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Verbesserte Genom-Editierung durch die Verabreichung von eiduktalen Nukleinsäuren In-vivo-Elektroporationstechnik für die Erzeugung von Knockout-Mäusen

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DOI:

10.3791/68704

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26. August 2025

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1Center of Transgenesis and Genome Editing, St. Petersburg State University, 2Resource Center Molecular and Cell Technologies, St. Petersburg State University, 3Amyloid Biology Laboratory, St. Petersburg State University, 4DNA-Nanosensoric laboratory, ITMO University, 5Laboratory of Toxinology and Molecular Systematics, L.A. Orbeli Institute of Physiology, National Academy of Sciences of the Republic of Armenia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Effizienz der I-GONAD-Methode (Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery) ist vergleichbar mit der herkömmlichen Mikroinjektion, bei der Zygotenentnahme von Spenderinnen und die Übertragung auf pseudoschwangere Frauen erforderlich ist. Dieses Protokoll demonstriert seine Wirksamkeit durch die Einführung von CRISPR/Cas9-induzierten Mutationen in den ROSA26-Locus auf Chromosom 6.

Zusammenfassung

Methoden zur Herstellung von Knockout-Mäusen umfassen in der Regel drei Hauptschritte: (1) die Entnahme von Embryonen von gespendeten Weibchen, (2) die Mikroinjektion genetischer Konstrukte in die Zygoten ex vivo und (3) die chirurgische Übertragung in den Eileiter von pseudoschwangeren Weibchen. Dieser Prozess erfordert eine beträchtliche Anzahl von Tieren, da er nicht nur gespendete Weibchen, sondern auch vasektomierte Männchen und pseudoschwangere Weibchen umfasst. Darüber hinaus stellen Mikroinjektionen in das Zytoplasma oder den Vorkern von Mauszygoten Herausforderungen dar, wie z. B. Verstopfung der Nadel, Probleme mit der Membranpermeabilität aufgrund der hohen Elastizität und möglicher Absterben von Embryonen. Die Entwicklung fortschrittlicher Elektroporatoren wie dem Nepa21 bietet eine einzigartige Möglichkeit, Mäuse mit gezielten Gen-Knockouts in einem einzigen Schritt durch eine Methode zu erzeugen, die als Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery (I-GONAD) bekannt ist. Bei dieser Technik werden CRISPR-Cas-Komponenten (Cas9-Protein und Guide-RNA) 0,7 Tage nach der Empfängnis in die Eileiter schwangerer Weibchen mikroinjiziert, gefolgt von einer In-vivo-Elektroporation , um diese Komponenten direkt in die Zygoten zu bringen. Nach dem I-GONAD-Verfahren trägt die trächtige Maus Welpen mit dem gezielten Gen-Knockout aus und bringt sie zur Welt. Dieser Artikel enthält ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Implementierung der I-GONAD-Methode bei Mäusen, das eine effizientere und zugänglichere Alternative zu herkömmlichen Knockout-Mausgenerationstechniken bietet.

Einleitung

Das Verständnis der genetischen Grundlagen von Krankheiten ist entscheidend für die Identifizierung der molekularen Mechanismen, die ihrer Ätiologie und Pathogenese zugrunde liegen. Ein wichtiger Schritt in dieser Forschung ist die Entwicklung von Tiermodellen mit gezielten Gen-Knockouts, die menschliche Krankheiten simulieren. Mäuse sind aufgrund ihrer allgemeinen genomischen Ähnlichkeit mit dem Menschen, ihrer geringen Größe, ihrer kurzen Lebensdauer und ihrer hohen Fruchtbarkeit besonders wertvoll für diese Studien. Mäusemodelle sind sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die präklinische Erprobung wichtig1.

Um eine Knockout-Maus mit dem CRISPR-Cas9-System zu erzeugen, injizieren die Forscher typischerweise einen Komplex aus Guide-RNA und Cas9-Nuklease in eine Zygote, was zu einem Doppelstrangbruch in der Ziel-DNA führt und dadurch das Reparatursystem der Zelle aktiviert, um eine Mutation an der Stelle des Bruchs zu verursachen 1,2. Die Mikroinjektion in Zygoten ist nach wie vor der Goldstandard für diesen Zweck. Diese Methode erfordert jedoch mehrere Schritte: die Isolierung von Embryonen von gespendeten Weibchen, die Durchführung von Mikroinjektionen genetischer Konstrukte in Zygoten und die chirurgische Übertragung in die Eileiter von pseudoschwangeren Weibchen. Infolgedessen ist es notwendig, eine große Anzahl von Tieren zu halten, darunter gespendete Weibchen, vasektomierte Männchen und pseudoschwangere Weibchen. Darüber hinaus erfordert die Isolierung von Zygoten die Euthanasie von Spenderinnen. Daher sind Protokolle vorzuziehen, die den Einsatz von Tieren minimieren, im Einklang mit den Prinzipien der 3R (Replacement, Reduction, Refinement)3.

Fortschritte in der Elektroporationstechnologie, wie z. B. die Verwendung des Nepa21-Systems, bieten eine einzigartige Möglichkeit, gezielte Gen-Knockout-Mäuse in einem einzigen Schritt zu erzeugen, wobei eine Technik verwendet wird, die als Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery (I-GONAD)4 bekannt ist. Der Super-Elektroporator NEPA21 Typ II verwendet ein 4-stufiges Multipuls-Elektroporationssystem, das eine hohe Elektroporationseffizienz bei gleichzeitiger Beibehaltung einer hohen Lebensfähigkeit des Embryos gewährleistet. Bei I-GONAD werden CRISPR-Cas-Komponenten (Cas9-Protein (500-600 ng/μl) und leitende RNA (80-100 ng/μl)) 0,7 Tage nach der Empfängnis in die Eileiter trächtiger Mäuse mikroinjiziert, gefolgt von einer In-vivo-Elektroporation, um diese Komponenten direkt in die Zygoten zu bringen5. Nach dem I-GONAD-Verfahren bringt die trächtige Maus Welpen mit dem gezielten Gen-Knockout 6,7,8 zur Welt. Die Wirksamkeit dieser Methode variiert je nach gewünschtem Ziel, ist aber vergleichbar mit Standard-Mikroinjektionstechniken (ca. 50 %)9,10. Darüber hinaus könnte I-GONAD möglicherweise für die Genom-Editierung bei anderen Spezies angepasst werden.

In diesem Artikel wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Implementierung der I-GONAD-Methode zur Erzeugung von Knockout-Mäusen vorgestellt. Als Beispiel wurde seine Wirksamkeit demonstriert, indem es auf den ROSA26-Genomlocus auf dem Mauschromosom 6 abzielte. Dieser Locus wurde ausgewählt, da er eine konstitutive Transkription ohne anschließende Translation durchläuft. Daher ist es unwahrscheinlich, dass die Einführung einer Mutation an diesem Ort einen negativen Einfluss auf die Gesundheit der daraus resultierenden Welpen hat.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission für Tierversuche der Staatlichen Universität Sankt Petersburg genehmigt (Genehmigung Nr. 131-03-5, 11. Oktober 2022). Alle Verfahren hielten sich strikt an die Richtlinien des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Gängige, im Labor gezüchtete CD1-Mäuse wurden aus dem Collective Use Center des Instituts für physiologisch aktive Verbindungen der Russischen Akademie der Wissenschaften (IPAC RAS) gewonnen. Weibliche CD1-Mäuse im Alter von 2-3 Monaten (Durchschnittsgewicht 27-30 g) wurden für die Paarung mit männlichen CD1-Mäusen im Alter von 2,5-4 Monaten (Durchschnittsgewicht 35-37 g) verwendet. Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Design der Single-Guide-RNA (sgRNA) und deren Vorbereitung für die Transfektion

  1. Verwenden Sie computergestützte Analysetools wie CHOPCHOP, SYNTHEGO Knockout Guide Design oder CRISPOR, um potenzielle sgRNA-Sequenzen zu identifizieren, die auf das ausgewählte Gen von Interesse abzielen.
    HINWEIS: Die Software kann potenzielle sgRNA-Sequenzen im gesamten Gen identifizieren und schlägt am Ausgang mehrere Varianten vor. Diese Tools schlagen die optimalsten sgRNA-Optionen vor und ermöglichen es dem Benutzer, bei Bedarf zwischen allen identifizierten Varianten zu wählen. Berücksichtigen Sie bei der Auswahl die folgenden Kriterien:
    1. Exon-Nähe: Wählen Sie Sequenzen, die sich in Exons befinden, die so nah wie möglich am gewünschten Mutationspunkt liegen. Um bessere Ergebnisse zu erzielen, sollten Sie die alternativen Spleißisoformen in Betracht ziehen und die Zielsequenz auswählen, die in den meisten Isoformen vorhanden ist. Ziehen Sie Genombrowser (z. B. Ensembl) in Betracht, um eine genaue Exon-Auswahl zu ermöglichen.
    2. Off-Target-Überlegungen: Analysieren Sie potenzielle Off-Target-Effekte mithilfe des Bewertungssystems des Tools und wählen Sie Sequenzen aus, die die geringste prognostizierte Off-Target-Aktivität aufweisen.
      HINWEIS: Computergestützte Tools wie CHOPCHOP oder Synthego sind sehr effektiv für die Bewertung der Exon-Nähe und Off-Target-Effekte und helfen dabei, optimale sgRNA-Sequenzen für eine präzise Genom-Editierung zu identifizieren. Bei der Entwicklung von Guide-RNAs ist es wichtig, die spezifische Sequenz des interessierenden Gens in dem verwendeten Mausstamm zu berücksichtigen. Für einige Mausstämme (z. B. C57Bl, CBA, C3H) ist die vollständige genomische Sequenz verfügbar. Wenn solche Daten nicht verfügbar sind, kann es ratsam sein, eine vorläufige Sequenzierung des Zielgens in der geplanten Editierungsregion durchzuführen. Einzelne Fehlpaarungen in der Guide-RNA, die durch Polymorphismen verursacht werden, können die Effizienz der Editierung beeinträchtigen. Der ROSA 26 Mausgenom-Locus wurde mit der sgRNA-Sequenz 5'-ACTCCAGTCTTTCTAGAAGA-3' angegriffen.
  2. Bestellen Sie ein Set von Primern für die PCR-Amplifikation von sgRNA-Templates, wie in Tabelle 1 beschrieben.
    HINWEIS: gRNA kann an anderer Stelle bestellt werden, entweder als sgRNA oder als crRNA:tracrRNA-Duplex.
  3. Erstellen Sie eine lineare dsDNA-Vorlage.
    1. Bereiten Sie den Mastermix wie in Tabelle 1 gezeigt vor. Fügen Sie die Polymerase zum Schluss hinzu und bewahren Sie den Mastermix auf Eis auf, um die Stabilität zu erhalten.
    2. Führen Sie die PCR unter folgenden Bedingungen durch: Anfängliche Denaturierung: 30 s bei 95 °C; 30 Zyklen: 20 s bei 95 °C (Denaturierung), 20 s bei 55 °C (Glühen), 15 s bei 72 °C (Dehnung); Enddehnung: 2 min bei 72 °C; Bei 4 °C halten.
  4. Verwenden Sie das PCR-Reaktionsgemisch in einer weiteren In Vitro Transkription (IVT)-Reaktion.
    1. Bereiten Sie den IVT-Mastermix wie in Tabelle 2 gezeigt vor und inkubieren Sie ihn 1,5 h bei 37 °C. Verwenden Sie einen Thermocycler für eine gleichmäßige Temperaturregelung.
    2. 2 μl DNase I zugeben und weitere 30 Minuten bei 37 °C inkubieren, um das DNA-Template zu entfernen.
    3. DNase I wird inaktiviert, indem das Reaktionsgemisch 5 min lang bei 75 °C inkubiert wird.
    4. Aufreinigung der RNA mit dem TRIZOL-Reagenz gemäß dem Protokoll des Herstellers.
      HINWEIS: Die Entsorgung des TRIZOL-Reagenzes und DNAse1, seiner Lösungen oder eventueller Nebenprodukte sollte in dafür vorgesehenen Behältern für chemische Abfälle erfolgen.
    5. Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer (die typische Ausbeute einer Reaktion beträgt 3-5 μg). Überprüfen Sie die Verhältnisse A260/A280 und A260/A230. A260/ A280 sollte mindestens 2,0 betragen, und das Verhältnis A260/A230 sollte ebenfalls mindestens 2,0 betragen (d. h. es gibt keine Kontamination durch Proteine oder organische Lösungsmittel). Lagern Sie die sgRNAs bis zur Verwendung bei -80 °C.
  5. Bereiten Sie die RNP-Mischung für die Transfektion vor
    1. Der Transfektionsmix besteht aus einem RNP-Komplex, der eine Mischung aus dem Cas9-Protein und der sgRNA ist. Befolgen Sie diese Schritte, um die RNP-Mischung vorzubereiten:
    2. 1 M Tris-HCl (pH 7,5) Puffer mit nukleasefreiem Wasser auf 100 mM verdünnen und mit einem Spritzenvorsatzfilter mit 0,022 μM Porengröße filtrieren, in 10 μL-Portionen aliquotieren und bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
    3. Bereiten Sie in einem nukleasefreien Röhrchen die Transfektionsmischung der folgenden Komponenten in den Endkonzentrationen vor: 500 ng/μl spCas9-Nuklease, 80 ng/μl sgRNA, 10 mM Tris-HCl, verdünnt mit DEPC-behandeltem Wasser.
      HINWEIS: Hohe Konzentrationen der RNP-Mix-Komponenten sind erforderlich, um eine ordnungsgemäße Effizienz des Protokolls zu gewährleisten.
    4. Inkubieren Sie die Transfektionsmischung 10 Minuten lang bei 37 °C, um die Bildung des RNP-Komplexes zu ermöglichen.
    5. Aliquotieren Sie die Mischung in kleine Volumina (2 μl), die für eine einzelne I-GONAD-Sitzung geeignet sind.
    6. Halten Sie die Aliquote während der I-GONAD-Sitzung bei 4 °C. Die Mischung wird für jede I-GONAD Elektroporationssitzung frisch zubereitet, um die Stabilität zu erhalten.
      HINWEIS: Die RNP-Mischung sollte für jede I-GONAD-Sitzung frisch zubereitet werden, um eine optimale Aktivität und Effizienz zu gewährleisten.

2. Vorbereitung weiblicher Mäuse für die Genom-Editierung mittels eiduktaler Nukleinsäureabgabe

  1. Verpaarung und Selektion von weiblichen Mäusen: Verpaaren Sie CD1-Weibchen über Nacht mit einstöckigen CD1-Mäusen. Überprüfen Sie morgens, ob bei den weiblichen Mäusen Kopulationspfropfen vorhanden sind. Wählen Sie Weibchen mit Kopulationsstopfen aus und setzen Sie sie für weitere Eingriffe in einen neuen Käfig um.
    HINWEIS: Um genetisches Mosaik zu minimieren, beträgt der optimale Zeitpunkt für die Abgabe des genetischen Konstrukts 0,7 Tage nach der Paarung im Einzelzellstadium (Zygote)10. Dies entspricht ungefähr 16:00 Uhr an dem Tag, an dem der Kopulationspfropfen erkannt wurde. In diesem Stadium zeigt die Dissektion des Eileiters, dass die Zygoten weniger Kumuluszellen haben, obwohl sie in der Ampulle verbleiben. Bemerkenswert ist, dass Kumuluszellen während der Elektroporation auch exogene Nukleinsäuren oder Proteine aufnehmen können. Wenn das Verfahren früher durchgeführt wird, z. B. 10 Stunden nach der Paarung, umgeben die Kumuluszellen die Zygoten immer noch fest, was eine effiziente elektrophoretische Abgabe von Nukleinsäuren in die Zygoten behindern kann. Verwenden Sie die hormonell stimulierten Mäuse nicht, da sie eine übermäßige Anzahl von Eizellen abgeben können, was zu einer Fehlgeburt führen kann.
  2. Aufbereitung von chirurgischen Instrumenten: Autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente aus Edelstahl, um die Sterilität zu gewährleisten.
  3. Anästhesie und Aufbereitung von Mäusen: Wiegen Sie die ausgewählten weiblichen Mäuse und betäuben Sie sie durch intraperitoneale Injektion mit einer Mischung aus Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) (nach institutionell anerkannten Protokollen).
    1. Überwachen Sie die Mäuse auf den Verlust des Zehenquetschreflexes, um eine angemessene Anästhesie zu bestätigen. Legen Sie die anästhesierte Maus auf ein Heizkissen, um die Körpertemperatur während des Eingriffs zu halten. Schützen Sie die Augen der Maus vor Trockenheit während der Narkose, indem Sie Veterinärsalbe auftragen.

3. Chirurgischer Eingriff

  1. Desinfizieren Sie den Rückenbereich der Maus mit 70%igem Ethanol.
  2. Machen Sie einen 0,7 cm langen Hautschnitt im unteren Rückenbereich.
  3. Wischen Sie die Inzisionsstelle mit einem in 70%igem Ethanol getränkten Wattepad ab und entfernen Sie alle Haare um den Schnitt herum.
  4. Verlängern Sie den Schnitt auf 1,3 cm, indem Sie mit leicht geöffneten Scherenspitzen seitlich drücken.
  5. Machen Sie vorsichtig einen kleinen Schnitt (0,7 cm) im Bauchfell, um Zugang zur Bauchhöhle zu erhalten.
  6. Verlängern Sie den Schnitt auf 1,1 cm, indem Sie mit leicht geöffneten Scherenspitzen seitlich drücken.
  7. Lokalisieren Sie das Fettpolster, das am Eierstock befestigt ist, und ziehen Sie es vorsichtig mit einer Pinzette heraus, bis der Eierstock, der Eileiter und die Gebärmutter deutlich sichtbar sind.
  8. Befestigen Sie das Fettpolster mit einer Gefäßklemme.
  9. Visualisieren Sie den Eileiter unter einem stereoskopischen Mikroskop für eine präzise Manipulation (Abbildung 1).
  10. Laden Sie 2 μl der Injektionsmischung mit einem-Pipettor in eine Kunststoffkapillare.
    HINWEIS: Der-Pipettierer mit Kunststoffkapillaren, der ursprünglich für die Manipulation von Embryonen in IVF-Kliniken entwickelt wurde, kann mehrere Anwendungen unterstützen, einschließlich des Embryotransfers und der CRISPR/Cas9-Konstruktverabreichung bei I-GONAD-Verfahren. Die Pipette fungiert als Präzisions-Flüssigkeitsspender; In Kombination mit flexiblen Einwegkapillaren ermöglicht es Sterilität und verhindert Kreuzkontaminationen. Kunststoffkapillaren sind Glas vorzuziehen, um RNP-Mischung zur Transfektion in den Eileiter zu injizieren, da sie für empfindliches Gewebe weniger traumatisch sind. Im Gegensatz zu Glaskapillaren müssen Einwegkapillaren aus Kunststoff nicht flammpoliert werden, um scharfe Kanten vor dem Einsetzen zu glätten, wodurch die Vorbereitungszeit und das Risiko von Beschädigungen reduziert werden.
  11. Machen Sie mit einer Mikroschere einige Millimeter vor der Ampulle einen kleinen Schnitt (0,2 cm) in der Eileiterwand.
  12. Führen Sie den-Pipettierer mit Kunststoffkapillare vorsichtig in den Schnitt ein und stoßen Sie die Injektionsmischung in den Eileiter aus.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine Luft in den Eileiter eindringt, da dies die Effizienz der Elektroporation beeinträchtigen kann.
    Um dies zu verhindern, füllen Sie die Injektionskapillare aus Kunststoff mit mehr Injektionsmischung als nötig und vermeiden Sie eine vollständige Injektion. Plastische Kapillaren eignen sich sowohl für den Infundibulum-Transfer als auch für die direkte Dissektion der Eileiterwand zwischen Infundibulum und Ampulle. Die Methode der direkten Eileiterwanddissektion könnte weniger traumatisch sein als der Infundibulumtransfer, da letzterer einen ersten Schnitt durch die dünne Schleimbeutelmembran erfordert, die den Eileiter und das Infundibulum bedeckt. Bei CD1-Mäusen ist diese Membran stark vaskularisiert, und das Schneiden kann zu leichten Blutungen führen, die die Sicht beeinträchtigen und die Mikroinjektion des RNP-Mixes erschweren können.
  13. Entfernen Sie vorsichtig die Kunststoffkapillare aus dem Eileiter.

4. Elektroporation und Naht

  1. Schalten Sie den Elektroporator ein, indem Sie den Schalter an der Frontplatte drücken.
  2. Einstellen der Elektroporationsparameter: Porenimpuls: Spannung: 50 V, Impulslänge: 5 m, Impulsintervall: 50 ms, Anzahl der Impulse: 3, Abklingrate - 10%, Polarität: +/-; Übertragungsimpuls: Spannung: 10 V, Impulslänge: 50 ms, Impulsintervall: 50 ms, Anzahl der Impulse: 3, Abklingrate - 40%, Polarität: +/-; Stromlimit: in vivo.
  3. Fassen Sie mit der Pinzettenelektrode vorsichtig nach dem Eileiter und überprüfen Sie den Widerstandswert, indem Sie die kΩ-Taste am Elektroporator drücken. Stellen Sie sicher, dass die Elektroden ausreichend zusammengedrückt werden, damit der Widerstand im optimalen Bereich von 350-400 Ω bleibt.
    HINWEIS: Dies kann erreicht werden, indem der Abstand zwischen den beiden Elektroden angepasst wird, wenn der intakte Eileiter zwischen ihnen eingeklemmt ist.
    1. Drücken Sie unmittelbar nach der Messung des Widerstands die Start-Taste, um die Elektroporation zu starten. Dieser Schritt ist entscheidend, um eine effiziente Abgabe von CRISPR-Cas-Komponenten in die Zygotenzu gewährleisten 4. Warten Sie, bis die Ω-Taste ein "Ende"-Signal anzeigt. Notieren Sie sich die Werte, die im Rahmen Messungen angezeigt werden.
      HINWEIS: Der Impedanzwert sollte ca. 250-400 Ω/150-250 mA des Spannungswerts betragen, um ein optimales Gleichgewicht zwischen Rentabilität und Übertragungseffizienz zu gewährleisten. Um dieses Gleichgewicht aufrechtzuerhalten, vermeiden Sie die Abdeckung der Eileiterregionen mit einem Stück nassem Papier, das mit Dulbeccos modifizierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) getränkt ist, die in einigen Protokollen empfohlen wird, da dieser Schritt den Widerstand erheblich über den optimalen Bereich hinaus verringern kann. Ein verminderter Widerstand kann die Spannung auf mehr als 250 mA anheben, was zum Zelltod führt.
  4. Nachdem Sie die Elektroporation an einem Eileiter abgeschlossen haben, legen Sie den Fortpflanzungstrakt vorsichtig wieder in die Bauchhöhle ein. Nähen Sie den Schnitt mit chirurgischem 4-0-Polyglykolsäure-Nahtmaterial.
  5. Wiederholen Sie den Vorgang und die Elektroporation am zweiten Eileiter. Sobald dies abgeschlossen ist, führen Sie den Fortpflanzungstrakt wieder in die Bauchhöhle zurück und nähen Sie den Schnitt wie oben beschrieben.
  6. Überwachung nach dem Eingriff: Legen Sie die Maus zur Genesung in einen warmen (37 °C), sauberen Käfig und überwachen Sie, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat.
    HINWEIS: Halten Sie die Mäuse nach der Operation in Käfigen mit zwei Mäusen pro Käfig. Wenn nur eine Maus operiert wurde, geben Sie ihr eine weibliche Maus. Diese Praxis trägt dazu bei, unnötigen Stress für die chirurgische Maus zu reduzieren und fördert ein natürlicheres soziales Umfeld.

5. Genotypisierung

  1. Design der Grundierung
    1. Entwerfen Sie für die Genotypisierung Primer, um ein PCR-Produkt mit einer Länge von 300 bis 600 bp zu amplifizieren. Die Primer sollten 18-21 Nukleotide lang sein und eine Schmelztemperatur (Tm) von etwa 60 °C haben.
    2. Vermeiden Sie Sequenzen, die Sekundärstrukturen oder Primer-Dimere bilden. Verwenden Sie Software-Tools wie PerlPrimer 1.1.2111, In-Silico PCR V39x1 oder ähnliches, um die Qualität der Primer sicherzustellen.
    3. Führen Sie eine BLAST-Suche in der Mausgenomdatenbank durch, um die Primerspezifität zu bestätigen und eine unspezifische Amplifikation zu vermeiden11.
      HINWEIS: Die folgenden Primer wurden für die Genotypisierung der Zielsequenz entwickelt: Vorwärtsprimer: 5'-CTCTCCCAAAGTCGCTCTGA-3'; Umgekehrter Primer: - 5'-TCTGTGGGAAGTCTTGTCCC-3', erwartete PCR-Produktlänge: 320 bp und Tm 62°C. Entwerfen Sie für die Sanger-Sequenzierung einen Sequenzierungsprimer, der 150-200 bp von der Cas9-Schnittstelle entfernt ist.
  2. Führen Sie eine DNA-Extraktion durch. Für eine schnelle DNA-Extraktion ist das Hotshot-Isolationsprotokoll12 das einfachste.
    1. Entnehmen Sie mit einem Ohrlocher ein kleines Gewebefragment (ca. 2 mm) aus dem Ohr der Maus.
    2. Fügen Sie 100 μl Lysepuffer (25 mM NaOH, 0,2 mM EDTA, pH = 12) hinzu.
    3. Bei 95 °C 60 min inkubieren und die Mischung alle 20 min vortexen.
    4. 100 μl Neutralisationspuffer (40 mM Tris-HCl, pH = 5) zugeben und gründlich vortexen.
    5. Verwenden Sie 1-5 μL des Endpräparats für die PCR.
  3. PCR-Amplifikation und Sequenzierung. Bereiten Sie den PCR-Mastermix vor, wie in Tabelle 3 beschrieben. Verwenden Sie eine Korrekturlesende DNA-Polymerase, um eine hohe Wiedergabetreue zu gewährleisten. Aliquotieren Sie den Mastermix in die erforderliche Anzahl von Röhrchen und fügen Sie genomische DNA hinzu.
    HINWEIS: Fügen Sie immer eine Wildtyp-DNA-Probe als Kontrolle für die Sequenzierungsanalyse hinzu.
  4. Führen Sie die PCR für die ROSA26-Genotypisierung durch. Folgende Bedingungen wurden verwendet: Anfängliche Denaturierung: 30 s bei 95 °C; 28 Zyklen: 20 s bei 95 °C (Denaturierung), 20 s bei 62 °C (Glühen), 20 s bei 72 °C (Dehnung); Enddehnung: 2 min bei 72 °C; Bei 4 °C halten.
    HINWEIS: Das bereitgestellte Protokoll ist genau für die Amplifikation von ROSA26-Locus-Fragmenten (geschätzte Größe 320 bp) unter Verwendung von Primern aus Schritt 1.1.2. Für eine spezifischere und genauere Amplifikation begrenzen Sie die Anzahl der Amplifikationszyklen auf 28-30.
  5. Sequenzierung und Analyse
    1. Führen Sie eine Sanger-Sequenzierung der erhaltenen PCR-Fragmente durch (Schritt 5.4).
    2. Analyse der Sequenzierungsergebnisse
      HINWEIS: Eine erfolgreiche Transfektion führt zu Mosaiktieren, die durch das Auftauchen zusätzlicher DNA-Sequenzen in der Nähe der Nuklease-Schnittstelle im Sequenzierungschromatogramm identifizierbar sind. Verwenden Sie Computerwerkzeuge wie EditCo ICE Analysis oder TIDE13 , um exakte Indels im Genom zu identifizieren und zu quantifizieren.
      1. Um die ICE-Analyse zu verwenden, laden Sie einfach die erhaltenen Sanger-Sequenzierungsdateien hoch (Kontroll-.ab1-Datei für die WT-Maus-PCR-Produktsequenz ohne Bearbeitung und Experiment-.ab1-Datei für die Experiment-Maus-PCR-Produktsequenz), geben Sie die Guide-RNA-Sequenz ein und wählen Sie die im CRISPR-Experiment verwendete Nuklease aus.
        HINWEIS: Das ICE-Analysewerkzeug berechnet die Gesamtbearbeitungseffizienz und bestimmt die Profile und relativen Häufigkeiten aller verschiedenen Arten von Bearbeitungen, die in der Stichprobe vorhanden sind.
      2. Um TIDE zu verwenden, geben Sie die Guide-RNA-Sequenz ein, laden Sie die erhaltenen Sanger-Sequenzierungsdateien hoch (Kontroll-.ab1-Datei für die wt-Maus-PCR-Produktsequenz ohne Bearbeitung und Experiment-.ab1-Datei für die Experiment-Maus-PCR-Produktsequenz) und aktivieren Sie Parameter (in einigen Fällen können erweiterte Einstellungen helfen, Indels zu finden, die größer als 10 bp sind).

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Ergebnisse

Wenn die Elektroporation erfolgreich war, werden die Versuchsmäuse: (1) eine Handvoll Jungtiere zur Welt bringen und (2) einige Tiere unterschiedliche Indels im Genom haben. Wenn die Genotypisierungsprimer gut konzipiert sind und das PCR-Programm optimal ist, liegt das PCR-Produkt auf dem Agarosegel als eine klare Bande der gewünschten Größe vor. Wenn die Nuklease die Ziel-DNA erfolgreich durchtrennt, dann werden die erhaltenen Tiere wahrscheinlich mosaikartig sein und eine Reihe von Ind...

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Diskussion

Die Effizienz der Erzeugung von Knockout-Mäusen mit der I-GONAD-Methode ist vergleichbar mit der herkömmlicher Mikroinjektionstechniken. Traditionelle Methoden umfassen jedoch die Isolierung von Zygoten von gespendeten Weibchen, die Durchführung von Mikroinjektionen und die Transplantation von Embryonen in die Eileiter von pseudoschwangeren Weibchen. Im Gegensatz dazu vereinfacht die I-GONAD-Methode diesen Prozess, indem sie Genom-Editing-Komponenten direkt in die Eileiter trächtiger Wei...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Die Autoren danken dem Forschungspark der Universität St. Petersburg, Zentrum für Molekular- und Zelltechnologien. Die Sequenzierung wurde mit einem ABI 3500 xL Genetic Analyzer (Thermo Fisher Scientific, USA) im Resource Center of Molecular and Cell Technologies des Wissenschaftsparks der Staatlichen Universität Sankt Petersburg durchgeführt. Die Autorinnen und Autoren danken Maria Rubel für ihre Hilfe bei der Bearbeitung und Einreichung der Dokumente. Diese Forschung wurde von der Staatlichen Universität Sankt Petersburg, Forschungsprojekt ID: 129658320, finanziert, und Luibov Shkodenko wurde von der Russischen Wissenschaftlichen Stiftung (Projekt 25-26-00247) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0.5 & Strich; 5 μL-Pipette Thermowissenschaftlich4642020
1,5-mL-RöhreAptaca1003/G
100-1000 uL Pipette Thermowissenschaftlich4642090
200-uL-RöhreAxygenPCR-02-C
20-200 μL Pipette Thermowissenschaftlich4642080
2-20 μL Pipette  Thermowissenschaftlich4642060
4x Gel-LadefarbeBiolabmixD-3002
AgaroseAppliChemA8963,0500
DNase I, RNase-frei (1 U/μ L)Thermo FisherEN0521
dNTP Set, 100 mM LösungThermowissenschaftlichR0181
DreamTaq Green DNA-Polymerase (5 U/μ L)ThermowissenschaftlichEP0713
Dulbecco' s modifizierte, phosphatgepufferte KochsalzlösungSigma AldrichD8537
EditCo ICE-Analysehttps://ice.editco.bio/#/Zugriff am 04.06.2025
EDTA 0,5M-Lösung, pH = 8AppliChemA4892.0500
Ensembl  https://www.ensembl.org/index.htmlZugriff am 09.06.2025
EthidiumbromidBiolabmixEtBr-10
Augengel-Tropfen " Oftagel"URSAPHARM204604
Gel-Dokumentationssystem ChemiDoc XRS+Bio-Rad1708265
In-Silico PCR V39x1 https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr  Zugriff am 09.06.2025
Integrierte DNA-Technologien;https://eu.idtdna.comZugriff am 09.06.2025
Mikrochirurgische SchereMedin URALM124
NEPA21-ElektroporatorNepa-GenNEPA21Mit CUY652P2,5x4-Elektrode
NTP-Set, 100 mM-LösungThermowissenschaftlichR0481
OligonukleotideEvrogenDirekter Auftrag, Standardreinigung mit Entsalzung
Opti-MEM I reduziertes SerummediumThermo Fisher31985070
PerlPrimerhttps://perlprimer.sourceforge.netVersion 1.1.21.
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase (2 U/μ L)ThermowissenschaftlichF530L
Pipettenspitzen 10 μLUlplastHT-10-960
Pipettenspitzen 1000 uLUlplastHT-1000-576
Pipetten-200-uL-SpitzenUlplastHT-200-960
Stromversorgung " Elf-4"DNA-TechnologiePS-400 NEU
RNAse/DNAse freies WasserInvitrogen10977049
KochsalzlösungPanEcoP011n
SE-1 horisontales ElektrophoresesystemHeliconSE-1
NatriumhydroxidSigma-AldrichS5881-500G
Stufe 100 DNA-LeiterBiolabmixS-8100
Stereomikroskop-SMZ1000Nikon5-363376
-MikropipetterCooperSurgicalMXL3-STR
-SpitzenORIGIOMXL3-125
Chirurgische Nadel KMIZ4A1- 0,6&-mal; 20
NähzangeMedin URALM302.2
NähzangeMedin URALM303
Nahtgewinde POLYCON Nfigure-materials-10Tonzos 95234
SYNTHEGO Knockout-Leitfaden Design https://design.synthego.com/#/Zugriff am 09.06.2025
T100-VerstärkerBioRad10014822
T7-RNA-Polymerase ThermowissenschaftlichEP0111
TBE 10x PufferBiolabmixTBE-500
Tide https://tide.nki.nl/Zugriff am 04.06.2025  
TrishydrochloridSuzhou Yacoo WissenschaftSYS-S0005-0.5
Trizma-HydrochloridlösungSigma AldrichT2663
TRIzol-ReagenzInvitrogen15596026
TrueCut Cas9 ProteinInvitrogenA36499
UniversalschereMedin URALM147
XylazinInterchemie Werken de AdelaarIX2
ZoletilVirbac-Labor2000443714739.00

Referenzen

  1. Fujihara, Y., Ikawa, M. CRISPR/Cas9-Based Genome Editing in Mice by Single Plasmid Injection. Methods Enzymol. 546, 319-336 (2014).
  2. Zuo, E., et al. One-step generation of complete gene knockout mice and monkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editing with multiple sgRNAs. Cell Res. 27 (7), 933-945 (2017).
  3. Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754(2019).
  4. Kobayashi, Y., et al. Modification of i-GONAD suitable for production of genome-edited C57BL/6 inbred mouse strain. Cells. 9 (4), 957(2020).
  5. Takabayashi, S., et al. Successful i-GONAD in mice at early zygote stage through in vivo electroporation three minutes after intra-oviductal instillation of CRISPR-ribonucleoprotein. Int J Mol Sci. 23 (18), 10678(2022).
  6. Sato, M., et al. Sequential i-GONAD: An improved in vivo technique for CRISPR/Cas9-based genetic manipulations in mice. Cells. 9 (3), 546(2020).
  7. Kessler, S., et al. A multiple super-enhancer region establishes inter-TAD interactions and controls Hoxa function in cranial neural crest. Nat Commun. 14 (1), 3242(2023).
  8. Kaneko, T., Tanaka, S. Improvement of genome editing by electroporation using embryos artificially removed cumulus cells in the oviducts. Biochem Biophys Res Commun. 527 (4), 1039-1042 (2020).
  9. Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nat Protoc. 14 (8), 2452-2482 (2019).
  10. Ohtsuka, M., et al. i-GONAD: A robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biol. 19 (1), 25(2018).
  11. Marshall, O. J. PerlPrimer: Cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphite and real-time PCR. Bioinformatics. 20 (15), 2471-2472 (2004).
  12. Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT). BioTechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
  13. Brinkman, E. K., Van Steensel, B. Rapid quantitative evaluation of CRISPR genome editing by TIDE and TIDER. CRISPR Gene Editing. 1961, 29-44 (2019).
  14. Imai, Y., Tanave, A., Matsuyama, M., Koide, T. Efficient genome editing in wild strains of mice using the i-GONAD method. Sci Rep. 12 (1), 13821(2022).
  15. Iwata, S., et al. Simple and large-scale chromosomal engineering of mouse zygotes viain vitro and in vivo electroporation. Sci Rep. 9 (1), 14713(2019).
  16. Abe, M., et al. A novel technique for large-fragment knock-in animal production without ex vivo handling of zygotes. Sci Rep. 13 (1), 2245(2023).
  17. Meyer-Dilhet, G., Courchet, J. In utero cortical electroporation of plasmids in the mouse embryo. STAR Protocols. 1 (1), 100027(2020).

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