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3D-Flipwell-Engineering für die Entwicklung asynchroner Systeme für toxikologische und immunmodulatorische Therapien in Bakterien-, Darm- und Immunzellen

DOI:

10.3791/68701

⸱

October 17th, 2025

 , 
1Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 2MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll mit den wichtigsten Schritten, um die Entwicklung und Nutzung von 3D-Flipwell zu unterstützen. Wir beschreiben und zeigen, wie die Co-Kultur-Einsatzstapel zusammengebaut und für die Co-Kultivierung geschichteter Schichten von Darmbakterien, Darmepithelien und Makrophagen verwendet werden, um die Darmschleimhautumgebung zu modellieren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um die Rolle des bakteriellen Sekretoms bei der Polarisation von Immunzellen und der Homöostase der Darmschleimhaut zu untersuchen, haben wir ein 3-dimensionales Co-Kulturmodell mit kommerziell erhältlichen Inserts in einem Back-to-Back-Stacked-Format entwickelt. Wir nannten dieses System 3D-Flipwells und kultivierten erfolgreich Bakterien, Dickdarmepithel- und Immunzellen in geschichteten Schichten, um die Mikroumgebung der Darmschleimhaut zu rekapitulieren. Dieses Co-Kultursystem ermöglicht die Aussaat von Dickdarmepithelzellen auf der einen Seite der Membran und von undifferenzierten, nicht adhärenten Monozyten auf der anderen Seite und ermöglicht so das synchrone Fortschreiten der Polarisation des Dickdarmepithels, der Schleimbildung sowie der Differenzierung und Polarisation von Monozyten und Makrophagen innerhalb einer einzigen Co-Kultur, ohne dass vordifferenzierte Makrophagen abgelöst und neu beschichtet werden müssen. Dieses System ist einfach zu konstruieren und erfordert nur wenige leicht verfügbare Materialien und Werkzeuge. Wir testeten seinen Nutzen, indem wir die Reaktionen von Co-Kulturkomponenten auf Sepiapterin (SEP) analysierten, den endogenen Vorläufer von BH4 (Tetrahydrobiopterin) -- einem Cofaktor der Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS). Wir zeigten, dass die SEP-Behandlung von 3D-Flipwell die Biofilmbildung durch Darmbakterien, die Schleimproduktion durch das Dickdarmepithel und die pro-immunogene Polarisation von Makrophagen induzierte. Dies deutet darauf hin, dass SEP die Aktivierung eines mukosalen Abwehrmechanismus durch Crosstalk zwischen verschiedenen zellulären Komponenten auslöst. Weitere Experimente sind erforderlich, um die Rolle der mukosalen Kommunikation zu untersuchen, die zur Reprogrammierung von Immunzellen führt, und um den Nutzen dieses Co-Kultursystems für das Screening nach neuen immunmodulatorischen Therapien zu bewerten.

Introduction

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Die Wechselwirkung zwischen Immunzellen und Darmmikrobiom beeinflusst die Wirksamkeit verschiedener Krankheitsbehandlungen stark. Ein solches Crosstalk wird durch äußere Reize deutlich modifiziert, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Stoffwechselanomalien des Wirts, Ernährungsumstellungen, Krankheitsmanifestation und pharmakologische Behandlung. Diese Veränderungen können zu einem Ungleichgewicht in der Zusammensetzung der Mikroflora führen, ein Zustand, der als Dysbiose bezeichnet wird 1,2,3.

Um die Wechselw....

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Protocol

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1. 3D Flipwell-Technik

  1. Alle Arbeiten sollten in einem Zellkulturschrank durchgeführt werden. Legen Sie alle Vorräte in den Schrank.
  2. Den Deckel der Petrischale öffnen und beiseite stellen. Öffnen Sie die Skalpellklinge aus dem Schutzgehäuse und legen Sie sie auf den Rand des Petrischalebodens. Stellen Sie die Sterilität sicher.
    ACHTUNG: Ein vorsichtiger Umgang mit der Skalpellklinge ist erforderlich. Verwenden Sie bei Bedarf schnittfeste, faserverstärkte Handschuhe, um die Hände zu schützen.
  3. Öffnen Sie die sterile Schutzverpackung des kommerziellen 12-Well-Einsatzes. Stellen Sie die S....

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Results

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Um die biologische Relevanz von Flipwell-Cokulturen von Darmbakterien, Dickdarmepithelien und Makrophagen zu bestimmen, behandelten wir die Co-Kulturen mit Sepiapterin (SEP), einem Modulator des Argininstoffwechsels, um die Produktion von Stickstoffmonoxid 9,10,11 im Vergleich zum Kontroll-DMSO zu fördern. Wir bestimmten die Auswirkungen der SEP-Behandlung auf jede Komponente von Co-Kulturen mit.......

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Discussion

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Um die Architektur der Darmschleimhaut in vitro nachzubilden, haben wir ein einfaches Co-Kultursystem entwickelt, das aus geschichteten Schichten von Darmbakterien, schleimproduzierenden Dickdarmepithelzellen und Makrophagen besteht. Dieses Multi-Co-Kultursystem hat es uns ermöglicht, die Auswirkungen des Crosstalks zwischen dem bakteriellen Sekretom, den Darmepithelien und den Makrophagen auf die Induktion immunogener Reprogrammierung und Schleimhautabwehrmechanismen zu untersu.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht. Die Autoren lehnen hiermit alle ausdrücklichen oder stillschweigenden Garantien ab, soweit dies gesetzlich zulässig ist. Unter keinen Umständen können die Autoren haftbar gemacht werden, sei es aufgrund eines Gesetzes, eines Vertrags, einer unerlaubten Handlung oder einer anderen Rechtstheorie, für besondere, zufällige, indirekte, strafbare, mehrfache oder Folgeschäden, die sich aus oder im Zusammenhang mit der Verwendung von Werkzeugen beim Bau der Flipwells, der Verwendung von BSL-Reagenzien, Zelllinien, Bakterienkulturen, der Verwendung des Flipwell-Systems unter anaerober Umgebung in einer anaeroben Kammer ergeben. Diese Haftungsbeschränkung umfasst, ist aber nicht beschränkt auf jede nicht näher spezifizierte Art der Flipwell-Nutzung, die hier nicht ausdrücklich beschrieben wird.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Hauptautor bedankt sich aufrichtig bei Dr. Saori Furuta für ihre hervorragenden Mentoring-Fähigkeiten, ihre kontinuierliche Anleitung und Unterstützung über große Entfernungen hinweg und ihr geschicktes und kontinuierliches Projektdesign, das fantastische Lernmöglichkeiten fördert. Die Autoren danken auch Dr. Vandana Sharma für ihre mikrobiologische Expertise und Anleitung und Dr. Veani R. Fernando für die Herstellung von THP-1-Makrophagen.  Darüber hinaus danken die Autoren Dr. Andrew Kleinhenz und Dr. William T. Gunning von der Electron Microscopy Facility sowie Cassandra Zamora und Kristin Kirschbaum vom Instrumentation Center ....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,4 % PFA (siehe Rezept in Reagents and Solutions)im Text beschrieben
10-ml-serologische PipetteCorning4488
12 Brunnen TC-Platte,   CostarCorning3513
15-ml konische Röhren, SpectraTubeAlkali ScientificC2715
200 & Mikro; l tips USA Scientific1111-1700
24-Bohrloch-Einsätze – Kultur-Einsätze für 24-Bohrlochplatten, PET 0,4 & Mikro; m BrandTech Scientific782710
3D-Flipwells vorgefertigt, UV-sterilisiert Im Labor herstellen
4 % PFA (siehe Rezept in Reagents and Solutions)im Text beschrieben
50 mM Sepiapterin-Brühe (SEP, siehe Rezept in Reagenzien und Lösung)Karriere bei Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
50-ml-konische RöhrenGreiner Bio-One227261
5-ml serologische PipetteCorning4487
70–95 % Ethanol (Ethylalkohol)Decon Labs04-355-151
AlufolieFisher Scientific01-213-100
Tier-Fütterungsnadeln, 20 Kaliber 1,5" Länge, Einmalnutzung Fisher Scientific01-208-87
Antikörper-Verdünnungspuffer (siehe Rezept in Reagents and Solutions)im Text beschrieben
Attofluorzellkammer ThermoFisher ScientificA7816
AutoklavenbandFisher Scientific15-901-111
Bacillus subtilis wt (3A1T) Stämme im Glycerol-Bestand ()Bacillus Genetic Stock Center (https:// bgsc. org/
BioGrip Pink Nitrile pulverfreie latexfreie HandschuheHochwertige FertigungP2810
Blockpuffer (siehe Rezept in Reagenzien und Lösungen – 10 % normales Ziegenserum in PBS)im Text beschrieben
Blockpuffer (siehe Rezept in Reagents and Solutions)im Text beschrieben
Hellfeldmikroskop (Nikon oder äquivalent) Eclipse Ts2NikonTS2
Caco-2-ZellenATCCHTB-37
Zellkultur-Inkubator, 37°F; c, 5 % CO2 (Eppendorf CellXpert)Eppendorf6734010015
Zentrifuge (Eppendorf, Zentrifuge 5804/5804 R oder äquivalentEppendorf22622501
Zentrifugenröhren 50 ml SpectraTubeAlkali ScientificC2750
Kultureinsätze für 12-Well-Platten, PET, 0,4 & Mikro; m, sterilBrandTech Scientific, BRAND Insert 2in1, BIO-CERT782730
DAPI VectaShield MontagemediumVektorlaboreH-1000
Tiefe Petrischalenböden, 100 x 25 mm tiefe Polystyrol-Stapelbare Petrischale, steril;USA Scientific8609-0625
Drummond Pipet Aid XPDrummond 4-000-101
Eppendorf 5804 Zentrifuge mit Schwenkschaufelrotor für 50 ml konische RöhrenEppendorf22622501
Pinzette, Edelstahl, steril autoklaviert, 2x SetsVWR82027-438
Pinzette, Edelstahl, sterile Autoklaven, 2x-Sets, ProbenzangeVWR82027-438
Glasflasche 500 mlCorning 4980-500
Hämatozomometer (Neubauer mit Deckungsschlägern)Thermo Fisher Scientific50-312-90
HT-29-MTX-E12-ZellenMillipore Sigma12040401
ImmunoPen (optional)Fisher Scientific4021761EA
Kevlar-basierte oder andere schneidresistente Handschuhe (optional)Baumarkt oder Amazon
Laborband oder VersandbandFisher Scientific 159015R
Laminarstromhaube 1300 Serie A2 BSC Klasse IIThermoFisher Scientific1375
Laminarströmungshaube mit UV-Licht SterilGARDDie Baker-GesellschaftSG403A-HE
Marker LösungsmittelbeweisVWR52877-310 oder 95042-566
Medien für Caco-2-Zellen (DMEM High Glucose-basiert, siehe Rezept in Reagents and Solutions)beschrieben in  Text
Medien für HT-29-Zellen (DMEM High Glucose, siehe Rezept in Reagents and Solutions)im Text beschrieben
Medien für THP-1-Zellen (RPMI, siehe Rezept in Reagents and Solutions)im Text beschrieben
Mikrozentrifugenrohr, 1,7 ml, steril & nbsp;Alkali ScientificC3017-ST
MikrozentrifugenröhrenThermo Fisher3451
Miller LB Media (siehe Rezept in Reagents and Solutions)Sigma-Aldrich  L3522
Nadelzange, 2x SätzeBaumarkt oder Amazon
Nitrilpulverfreie latexfreie Handschuhe Aurelia AmazingMidSci92885
Petrischalendeckel, sterile Falcon Petri Dish steril 100x15 mm StyleCorning Inc351029
Phorbol-Myristatacetat (PMA) (100 ng/μ l, siehe Rezept in Reagents and Solutions) InvivoGenTlrl-pma
Pipetspitzen (10 & Micro; L, 200 & Mikro; l, 1000 & Mikro; l) PurePoint oder äquivalentAlkali Scientific ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS
FrischhaltefolieLebensmittelgeschäft
Purecol-Arbeitskollagenase-Lösung (100 & mikro; g/mL)Advanced BioMatrix5005-100ML
Runde Überdeckungsschlitze #1 1 oz (Corning Float Glass oder Fisherbrand)Corning oder Fisherbrand50143822 oder 12-546-2 25CIR-2
Skalpellklingen, steril, Einweg- Mopec oder Feder #10AJ136 oder 2975#10
Sepiapterin (SEP, 100 & Mikro; M, siehe Rezept in Reagents and Solution)Karriere bei Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
Schüttelinkubator eingestellt auf 220 U/min 37 Grad; CEppendorf, New Brunswick ScientificM12990080
Silikon-Klebstoff Loctite Clear Silikon IDH oder 3M Marine Grade Silikondichtmittel Klar mit NasenspitzeLoctite oder 3M1745658 oder PN08019
Einkanal-Pipet Eppendorf Research Plus, 200 & micro; lEppendorf
Einkanal-Pipetten (10 & Mikro; L, 200 & Mikro; l, 1000 & Mikro; l)Eppendorf2231001122
Spektrophotometer NanoDropOneCThermo Fisher Scientific13-400-519
Steriles, deionisiertes Wasser   
Steriles phosphatgepuffertes Serin (PBS) ohne Kalzium oder MagnesiumFisher Scientific  BSS-PBS-1X6
Spritze 3 ml oder 5 ml mit Luer-Lok-SpitzeBD309585 oder 309603
THP-1-ZellenATCCTIB-202
Transfer-Pipets, sterilFisherbrand13-711-20
Triton X-100Millipore SigmaX100
Trypan-blaue LösungVWR97063-702
Trypsin-EDTA 0,25 %Thermo Fisher Scientific25200-056
Wipes Kimwipes Professional mit LintGuard Anti-Stat PolyshieldKimberly-Clark34120
Primäre Antikörper: 
Anti-menschliche CD163Abcam156769
Anti-menschliches CD68Novus BiologicalsNB100-683-0,1 mg
Anti-menschlicher CD80, E3Q9VZell-Signalisierungstechnologien15416
Anti-menschlich CK20 LebenstechnologienPA5-82875
Anti-menschliches MUC2 (996/1)ThermoFisherMA5-12345
Sekundärantikörper:
Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (für CD80 und CK20)ThermoFisherA11008
Alexa Fluor 594 Ziegen-Anti-Maus-IgG (für MUC2 und CD68 oder CD163)ThermoFisherA11005
Reagenzien und Lösungen:   
Caco-2 Mittel:
DMEM mit hohem Blutzucker (4,5 g/L) und 1 % (v:v) GlutaMax Thermo Fisher Scientific35050061
FBS 10 % (v:v) hitzeinaktiviertSigmaF2242-500ML
Nicht-essentielle Aminosäuren 1 % für Caco-2-MedienThermo Fisher Scientific11140076
Pen Strep 1% (v:v)SigmaF2242-500ML
HT-29-MTX Medium
DMEM mit hohem Blutzucker (4,5 g/L) und 1 % (v:v) GlutaMax Thermo Fisher Scientific35050061
FBS 10 % (v:v) hitzeinaktiviertSigmaF2242-500ML
HEPES (10 mM Endkonzentration)Thermo Fisher Scientific15630080
Pen Strep 1% (v:v)SigmaF2242-500ML
THP-1 Mittel:
FBS (10% v:v) hitzeinaktiviertes fetales RinderserumSigma F2242-500ML
Glukose (4,5 g/L Endkonzentration)Thermo Fisher ScientificA249001
GlutaMax 1% (v:v)  2 mM EndkonzentrationThermo Fisher Scientific35050061
HEPES (10 mM Endkonzentration)Thermo Fisher Scientific15630080
Pen Strep 1% (v:v)SigmaF2242-500ML
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 MediumThermo Fisher Scientific11875119
Natriumpyruvat (1 mM Endkonzentration)Thermo Fisher Scientific11360070
Purecol arbeitende Kollagenase-Lösung (Verdünnung auf 1:30 100 & Mikro; g/ml):
Purecol 3 mg/ml 1:30 bis 100 & Mikro; g/ml Advanced BioMatrix5005-100ML
steriles, deionisiertes Wasser
L-Sepiapterin-Serienlösung (50 mM):
L-Sepiapterin (SEP)Karriere bei Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
Phorbol-Myristatacetat-Fondlösung (PMA, 5 mg/mL)InvivoGenTlrl-pma
BSA 1% Rinderserumalbumin Sigma-Aldrich5470
DMSO Sigma D2650
Miller LBSigma-Aldrich  L3522
Normales Serum derselben Spezies wie der sekundäre AntikörperSigma NS02L-1ML
ParaformaldehydSigma-Aldrich441244

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
  2. Xuan, C., et al.

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3D Co CultureFlipwell EngineeringGut Mucosal ModelBacterial SecretomeImmune Cell PolarizationColon Epithelial CellsMacrophage PolarizationBiofilm FormationSepiapterin TreatmentImmunofluorescent Staining

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