl-pma | |
| BSA 1% Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Miller LB | Sigma-Aldrich | L3522 | |
| Normales Serum derselben Spezies wie der sekundäre Antikörper | Sigma | NS02L-1ML | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | 441244 |
Referenzen
- Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
- Xuan, C., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
