Optimierung und Bewertung des Handziehens und Nassspinnens für die Herstellung rekombinanter Spinnenseidenfasern

Zusammenfassung

Das vorgestellte Protokoll bietet eine vielseitige Reihe von Methoden zur Optimierung der Solubilisierung von rekombinanten Seidenproteinen für das Spinnen; Prüfung der Spinnbarkeit durch Handzeichnung; Herstellung langer, kontinuierlicher Fasern durch automatisiertes Nassspinnen; und vergleichende Bewertung der Morphologie, der molekularen Ausrichtung, des mechanischen Verhaltens und des sekundären strukturellen Gehalts von oder innerhalb von Fasern.

Zusammenfassung

Spinnenseide ist bekannt für ihre mechanischen Eigenschaften, die für sie charakteristisch sind: hohe Festigkeit, hohe Dehnbarkeit oder eine Kombination davon, die zu einer hohen Zähigkeit führt. Eine typische weibliche Radspinne produziert sieben verschiedene Arten von Seide, die typischerweise aus typspezifischen Proteinen gesponnen und mechanisch auf eine bestimmte Überlebensfunktion zugeschnitten sind. Die rekombinante Herstellung von Spinnenseide bietet einen vielversprechenden Weg zur Gewinnung dieser Materialien, da sie die Herausforderungen bei der Gewinnung großer Mengen natürlicher Seide umgeht und Vorteile bei der Ermöglichung der Proteinanpassung bietet, z. B. durch ortsgerichtete Mutagenese oder Fusionsproteinkonstruktion.

In dem vorgestellten Protokoll skizzieren wir eine Methodik zur Bewertung der Proteineignung für das Spinnen sowohl durch Handzeichnungs- als auch durch Nassspinnansätze. Beginnend mit einem entsprechend gereinigten lyophilisierten Proteinpulver werden Verfahren zur Optimierung des anfänglichen löslichen Proteinzustands zur Bereitstellung eines hochkonzentrierten "Spinndope"-Zustands detailliert beschrieben. Als nächstes werden Handzieh- und Nassspinnansätze verglichen, einschließlich einer Diskussion über Methoden zur Modulation des Faserverhaltens unter Verwendung eines Nachspinnzugs als Teil des Spinnprozesses. Ein typischer Arbeitsablauf zur Charakterisierung der resultierenden Seidenfasern und zur Entscheidung, welche Spinnbedingungen am ehesten fruchtbar sind, wird dann detailliert beschrieben, einschließlich optischer Mikroskopie zur Bewertung des Faserdurchmessers und seiner Gleichmäßigkeit; Polarisationslichtmikroskopie zur Abschätzung des Grades der (supra)molekularen Ausrichtung, die innerhalb der Faser erreicht wird; Zugversuche zur Bewertung von Festigkeit, Dehnbarkeit, Elastizitätsmodul und Zähigkeit; und Fourier-Transformations-Infrarot (FTIR)-Spektromikroskopie zur Bewertung der sekundären Proteinstrukturierung innerhalb der Faser.

Dieses Protokoll hat sich als geeignet für mehrere verschiedene rekombinante Spinnenseidenproteine erwiesen, die auf repetitiven und nicht-repetitiven Domänen von aciniformer (umhüllender) Seide basieren; pyriforme Seide; und Fusionsproteine, die aciniforme, pyriforme und/oder große Ampullatseide (Schleppleinenseide) umfassen. Eine breitere Anwendbarkeit wird durch mehrere hervorgehobene Schritte gewährleistet, bei denen Bedingungen und Parameter variiert werden können, um dem Verhalten eines einzelnen Proteins gerecht zu werden und Unterschiede im funktionellen Ergebnis zu erzielen.

Einleitung

Spinnen produzieren Seide für verschiedene spezielle Aufgaben, darunter Netzkonstruktion, Beutefang und Eierschutz¹. Spinnenseide weist hervorragende mechanische Eigenschaften auf, die die der meisten bekannten natürlichen und synthetischen Materialien^{übertreffen 2}, was zu erheblichen Anstrengungen bei der Herstellung von technischen und verbesserten Spinnenseidenmaterialien für verschiedene industrielle und biomedizinische Anwendungen führt. Spidroin, das Protein, das Spinnenseide bildet, besteht aus einer relativ großen, sich wiederholenden Domäne, die von nicht-repetitiven N-terminalen und C-terminalen Domänen begrenzt wird³, wobei die einzigartigen mechanischen Eigenschaften einiger Seidenarten mit der Wiederholung kurzer Motive innerhalb der repetitiven Domäne in Verbindung gebracht wurden ^4,5,6. Im Gegensatz zur kommerziell angebauten Maulbeerseidenraupe (Bombyx mori), die große Mengen an Seide in einem konsistenten Kokonformat produziert, das für die Ernte geeignet ist, sind Spinnen von Natur aus kannibalistische und territoriale Organismen, die Seide in begrenzten Mengen produzieren, was eine Herausforderung für die landwirtschaftliche Produktion und Sammlung darstellt⁷. Angesichts dieser Einschränkungen wurde die Produktion von rekombinanter Spinnenseide als praktikablere und nachhaltigere Alternative entwickelt, um kontrolliert ausreichende Mengen an Spinnenseide für die Anwendung zu erhalten.

Die Herstellung von rekombinanter Spinnenseide erfordert die Auswahl eines geeigneten Wirts für die Proteinexpression. Spinnenseide wurde in verschiedenen Wirtssystemen exprimiert, darunter Bakterien ^8,9, Hefen^10,11, Insektenzellen¹², Pflanzen^13,14 und Säugetierzellen^15,16, wobei Escherichia coli das am häufigsten verwendete Wirtssystem ist. Die hohen Molekulargewichte der Spidroine, die bis zu 700 kDa⁷ erreichen können, stellen eine große Herausforderung für die Expression von Konstrukten in voller Länge dar. Um rekombinante Spinnenseide mit vergleichbaren oder verbesserten Eigenschaften im Vergleich zu denen natürlicher Spinnenseide herzustellen, besteht die primäre Strategie in der Expression von verkürzten Varianten, wie z. B. Konstrukten mit einer begrenzten Anzahl von Wiederholungseinheiten (mit oder ohne nicht-repetitive Domänen), Chimären, die aus Kombinationen verschiedener Seidentypen bestehen, und Hybridseiden, die mit Nicht-Seidenproteinen fusioniert sind. Zum Beispiel wurde rekombinantes Hauptampulat-Spidroin (284,9 kDa) erfolgreich in einem metabolisch veränderten E. coli exprimiert, und die resultierende Seide wies mechanische Eigenschaften auf, die mit denen der natürlichen Hauptampulatseide^{vergleichbar sind 9}. Darüber hinaus zeigte eine technisch hergestellte Seidenfaser, die aus zwei Wiederholungseinheiten von pyriformem Spidroin und zwei Wiederholungseinheiten von aciniformem Spidroin besteht, eine überlegene Dehnbarkeit gegenüber einer der konstituierenden pyriformen oder aciniformen Seiden, vergleichbar mit der von natürlicher flagelliformen Seide¹⁷.

Die rekombinante Proteinproduktion ermöglicht auch den einfachen Einbau von funktionellen Peptid- oder Proteinsegmenten in Seidenproteine und ermöglicht so die Herstellung von Biomaterialien mit Eigenschaften, die auf bestimmte Anwendungen zugeschnitten sind. So führte beispielsweise die genetische und chemische Fusion von RGD-Zellbindungsmotiven mit einer gentechnisch hergestellten Seide, die aus wichtigen Ampullat-Spidroinen gewonnen wurde, zu Filmen, die die Adhäsion und Proliferation von Fibroblasten signifikant verstärkten¹⁸. In einer separaten Studie wurde gezeigt, dass ein Hybridseidenkonstrukt, das aus einem Nervenwachstumsfaktor-β-Bindungsmotiv (NGF) besteht, das mit einem chimären Protein fusioniert ist, das zwei Repeat-Einheiten von aciniformem Spidroin und die C-terminale Domäne eines großen Ampullat-Spidroins umfasst, das neuronenähnliche Zellwachstum und die Differenzierung unterstützt¹⁹.

Bei erfolgreicher Expression und Reinigung eines rekombinanten Seidenproteins kann es dann je nach beabsichtigter Anwendung zu verschiedenen Formen wie Hydrogelen, Filmen, Fasern, Nanopartikeln, Schäumen und Schwämmen verarbeitet werden^20,21. Um die Herstellung von Kunstseidenfasern zu ermöglichen, wurden Spinnverfahren entwickelt, die bestimmte Aspekte des hochkomplexen und streng regulierten Naturfaserspinnprozesses von Spinnen imitieren. In natürlicher Hauptampulatseide werden Spidroine von Epithelzellen in der großen Ampullatdrüse produziert und in einem löslichen Zustand im Lumen in hohen Konzentrationen (bis zu 50 % (w/v))²² gespeichert, wobei ein wässriges Spinndope gebildet wird. Wenn sich das Spinnmittel durch den Spinnkanal bewegt, erfährt es Veränderungen des pH-Werts, der Ionenkonzentration, des Wassergehalts und der Scherkräfte sowohl durch die Verengung des Kanals als auch durch den Faserpultrusionsprozess, der die Umwandlung von flüssigen Seidenproteinen in feste Fasern induziert^23,24. Die Identifizierung eines geeigneten Lösungsmittels, das rekombinante Seidenproteine in hoher Konzentration zu einem Spinnmittel lösen oder suspendieren kann, ist daher ein kritischer erster Schritt im Prozess des Spinnens von Kunstfasern.

Für die Formulierung von Seidenproteinspinnmitteln wurde eine breite Palette von Lösungsmitteln eingesetzt, und es hat sich gezeigt, dass die Wahl des Lösungsmittels die Faserbildung und die mechanischen Eigenschaften beeinflusst ^25,26. Daher ist eine sorgfältige Berücksichtigung der Auswahl des Lösungsmittels unerlässlich, um die resultierenden Fasereigenschaften zu optimieren. Spinndope können unter Verwendung von organischen oder wässrigen Lösungsmitteln formuliert werden, wie z. B. 1,1,1,3,3,3-Hexafluorisopropanol (HFIP)²⁷, Hexafluoraceton (HFA)²⁸, Mischungen aus Trifluoressigsäure (TFA) und 2,2,2-Trifluorethanol (TFE)²⁶, Ameisensäure²⁹ und Natriumphosphat/Tris-Puffer³⁰. Da die Proteinlöslichkeit typischerweise von Faktoren wie pH-Wert, Ionenstärke und Konzentration beeinflusst wird, umfasst die Identifizierung eines geeigneten Dope-Lösungsmittels im Allgemeinen eine systematische Bewertung verschiedener Lösungsmittel, eine Optimierung des pH-Werts und der Proteinkonzentrationen und in einigen Fällen die Verwendung von Lösungsmittel-Wasser-Gemischen, um die optimalen Spinndope-Bedingungen zu bestimmen. Darüber hinaus ist die Viskosität des Spinnmittels ein wichtiger Parameter, der vor dem Spinnprozess beurteilt werden muss, da eine hochviskose Dope-Lösung den Flüssigkeitsfluss während des Spinnens behindern kann, während ein unzureichend viskoses Dope typischerweise nicht für die Faserbildung geeignet ist ^31,32. Es sollte beachtet werden, dass die Verwendung von harten Spin-Dope-Bedingungen die Proteinstruktur bei längerer Exposition verändern kann; Daher bleibt die Entwicklung umweltfreundlicher Dope-Lösungsmittel ein aktives Forschungsgebiet.

Handziehen und Nassspinnen sind zwei gängige Methoden des rekombinanten Seidenfaserspinnens. Die mechanischen Eigenschaften der Fasern, die mit den einzelnen Verfahren hergestellt werden, hängen stark sowohl von den Spinnbedingungen selbst als auch von der Nachspinnverarbeitung ab. Das Handziehen, auch als Streckspinnen bezeichnet, ist ein einfaches Faserherstellungsverfahren, bei dem Fasern aus Lösungen gereinigter Proteine gezogen werden, normalerweise unter Verwendung einer Pipettenspitze, einer Pinzette oder einer Pinzette, gefolgt von Lufttrocknung und Charakterisierung 33,34,35,36,37. Während das Handziehen einen hervorragenden Ansatz bietet, um eine Vielzahl von Bedingungen für die Bildung von Seidenfasern schnell zu screenen und das resultierende mechanische Verhalten der Faser allgemein zu klassifizieren, ist diese Technik nicht ohne weiteres auf lange (d. h. mehrere Meter lange) Endlosfasern skalierbar. Als Alternative verwenden wir das Nassspinnen, bei dem eine kontinuierliche Extrusion eines Spinnmittels mit konstanter Geschwindigkeit in ein Koagulationsbad angewendet wird, typischerweise ein wässriges oder organisches Lösungsmittel, das aus einem Gemisch aus Wasser und Ethanol oder Methanol 9,15,31,38,39,40 besteht . Das Eintauchen des Spinnmittels in das Gerinnungsbad bewirkt eine schnelle Proteindesolvatisierung, die zur Bildung von Endlosfasern^{führt 24}. Anschließend werden die Fasern mit konstanter Geschwindigkeit aus dem Koagulationsbad gezogen, entweder abgestimmt auf die Extrusionsgeschwindigkeit, um as-gesponnene (AS) Fasern zu erhalten, oder einem Nachspinnzug unterzogen, um nachgesponnene (PS) Fasern zu erhalten, die typischerweise verbesserte mechanische Eigenschaften aufweisen. Das Ziehen nach dem Schleudern beinhaltet typischerweise das Dehnen von Fasern auf ein Verhältnis von 2-8x ihrer ursprünglichen Länge an der Luft, in einem Lösungsmittel oder nach dem Eintauchen in das Lösungsmittel, wobei jeder Parameter zu spezifischen mechanischen Eigenschaften beiträgt 15,17,31,38.

Obwohl sich dieses Protokoll auf Handzieh- und Nassspinnmethoden konzentriert, ist es wichtig, diese Methoden in einen Kontext zu setzen. Elektrospinnverfahren wurden für rekombinante Spinnenseide sowohl unter wässrigen als auch aus organischen Bedingungen beschrieben, die die Herstellung von Fasermatten, ausgerichteten Fasern und Garnen ermöglichen, wobei die Fasern typischerweise im Nanometerbereich mit einem Durchmesser^{von 41} liegen. Dies bietet den potenziellen Vorteil von nanoskaligen Fasern und eine entsprechende Herausforderung, wenn Fasern im Mikrometerbereich gewünscht werden, typischerweise mit der Anforderung, eine Nachspinnverarbeitung durchzuführen, um eine Umwandlung in eine β-Blattstruktur zu induzieren, um die Mechanik und Wasserverträglichkeit zu verbessern. Mehrere Meter lange rekombinante Spinnenseidenbänder mit einer Breite und Dicke im Mikrometerbereich wurden durch Trockenspinnen aus organischem Lösungsmittel^{erhalten 42}, wobei kürzlich gezeigt wurde, dass der Einbau von Metallionen in der Spin-Dope-Phase die Mechanik verbessert⁴³. Das auf Mikrofluidik basierende Spinnen⁴⁴, einschließlich einer neueren Kombination von 3D-Drucktechnologie mit Mikronadel-Spinndüsen, die die natürliche Spinndüse⁴⁵ nachahmen, eignet sich für das hochgradig kontrollierbare rekombinante Seidenfaserspinnen. Ungeachtet der Vielzahl von Methoden, von denen berichtet wird, dass sie für die Herstellung von Seidenfasern (oder seidenähnlichen) Fasern geeignet sind, beschreibt das vorliegende Protokoll die Herstellung rekombinanter Seidenfasern durch Handziehen und Nassspinnen, da sich diese Methoden in unseren Händen als übertragbar auf mehrere verschiedene rekombinante Seidenvarianten erwiesen haben und einen handhabbaren Ausgangspunkt für die Entwicklung von Biomaterialien und eine vergleichende Bewertung bieten.

Nach dem Spinnen und Sammeln von Fasern wird routinemäßig eine Kombination aus optischen, mechanischen und spektroskopischen Techniken verwendet, um die Eigenschaften nach dem Spinnen zu charakterisieren. Jede Methode bietet wichtige Einblicke in den Faserbildungsprozess und seine Korrelation mit der Materialleistung. Hier konzentrieren wir uns auf eine Teilmenge dieser Methoden und stellen fest, dass es viele andere Methoden gibt, die wichtige Informationen über die Eigenschaften und die Leistung von Seidenfasern liefern. Die optische Mikroskopie wird zur Beurteilung der Fasermorphologie verwendet und ermöglicht den Vergleich der Durchmesser von Fasern, die sowohl unter identischen als auch unter unterschiedlichen Bedingungen gesponnen wurden 17,31,38,46. Diese Technik ist auch wichtig, um Fasersegmente mit Defekten oder Anomalien vor der anschließenden Charakterisierung zu identifizieren und zu eliminieren. Darüber hinaus kann die Polarisationslichtmikroskopie eingesetzt werden, um den Grad der molekularen Ausrichtung innerhalb der Faser zu bewerten, da höhere Ausrichtungsgrade typischerweise mit verbesserten mechanischen Eigenschaften verbunden sind 17,26,47. Die mechanische Charakterisierung erfolgt durch Zugversuche, bei denen Spannungs-Dehnungs-Kurven gemessen und verwendet werden, um Parameter wie Zugfestigkeit, Dehnbarkeit, Elastizitätsmodul und Zähigkeit zu quantifizieren und wesentliche Informationen zur Bewertung der Fasereignung in strukturellen oder biomedizinischen Anwendungen zu liefern 17,33,48. Die letzte Technik, die hier behandelt wird, die Fourier-Transformations-Infrarot-Spektromikroskopie (FTIR), wird angewendet, um die Sekundärstruktur von Proteinen zu untersuchen, insbesondere den Grad der β-Faltblattbildung, da dies eine entscheidende Rolle für die Faserstabilität und die mechanische Festigkeit spielt 17,46,49. Zusammen ermöglichen diese Techniken ein umfassendes Verständnis der Morphologie, Struktur und des mechanischen Verhaltens von rekombinant hergestellten Seidenfasern.

Protokoll

In diesem Protokoll gehen wir davon aus, dass der Ausgangspunkt ein lyophilisiertes Seidenproteinpulver ist. Dies wäre in unserer Arbeit am typischsten ein rekombinantes Spinnenseidenprotein. Einen Überblick über das Protokoll gibt es in Abbildung 1, wobei jeder der folgenden fünf Schritte im Folgenden aufgeführt ist: (1) Spinndope-Vorbereitung und -Optimierung; (2) Handziehen oder Nassspinnen von Seidenfasern; (3) Faserdurchmesser und morphologische Bewertung durch optische Mikroskopie; (4) mechanische Bewertung durch Zugversuch; und (5) Bewertung der Sekundärstruktur durch FTIR-Spektromikroskopie.

Abbildung 1: Schematischer Überblick über die wichtigsten Schritte im Protokoll für die Herstellung, Sammlung und Charakterisierung von rekombinanten Spinnenseidenproteinfasern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Spinning-Dope-Aufbereitung und -Optimierung

HINWEIS: Um die Dope-Lösung für das Spinnen von Fasern zu optimieren, versuchen Sie, unterschiedliche Konzentrationen von rekombinantem Spinnenseidenprotein in verschiedenen Lösungsmitteln zu lösen, um Dope-Lösungen herzustellen (Tabelle 1). Nur die Lösungsmittel, die das Protein auflösen und eine ausfallfreie und klare Dope-Lösung ergeben, sollten für Versuche des Faserspinnens verwendet werden.

1. Aufbereitung von Lösungsmitteln
   1. Um 8:1:1 TFA/TFE/H₂O herzustellen, messen Sie 800 μl TFA, 100 μl TFE und 100 μl Reinstwasser vom Typ 1 in ein Glasröhrchen in einem Abzug. Alle Komponenten gründlich vermischen. Verschließen Sie das Glasrohr und bedecken Sie es mit Parafilm, um das Verdampfen flüchtiger Bestandteile zu verhindern.
      HINWEIS: Bereiten Sie immer eine frische Lösung für das Faserspinnen vor.
      ACHTUNG: Gehen Sie vorsichtig mit TFA und TFE um, TFA ist stark korrosiv und flüchtig, während TFE brennbar und giftig ist. Tragen Sie geeignete PSA, einschließlich Handschuhe, Laborkittel und Schutzbrille, um Hautkontakt und die Gefahr eines Einatmens zu vermeiden.
   2. Um 3:1:1 TFA/TFE/H₂O herzustellen, werden in einem Abzug 300 μl TFA, 100 μl TFE und 100 μl Reinstwasser vom Typ 1 in ein Glasröhrchen gegeben und die Komponenten vermischt. Verschließen Sie das Glasrohr und bedecken Sie es mit Parafilm, um die Verdunstung flüchtiger Bestandteile zu minimieren.
      HINWEIS: Bereiten Sie immer eine frische Lösung für das Faserspinnen vor.
   3. Um 7:3 HFIP/H₂O herzustellen, mischen Sie 700 μl 1,1,1,3,3,3-hexafluroro-2-propanol (HFIP) mit 300 μl Reinstwasser vom Typ 1, um 1 ml-Lösung herzustellen. Bereiten Sie die Lösung bei Bedarf frisch vor.
      ACHTUNG: Behandeln Sie HFIP in einem Abzug und vermeiden Sie Einatmen oder Hautkontakt.
   4. Zur Herstellung von 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) nehmen Sie 800 ml entionisiertes Wasser in ein Becherglas und lösen Sie 1,199 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄- MW. 136,09 g/mol) und 7,173 g zweibasisches Kaliumphosphat (K₂HPO₄- MW. 174,18 g/mol) enthalten. Mischen Sie alle Komponenten gründlich und stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit NaOH oder HCl ein. Füllen Sie das Volumen auf 1 l mit entionisiertem Wasser auf und lagern Sie es bei Raumtemperatur.
   5. Zur Herstellung von 10 mM Tris-Cl-Puffer (pH 8,0) lösen Sie 1,21 g Tris-Hydrochlorid (MW. 157,60 g/mol) in 800 mL entionisiertem Wasser. Passen Sie den pH-Wert mit NaOH an und füllen Sie das Endvolumen auf 1 l mit deionisiertem Wasser auf. Lagern Sie die Lösung bei Raumtemperatur.
   6. Zur Herstellung von 20 mM Na-Acetat-Puffer (pH 5,0) werden in 450 mL entionisiertem Wasser 0,55 g Natriumacetat (MW. 82,03 g/mol) und 0,02 M (6 mL) Essigsäure gelöst. Füllen Sie das Volumen auf 500 mL mit entionisiertem Wasser auf und lagern Sie es bei Raumtemperatur.
   7. Zur Herstellung von 1 M Citratphosphatpuffer (pH 7,0) werden 11,69 g Dinatriumhydrogenphosphat (Na₂HPO₄- MW. 141,96 g/mol) und 1,85 g Zitronensäure (MW. 192,12 g/mol) in 400 ml entionisiertem Wasser gelöst. Passen Sie den pH-Wert der Lösung mit HCl oder NaOH an und stellen Sie das Endvolumen mit deionisiertem Wasser auf 500 mL ein.
   8. Um die 98%ige Ameisensäure-CaCl_2-Lösung herzustellen, verdünnen Sie Ameisensäure auf 98 %, indem Sie 98 ml Ameisensäure mit 2 ml deionisiertem Wasser mischen, um insgesamt 100 ml Lösung zu erhalten. Fügen Sie nun 4 g CaCl₂ zu 100 ml 98%iger Ameisensäurelösung hinzu, um 4% w/v Ameisensäure-CaCl_2-Lösung herzustellen. Lagern Sie die Lösung bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Siehe Tabelle 1. Nur die Lösungsmittel, die das Protein auflösen und eine ausfallfreie und klare Dope-Lösung ergeben, sollten für Versuche des Faserspinnens verwendet werden.
2. Herstellung von Faserspinn-Dope-Lösung
   1. Wiegen Sie das lyophilisierte Spinnenseidenprotein entsprechend der gewünschten Konzentration (z. B. 10 mg für eine 10%ige Lösung in 100 μl Lösungsmittel) und mischen Sie es mit dem entsprechenden Lösungsmittelvolumen (z. B. 100 μl für eine Konzentration von 10 % (w/v).
   2. Strudeln Sie die Mischung, bis sich das Proteinpulver vollständig im Lösungsmittel aufgelöst hat.
   3. Da die Löslichkeit von Spinnenseidenprotein je nach Lösungsmittel und Proteintyp variiert, beginnen Sie mit einer niedrigen Proteinkonzentration (10 % w/v) und erhöhen Sie die Konzentration allmählich (25-30 % w/v) nach Bedarf.
   4. Nach vollständiger Auflösung des Proteins ist die Viskosität der Dope-Lösung qualitativ zu beurteilen. Wenn die Dope-Lösung nicht viskos genug erscheint, erhöhen Sie allmählich die Proteinkonzentration, bis eine klare, viskose Lösung erhalten wird. Verwenden Sie Wasser als Referenzstandard.

Lösungsmittel	Proteinkonzentration (% - w/v)	Referenz
8:1:1 TFA/TFE/H2Ω	10 – 25	19
3:1:1 TFA/TFE/H2Ω	10 – 30	26
7:3 HFIP/H2Ω	15 – 30	31
50 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,5)	10 – 25	50
10 mM Tris-Cl-Puffer (pH 8,0)	10 – 20	34
20 mM Na-Acetat-Puffer (pH 5,0)	10 – 25	49
1 M Citratphosphat-Puffer (pH 7,0)	10 – 25	51
98% Ameisensäure – CaCl2	20 – 25	52

Tabelle 1: Empfohlene Lösungsmittel und Proteinkonzentrationen für die Herstellung von Faserspinnmitteln.

2. Faserspinnen und -sammlung

HINWEIS: In Abbildung 2 finden Sie eine schematische Darstellung der Handzeichnung und in Abbildung 3 die verschiedenen unten beschriebenen Nassspinngerätekonfigurationen.

Abbildung 2: Handzeichnung von Spinnenseidenfasern. (A) Ein C-förmiger Papierrahmen wird vorbereitet und mit transparentem Klebeband auf der linken Seite und doppelseitigem Klebeband auf der rechten Seite befestigt, um das Ziehen von Fasern von links nach rechts zu ermöglichen. (B) Ein Tropfen Spinnmittel wird auf das transparente Band aufgebracht, und eine einzelne Faser wird mit einer Kunststoffpipettenspitze über die Öffnung des C-förmigen Rahmens von Hand auf das doppelseitige Klebeband gezogen. (C) Die Faser wird mit Klebeband auf der linken und rechten Seite am Papierrahmen auf dem Objektträger befestigt. (D,E) Demonstration eines repräsentativen (D) Handziehverfahrens für eine rekombinante Spinnenseide, die effektiv in einem Spindope solubilisiert wurde, und (E) die resultierende Faser, bevor sie mit Klebeband gesichert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Nassspinnen von Spinnenseidenfasern. In allen Fällen wird das Spinnmittel in eine luftdichte Glasspritze gegeben und mit einer Spritzenpumpe mit einer konstanten Geschwindigkeit durch eine stumpfe Metallnadel (d. h. die Spinndüse) in ein Gerinnungsbad (z. B. 95 % Ethanol) extrudiert. (A) Die gesponnenen Fasern werden auf der Walze 1 gesammelt und drehen sich computergesteuert mit einer Geschwindigkeit, die der Extrusionsgeschwindigkeit entspricht. (B) Das Dehnen nach dem Schleudern in Luft wird erreicht, indem Fasern über die Walze 1 geführt und auf der Walze 2 gesammelt werden, die sich mit einem Vielfachen der Geschwindigkeit von Walze 1 dreht (z. B. die doppelte Geschwindigkeit für ein 2-faches Zugverhältnis). In ähnlicher Weise können Fasern (C) nach dem Eintauchen in Lösungsmittel (z. B. 40 % Ethanol, Wasser usw., je nach geeigneter für eine gegebene Seide) hergestellt werden, indem Fasern von Walze 1 zu Walze 3 geführt werden (in ein Lösungsmittelbad eingetaucht und mit der gleichen Geschwindigkeit wie Walze 1 rotierend), bevor sie auf Walze 2 geführt werden (rotierend mit einem Vielfachen der Geschwindigkeit der Walzen 1 und 3); oder (D) in Lösungsmittel durch Führen von Fasern von Walze 1 zur Walze 3 (in ein Lösungsmittelbad getaucht und mit der gleichen Geschwindigkeit wie Walze 1 rotierend) und dann zu Walze 4 (ebenfalls in Lösungsmittel eingetaucht und mit einem Vielfachen der Geschwindigkeit der Walzen 1 und 3 rotierend), bevor sie sich auf Walze 2 sammeln (Geschwindigkeit entspricht der von Walze 4). Der modulare Aufbau bedeutet, dass verschiedene Permutationen in den Faserspinnbedingungen leicht getestet werden können, sicherlich nicht auf die vier hier schematisch gezeigten beschränkt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Handzeichnung
   1. Bereiten Sie einen C-förmigen Papierrahmen mit einem Fenster von 1 cm x 0,5 cm (L x B) vor und legen Sie ihn auf einen Objektträger (Abbildung 2). Befestigen Sie den oberen Teil des Papierrahmens mit Klebeband am Objektträger. Befestigen Sie transparentes Klebeband an einem Arm des Papierrahmens, um eine hydrophobe Oberfläche für die Abscheidung der Dope-Lösung zu schaffen, und befestigen Sie doppelseitiges Klebeband am gegenüberliegenden Arm zur Fasersicherung.
   2. Geben Sie 10-20 μl rotierende Dope-Lösung bei Raumtemperatur (22 ± 2 °C) auf das transparente Band.
   3. Tauchen Sie eine 200-μl-Pipettenspitze aus Kunststoff in den Tropfen der Dope-Lösung und ziehen Sie sie mit einer konstanten Geschwindigkeit (~6 mm/s) vertikal aus der Lösung, so dass die Fasern aus der Lösung gezogen werden können.
   4. Führen Sie die handgezogene Faser über das Rahmenfenster und befestigen Sie sie auf dem doppelseitigen Klebeband. Trocknen Sie die Faser bei Raumtemperatur an der Luft und befestigen Sie dann beide Enden der Fasern mit zusätzlichem Klebeband.
   5. Fokussierung auf den Teil der Faser, der den Papierrahmen für die anschließende Charakterisierung überspannt.
2. Nass-Schleudern
   1. Bau einer Nassspinnvorrichtung, wobei die hier beschriebene Vorrichtung im Vergleich zu früheren Iterationen verbesserte Motorsteuerungsfähigkeiten aufweist^31,38.
      1. Stellen Sie eine steife Metallmontageplatte her, die vertikal gehalten und mit einer geeigneten Konfiguration bearbeitet wird, um einen Satz Schrittmotoren zu befestigen (siehe Abbildung 3). Jede Motorhalterung erfordert Löcher, die gebohrt werden, um eine sichere Verschraubung der Schrittmotoren auf der Rückseite der Montageplatte zu ermöglichen (d. h. vier Löcher in angemessenem Abstand und Größe) und ein fünftes Loch, durch das die Motorwelle hindurchgeführt werden kann.
      2. Wählen Sie bipolare Schrittmotoren mit einem Schritt von 1,8°, einem Haltemoment von 45 N∙cm, einer Länge von 24 mm und einer Welle mit einem Durchmesser von 5 mm mit einem 15 mm langen "D"-Schnitt, einem Gehäuse von 39 mm, einem Nennstrom von 1,50 A und einem Phasenwiderstand von 2,3.
      3. Entwicklung eines Systems zur Steuerung der Geschwindigkeit und Drehrichtung für jeden Motor, wie es zuvor für eine Vielzahl von Seidenfasertypen 17,53,54 verwendet wurde, das eine in Python codierte grafische Benutzeroberfläche (GUI) für einen Raspberry Pi verwendet, der mit mehreren Schrittmotorsteuerungen verbunden ist, wie in https://github.com/raineylab/MotorController.git beschrieben.
      4. Zum Spinnen ist jeder Motor, der in einer bestimmten Spinnkonfiguration verwendet wird, an einem bearbeiteten Metallzylinder anzubringen (Durchmesser 6 cm, Länge 8 cm für die Zylinder in den Positionen 1 und 2 in Abbildung 3, gerillte Rollen mit einem Durchmesser von 9 cm an beiden Enden, die sich in der Mitte der Walze auf einen Durchmesser von 6 cm verjüngen, Länge von 7 cm in den Positionen 3 und 4 in Abbildung 3; siehe z. B. Abbildung 4 für die Beispielkonfiguration).
      5. Verwenden Sie für die Spinndüse (Abbildung 3) eine 0,25-ml-Glasspritze mit einer fest angebrachten Metallnadel mit stumpfem Ende (Innendurchmesser 0,127 mm), die in einer Spritzenpumpe montiert ist, die das Spindope mit einer kontrollierten Geschwindigkeit in ein Gerinnungsbad extrudiert.
   2. Zentrifugieren Sie die Dope-Lösung bei 20.000-21.000 × g für 30 min bei Raumtemperatur und sammeln Sie den Überstand für das Faserspinnen.
      HINWEIS: Entfernen Sie Restpartikel, um ein Verstopfen der Extrusionsnadel während des Nassschleuderns zu verhindern.
   3. Laden Sie 50-80 μl rotierende Dope-Lösung in die Spritze, die als Spinndüse dient.
   4. Befestigen Sie die Spritze in einer Spritzenpumpe und stellen Sie die Extrusion auf eine Geschwindigkeit von 600 μL/h ein.
      HINWEIS: Passen Sie die Extrusionsrate an und optimieren Sie sie, um die Faserbildung für eine bestimmte Proteinspinn-Dope-Bedingung zu ermöglichen.
   5. Bereiten Sie ein Koagulationsbad vor (95 % Ethanol/5 % deionisiertes Wasser, v/v).
   6. Positionieren Sie die Spritzenpumpe so, dass die Nadel der Spritze mit der Dope-Lösung in das Gerinnungsbad eingetaucht ist.
   7. Befestigen Sie die Rolle(n) an der Spinnvorrichtung, stellen Sie die Walzendrehzahl mithilfe der Motorsteuerungssoftware ein und schalten Sie die Motoren ein, die für eine bestimmte Spinnkonfiguration erforderlich sind.
      HINWEIS: Passen Sie die Rotationsrate von Walze 1 an die Extrusionsrate an. Extrusionsraten von 400 μL/h oder 600 μL/h entsprechen 6 U/min oder 9 U/min für Walze 1. Wenn ein Post-Spin-Draw durchgeführt wird, müssen eine oder mehrere Rollen 2-4 so eingestellt werden, dass sie sich entsprechend schneller drehen.
   8. Starten Sie die Spritzenpumpe und führen Sie die Faser, die sich im Gerinnungsbad bildet, mit einer Pinzette auf eine der folgenden Arten.
      1. Um AS-Fasern zu sammeln, führen Sie die im Koagulationsbad gebildete Faser zur Sammlung auf die erste Walze (Geschwindigkeit gleich der Extrusionsrate).
      2. Um das Strecken nach dem Schleudern an der Luft durchzuführen, stellen Sie die Rotationsrate von Rolle 2 auf ein Vielfaches der Rotationsrate von Rolle 1 ein. Führen Sie die Faser aus der Koagulation über Walze 1 ohne Schlaufe um Walze 1 und sammeln Sie sie auf Walze 2.
         HINWEIS: Ein Nachschleudungszugverhältnis von 2x erfordert, dass die Rotationsrate für Walze 2 doppelt so hoch ist wie für Walze 1; 3x, dreifach; und so weiter.
      3. Um eine Nachspinndehnung nach dem Eintauchen in Lösungsmittel durchzuführen, füllen Sie das Lösungsmittelbad mit dem gewünschten Lösungsmittel (z. B. entionisiertes Wasser; 2:3 V/V Ethanol/H₂O; etc.) und führen Sie die Faser aus dem Koagulationsbad um die Walze 1 (Rotationsgeschwindigkeit abgestimmt auf die Extrusionsrate), um die Walze 3 (Rotationsrate gleich Walze 1) im Lösungsmittelbad, und sammeln Sie die Faser auf der Walze 2 an der Luft (die sich schneller dreht als die Rollen 1 und 3).
         HINWEIS: Die Rotationsrate der Walze 2 relativ zu den Rollen 1 und 3 bestimmt das Nachschleudern des Zugverhältnisses wie in Schritt 2.2.8.2.
      4. Um das Nachspreizen in Lösungsmittel durchzuführen, füllen Sie das Lösungsmittelbad mit dem gewünschten Lösungsmittel (z. B. entionisiertes Wasser; 2:3 V/V Ethanol/H₂O; etc.) und führen Sie die Faser aus dem Koagulationsbad um die Walze 1 (Rotationsgeschwindigkeit abgestimmt auf die Extrusionsrate), um die Walze 3 (Rotationsrate gleich Walze 1) im Lösungsmittelbad, um Walze 4 im Lösungsmittelbad (Rotationsgeschwindigkeit ein Vielfaches der der Walzen 1 und 3) und sammeln Sie die Faser auf Walze 2 in Luft (Rotationsrate abgestimmt auf Walze 2).
         HINWEIS: Die Rotationsgeschwindigkeit der Rollen 2 und 4 relativ zu der der Rollen 1 und 3 bestimmt das Nachschleudern des Zugverhältnisses wie in Schritt 2.2.8.2.
         Sammeln Sie Fasern unter kontrollierten Umgebungsbedingungen, um den Einfluss von Feuchtigkeit und Temperatur auf das Faserverhalten zu vermeiden. Wir streben eine relative Luftfeuchtigkeit von ~ 28,2 ± 2,4% und eine Temperatur von ~ 28,0 ± 2,2 °C an.

Abbildung 4: Wichtige Schritte beim Nassspinnen von Spinnenseidenfasern. (A) Spinnen Sie die Dope-Extrusion in ein Koagulationsbad, gefolgt von der Fasersammlung (das rote Rechteck links markiert die Nadel, die für die Dope-Extrusion verwendet wird, das rote Rechteck rechts ist der Weg der nassgesponnenen Seidenfaser. (B) Illustration der Faser, die nach dem Spin in der Luft gedehnt wird (rotes Rechteck zur Führung des Auges). (C) Illustration der Dehnung der Faser nach dem Eintauchen in Wasser (rotes Rechteck zur Führung des Auges). (D) Kontinuierliche rekombinante Seidenfaser, die auf einer Walze gesammelt wird (z. B. gespulte Faser am roten Pfeil). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Optisch-mikroskopische Auswertung von Fasern

1. Faser-Montage
   1. Erstellen Sie einen C-förmigen Papierhalter, indem Sie ein 1 x 1 cm großes Quadrat aus einem 3 x 2 cm großen rechteckigen Blatt Papier ausschneiden (Abbildung 5).
   2. Befestigen Sie den C-förmigen Halter mit Klebeband an einem Glasobjektträger.
   3. Kleben Sie zwei Stücke doppelseitiges Klebeband auf beiden Seiten des 1 cm Spalts des C-förmigen Papierhalters an.
   4. Entfernen Sie eine Faser von der Walze, auf der sie gesammelt wurde, und schneiden Sie ein ca. 2 cm langes Segment ab.
      HINWEIS: Vermeiden Sie beim Umgang mit Fasern den Einsatz übermäßiger Kraft, um Materialverformungen oder andere Veränderungen der Eigenschaften zu vermeiden.
   5. Platzieren Sie das Fasersegment oben auf dem doppelseitigen Klebeband und stellen Sie sicher, dass die Längsachse der Faser parallel zur Unterkante des Halters ausgerichtet ist (Abbildung 5).
   6. Befestigen Sie die Faser mit Kreppband auf beiden Seiten auf doppelseitigem Klebeband.
   7. Befestigen Sie ein zusätzliches Stück Kreppband, um die Unterseite des Papierhalters fest an der Glasschiene zu befestigen und ein Verrutschen der Faser bis zum Gebrauch zu verhindern.
   8. Lagern Sie die montierten Fasern in einer Objektträger-Aufbewahrungsbox, bis sie für die Bildgebung und Zugprüfung verwendet werden.
2. Durchmesserbestimmung und Fehlerbewertung
   1. Untersuchen Sie die eingefassten Fasern mit dem Lichtmikroskop. Prüfen Sie zunächst die gesamte Länge der Faser auf sichtbare Unvollkommenheiten wie Einschnürungen, Verdrehungen, Wölbungen oder Doppelfasern. Wenn Defekte festgestellt werden, schließen Sie diese Fasern von der mechanischen Prüfung aus.
   2. Bei Fasern, die fehlerfrei erscheinen, machen Sie drei Mikroskopaufnahmen mit 10-facher Vergrößerung entlang der Längsachse der Faser, eine in der Mitte und eine in der Nähe jedes Faserendes.
   3. Messen Sie den Faserdurchmesser mit der ImageJ^55-Software :
      1. Gehen Sie in ImageJ zum Menü Analysieren und wählen Sie Maßstab festlegen (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S1). Stellen Sie die Skala entsprechend den Kalibrierungseinstellungen des Mikroskops ein und stellen Sie die Maßeinheit auf Mikrometer (μm) ein (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S2).
      2. Zeichnen Sie mit dem Linienwerkzeug eine gerade Linie senkrecht zur Längsachse der Faser, die sich von einer Kante der Faser zur anderen Kante erstreckt.
      3. Messen Sie für jede Mikroskopaufnahme den Faserdurchmesser an sechs verschiedenen Bereichen entlang der Faser.
      4. Nachdem Sie jede Linie gezeichnet haben, klicken Sie im Menü Analysieren auf Messen, um den Faserdurchmesser anzuzeigen (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S3).
3. Qualitative Beurteilung der molekularen Ausrichtung durch Polarisationsmikroskopie
   1. Verwenden Sie die Polarisationslichtmikroskopie, um die molekulare Ausrichtung innerhalb der Faser nach der Durchmesser- und Defektbewertung durch optische Mikroskopie zu bewerten.
      1. Untersuchen Sie die Faser mit einem inversen optischen Mikroskop, das mit einem drehbaren Tisch, einem festen Analysatorschieber und einem um 90° drehbaren Polarisator ausgestattet ist.
      2. Platzieren Sie die Faser in einem Winkel von ca. 45° relativ zum einfallenden planpolarisierten Licht, um die Helligkeit aufgrund der Doppelbrechung zu maximieren und die Sichtbarkeit der Molekülstruktur zu verbessern.
      3. Nehmen Sie unter diesen Bedingungen ein Bild der Faser auf, um ihre Doppelbrechung zu bewerten.
         HINWEIS: Eine hohe Doppelbrechung deutet auf eine gut ausgerichtete Molekülstruktur hin, während eine niedrige oder keine Doppelbrechung auf eine amorphere oder zufällig orientierte Struktur hindeutet.

Abbildung 5: Montage einer Spinnenseidenfaser auf einem Objektträger, der eine nachgelagerte Analyse mit einem C-förmigen Papierhalter und einer Reihe von Klebebandschichten ermöglicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Zugversuch

ANMERKUNG: Ein Zugprüfgerät, das für die genaue Bewertung von Seidenfasern geeignet ist, kann ohne weiteres zu relativ geringen Kosten hergestellt werden^25,56. Kurz gesagt, stellen Sie ein Paar Edelstahlklemmen her, um ein festes Greifen jedes Endes jeder Faser in einem C-förmigen Rahmen zu ermöglichen, der getestet wird (z. B. Abbildung 6). Befestigen Sie eine dieser Klemmen an einem Gewicht auf einer Analysenwaage und die andere an einer Spritzenpumpe. Die Spritzenpumpe muss so konfiguriert sein, dass sie ein konstantes Ziehen mit einer festgelegten Dehnungsrate ermöglicht. Die Analysenwaage muss mit einem Computer verbunden sein, um protokollierte Gewichts-/Massendaten in Abhängigkeit von der Zeit zu erfassen.

Abbildung 6: Schematische Darstellung der vorbereitenden Schritte für den Zugversuch. (A) Der Papierhalter mit Faser (Konfiguration siehe Abbildung 5 ) wird vom Objektträger gelöst und mit einem an einem Gewicht befestigten Clip vertikal montiert. (B) Diese gewichtete Klemme wird auf die Analysenwaage aufgesetzt, und der obere Teil des Papierhalters ist an einer Klemme befestigt, die an einem Stab befestigt ist, der fest in einer Spritzenpumpe befestigt ist. Der Papierhalter wird in der Mitte horizontal geschnitten, bevor mit dem Zugversuch begonnen wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Datenerfassung von Spannungs-Dehnungs-Kurven
   1. Nach der Messung des Faserdurchmessers ist ein Zugversuch an derselben Faser mit einem selbstgebauten Gerät durchzuführen (Abbildung 6).
      1. Lösen Sie den C-förmigen Papierrahmen, der die Faser hält, von der Glasschiene und befestigen Sie ihn an einer Klemme, die an einem Gewicht befestigt ist (Abbildung 6A).
      2. Verbinden Sie die Analysenwaage mit der Datenerfassungs-/Steuerungssoftware und navigieren Sie zur Workbench (Ergänzungsdatei 1 - Ergänzende Abbildung S4).
      3. Richten Sie das Experiment in der Software zur Steuerung der Waage ein, indem Sie auf die Schaltfläche Start klicken. Geben Sie den Namen des Experiments ein, wenn Sie dazu aufgefordert werden (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S5).
      4. Stellen Sie sicher, dass die Analysenwaage leer ist, und setzen Sie die gewichtete Klemme mit der Faser darauf auf.
      5. Befestigen Sie die Oberseite des Papierrahmens an einer Klemme, die mit der Spritzenpumpe verbunden ist, und schneiden Sie eine Seite des Papierhalters ab, damit sich die Faser frei bewegen kann (Abbildung 6B).
         HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass beide Klemmen parallel zueinander stehen und dass die Faser in der Klemme bei einer Messlänge von 10 mm zentriert ist.
      6. Tarieren Sie die Waage, um die Masse des Gewichts und der Klemme auf Null zu setzen, drücken Sie die Run-Taste an der Spritzenpumpe und klicken Sie in der Waagensteuerungssoftware auf OK (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S6).
      7. Wenn die Faser reißt, drücken Sie Stopp an der Spritzenpumpe und die Ja-Taste in der Waagensteuerungssoftware (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S7), um das gemessene Gewicht als Funktion der Zeit zu protokollieren.
      8. Übertragen Sie Daten zur Verarbeitung in eine Tabellenkalkulation oder ein anderes geeignetes Datenverarbeitungssoftwarepaket. Kopieren Sie das Gewichts-Zeit-Datenprotokoll in die Zwischenablage und fügen Sie es in die bereitgestellte Tabelle für mechanische Prüfungen (Ergänzungsdatei 2) ein oder exportieren Sie die Daten als Textdatei und importieren Sie sie mit entsprechendem Parsing.
2. Datenverarbeitung von Spannungs-Dehnungs-Kurven
   HINWEIS: Das folgende Protokoll basiert auf der Tabelle für mechanische Prüfungen, die für die Verwendung in Microsoft Excel formatiert ist (Ergänzende Datei 2).
   1. Stellen Sie sicher, dass die experimentellen Parameter korrekt sind (Spalte C).
   2. Fügen Sie die Massenaufzeichnungen als Funktion der Zeit in die Tabelle ein (die "Nettomasse" in Spalte F). Wenn vor Beginn des Dehnens Massenwerte aufgezeichnet wurden, entfernen Sie diese Werte, indem Sie die entsprechenden Zellen löschen und die Daten nach oben verschieben. Wenn nach dem Bruch der Verbindungslinie Massenwerte aufgezeichnet wurden, löschen Sie diese Datenzellen.
   3. Füllen Sie die Indexwerte in Spalte E automatisch aus, indem Sie Inkremente von 1 hinzufügen, sodass die Gesamtzahl der Indizes mit der Gesamtzahl der gemessenen Massenwerte in Spalte F übereinstimmt.
   4. Skalieren Sie die Nettomasse neu, sodass diese bei 0 g beginnt und während des Streckexperiments zunimmt, indem Sie die anfängliche Nettomasse von jedem Nettomassenwert subtrahieren und diese Differenz mit -1 multiplizieren (Spalte G).
   5. Berechnen Sie die Änderung der Faserlänge bei jeder Messung, indem Sie den Messindex mit der Zugrate der Spritzenpumpe und der Zeitverzögerung zwischen den aufgezeichneten Massenmessungen multiplizieren (Spalte H).
   6. Berechnen Sie die technische Dehnung, indem Sie die Änderung der Faserlänge durch die ursprüngliche Länge dividieren (Spalte I).
      HINWEIS: Diese Berechnung gibt die technische Dehnung in mm/mm an. Um die technischen Dehnungswerte in % umzurechnen, multiplizieren Sie die Werte in Spalte I mit 100 %.
   7. Notieren Sie die Dehnbarkeit als maximalen technischen Dehnungswert (Zelle T3).
   8. Berechnen Sie die Kraft (in N), die erforderlich ist, um jede aufgezeichnete Längenänderung zu erreichen, indem Sie die Masse von g in kg umrechnen und mit der Standardgravitation (9,81 m/s²; Spalte J).
   9. Berechnen Sie die technische Spannung (in Pa), indem Sie die bei einem gegebenen Dehnungsgrad ermittelte Kraft durch die Faserquerschnittsfläche dividieren und mit ^10-6 multiplizieren, um sie in MPa umzuwandeln (Spalte K).
   10. Notieren Sie die maximal beobachtete Spannung als ultimative Spannung (Zelle U3) und die Bruchspannung als den endgültigen Spannungswert, der vor dem Faserbruch aufgezeichnet wurde (Zelle V3).
   11. Berechnen Sie die Fläche unter der Spannungs-Dehnungs-Kurve, um die Zähigkeit zu erhalten, indem Sie die Trapezregel verwenden, um die Fläche unter der Kurve nach jeder Messung zu berechnen (Spalte L). Addieren Sie diese Bereiche, um die Zähigkeit (Zelle W3) zu ermitteln.
   12. Berechnen Sie den Elastizitätsmodul (in MPa), indem Sie die Steigung des anfänglichen linearen Bereichs der Spannungs-Dehnungs-Kurve mit der Funktion LINEST bestimmen. Konvertieren Sie in GPa, indem Sie mit 10³ multiplizieren (Zelle X3).

5. Fourier-Transformations-Infrarot-Spektromikroskopie (FTIR)

1. Bereiten Sie eine Probe für FTIR vor, indem Sie einen zweiten Objektträger an den Boden eines für die optische Mikroskopie vorbereiteten Objektträgers kleben.
2. Optische Bild- und FTIR-Spektralerfassung
   1. Füllen Sie den Dewar des Detektors mit flüssigem Stickstoff, um den Detektor zu kühlen.
   2. Öffnen Sie die FTIR-Gerätesteuerungssoftware.
   3. Öffnen Sie im Fenster Anzeigen und Sammeln (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S8) die Registerkarte Sammlung , stellen Sie den Erfassungsmodus auf ATR und den Detektor auf Gekühlt ein (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S9).
   4. Setzen Sie die Folie in den Folienhalter ein und platzieren Sie die Halterung auf der Bühne.
   5. Stellen Sie die obere Beleuchtung auf 100 und die Blende und die untere Beleuchtung auf 0 ein.
   6. Fokussieren Sie die Mitte des Sichtfelds für das optische Mikroskopbild der Probe auf die Faser, indem Sie entweder den physischen Joystick oder den digitalen Joystick in der Software verwenden, um die Position der Mitte des Sichtfelds und der Fokusebene zu steuern.
   7. Legen Sie den Sammlungsmodus auf Karte fest (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S8).
   8. Wählen Sie die Region aus, die mit dem Werkzeug Kartenansicht - Bereich abgebildet und gemessen werden soll. Klicken und ziehen Sie den Cursor, um den Bereich anzugeben, für den Spektren in der Vorschau des Mikrobildes aufgenommen werden sollen (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S8). Jeder Kreis auf dem Bild repräsentiert ein erfasstes Spektrum an dieser Position. Ändern Sie bei Bedarf die Kanten dieses Feldes, indem Sie den Cursor über eine bestimmte Feldkante bewegen und dann klicken und an die gewünschte Position ziehen. Verschieben Sie das gesamte Feld, indem Sie innerhalb des Rechtecks klicken und ziehen. Ändern Sie den Bereich des Quaders und die Anzahl der Datenpunkte unter Bühne, Blende und Anzeige (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S10).
   9. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Vorschau des Mikrobildes und wählen Sie Mosaik erfassen , um das Bild zu speichern (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S8).
   10. Stellen Sie den ATR-Druck ein, indem Sie auf das Dropdown-Menü Aktuelles Druckprofil klicken. Verwenden Sie für Proteinfasern einen Druck von 2 % (d. h. den niedrigstmöglichen ATR-Druck), um die Schädigung der Faser zu minimieren (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S8).
   11. Setzen Sie die ATR FTIR-Spitze ein.
   12. Klicken Sie auf die Schaltfläche Sammeln (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S8), um ein Hintergrundspektrum und dann das Spektrum an jedem der ausgewählten Punkte zu erfassen. Nachdem die Erfassung abgeschlossen ist, werden die Daten in einem neuen Fenster angezeigt.
3. Datenaufbereitung für die nachgelagerte Analyse
   1. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Heatmap oder das Mikrographenbild, um das Spektrum zu sehen, das an der entsprechenden Position aufgenommen wurde (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S11).
   2. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf ein zu analysierendes Spektrum und wählen Sie Kopieren (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S11).
   3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in die Windows-Leiste am oberen Bildschirmrand und wählen Sie Neues Fenster (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S11).
   4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Einfügen am oberen Bildschirmrand, wenn sich das neue Fenster öffnet (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S11).
   5. Verwenden Sie die gleiche Vorgehensweise zum Kopieren und Einfügen aller anderen Spektren, die für die Analyse in dieses Fenster gewünscht werden.
   6. Markieren Sie ein Spektrum oder mehrere Spektren, indem Sie die Strg-Taste drücken, während Sie auf jedes gewünschte Spektrum klicken, oder indem Sie die gewünschten Spektren im Dropdown-Menü markieren.
   7. Klicken Sie auf Speichern unter... und speichern Sie die Dateien als . spa-Dateien, um die Daten in der Spektrometersteuerungssoftware zu analysieren, oder als .csv, um die Daten in einem anderen Softwarepaket zu analysieren (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S12).
4. Zweite Derivateanalyse mit instrumentspezifischer Software
   1. Öffnen Sie die zu analysierenden Spektren in der gerätespezifischen Software für die Spektralverarbeitung und -analyse.
   2. Um zwischen den Modi % Durchlässigkeit und Absorption umzurechnen, verwenden Sie Strg+A (% Durchlässigkeit zu Absorption) oder Strg+T (Absorption zu % Durchlässigkeit).
   3. Wählen Sie den gewünschten Bereich aus, indem Sie auf Ansicht | Anzeigegrenzen (oder Strg+D) (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S13A). Um die Bänder von Amid I (1.700-1.600 ^cm-1) und Amid II (1.600-1.500 ^cm-1) anzuzeigen, legen Sie die Grenzwerte für die X-Achse für Start und Ende auf die entsprechenden Wellennummern fest. Wenn Sie mehr als ein Spektrum analysieren, wählen Sie Auf alle Spektren anwenden. Klicken Sie auf OK (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S13B).
   4. Um die zweite Ableitung zu plotten, klicken Sie auf Prozess | Ableitung... und wählen Sie Zweite aus dem Dropdown-Menü (Ergänzungsdatei 1 - Ergänzende Abbildung S14A). Wählen Sie eine Norris-Ableitung mit einer Segmentlänge von 5 und einer Lücke zwischen den Segmenten von 5 (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S14B). Die Minima des zweiten Ableitungsspektrums stimmen mit den Komponentenpeaks innerhalb des ursprünglichen Absorptionsspektrums überein.
      1. Wenn das Spektrum zu verrauscht ist, um die Minima auszuwerten, glätten Sie das Spektrum, indem Sie auf Prozess>Automatische Glättung klicken (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S15). Berechnen Sie dann die zweite Ableitung und finden Sie die Minima.
   5. Setzen Sie die Wellenzahlen an den Minima der zweiten Ableitung mit charakteristischen Bandenpositionen für Sekundärstrukturen in Beziehung, indem Sie eine Referenztabelle (z. B. Tabelle 2) verwenden, um Einblicke in die Sekundärstruktur des Proteins zu erhalten.
5. Peak-Dekonvolution mit gerätespezifischer Analysesoftware
   1. Setzen Sie den Anzeigebereich auf den Bereich, der wie in Schritt 5.4.3 entfaltet werden soll. Nur dieser Bereich wird entfaltet.
   2. Korrigieren Sie den ausgewählten Spektralbereich mit einer der folgenden Methoden:
      1. Klicken Sie auf Prozess | Automatische Baseline-Korrektur (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S16); oder
      2. Klicken Sie auf Prozess | Baseline Correct (Supplemental File 1 - Supplemental Figure S17A) und wählen Sie dann Linear aus dem Dropdown-Menü und geben Sie den Spektralbereich an, der im Positionsspektrum grundlinienkorrigiert werden soll, indem Sie auf die beiden Punkte klicken und diese ziehen, die die untere und obere Grenze des zu korrigierenden Bereichs für Dekonvolutionszwecke angeben. Wählen Sie anschließend im zweiten Dropdown-Menü die Option Zum Fenster hinzufügen und klicken Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S17B).
   3. Wenn das baseline-korrigierte Spektrum ausgewählt ist, klicken Sie auf Analysieren | Höchste Entschlossenheit... , um das Fenster Peak Resolve zu öffnen (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S18).
   4. Wählen Sie die zu analysierenden Spektren und Kurven über die Auswahlleiste auf der linken Seite des Bildschirms aus.
   5. Wählen Sie Gauß/Lorentzian mit einer Empfindlichkeitseinstellung von Niedrig und einer FWHH-Einstellung von 2 auf der Registerkarte Peaks suchen und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Peaks suchen (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S19).
   6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Peaks , um eine Tabelle mit einer Beschreibung der Peaks zu öffnen.
      1. Wenn mehr Peaks ausgewählt wurden, als physikalisch sinnvoll sind, klicken Sie auf Peak löschen , bis die richtige Anzahl von Peaks für die Analyse erhalten wurde (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S20). Für die Amid-I-Region werden beispielsweise in der Literatur typischerweise 5-11 Peaks berichtet (Tabelle 2).
      2. Um sicherzustellen, dass alle Peaks nach der Anpassung positiv sind, klicken Sie auf Peak bearbeiten und legen Sie das Höhenminimum auf 0 fest. Klicken Sie dann auf Weiter und wiederholen Sie den Vorgang für jeden Peak, gefolgt von OK , um das Bearbeitungsfenster zu schließen (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S21).
      3. Wenn es bestimmte Wellennummern gibt, die in der endgültigen Entfaltung vorhanden sein müssen, klicken Sie auf Peak bearbeiten und fixieren Sie den Peak-Mittelpunkt auf die im Feld Wert angegebene Wellenzahl, indem Sie Fest auswählen, oder geben Sie einen Bereich mit den Feldern Unterer Grenzwert und Oberer Grenzwert an. Klicken Sie auf OK , um diese Einstellungen auf den angegebenen Peak anzuwenden.
         HINWEIS: In diesem Schritt ist es optimal, Peakpositionen zu verwenden, die während der zweiten Ableitungsanalyse gefunden wurden, oder Peaks aus einer Referenztabelle von FTIR-Sekundärstrukturen, die idealerweise für einen ähnlichen Seidenprobentyp annotiert sind (z. B. Tabelle 2).
   7. Klicken Sie auf die Schaltfläche Peaks anpassen (Ergänzungsdatei 1 - Ergänzende Abbildung S22).
      1. Wenn der Peak-Anpassungsalgorithmus nicht erfolgreich konvergiert, klicken Sie erneut auf Peaks anpassen , um die Anpassung der Peaks iterativ fortzusetzen.
   8. Klicken Sie auf die Schaltfläche Peaks... , um Informationen über Position, Höhe, FWHH und die Fläche aller Peaks zu erhalten, die angepasst wurden.
      1. Diese Peaks können in die Zwischenablage kopiert werden, indem Sie auf Zwischenablage klicken, um sie in ein anderes Fenster oder eine andere Datei einfügen zu können (Ergänzungsdatei 1 - Ergänzende Abbildung S23).
      2. Kopieren Sie Peaks und Spektren in ein anderes Fenster, indem Sie das Ziel im Dropdown-Menü der Fensterauswahl neben der Schaltfläche Hinzufügen auswählen (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S24).
      3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Alle auswählen und verwenden Sie Datei | Speichern unter , um die Peaks und Spektren als .spa- und/oder .csv-Dateien zu speichern (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S25).
   9. Beziehen Sie jeden Komponentenpeak mithilfe einer Referenztabelle auf eine Sekundärstruktur. Die relative Fläche von Peak(s), die einer gegebenen Sekundärstruktur entspricht, bezogen auf die Gesamtfläche aller zugewiesenen Peaks, liefert den Anteil des Proteins, der diese Sekundärstruktur aufweist.
6. Datenaufbereitung für die nachgelagerte Analyse mit Hilfe von Software von Drittanbietern
   1. Öffnen Sie eine Arbeitsmappe, und laden Sie die Spektraldaten in die Spektralverarbeitungs- und Analysesoftware eines Drittanbieters, indem Sie die Schaltfläche Daten | Mit Datei verbinden | Text/CSV (Ergänzungsdatei 1 - Ergänzende Abbildung S26). Wählen Sie die gewünschte Datei im Datei-Explorer aus und klicken Sie auf Öffnen.
   2. Plotten Sie das Spektrum, indem Sie die zu zeichnenden Spalten markieren und die Schaltfläche Plotten | Grundlegendes 2D | Zeilen-Menüpunkt (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S27).
   3. Doppelklicken Sie auf die x-Achse und verwenden Sie die Registerkarte Skala, um den Bereich an den Amide I-Peak anzupassen (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S28).
   4. Wenn die Daten sehr verrauscht sind, glätten Sie die Kurve, indem Sie die Schaltfläche Analyse | Signalverarbeitung>Glatt>Dialog öffnen... (Ergänzungsdatei 1 - Ergänzende Abbildung S29A).
      1. Setzen Sie die Option Neu berechnen auf Auto, die Methode auf Savitzky-Golay, die Punkte des Fensters auf 5, die Randbedingung auf Keine und die Polynomordnung auf 2 (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S29B).
      2. Klicken Sie zum Verarbeiten auf OK .
7. Zweite Ableitungsanalyse mit Software von Drittanbietern
   1. Wählen Sie den Menüpunkt Analyse | Mathematik | Differenzieren | Dialog öffnen... (Ergänzungsdatei 1 - Ergänzende Abbildung S30).
   2. Legen Sie die Option Neu berechnen auf Auto fest, setzen Sie die Ableitungsreihenfolge auf 2, wählen Sie die Option Ableitungskurve plotten , und klicken Sie auf OK (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S31).
   3. Wenn die resultierende zweite Ableitungskurve sehr verrauscht ist, führen Sie die Schritte 5.7.1 aus. und 5.7.2, indem Sie Savitzky-Golay Smooth auf der Registerkarte Smooth des Dialogfelds Differenzieren auswählen.
   4. Wie in 5.4.5 werden die Wellenzahlen an den Minima der zweiten Ableitung mit Sekundärstrukturen in Beziehung gesetzt.
8. Peak-Dekonvolution mit Software von Drittanbietern
   1. Nachdem Sie auf das Diagramm des Amid-I-Absorptionsspektrums geklickt haben, wählen Sie den Menüpunkt Analyse | Peaks und Baseline | Peak-Analysator | Dialog öffnen... (Ergänzungsdatei 1 - Ergänzende Abbildung S32).
   2. Legen Sie im Dialogfeld Ziel - Peaks anpassen (Pro) die Option Neu berechnen auf Auto fest, wählen Sie Peaks anpassen aus, und klicken Sie auf Weiter. (Ergänzende Akte 1 - Ergänzende Abbildung S33A).
   3. Legen Sie im Dialogfeld Basislinienmodus den Parameter Basislinienmodus auf Gerade Linie fest, und klicken Sie auf Weiter (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S33B).
   4. Wählen Sie im Dialogfeld "Baseline-Behandlung " die Option "Baseline automatisch subtrahieren", klicken Sie auf die Schaltfläche "Jetzt subtrahieren " und dann auf "Weiter " (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S33C).
   5. Deaktivieren Sie im Dialogfeld "Gipfel suchen " die Option "Automatische Suche aktivieren " und klicken Sie auf "Hinzufügen".
      1. Doppelklicken Sie auf das Fenster, das den Plot eines Spektrums mit den einzupassenden Peaks enthält.
      2. Wählen Sie die Peaks basierend auf den Minima aus, die in der zweiten Ableitung (Schritt 5.7.4) oder in Referenztabellen (z. B. Tabelle 2) beobachtet wurden.
      3. Klicken Sie auf Fertig und dann auf Weiter (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S33D).
   6. Wählen Sie im Dialogfeld Peaks anpassen (Pro) die Option Bericht aus aktuellem Anpassungsergebnis generieren aus, und klicken Sie auf Anpassen. gefolgt von Finish (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S33E).
   7. Werten Sie die Registerkarte PeakProperties1 der Arbeitsmappe aus, um den Mittelpunkt, den integrierten Bereich und den FWHM jedes Peaks anzuzeigen (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S34). Wie in Schritt 5.5.9 wird jeder Komponentenpeak mit einem Sekundärstrukturtyp in Beziehung gesetzt und der prozentuale Anteil der Proteinstruktur an dieser Sekundärstruktur bewertet.

Wellenzahlbereich (cm-1)	Zuweisung
Nr. 1605−1615	Tyr Seitenketten/Aggregierte β-Litzen
1616–1621	Aggregierte β-Stränge/Intramolekulare β-Faltblätter [schwach]
1622–1627	Intermolekulare β-Faltblätter [stark]
1628–1637	Intramolekulare β-Faltblätter [stark]
1638–1646	Exzenterspule/Verlängerte Ketten
1647–1655	Zufällige Spule
1656–1662	α-Helices
1663–1696	Drehungen
1697-1703	Intermolekulare β-Faltblätter [schwach]

Tabelle 2: Schwingungsbandzuordnungen in der Amid-I-Region für Bombyx mori-Seide basierend auf einer vergleichenden Auswertung mehrerer Studien von Hu et al.57.

Ergebnisse

Eine ideale spinnbare Dope-Lösung ist eine klare, niederschlagsfreie und viskose Lösung, die auf eine vollständige Proteinauflösung hinweist (Abbildung 7A). Umgekehrt führt eine unvollständige Auflösung entweder zu einer milchigen Suspension oder zu sichtbaren Ausfällungen (Abbildung 7B,C). Die Zeit, die für eine vollständige Proteinauflösung erforderlich ist, variiert je nach Lösungsmittel, wobei einige Lösungsmittel, wie TFA/TFE/H₂O-Gemische, das Protein typischerweise innerhalb eines Zeitintervalls von 30 Minuten vollständig auflösen, während andere, wie z. B. HFIP, neben gelegentlichem Vortexen auch ein Rühren über Nacht erfordern können.

Abbildung 7: Optimierung der Spinning-Dope-Lösung. (A) Ein Lösungsmittel, das in der Lage ist, das Protein vollständig aufzulösen, ergibt eine klare und viskose spinnbare Dope-Lösung. Eine teilweise Auflösung oder Suspension des Proteins durch eine nicht optimale Lösungsmittelwahl kann zu (B) einem übermäßig viskosen Zustand, normalerweise mit sichtbarem Niederschlag, oder (C) einer milchigen Suspension führen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2E zeigt eine repräsentative handgezogene Faser, während Abbildung 4D eine gespulte nassgesponnene Faser zeigt. Vor jeder nachgelagerten Analyse ist die optische Mikroskopie unerlässlich, um die Faserqualität zu bewerten. In Abbildung 8 sind repräsentative optische Mikroskopaufnahmen von nassgesponnenen rekombinanten Seidenfasern dargestellt, die für die nachgelagerte Analyse geeignet sind und unter zwei verschiedenen Bedingungen gesponnen wurden (siehe Abbildung 3 für Proben-Nassspinnkonfigurationen). Durch die optische Mikroskopie (Abbildung 8A) wird deutlich, dass diese Fasern einen gleichmäßigen Durchmesser aufweisen, wobei ein verringerter Durchmesser bei Anwendung eines Nachspinzugs sichtbar wird (d. h. as-gesponnen (AS) vs. nachgesponnen, gestreckt in einem 4-fachen Verhältnis in 40 % Ethanol (4x-EtOH)). Der höhere Grad an Doppelbrechung, der zu einem größeren Kontrast in der Polarisationsmikroskopie führt (Abbildung 8B), steht im Einklang mit einer verbesserten molekularen Ausrichtung in der Faser als Ergebnis des Post-Spin-Draw-Prozesses. Schließlich sollte beachtet werden, dass Defekte höchstwahrscheinlich in einem Teil der bewerteten Fasern beobachtet werden, wodurch ein bestimmtes Fasersegment für die nachgelagerte Analyse ungeeignet ist. Zwei solcher Beispiele sind in Abbildung 9 dargestellt.

Abbildung 8: Repräsentative optische Mikroskopaufnahmen von nassgesponnenen rekombinanten Spinnenseidenfasern. Fasern im AS-Zustand und nach einer 4-fachen Post-Spin-Dehnung in Ethanol (EtOH) sind für ein chimäres pyriform-aciniformes Seidenkonstrukt (Py₂W₂) dargestellt, das mittels optischer Mikroskopie (linke Spalte) und polarisierter Lichtmikroskopie (rechte Spalte) beobachtet wurde. Die Bilder werden mit Genehmigung von Ghimire et ^al.17 reproduziert. Maßstabsleisten = 30 μm. Abkürzungen: AS = as-spun; EtOH = Ethanol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 9: Beispiel für potentielle Faserdefekte, die mit Hilfe der optischen Mikroskopie beobachtbar sind. (A) Ein Beispiel für einen "gewölbten" Defekt. (B) Ein Beispiel für einen "Einschnürungs"-Defekt. Maßstabsbalken = 20 μm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Nach der Sicherstellung, dass in einem bestimmten Fasersegment keine Defekte vorhanden sind, und nach der Durchmesserbestimmung (Protokollabschnitt 3.2) kann ein Zugversuch durchgeführt werden (z. B. Abbildung 6). Repräsentative Spannungs-Dehnungs-Kurven, die für eine chimäre rekombinante Spinnenseide erhalten wurden, die unter verschiedenen Bedingungen gesponnen wurde, sind in Abbildung 10 dargestellt. Abhängig von den Spinnbedingungen reichen die resultierenden Fasern von spröde (AS-Zustand) über hochdehnbar mit ähnlicher Festigkeit wie der AS-Zustand (2x-Luftzustand) bis hin zu deutlich stärkeren und weniger dehnbaren Fasern (4x-EtOH-Zustand). Es ist zu beachten, dass mehrere Fasersegmente und Chargen von gesponnenen Fasern bewertet werden müssen, um das mechanische Verhalten eindeutig und streng zu beurteilen.

Abbildung 10: Repräsentative Spannungs-Dehnungs-Kurve von Fasern, die unter verschiedenen Bedingungen gesponnen wurden. Die Fasern wurden entweder im as-gesponnenen Zustand (AS) oder während der Produktion mittels automatisierter Nachspinndehnung analysiert (Ziehverhältnis und Streckbedingungen (Luft vs. Lösungsmittel) angegeben). Abbildung mit Genehmigung von Ghimire et al.(2024)¹⁷ angepasst. Abkürzung: AS = as-spun. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Schließlich kann die Sekundärstruktur des Faserzustands mit Hilfe der ATR-FTIR-Spektromikroskopie bewertet werden. Typische Seidenfaserspektren, die mit dieser Methode erfasst wurden (Abbildung 11A,B), hätten charakteristische Proteinbanden, einschließlich eines breiten Amid-A-Peaks (zentriert um ~3.300 cm-1), eines Amid-I-Peaks (~1.600-1.700 cm-1) und eines Amid-II-Peaks (~1.500-1.600 ^cm-1). Hier konzentrieren wir uns auf die Bewertung der Amid-I-Region (z.B. Abbildung 11C,D). Die zweite Ableitungsanalyse ist nützlich als Mittel zur Identifizierung von Schlüsselkomponenten des Amid-I-Peaks (Abbildung 11E,F) und verleiht der quantitativen Peak-Dekonvolution Glaubwürdigkeit (Abbildung 11G-J), die eine Bewertung und einen Vergleich der Anteile des Sekundärstrukturtyps ermöglicht, die in einer unter einer gegebenen Bedingung gesponnenen Seidenfaser beobachtet wurden.

Abbildung 11: FTIR-Spektren und Sekundärstrukturanalyse. (A,B) FTIR-Spektren von Py₂W₂ Fasern, die durch Nassspinnen im ( A) as-gesponnenen Zustand (AS) und (B) mit einer 4 Post-Spin-Dehnung in Ethanol hergestellt wurden. (C,D) Amide I-Regionen der FTIR-Spektren, die in A bzw. B gezeigt sind. (E-F) Zweite Ableitung der in C bzw. D gezeigten Amid-I-Regionen, berechnet mit dem angegebenen Softwarepaket. (G-J) Amide I Peak-Dekonvolution, die mit den Softwarepaketen (G und I) OMNIC oder (H und J) OriginPro durchgeführt wird, wobei die Felder G und I die Dekonvolution sind, die C und H und J bis D entspricht. Abkürzungen: FTIR = Fourier-Transformation Infrarot; AS = as-spun. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Über die einzelnen Techniken hinaus ist die Korrelation von Sekundärstrukturierung, mechanischer Leistung und (supra)molekularen Orientierungsdaten in der Regel sowohl für das Verständnis der Einflüsse verschiedener Spinnparameter auf das resultierende Material als auch für die rationale Optimierung des Spinnprozesses unerlässlich. In den in Abbildung 11 gezeigten FTIR-Dekonvolutionen, z. B. beim Vergleich der AS- mit 4×-EtOH-Bedingungen für eine chimäre Seide, sind wesentliche β-Blatt-Beiträge zur Amid-I-Bande für beide Bedingungen klar, umfassen jedoch einen größeren Anteil der gesamten Sekundärstruktur für den nachgesponnenen gedehnten Zustand relativ zum AS-Zustand, unabhängig von der Dekonvolutionsmethode (z. B. Abbildung 11G,H vs. Abbildung 11I,J). Dies stimmt sowohl mit der wesentlich höheren Festigkeit überein, die für den 4×-EtOH-Zustand als für den AS-Zustand beobachtet wurde (Abbildung 10), und mit der Verbesserung der molekularen Ausrichtung im 4×-EtOH-Zustand im Vergleich zum AS-Zustand (Abbildung 9). Über eine detaillierte Charakterisierung und Analyse, die den in Abbildung 10 gezeigten Bereich der Zustände abdeckt, wurde bereits berichtet¹⁷. Wir haben daher hier nicht die gesamte Analyse rekapituliert, sondern diesen paarweisen Vergleich als Demonstration der Art und Weise verwendet, in der diese drei Datenklassen einander ergänzen und die Entwicklung eines viel umfassenderen Verständnisses des Faserverhaltens ermöglichen als jede einzelne Technik.

Ergänzende Datei 1: Eine Datei mit den ergänzenden Abbildungen S1-S34, die die Messung des Faserdurchmessers, die mechanische Datenverarbeitung und die FTIR-Datenerfassung und -verarbeitung darstellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Eine Tabelle, die die Bestimmung der wichtigsten mechanischen Eigenschaften (d. h. Spannung, Dehnung, Elastizitätsmodul und Zähigkeit) aus Massen- und Zeitdaten ermöglicht. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die rekombinante Proteinproduktion ermöglicht das aufregende Potenzial zur Herstellung von Materialien in einer Vielzahl von Formaten, wobei die jüngsten Fortschritte darauf hindeuten, dass sich diese proteinbasierten Materialien einer breiteren industriellen Verwendung nähern⁵⁸. Hier haben wir uns auf die Faserherstellung aus rekombinanter Seide konzentriert, da dies das Format der rekombinanten Seide ist, das in direktem Zusammenhang mit nativer faseriger Spinnenseide steht. Seidenfasern wurden aufgrund der bekannten mechanischen Eigenschaften natürlicher Spinnenseide und des Potenzials, Hochleistungsfasern nachhaltig zu produzieren, zahlreiche potenzielle Anwendungen zugeschrieben³². Die vorgeschlagenen Anwendungen reichen von Hochleistungstextilien über energieabsorbierende Materialien bis hin zu Körperpflegeprodukten und Anwendungen im Gesundheitswesen^58,59. Auf Spinnenseide basierende Geräte und Materialien in tragbaren Formaten oder in anderen Kontexten, in denen die elektrische Leitfähigkeit verbessert wird, werden ebenfalls aktiv sowohl für die biomedizinische als auch für eine breitere Anwendung erforscht⁶⁰. Es besteht daher ein breites Interesse an der Entwicklung, Optimierung und Individualisierung von Spinnenseiden-basierten Materialien. In diesem Protokoll skizzieren wir eine Reihe von Verfahren, die darauf abzielen, die Faserproduktion zu beschleunigen, entweder nach der Herstellung eines neuen rekombinanten Seidenproteins oder zur Modulation der Materialeigenschaften einer rekombinanten Seide, die bereits als spinnbar erwiesen wurde.

Unabhängig von dem verwendeten Spinnverfahren ist es entscheidend, Bedingungen zu bestimmen, die die Spin-Dope-Produktion durch Screening der Lösungsmittel-/Pufferbedingungen und der Proteinkonzentration ermöglichen, wie hierin beschrieben. Das ultimative Ziel ist die Solubilisierung des Proteins in einer ausreichend hohen Konzentration, um eine schnelle Umwandlung in eine Faser zu ermöglichen, ohne dass es zu einer Selbstorganisation außerhalb des Signalwegs zu Aggregaten oder anderen unlöslichen Spezies kommt, die ein "produktives" Spinnen verhindern. Dabei handelt es sich typischerweise um eine transparente, relativ viskose Lösung, die höchstwahrscheinlich selbstorganisierte Spezies wie Mizellen/Nanopartikel^26,61 und/oder Flüssig-Flüssig-Phasentrennung⁶² umfasst. Dieses Protokoll beschreibt keine Methoden zur umfassenden Bewertung des Spin-Dope-Zustands, da ein erfolgreiches Faserspinnen durch iterative Bewertung verschiedener Spindope und Spinnkonfigurationen erreicht werden kann. Detaillierte molekulare und supramolekulare Einblicke in den Spin-Dope-Zustand können durch Techniken wie Viskosimetrie, Lichtstreuung, Fern-UV-Zirkulardichroismus-Spektroskopie, Kernspinresonanzspektroskopie und/oder Elektronenmikroskopie²⁶ erreicht werden. Es sollte auch beachtet werden, dass das rekombinante Protein selbst modifiziert werden kann, um sein Verhalten beim Spinnen zu verbessern, wobei die Einbeziehung der globulären nicht-repetitiven N- und C-terminalen Domänen ein Beispiel für ein Verfahren zur Erhöhung der Spidroin-Löslichkeit^{ist 32}. Kurz gesagt, ohne eine geeignete Identifizierung des Spindopes ist es nicht möglich, mit vergleichenden Tests der Spinnbedingungen fortzufahren.

Sobald eine oder mehrere Spin-Dope-Bedingungen identifiziert wurden, bietet das Handziehen einen schnellen Weg zur Bewertung der Seidenfasereigenschaften. Da für die produktive Handziehung wesentlich geringere Mengen an Dope benötigt werden, werden viel geringere Massen an reinem Protein benötigt, was dies zu einem hervorragenden Vorläufer für automatisierte Nassspinnansätze macht. Dies bietet auch ein sehr handhabbares und unkompliziertes Verfahren zum direkten Vergleich der Fasereigenschaften verschiedener Spidroine³³, wiederum mit dem Vorteil, dass die Faserproduktion mit kleinen Proteinmengen relativ einfach ist. Dies würde bedeuten, dass die Optimierung der Proteinexpressions- und Reinigungsprotokolle, um die für das Nassspinnen erforderlichen höheren Ausbeuten zu erzielen, auf die vielversprechendsten Spidroine konzentriert werden kann. Der Nachteil ist natürlich, dass das Handziehen weder für die Herstellung langer Endlosfasern noch für die rationelle Herstellung erheblicher Fasermengen geeignet ist.

Bei ausreichendem Proteingehalt bietet das Nassspinnen dann Vorteile für eine optimierte Produktion langer Endlosfasern³². Darüber hinaus können die Fasereigenschaften durch den Spinnprozess leicht moduliert werden. Die Wahl der Spinndope-Bedingungen bietet beispielsweise einen klaren Weg zur Verbesserung der Fasermechanik. Im Fall eines ~60 kDa rekombinanten aciniformen Seidenproteins führte beispielsweise der Wechsel von einem Spin-Dope zu einem anderen bei gleichbleibenden allen anderen Spinnparametern zu dramatischen Veränderungen der Faserdehnbarkeit²⁶. Dies wiederum war auf die Art und Weise zurückzuführen, in der sich das aciniforme Spidroin vor dem Spinnen in der Spindope assemblierte, wobei eine verbesserte Homogenität der selbstorganisierten Nanopartikel in der Spindope mit einer verbesserten Fasermechanik korrelierte. Die Einbeziehung eines Post-Spin-Draws, wobei darauf hingewiesen wird, dass das Draw-Verhältnis für einen gegebenen Fasertyp optimiert werden muss, verbessert typischerweise auch die Mechanik der Seidenfaser durch eine Kombination aus verbesserter molekularer Ausrichtung und verbesserter Umwandlung in beispielsweise β-Blatt-Kristallite, die die Fasern^{verstärken 32}. Schließlich bietet die Verwendung unterschiedlicher Bedingungen während der Nachziehphase nach dem Schleudern die Möglichkeit, die Fasereigenschaften zu modulieren. Die Exposition gegenüber dem Lösungsmittel unmittelbar vor oder während des Ziehens kann die mechanischen und strukturellen Eigenschaften der Faser erheblich verändern^17,38, wobei zu beachten ist, dass verschiedene Spidroine unterschiedliche Lösungsmittelpräferenzen und -toleranzen aufweisen (z. B. sind rekombinante aciniforme Fasern hochgradig wasserverträglich^26,31 im Vergleich zu rekombinanten pyriformen Fasern, die in Wasser eine Kontraktion durchlaufen³⁸ vs. Fasern von chimärem pyriform-aciniformen Spidroin, die die Wasserkompatibilität von aciniformen Spidroin aufweisen, obwohl dies weniger als die Hälfte der Masse des Proteins ausmacht¹⁷).

Das beschriebene Protokoll bietet einen hochgradig anpassbaren und vielseitigen Ansatz zur Bewertung und Optimierung der Spinnbarkeit und der Fasereigenschaften von rekombinanter Spinnenseide. In jedem Fall müssen die resultierenden Fasereigenschaften konsistent und robust analysiert und verglichen werden. Hier schlagen wir den Einsatz der optischen Mikroskopie, einschließlich Polarisationslichtmikroskopie, Zugprüfung und FTIR-Spektromikroskopie als "Standardwerkzeugkasten" für Techniken zu diesem Zweck vor. Zusätzliche biophysikalische und Materialcharakterisierungstechniken können angewendet werden, um das Verständnis der resultierenden Fasern zu erweitern, aber diese Techniken bieten eine hervorragende Abdeckung der Schlüsseleigenschaften der Morphologie, der intrafibrillären Ausrichtung/Anisotropie, der mechanischen Leistung und der sekundären Proteinstrukturierung. Obwohl die FTIR-Spektromikroskopie ein relativ einfaches Mittel zur Bewertung der Sekundärstrukturierung von Seidenfasern darstellt und die Polarisationslichtmikroskopie Rückschlüsse auf den Grad der erreichten verbesserten molekularen Ausrichtung zulässt, können andere Methoden wie die Festkörper-NMR-Spektroskopie^63,64, die Röntgenbeugung⁶⁴, die polarisierte Raman-Spektromikroskopie⁶⁵ und/oder die nichtlineare optische Mikroskopie⁵⁴ sollte in Betracht gezogen werden, um die Kristallinität, Ausrichtung und Strukturierung innerhalb von Seidenfasern umfassender zu bewerten und die Struktur-Mechanik-Beziehung vollständig aufzuklären. Angesichts der Eignung des Nassspinnens für andere Arten von Proteinen⁶⁶ gehen wir davon aus, dass dieses Protokoll über rekombinante Seide hinaus allgemein anwendbar ist.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,1,1,3,3,3-Hexafluroropropanol (HFIP)	Thermo Fisher Scientific 445820500		Wird für die Dope-Zubereitung
verwendet 1725LTSN Spritze mit zementierter Luer-Spitze	Hamilton	81100	Wird für das Nassspinnen
von 2,2,2-Trifluorethanol (TFE)	verwendetSigma-Aldrich	T63002-500G	Wird für die Dope-Aufbereitung
verwendet Absolutes Ethanol	Fisher Scientific	BP28184	Wird für Koagulationsbäder verwendet
Essigsäure	Fisher Scientific	A38-212	Wird für die Dope-Zubereitung
Analysenwaage	Mettler Toledo	XS105	Zweibereichs-Zugprüfgerät
Calciumchlorid (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C-3881	Wird für die Dope-Zubereitung
verwendet Zitronensäure	Millipore Sigma	77-92-9	Wird für die Dope-Vorbereitung
verwendet Computer	Raspberry Pi	Raspberry Pi 4 Modell B	Nassspinnende Abteilung - bietet die Möglichkeit, eine grafische Benutzeroberfläche zur Steuerung von Schrittmotoren zu verwenden
Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4)	Millipore Sigma	7558-79-4	Wird zur Dope-Zubereitung
verwendet Ameisensäure	Fisher Scientific	A118-500	Wird für die Dope-Vorbereitung
von Glasobjektträgern verwendet	Millipore Sigma	S8902-1PAK	Wird für die Fasermontage
Salzsäure (HCl)	EM Science	HX0603-53	Wird für die Dope-Vorbereitung
verwendet MCT-A Gekühlter Detektor	Thermo Fisher Scientific	840-199300	FTIR-Bewertung der Faser-Sekundärstruktur
Montageplatte	Eigengefertigtes		Nassspinngerät
NEMA 17 Biopolarer Schrittmotor	STEPPERONLINE	17HS15-1504S-X1	Nassspinngerät - Hinweis: Für die Durchführung des Post-Spin-Stretchings sind mehrere Motoren erforderlich
Nicolet iN10 FTIR-Spektromikroskop	Thermo Fisher Scientific	912A0604	FTIR-Bewertung der Faser-Sekundärstruktur
Nicolet iN10 Mapping Stage	Thermo Fisher Scientific	840-198800	FTIR-Bewertung der Faser-Sekundärstruktur
Nicolet iN10 Motorisierter Tisch-Joystick	Thermo Fisher Scientific	840-199800	FTIR-Bewertung der Faser-Sekundärstruktur
Nicolet Slide-On Ge Micro Tip ATR 350	Thermo Fisher Scientific	840-194800	FTIR-Bewertung der Faser-Sekundärstruktur
1.7.224	Thermo Fisher Scientific	INQSOF018	FTIR Software zur Gerätesteuerung
OMNIC Version 9.11.745	Thermo Fisher Scientific	INQSOF018	FTIR gerätespezifische Datenverarbeitungs- und Analysesoftware
Optisches/polarisiertes Lichtmikroskop	Zeiss Deutschland	Axio Observer A1	Inverses optisches
Mikroskop OriginPro 2025 10.2 SR1	OriginLab Corporation	OriginPro 10.200196	FTIR-Datenverarbeitungs- und Analysesoftware eines Drittanbieters
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)	Fisher	Scientific P285-10	Wird für die Dope-Zubereitung verwendet
Kaliumphosphat zweibasisch (K2HPO4)	Fisher Scientific	BP363-500	Wird für die Dope-Aufbereitung verwendet
Netzteil	ALITOVE	ALT-1205	Nassspinngerät - 12V 5A Netzteiladapter Konverter AC 100-240V Eingang mit 5,5x2,5mm DC Ausgangsbuchse - Hinweis: Für optimale Leistung kann für jeden Motor ein separates Netzteil erforderlich
Natriumacetat	Sigma-Aldrich	S2889-1KG	Wird für die Dope-Aufbereitung
verwendet Natriumhydroxid (NaOH)	Millipore Sigma	1310-73-2	Wird für die Dope-Aufbereitung
verwendet Spinnwalzen	Hergestellt im eigenen Haus		Wird für das Nassspinnen
Schrittmotorkabeln	verwendet XMSJSIY	B0BD5FV3R2	Nassspinngerät - ermöglicht die Verbindung von Schrittmotorsteuerungen zu Schrittmotoren
Schrittmotorsteuerung (Pi HAT)	Adafruit	DC & Schrittmotor HAT für Raspberry Pi	Nassspinngerät Motorsteuerung Permutation 1 - beachten Sie die begrenzte Motordrehzahl von ~46 U/min
Schrittmotorsteuerung (USB)	Polulu	Tic T249	Nassspinngerät Motorsteuerung Permutation 2 - verwenden, wenn eine Drehung von mehr als 46 U/min erforderlich sein kann
Spritzenpumpe	KD Scientific	Modell 100	Zugprüfgerät und Nassspinngerät
Trifluoressigsäure (TFA)	Millipore Sigma	TX1276-7	Wird für die Dope-Zubereitung
Tris-Hydrochlorid verwendet	EMD Millipore	9310-500GM	Wird für die Dope-Vorbereitung
verwendet USB Hub	Acasis	B07Q3TYF15	Nassspinnbares Gerät - 48W Powered USB Hub - ACASIS 10 Ports USB 3.0 Data Hub - mit individuellen Ein-/Ausschaltern und 12V/4A Netzteil USB Splitter - Schnittstelle zwischen Raspberry Pi und Tic T249 Schrittmotor-Controllern