Verfahren zur Untersuchung von Nervenreparation und funktioneller Wiederherstellung des Ischiasnervs Maus zur Untersuchung von Nervenreparatur und funktioneller Erholung

Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein Ischiasdurchschnitts- und Nahtmodell bei Mäusen, um die Regeneration peripherer Nerven mit erwachsenen dorsalen Wurzelganglienneuronen zu untersuchen. Es ermöglicht eine in-vivo-Analyse des Axonwachstums, der Muskelrenervation und der funktionellen Erholung nach einer Nervenverletzung.

Abstract

Die Nervenreparatur ist entscheidend für die Wiederherstellung der Funktion nach einer axonalen Verletzung. Ausgewachsene Neuronen im zentralen Nervensystem (ZNS) haben jedoch aufgrund verminderter intrinsischer Wachstumskapazität und einer feindlichen Umgebung eine begrenzte Fähigkeit, ihre Axone nach einer Verletzung zu regenerieren. Im Gegensatz dazu zeigen Neuronen im peripheren Nervensystem (PNS) ein robustes regeneratives Potenzial. Unter ihnen sind adulte Neuronen des dorsalen Wurzelganglions (DRG) besonders bekannt für ihre Fähigkeit, sich nach peripheren Nervenverletzungen effektiv zu regenerieren, was sie zu einem idealen Modell zur Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen der Nervenreparatur macht. Hier wird eine modifizierte Mikronahttechnik, genannt "Loop-before-Transsection", beschrieben, um ein Ischias-Genomschnitts- und Resuturmodell bei Mäusen zu erzeugen, gefolgt von der Analyse der Axonregeneration. Verhaltensanalysen und Muskelwiedernervation werden ebenfalls demonstriert, um die funktionelle Erholung zu bewerten. Nach Ischiasdurchtrennung und Wiedernähung zeigen Tiere zunächst Verhaltensdefizite, aber eine vollständige Genesung ist typischerweise 30 Tage nach der Verletzung zu beobachten. Die Anwendung von Medikamenten, die die axonale Versteifung an der Verletzungsstelle fördern, beschleunigt die funktionelle Genesung erheblich. Dieses Modellsystem bietet ein kraftvolles Werkzeug zur Untersuchung der Mechanismen, die die Nervenreparatur von Säugetieren in vivo steuern.

Introduction

Axonale Verletzungen sind eine häufige und schwerwiegende Folge von Hirn- und Rückenmarksschädigungen, die oft durch traumatische Verletzungen, Neurotoxine oder neurologische Störungen verursacht werden, die die neuronale Konnektivität stören und die axonale Regeneration^{beeinträchtigen 1,2}. Nicht alle Neuronen besitzen eine intrinsische Fähigkeit zur Regeneration, die für die Reparatur abgetrennter Axone entscheidend ist. Die Rate der axonalen Regeneration wird von mehreren Faktoren beeinflusst, darunter das intrinsische Wachstumspotenzial des Neurons, die Effizienz der Proteinsynthese, die zytoskelettale Dynamik, die Beseitigung von Myelinreste und die Verfügbarkeit von Wachstumsfaktoren ^3,4.

Im zentralen Nervensystem der adulten Säugetiere (ZNS) führt eine axonale Verletzung zu einer verminderten Regenerationsfähigkeit, hauptsächlich aufgrund fehlender intrinsischer wachstumsfördernder Faktoren und des Vorhandenseins inhibitorischer extrinsischer Signale ^1,5. Im Gegensatz dazu besitzen Axone im peripheren Nervensystem (PNS) eine robuste Fähigkeit zur Regeneration nach einer Verletzung, was auf die intrinsischen Selbstreparaturmechanismen peripherer Neuronen und die schnelle Reaktivierung proregenerativer Wachstumsprogramme zurückzuführen ist. Nach der Verletzung löst sich das distale Axonsegment vom neuronalen Soma und durchläuft Wallersche Degeneration, gekennzeichnet durch axonale Auflösung und Fragmentierung ^6,7. Eine effiziente Entfernung von axonalen und myelinhaltigen Ablagerungen durch Gliazellen ist für eine erfolgreiche Regeneration unerlässlich, da sie die Narbenbildung verhindert, die das axonale Wachstum behindern könnte ^3,8. Dieser Prozess, zusammen mit der zytoskelettalen Remodellierung verletzter Axone, unterstützt das Nachwachsen des proximalen Stumpfs und erleichtert die Wiedernervation des Ziels. Diese Ereignisse treten in teilweise überlappenden Phasen auf, in denen die durch Verletzungen induzierte Aktivierung von Transkriptionsfaktoren wie ATF3 und c-Jun pro-regenerative Genexpressionsprogramme ^4,9,10 fördert.

Regenerative axonale Fusion stellt einen effizienten Mechanismus zur Wiederherstellung neuronaler Konnektivität nach axonaler Verletzung¹¹ dar. Dieser Prozess wurde erstmals 1967 beim Flusskrebs Procambarus clarkii ^{beschrieben und wurde} seitdem bei mehreren Arten^{dokumentiert: 13,14,15,16}, darunter Caenorhabditis elegans¹⁷. Obwohl direkte Hinweise auf axonale Verschmelzung bei Säugetieren weiterhin begrenzt sind, wurden fusionseinduktionierende Strategien erfolgreich eingesetzt, um die Nervenreparatur^{zu verbessern 11}. Bemerkenswert ist, dass das chemische Fusogen-Polyethylenglykol (PEG) die Membranabdichtung fördert und in Säugetiermodellen 18,19,20,21,22,23,24 die funktionelle Genesung sowohl nach peripheren Nerven- als auch Rückenmarksverletzungen unterstützt. Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass der Depletion der Glutathionperoxidase (GPX) ausreichend ist, um die axonale Fusion bei C. elegans²⁵ zu fördern. Ähnlich zeigten Gpx4-bedingte Knockout-Mäuse oder solche, die mit dem GPX-Inhibitor ML162 behandelt wurden, eine beschleunigte funktionelle Erholung nach der Ischiasdurchtrennung, möglicherweise durch verstärkte axonale^{Fusion 25}.

Der Ischiasnerv ist ein Mischnerv, der aus sensorischen, somatischen motorischen und autonomen motorischen Axonen^besteht. Sie entspringt aus den L4- und L5-Spinalsegmenten bei Ratten²⁷ sowie aus den L3- und L4-Segmenten bei^{Mäusen 28}. Aufgrund ihrer Zugänglichkeit und anatomischen Konsistenz ist die Ischiasnervverletzung zu einem der am weitesten verbreiteten Modelle zur Untersuchung der peripheren Nervenregeneration^29,30 geworden. Diese Modelle ermöglichen die Untersuchung sowohl intrinsischer neuronaler Mechanismen als auch extrinsischer Umweltfaktoren, die das axonale Wachstum und die funktionelle Erholung beeinflussen ^3,4,9. Die Verwendung des Ischiasnervenquetschungs als experimentelles Paradigma in der Neurowissenschaft reicht bis ins späte 19. Jahrhundert^zurück. Neben Nervenquetschungsmodellen wird die Nervendurchtrennung weit verbreitet zur Untersuchung der Axonregeneration und funktionellen Erholung eingesetzt. Allerdings ist die klassische Ischiasdurchtrennung mit anschließender Naht bei Mäusen oft weniger reproduzierbar und zuverlässig als bei Ratten, da der Nerv so klein ist und die empfindliche Textur³¹ empfindlich ist.

Mit einem modifizierten Ischiasdurchschnitts- und Resuturmodell, genannt "Schleife-vor-Transektion", konnten reproduzierbare Ischiasdurchschnitts- und Resuturmodelle erfolgreich^erstellt werden. Dieser Ansatz eliminiert die Notwendigkeit der Nervenhandhabung nach der Durchtrennung, indem die Naht vor dem Schneiden voreingesetzt wird, wodurch mechanische Belastungen reduziert und die Variabilität durch chirurgische Technik minimiert wird. Moderate GPX-Modulationsstufen wurden als Beiträger zur funktionellen Erholung nach vollständiger Durchtrennung des Maus-Ischiasnervs²⁵ befunden. Die Kobehandlung der niedrigen Konzentrationen ML162 (0,25 μM)³², GPX-Inhibitor und Polyethylenglykol (PEG, 500 mM)18,19,20,21,22,23,24 an der Ischiasdurchquerung (SNT) / Resutur-Läsion verbesserte erfolgreich den Verhaltenswert, der durch Nadelstich, Fußfehlerasymmetrie und Zehenspreiztest ^25,33 bewertet wurde^.34. Amputierte distale Axonfragmente von Säugetier-Neuronen des dorsalen Wurzelganglions (DRG) degenerieren innerhalb von 3 Tagen, was zu einer Störung der neuromuskulären Verbindungen (^{NMJ) führt}. ^6,35, und regenerative DRG-Neuronen renervieren die Muskeln, um ihre Funktionen wiederherzustellen. Die SNT/Resuture-ML162/PEG-Kobehandlungsgruppe zeigte zu Beginn (3 Tage nach der Operation) innervierte NMJs und verbesserte Verhaltenswerte, was auf eine frühe Wiederherstellung der neuromuskulären Funktion²⁵ hindeutet.

Hier werden die "Schleife-vor-Transsektion"-Mikronahtmethode und die Verabreichung des Medikaments beschrieben, die die oben genannten Beobachtungen bei Mäusen ermöglichten. Ein zuvor etabliertes PEG-Fusionsprotokoll, das eine schnelle Reparatur durchtrennter Rattennerven ermöglicht, wurde¹⁸ modifiziert. Es wurde zunächst berichtet, dass Polyethylenglykol (PEG) die exogene Rekonnektion von geschnittenen Flusskrebs-medialen riesigen Axonen (MGA) in vitro³⁶ fördert. PEG-Fusionsprotokolle verbesserten die Verhaltensergebnisse in 25 % bis 30 % der Studien mit Crush-Severance-Verletzungen des Rattenischiasnervs, obwohl die funktionelle Erholung zu frühen Zeitpunkten³⁴ nicht beobachtet wurde. Nachfolgende Verfeinerungen integrierten das Konzept der endogenen Membranversiegelung³⁷. Nach einer Nervenverletzung ist die schnelle plasmalemmale Reparatur neuroprotektiv und verhindert Neurodegeneration. Die durch Ca²⁺ induzierte Ansammlung membrangebundener Vesikel erleichtert diesen Versiegelungsprozess³⁸. Eine vollständige Nervendurchschnitt stört die Axolemma sowie die endoneurialen, perineurialen und epineurialen Scheiden an der Läsionstelle. Die Mikronaht der Epineurialscheide richtet die proximalen und distalen Nervenstümpfe aus. Während des Nahtschritts reduziert die Verwendung von^Ca-2+-freier hypotoner Kochsalzlösung die Bildung membrangebundener Vesikel, wodurch die endoneurialen und perineurialen Hüllen offen bleiben und sie durch die epineuralen Nähte eng angenähert werden können. Anschließend induziert die Anwendung von Ca^2+-haltiger Kochsalzlösung die Vesikelansammlung, um die verbleibende plasmalemmale^{Störung 18} zu versiegeln.

In diesem Protokoll wurden erwachsene FVB-Mäuse (8–10 Wochen alt) und C57BL/6-Mäuse verwendet, und es wurde kein stammspezifischer Unterschied festgestellt. Der Ischiasnerv bei Mäusen befindet sich etwa 1–2 mm unterhalb des Gluteusmuskels auf Höhe der Mitte des Oberschenkels und ist deutlich dünner und empfindlicher als bei Ratten, was eine größere chirurgische Präzision bei Dissektion und Nähten erfordert. Es muss darauf geachtet werden, eine Überdehnung der Nerven oder übermäßige Manipulationen zu vermeiden, die die funktionelle Erholung beeinträchtigen könnten. Bei diesem Vorgehen wird der Nerv vollständig durchtrennt, was zu einer physischen Lücke zwischen dem proximalen und distalen Stumpf führt. Da diese Lücke die direkte axonale Regeneration hemmt, erfordert eine erfolgreiche Genesung typischerweise mikrochirurgische Eingriffe oder Nerventransplantationen.

Da der Ischiasnerv der Maus dünner und empfindlicher ist als der der Ratte, ist eine größere chirurgische Präzision erforderlich. Obwohl Mikronähte häufig verwendet werden, kann sie unbeabsichtigt durch übermäßige Manipulation oder wiederholte Nadelstiche³⁹ zusätzliches Trauma verursachen. Diese Einschränkungen können Variabilität verursachen und potenziell die Bewertung neuartiger Behandlungsstrategien behindern. Daher ist es unerlässlich, konsistente chirurgische Ergebnisse zu erzielen und gleichzeitig nahtinduzierte Nervenschäden zu minimieren, um die funktionelle Genesung in Nervendurchschnittsmodellen zuverlässig zu beurteilen. Mit dieser "Loop-before-Transsection"-Methode wurden reproduzierbare Ischias-Transsektions- und Resutur-Modelle erstellt, und die Auswirkungen der Doppelbehandlung mit PEG und ML162 auf die funktionelle Genesung wurden bewertet. Insgesamt stellt das Modell der Maus-Ischias-Durchquerung trotz seiner weitverbreiteten Anwendung aufgrund der geringen Größe und Zerbrechlichkeit des Nervs technische Herausforderungen dar. Diese hier beschriebene modifizierte Nahtmethode erfüllt den dringenden Bedarf an einem reproduzierbaren, standardisierten mikrochirurgischen Protokoll, das mechanische Schäden minimiert.

Protocol

Alle Tierverfahren wurden gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am University of Texas Health Science Center in San Antonio durchgeführt (Protokollnummer: 20200082AR). Erwachsene männliche und weibliche FVB-Mäuse (8–10 Wochen alt, 20–25 g) wurden für die hier beschriebenen JoVE-experimentellen Verfahren verwendet. C57BL/6-Mäuse (8–10 Wochen alt, 20–25 g) wurden nur in vorläufigen Übungsoperationen vor den formellen Experimenten eingesetzt, um Handhabung und Nahtpräzision zu optimieren. Diese Übungssitzungen bestätigten, dass das "Loop-before-Transsection"-Verfahren bei beiden Stämmen vergleichbare Ergebnisse erzielte; daher wurden alle in diesem Manuskript präsentierten formalen Daten von FVB-Mäusen bezogen. Insgesamt wurden zunächst zehn FVB-Mäuse (fünf Männchen und fünf Weibchen) zur Ischiasdurchtrennung einbezogen, gefolgt von einer ML162 + PEG-Behandlung. Ein Tier zeigte eine angeborene anatomische Variation, bei der sich der Ischiasnerv vor der Durchschnittsstelle in zwei Hauptzweige teilte, was zu einer unvollständigen Operation und einem Ausschluss von der Analyse führte. Daher wurden Verhaltens- und histologische Analysen an neun Tieren durchgeführt (n = 9). Beide Geschlechter zeigten vergleichbare regenerative und verhaltensbezogene Erholung, und es wurden keine geschlechtsspezifischen Unterschiede beobachtet. Eine weitere Maus unterzog sich einer doppelten Nahtpenetration ohne Nervendurchtrennung (Scheinkontrolle), um die potenziellen Auswirkungen des Nahtverfahrens auf die Verhaltensergebnisse zu bewerten. Es wurden keine auffälligen Unterschiede in der regenerativen Reaktion zwischen den Geschlechtern beobachtet. Die Tiere wurden unter Standardbedingungen mit einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus bei 75 °F und 40%-60% relativer Luftfeuchtigkeit gehalten, mit Ad-Libitum-Zugang zu Futter und Wasser. Sowohl männliche als auch weibliche Mäuse wurden eingesetzt, und es wurde kein spürbarer Unterschied zwischen männlichen und weiblichen Tieren beobachtet. Chirurgische Eingriffe wurden unter Isoflurananästhesie des SomnoSuite Low-Flow-Anästhesiesystems durchgeführt. Verhaltenstests wurden ab dem postoperativen Tag 2 durchgeführt und an den Tagen 4, 7, 10, 14, 18, 22 und 27 wiederholt, wie in den entsprechenden Abbildungen angegeben. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Ischiasdurchquerung/-resutur und medikamentöse Behandlung

1. Setzen Sie das Tier auf eine beheizte Platte, wo der Ischiasnerv unter einem Stereo-Dissektionsmikroskop beobachtet werden kann (Abbildung 1A).
2. Betäuben Sie die Maus mit dem SomnoSuite Low-Flow-Anästhesiesystem.
   HINWEIS: Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch das Ausbleiben von Reflexreaktionen, wie etwa der Reaktion auf einen Zehenkniff, bevor die Operation beginnt. Tragen Sie eine veterinärärztliche Augensalbe auf, um Hornhauttrockenheit zu vermeiden.
3. Rasiere die Haare am Oberschenkel und um sie herum.
   HINWEIS: Entfernen Sie die rasierten und abgefallenen Haare so sauber wie möglich. Andernfalls haften die Haare an der 10-0-Nylonnaht und kontaminieren den Ischiasnerv. Resthaare können nach dem Rasieren vorsichtig mit Labor- oder Klebeband entfernt werden, um ein sauberes Operationsfeld zu gewährleisten. Desinfizieren Sie die Operationsstelle, indem Sie die rasierte Stelle nacheinander mit 70 % Ethanol, Betadin abwischen, und ein letztes Wisch mit 70 % Ethanol mit autoklavierten Wattebäuschchen abwischen.
4. Lokalisieren Sie den Oberschenkelknochen und machen Sie einen kleinen Hautschnitt von etwa 1,0 cm (Bereich 0,8–1,2 cm) auf Oberschenkelhöhe, etwa ~1 mm hinter dem Oberschenkelknochen und parallel zum Oberschenkelknochen mit einer feinen chirurgischen Schere.
   1. Ziehe den Gluteus maximus vorsichtig zurück, um den darunterliegenden Bizeps femoris freizulegen. Dann werden mit den Spitzen der Schere vorsichtig die vorderen und hinteren Köpfe des Bizeps femorius getrennt, ohne zu schneiden, um den Ischiasnerv unter der Ischias-Kerbe freizulegen. Diese Schritte werden unter direkter visueller Beobachtung durchgeführt, nicht unter dem Mikroskop.
5. Ziehen Sie den Ischiasnerv mit einer mikrodissektionierenden Zange aus dem Körper, um die Operation am Ischiasnerv zu erleichtern (Abbildung 1A).
   HINWEIS: Sichern Sie die Pinzette mit Klebeband, um zu verhindern, dass sie sich über ein bestimmtes Niveau hinaus ausbreiten und so Schäden am Ischiasnerv minimieren. Setzen Sie die Spitze der Pinzette unter den Ischiasnerv und heben Sie den Ischiasnerv mit dem Mausschenkel als Drehpunkt nach oben. Achte darauf, den Nerv nur so weit anzuheben, wie nötig ist, um das Nähen zu erleichtern, und vermeide es, Spannung auszuüben oder nach außen zu ziehen, da eine übermäßige Dehnung die Axone oder umliegende Strukturen beschädigen kann.
6. Fokussiere das Mikroskop auf den freiliegenden Ischiasnerv. Von diesem Schritt aus gehen Sie mit Schritt 15 mit einem Mikroskop fort (Abbildung 1A).
7. Durchdringen Sie den Ischiasnerv doppelt mit 10-0 Nylonnaht (Abbildung 1B, C). Gehe zu Schritt 1-8 für unbeschnittene Kontrolle. Gehe zu Schritt 1-11 für die Nervendurchtrennung.
   HINWEIS: Zwei Durchführungen wurden etwa eine Nervenbreite auseinander (~0,7 mm) durchgeführt, symmetrisch auf beiden Seiten der vorgesehenen Durchschnittsstelle positioniert. Dieser Abstand gewährleistete eine korrekte Ausrichtung der proximalen und distalen Stümpfe und minimierte gleichzeitig die mechanische Belastung an der Läsion. Führen Sie mit der Naht durch das Zentrum des Ischiasnervs ein und stellen Sie sicher, dass die beiden Penetrationen der Naht exakt parallel verlaufen. 10-0-Nähte sind klein und müssen mit einer sehr feinen Pinzette kontrolliert werden. Nicht absorbierbares 10-0-Nylon wurde verwendet, da es während der 30-tägigen Beobachtungszeit eine ausgezeichnete Zugstabilität und minimale Gewebereaktivität bietet. Dieses Material wird häufig in mikrochirurgischen Nervenreparaturmodellen bei Mäusen und Ratten^{verwendet 18,31}. Absorbierbare Nähte wurden nicht verwendet, da ein allmählicher Abbau die Ausrichtung der durchschnittenen Nervenstümpfe beeinträchtigen könnte, bevor die funktionelle Erholung vollständig ist. Um die vom Bediener abhängige Variabilität zu minimieren, wurden alle chirurgischen Eingriffe von einem einzelnen ausgebildeten Chirurgen nach umfangreicher mikrochirurgischer Praxis unter einem Stereomikroskop durchgeführt. Die "Schleife-vor-Transektion"-Methode selbst reduziert die Variabilität zusätzlich, indem sie die Notwendigkeit einer Nervenmanipulation nach der Transsektion eliminiert und so eine gleichmäßige Ausrichtung und Spannung zwischen Tieren gewährleistet. Dies erfordert erhebliche Übung und ein hohes Maß an Kontrollfähigkeiten. Vor Tieroperationen kann es Anfängern hilfreich sein, die Nahtbewegung mit feinen synthetischen Fäden wie Zahnseide zu üben, um Geschicklichkeit und Kontrolle unter einem Stereomikroskop zu entwickeln.
8. Binde vorsichtig einen Knoten mit der Nylonnaht.
9. Legen Sie den freiliegenden Ischiasnerv unter die Muskelschicht und schließen Sie die Haut mit 4-0 Nylonnähten.
10. Stellen Sie fest, dass eine doppelte Penetration des Ischiasnervs mit einer 10-0-Nylonnaht das Verhalten der Maus nicht beeinflusst.
    HINWEIS: Zur Bestätigung wurden Mäuse, die eine doppelte Nahtpenetration ohne Durchschnitt unterzogen hatten, denselben Verhaltenstests wie in den experimentellen Gruppen unterzogen, darunter Nadelstich, Fußfehlerasymmetrie und Zehenspreizung. Diese Mäuse erreichten durchgehend volle Werte, die unoperierten Wildtyp-Kontrollpersonen entsprechen, was darauf hindeutet, dass das Nahtverfahren allein die Funktion des Ischiasnervs nicht beeinträchtigte.
11. Schneiden Sie den Ischiasnerv mitten zwischen den beiden 10-0 Nylonnähten mit einem Skalpell durch (Abbildung 1D).
    HINWEIS: Um die Variabilität zu minimieren, wurden alle Operationen vom selben geschulten Experimentator mit einem standardisierten Verfahren durchgeführt. Darüber hinaus minimiert das "Loop-before-Transsection"-Design die Variabilität, indem es die Nervenbehandlung nach der Transsektion vermeidet und so eine gleichmäßige Nahtplatzierung und Spannung bei allen Tieren gewährleistet. Die Position der Nähte wurde unter einem Seziermikroskop überprüft, um die Gleichmäßigkeit der Tiere zu gewährleisten.
12. Steck die Pinzette weg.
13. Waschen Sie den durchschnittenen Nerv mit Ca^2+-freier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 7,4), zubereitet ohne Calciumchlorid.
    HINWEIS: Spülen Sie den durchtrennten Nervenstumpf etwa 10–20 Sekunden lang mit calciumfreiem PBS, um das Blut zu reinigen und eine vorzeitige Verdichtung zu verhindern. Das Wiedernähen sollte umgehend innerhalb von 1–2 Minuten abgeschlossen werden, um die Ausrichtung und Gewebelebensfähigkeit zu erhalten.
14. Entfernen Sie das Ca²⁺-freie PBS, indem Sie es mit einem Taschentuch aufnehmen.
15. Binde vorsichtig einen Knoten mit der Nylonnaht (Abbildung 1E). Gehen Sie zu Schritt 20, wenn eine Drogenbehandlung nicht geplant oder erforderlich ist.
    HINWEIS: Für das Mikronähen wurde ein standardmäßiger quadratischer Knoten verwendet, der aus zwei entgegengesetzten Zügen bestand, die sanft mit feinen Zangen unter einem Stereomikroskop festgezogen wurden. Die beiden abgetrennten Axone, die durch die Naht verbunden sind, nehmen wieder eine Form an, die ihrer ursprünglichen Form nahekommt. Die Wiederverbindung eines durchtrennten Blutgefäßes kann ein visuelles Zeichen dafür sein, dass die proximalen und distalen Nervenstümpfe richtig ausgerichtet sind. Während des Eingriffs sollte das Gewebe frisch und feucht erscheinen, ohne Blässe oder Kompression. Vermeiden Sie es, die Naht zu fest zu binden, da dies Blutgefäße kollabieren oder den Nerv verformen kann. Bevor Sie den letzten Knoten binden, stellen Sie sicher, dass die Nervenenden ohne Spannung angenähert sind. Falls nötig, stellen Sie das Gliedmaß vorsichtig neu positioniert, um eine natürliche Ausrichtung zu ermöglichen, anstatt am Nerv zu ziehen, da übermäßige Verspannungen das Risiko für Neurome oder Fibrose erhöhen können.
16. Legen Sie 0,25 μM ML162 in DMSO, verdünnt in PBS, mit einer Spritze auf den genähten Ischiasnerv ein. Lass den genähten Ischiasnerv 1 Minute im Medikament eintauchen.
17. Entfernen Sie das ML162, indem Sie es mit einem sterilen Wattestäbchen aufnehmen.
18. Geben Sie 500 mM PEG in destilliertes Wasser, vorgeheizt auf 37 °C, auf den genähten Ischiasnerv mit einer Spritze. Lass den genähten Ischiasnerv 1 Minute im Medikament eintauchen.
    HINWEIS: 500 mM PEG ist eine dichte Lösung, die bei Betriebsraumtemperatur fest werden kann. Setzen Sie die Spritze während des Betriebs auf ein beheiztes Pad, um sicherzustellen, dass der PEG flüssig bleibt. Man nimmt an, dass PEG die Membranfusion fördert, indem Wassermoleküle zwischen benachbarten Lipiddoppelschichten entfernt werden, wodurch enger Membrankontakt und spontane Fusion ermöglicht werden. Obwohl der genaue molekulare Mechanismus noch untersucht wird, wurde gezeigt, dass dieser Ansatz die axonale Kontinuität fördert und die funktionelle Wiederherstellung in peripheren Nervenverletzungsmodellen verbessert.
19. Entfernen Sie das PEG, indem Sie es mit einem Taschentuch aufnehmen.
20. Waschen Sie den genähten Nerv mit Ca²⁺-haltigem PBS (PBS ergänzt mit 1 mM CaCl₂; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Phosphatpuffer, pH7,4).
21. Entfernen Sie das mit Ca²⁺ enthaltende PBS, indem Sie es mit einem Taschentuch aufnehmen.
22. Legen Sie den freiliegenden Ischiasnerv unter die Muskelschicht und schließen Sie die Haut mit 4-0 Nylonnähten.
23. Sobald das Tier sich von der Narkose erholt hat, kehren Sie zurück in den Käfig.
    HINWEIS: Nach dem Schließen der Haut wurde die Operationsstelle mit einer topischen antibiotischen Salbe mit Schmerzmittel behandelt. Jedes Tier wurde auf einer Wärmematte überwacht, bis es genügend Bewusstsein erlangt hatte, um die sternalen Liegen aufrechtzuerhalten. Die Tiere wurden dann einzeln untergebracht und erst nach vollständiger Wiederherstellung der motorischen Funktion zu ihrer Gruppe zurückgebracht. Obwohl die chirurgische Umgebung nicht unter einer laminaren Flusshaube aufrechterhalten wurde, wurden alle chirurgischen Instrumente sterilisiert und die Eingriffe wurden mit aseptischer Technik mit behandschuhten Händen und sterilen Werkzeugen durchgeführt.

2. Verhaltenstest – Nadelstich

HINWEIS: Zur Beurteilung der mechanischen Empfindlichkeit mit hohem Schwellenwert nach Verletzung³³.

1. Stelle die Maus in ein Drahtgitter und lasse sie 30 Minuten lang frei herumlaufen, damit sie sich an die neue Umgebung gewöhnt.
2. Der seitlichste Teil der Plantarfläche der Hinterpfote war in 5 Bereiche (A bis E) unterteilt. Tragen Sie das Austerlitz (Größe 000) vorsichtig auf die Plantaroberfläche der ipsilateralen Pfote auf. Der Nadelstich wurde zweimal vom seitlichsten Zeh (Bereich A) bis zur Ferse (Bereich E) aufgebracht.
   HINWEIS: Nicht in die Haut eindringen.
   HINWEIS: Eine Reaktion galt als positiv, wenn das Tier seine Pfote schnell von den beiden Nadelstichreizen entfernte. Die Maus wurde für diesen Bereich mit 1 bewertet und dann für den nächsten Test getestet (Maximum 5). Wenn keine der Bewerbungen eine positive Antwort erhielt, lag die Gesamtnote bei 0. Nutze das saphenus-Territorium derselben ipsilateralen Seite als positive Kontrolle. Es wird immer eine positive Reaktion hervorrufen.

3. Verhaltenstest – Fußfehler (FF) Asymmetrie

HINWEIS: Um zu messen, wie gut Ischiasaxone mehr proximale Muskeln innervieren³⁴.

1. Erlauben Sie den Tieren, frei auf einem erhöhten Drahtgitter auf dem Käfig herumzulaufen, um die Umgebung zu gewöhnen. Ein Versuch besteht aus insgesamt 50 Schritten pro Achsgliedmaß.
2. Punkt, wenn die Tiere einen Fehler machen. Die Bewertungskriterien sind wie folgt.
   Punktzahl 1: Teilweise schuld. Zurückgezogen, bevor das Bein ganz bis zum Oberschenkel herausfiel.
   Punktzahl 2: Volle Schuld. Er fiel komplett in den Schritt ab.
3. Berechnen Sie den zusammengesetzten Fußfehlerwert aller verletzten und unverletzten Hintergliedmaßen aller Tiere zu jedem postoperativen Zeitpunkt.
   Zusammengesetzter Fußfehlerwert = (# Teilverwerfungen x 1) + (# vollständige Fehler x 2)
4. Teilen Sie den Zusammensatz-Fußfehlerwert durch 50 (Gesamt Schritte/Gliedmaße), um den Fehlerprozentsatz für jedes Hintergliedmaß zu erhalten.
   % Fußfehler = Zusammengesetzter Fußfehlerwert/50 (Gesamtschritte) x 100 %
5. Subtrahieren Sie die Fußfehler im verletzten Hintergliedarm vom Anteil der Fußfehler im intakten Hinterbein, um für jedes Tier zu einem gegebenen postoperativen Zeitpunkt eine Asymmetriewertung zu erhalten.
   Fußfehler (FF) Asymmetriewert = %FF (intakte Gliedmaße) - %FF (verletzte Gliedmaße)

4. Verhaltenstest – Zehenspreizung

HINWEIS: Zur Bewertung der motorischen Erholung nach einer Nervenverletzung. Laut einer früheren Studie ist der Zehenspreizungs-Motortest empfindlicher als die Ganganalyse, um die Wiederherstellung der motorischen Funktion nach einer Ischiasnervverletzung³⁰ zu erkennen.

1. Bedecken Sie das Tier vorsichtig mit einem Stück Tuch und heben Sie den Schwanz, um die Hinterpfoten gut zu sehen.
   HINWEIS: Alternative: Greifen Sie vorsichtig den Nacken der Maus, fixieren Sie den Schwanz, drehen Sie ihn um und lassen Sie die Maus sich winden, um die Zehenbewegung zu beobachten.
2. Verleihen Sie den Toe-Spreading-Wert wie folgt:
   Punktzahl 2: Volle Ausbreitung. Definieren Sie es als eine vollständige, breite und anhaltende Ausbreitung aller Zehen für mindestens 2 Sekunden.
   Punktzahl 1: Mittlere Ausbreitung. Jede Bewegung, die keinen vollständigen Spreading-Wert erreicht. Leicht zittern oder teilweise Bewegung.
   Punktestand 0: Kein Spreading. Keine Bewegung.
   HINWEIS: Alle Verhaltensuntersuchungen (Nadelstich, Fußfehler und Zehenspreizung) wurden von einem Experimentator überprüft, der auf Behandlungsgruppen blind war. Die Tiere wurden zum Zeitpunkt der Operation zufällig in Behandlungsgruppen eingeteilt, entsprechend dem Design unserer vorherigen Studie (Ko et ^al.25), das vier experimentelle Erkrankungen umfasste (nur Resuture, PEG, ML162, ML162 + PEG). Der aktuelle Artikel präsentiert Daten aus der ML162 + PEG-Gruppe, die unabhängig analysiert wurden und dabei die ursprüngliche experimentelle Strenge beibehalten wurden.

5. Gewebeperfusion und -verarbeitung für die Histologie

1. Das Tier tief betäuben und transkardiale Perfusion mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) über den linken Ventrikel durchführen.
2. Schneide den rechten Vorhof, um einen vollständigen Blutabfluss zu ermöglichen.
3. Tauchen Sie das gesammelte Gewebe über Nacht bei 4 °C in 4 % Paraformaldehyd (PFA) zur Fixierung ein.
4. Waschen Sie die fixierten Gewebe dreimal mit PBS und befruchten Sie sie dann über Nacht in PBS bei 4 °C.
5. Kryoschützt das Gewebe, indem man es über Nacht in 30 % Saccharose bei 4 °C eintaucht.
6. Gewebe in OCT-Substanz einbetten, einfrieren und mit einem Kryostat in 12 μm Dicke schneiden.
7. Lagern Sie Gewebeblöcke bei -80 °C und Kryosektionen bei -20 °C bis zur Gebrauchszeit.
8. Für die alleinige Ischias-Nervensammlung verzichten Sie auf die Perfusion, da der Blutspiegel die Immunfärbungsqualität in diesen peripheren Geweben nicht signifikant beeinflusst.

Results

Das vorherige PEG-Fusionsprotokoll¹⁸ wurde modifiziert, um konsistente chirurgische Ergebnisse zu gewährleisten und Nervenschäden durch das Nähen²⁵ zu minimieren. Durch das Eindringen der Naht durch den Nerv vor der Querschnitt konnte der Schaden durch das Kneifen mit der Pinzette oder das Stichen mit einer Nadel nach dem Durchschnitt minimiert werden. Um die Wirkung einer Naht, die einen Nerv durchdringt, auf seine Funktion zu testen, wurd...

Discussion

Nervenregenerationsstudien mit Nervendurchtrennungsmodellen werden weit verbreitet am Ischiasnerv der Maus^{durchgeführt 31,39}. Aufgrund seiner geringen Größe und weichen Textur ist der Ischiasnerv der Maus jedoch schwer vorsichtig mit chirurgischen Werkzeugen zu handhaben, und das Gewebe neigt beim Nähen zu Reißen. Der Mikronahtprozess, der oft übermäßige Manipulation beinhaltet, kann zu Nervendeformation und Trauma führen. Selbst...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#55 Zange	Dumostar-Biologie	11295-51	Eine in jeder Hand. Du brauchst zwei, um eine 10-0-Nylonnaht zu greifen.
10-0 Nylonnaht	DemeTECH	NL761000,4F0P
4-0 Nylonnaht	Matrix-Zauberer	0197
Anti-Beta-Tubulin	R& D-Systeme	MAB1195
Anti-NF-200	Millipore Sigma	N4142
Austerlitz Größe 000			Für den Pinprick-Test
CF488 konjugiert-alpha-bungarotoxin	Biotium	00005
Zerschneidende Schere	Kent Scientific
Feine Nahtschere	Kent Scientific
Iris-Zange	Kent Scientific
K& H Kleintier-Heizpad	K& H-Haustierprodukte
ML162	Millipore Sigma	SML2561
Maus-OP-Set	Kent Scientific
Nadelhalter	Kent Scientific
Polyethylenglykol (PEG)	Millipore Sigma	P5413
SCG10	Novus Biologicals	NBP1-49461
SomnoSuite	Kent Scientific		Für die Isofluran-Anästhesie
Splitterzange			Früher wurde der Ischiasnerv freigelegt.