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Methodenartikel

Arzneimittelinduzierte Seneszenz in Leberzellen fördert die Polarisation von M2-Makrophagen: Implikationen für die Tyrosinkinase-Inhibitor-assoziierte Hepatotoxizität

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DOI:

10.3791/68725

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17. Oktober 2025

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1Department of Life Sciences, Shiv Nadar Institution of Eminence, 2Independent Researcher, 3Servier Institute of Translational Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit untersuchen wir die Hepatotoxizität, die durch Lapatinib und Neratinib durch SASP-gesteuerte Makrophagenpolarisation verursacht wird, was ein tieferes mechanistisches Verständnis über traditionelle Toxizitätstests hinaus ermöglicht. Dieser Ansatz zeigt, wie seneszente Hepatozyten die Immunantwort beeinflussen. Dies ist besonders wertvoll für die Bewertung langfristiger Arzneimittelwirkungen und die Entdeckung neuer therapeutischer Ziele für die Behandlung arzneimittelinduzierter Hepatotoxizität.

Zusammenfassung

Lapatinib und Neratinib sind Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKIs), die für die Behandlung von HER2-positivem metastasierendem Brustkrebs zugelassen sind, deren klinischer Einsatz jedoch durch Hepatotoxizität eingeschränkt ist. In den Hepatozyten produzieren Cytochrom P450-Enzyme reaktive Metaboliten dieser Medikamente, die DNA-Schäden, mitochondriale Dysfunktion und oxidativen Stress verursachen, die zu einer Schädigung der Hepatozyten führen. Dieser zelluläre Stress löst die Seneszenz der Hepatozyten aus, einen Zustand des Wachstumsstillstands, der von der Sekretion von entzündungsfördernden und gewebeumbauenden Faktoren begleitet wird, die als Seneszenz-assoziierter sekretorischer Phänotyp (SASP) bezeichnet werden. SASP verändert die Mikroumgebung der Leber erheblich, beeinflusst das Verhalten von Immunzellen und verschlimmert Gewebeschäden. Wir zeigen, dass Lapatinib und Neratinib Seneszenz und SASP in der HepG2-Leberzelllinie induzieren. Darüber hinaus fördert SASP aus diesen seneszenten Zellen die M2-ähnliche Polarisation von RAW264.7-Makrophagen. Obwohl M2-Makrophagen mit entzündungshemmenden Reaktionen und Gewebereparatur in Verbindung gebracht werden, kann ihre übermäßige oder verlängerte Aktivität zu Gewebeschäden und Fibrose führen. Unsere Ergebnisse unterstreichen einen Mechanismus, durch den TKI-induzierte Hepatozytenseneszenz und SASP die Immunantwort modulieren und zur Lebertoxizität bei Brustkrebspatientinnen beitragen können. Dies unterstreicht, wie wichtig es ist, seneszente Zellen oder SASP-Faktoren ins Visier zu nehmen, um die Lebertoxizität zu reduzieren und die Behandlungsergebnisse zu verbessern, was die Identifizierung wirksamer Senotherapeutika zu einem wichtigen Forschungsschwerpunkt macht. Es gibt keinen Literaturbericht, der die Wirkung des TKI-induzierten Leberzellsekretoms auf die Makrophagenpolarisation zeigt.

Einleitung

Lapatinib und Neratinib, beides niedermolekulare Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKI), erhielten 2007 und 2017 die FDA-Zulassung für die Behandlung von metastasierendem Brustkrebs1. Es ist bekannt, dass diese Medikamente den humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2, HER22, hemmen, eine Rezeptor-Tyrosinkinase, die bei bestimmten Brustkrebsarten überexprimiert wird3. Trotz ihres klinischen Erfolgs sind Lapatinib und Neratinib auch mit Nebenwirkungen, insbesondere Hepatotoxizität, verbunden 4,5. Eine akute Leberschädigung, die sich in erhöhten Aminotransferasespiegeln manifestiert, tritt bei etwa 14 % der Patienten auf, die sich einer Behandlung mit Lapatinib oder Neratinib6 unterziehen. Die Hepatotoxizität wird weitgehend auf den Leberstoffwechsel dieser Arzneimittel zurückgeführt, an dem Cytochrom P450 (CYP)-Enzyme, überwiegend CYP3A4/5, beteiligt sind 7,8. Diese Enzyme katalysieren die Bildung von Chinon-Imin-Zwischenprodukten, die elektrophil und hochreaktiv sind 9,10. Diese reaktiven Metaboliten, einschließlich O-dealkyliertem Lapatinib, N-dealkyliertem Lapatinib und N-Hydroxylapatinib, O-dealkyliertem Neratinib und N-demethyliertem Neratinib, können kovalente Addukte mit zellulären Makromolekülen bilden, wodurch normale zelluläre Funktionen gestört werden und letztendlich Leberschäden auftreten11.

Reaktive Metaboliten von Lapatinib und Neratinib können ebenfalls oxidativen Stress induzieren, einen wichtigen Auslöser der zellulären Seneszenz12. Die zelluläre Seneszenz ist ein wachstumshemmender, aber metabolisch aktiver Zustand, der durch die Sekretion verschiedener entzündungsfördernder Zytokine, Wachstumsfaktoren und Proteasen gekennzeichnet ist. Dieser sekretorische Phänotyp ist als Seneszenz-assoziierter sekretorischer Phänotyp (SASP) bekannt13,14,15. Das SASP kann die umgebende Mikroumgebung tiefgreifend beeinflussen und oft Entzündungen und Gewebeumbau fördern. Im Rahmen der Krebstherapie kann der SASP die Krebsstammzellpopulation anreichern und die Immunantwort so modifizieren, dass das Überleben des Tumors begünstigtwird 16. Zusätzlich können die entzündlichen Zytokine Gewebeschäden verschlimmern. Wir spekulierten, dass bei Patienten, die mit Lapatinib und Neratinib behandelt wurden, die Leberschädigung teilweise durch TKI-induzierte Seneszenz und proinflammatorische SASP-Produktion verursacht wurde.

Unsere Experimente zeigten, dass Lapatinib und Neratinib die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Leberzellen induzieren, was zu DNA-Schäden und mitochondrialer Dysfunktion führt, was wiederum die zelluläre Seneszenz auslöst. Diese Seneszenz kann zu einer Lapatinib/Neratinib-induzierten Hepatotoxizität beitragen, indem sie SASP-Faktoren freisetzt, die die Polarisation von Makrophagen beeinflussen können.

Makrophagen spielen eine entscheidende Rolle bei der Immunantwort, und ihr funktioneller Phänotyp kann sich als Reaktion auf verschiedene Reize verschieben17,18. Der klassische M1-Makrophagen-Phänotyp ist typischerweise mit proinflammatorischen Reaktionen verbunden, einschließlich der Produktion von Zytokinen wie TNF-α und IL-1β, und wird allgemein als Marker für akute Entzündungen angesehen19,20. Im Gegensatz dazu ist der M2-Makrophagen-Phänotyp mit Fibrose, Gewebereparatur21, Immunsuppression und einer Reaktion auf chronische Entzündungenassoziiert 22,23. Die inflammatorischen Zytokine im SASP können die Polarisation von Makrophagen beeinflussen und so die Umwandlung von M1-Makrophagen in einen M2-ähnlichen Phänotypfördern 23. Diese Verschiebung der Polarisation kann erhebliche Auswirkungen auf die Immunmikroumgebung haben und möglicherweise zu Immunsuppression, Tumorprogression und Umbau der Gewebearchitektur führen.

Um die durch Lapatinib und Neratinib induzierte Makrophagenpolarisierung zu untersuchen, verwendeten wir die RAW264.7-Zelllinie, eine murine Makrophagen-ähnliche Zelllinie, die häufig in der immunologischen Forschung verwendet wird24,25. RAW264.7-Zellen stammen von BALB/c-Mäusen ab und werden häufig zur Untersuchung von Entzündungen, Phagozytose und Immunreaktionen verwendet25. Sie reagieren auf verschiedene Stimuli, einschließlich Lipopolysaccharide (LPS), und sind besonders wertvoll für die Untersuchung der Makrophagenfunktion, der Zytokinproduktion und der Krebsbiologie26. In dieser Studie wurde HepG2, eine humane Hepatomzelllinie, mit Lapatinib und Neratinib behandelt, um die bei Patienten beobachteten hepatotoxischen Wirkungen nachzuahmen. Die HepG2-Zelllinie wird aufgrund ihres menschlichen Ursprungs und ihrer hepatozellulären Karzinomlinie häufig als Studienmodell für den Arzneimittelmetabolismus und die Hepatotoxizität verwendet27. Nach der Behandlung der HepG2-Zellen mit den TKIs wurden die konditionierten Medien gesammelt und den RAW264.7-Zellen zugesetzt. Die nachfolgenden phänotypischen Veränderungen der Makrophagen wurden überwacht, wobei der Schwerpunkt darauf lag, ob die Behandlung eine Verschiebung vom proinflammatorischen M1-Phänotyp zum immunsuppressiven M2-Phänotyp induziert.

Die arzneimittelinduzierte Hepatotoxizität wird im Allgemeinen durch Zytotoxizitätsassays, die Bewertung von Entzündungsmarkern und die Verwendung von Tiermodellen untersucht. Im Vergleich zu diesen hat unsere Methode zur Untersuchung der TKI-Lapatinib- und Neratinib-induzierten Hepatotoxizität durch Seneszenz-assoziierte sekretorische Phänotypfaktoren (SASP) und deren Einfluss auf die Makrophagenpolarisation mehrere Vorteile. Zunächst stellt unsere Methode einen Zusammenhang zwischen SASP-Faktoren, die von medikamenteninduzierten seneszenten Leberzellen produziert werden, und angeborener Immunität her, die weiter mit Gewebeumbau, chronischen Entzündungen und Karzinogenese in Verbindung gebracht werden kann 28,29,30,31. Herkömmliche Toxizitätsscreenings können uns nicht helfen, die kurzfristigen Wechselwirkungen zwischen der Leber und Immunzellen zu erfassen, noch können sie die langfristigen Auswirkungen von TKIs auf Leberentzündungen und Fibrose aufdecken, insbesondere im Zusammenhang mit chronischer Arzneimittelexposition. In Kombination mit einem geeigneten Proteomik-Ansatz zur Identifizierung von SASP-Bestandteilen kann diese Technik dazu beitragen, prädiktive Biomarker für TKI-induzierte Hepatotoxizität zu identifizieren und das Design therapeutischer Interventionen zu deren Milderung zu informieren 29,30,31.

Für die Implementierung sollten die Forscher wie beschrieben Co-Kultur- oder konditionierte Mediensysteme mit Leber- und Immunzelllinien verwenden und Biomarker der Seneszenz sowie M1- und M2-Makrophagen evaluieren. Diese Methode ist am effektivsten für die Beurteilung von medikamenteninduzierten akuten oder chronischen Leberschäden oder für die Erforschung von Strategien zur Minimierung von Off-Target-Effekten von Krebstherapien 29,30,31.

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Protokoll

1. Zellkultur

  1. Kultivieren Sie HepG2-Zellen in Modified Eagle Medium (MEM) mit hohem Glukosegehalt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und RAW264.7-Zellen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) hoher Glukose mit 10 % FBS bei 37 °C mit 5 % CO 2 und aktualisieren Sie sie alle 3 Tage.
    HINWEIS: Die Verwendung von Antibiotika wird nicht empfohlen, es sei denn, es liegt eine Pilz- oder Bakterienkontamination vor. RAW264.7-Zellen wachsen sehr schnell und sollten nach 2 Tagen passageiert werden.

2. MTT-Assay

  1. Zellzählung und Zellplattierung
    1. Züchten Sie HepG2-Zellen in einer 60-mm-Kulturschale in einem Zellkultur-Inkubator in vollständigen Wachstumsmedien (MEM + 10% FBS).
    2. Wenn die Zellen zu etwa 80 % konfluent waren, entfernen Sie das Wachstumsmedium, waschen Sie es schnell mit 1 ml 1x PBS und fügen Sie 600 μl 0,5x Trypsin hinzu. 5-6 Min. inkubieren.
      HINWEIS: Alle Schritte sollten in einem BSL 2-Zellkulturschrank durchgeführt werden.
    3. Neutralisieren Sie Trypsin, indem Sie 1,2 ml vollständiges Wachstumsmedium in das BSL 2 geben.
      HINWEIS: Um eine Übertrypsinisierung zu verhindern, sollte ein vollständiges Medium mit dem doppelten Volumen des zugesetzten Trypsins hinzugefügt werden.
    4. Nehmen Sie die Zellsuspension in ein 5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (MCT) und pelletieren Sie es, indem Sie es 3-4 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) bei 180 g (1000 U/min) zentrifugieren.
    5. Entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Medium, pipettieren Sie, um es als Einzelzellsuspension zu mischen, und zählen Sie mit einem Hämozytometer unter einem Mikroskop.
    6. Als nächstes werden HepG2-Zellen in einer 96-Well-Platte mit 5000 bis 7000 Zellen pro Vertiefung in vollständigem Wachstumsmedium in dreifacher Ausführung für jede Arzneimitteldosis plattiert und 12 bis 16 Stunden im Inkubator aufbewahrt.
      HINWEIS: Die Zellkonfluenz sollte für die medikamentöse Behandlung 50-60 % betragen, und dieser Schritt sollte in der Haube durchgeführt werden.
  2. Medikamentöse Behandlung
    1. Bereiten Sie allmählich ansteigende Arbeitskonzentrationen von Lapatinib und Neratinib in Dimethylsulfoxid (DMSO) aus der Stammkonzentration (30 mM bzw. 3,5 mM) in der Haube vor. Die Endkonzentrationen betragen 1, 2,5, 5, 10, 15, 25, 50 μM für Lapatinib und 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10 μM für Neratinib in Wachstumsmedien (MEM + 5 % FBS). Behalten Sie für beide Medikamente eine Behandlung ohne Behandlung bei.
    2. Entsorgen Sie das vorherige Medium von der 96-Well-Platte mit den Zellen, fügen Sie 100 μl Medium mit dem Medikament hinzu und inkubieren Sie es 48 Stunden lang im Inkubator.
  3. Färbung und Quantifizierung
    1. Nach 48 h 10 μl 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid-Farbstoff (MTT; 5 mg/ml) zugeben, in jeder Vertiefung in 1x Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) auflösen und mindestens 2 h im Inkubator inkubieren, bis violett gefärbte Kristalle erscheinen.
      HINWEIS: Geben Sie den Farbstoff direkt in arzneimittelhaltige Medien und inkubieren Sie die Zellen nicht länger als 4 Stunden mit dem Farbstoff.
    2. Entfernen Sie nach der Inkubation den Farbstoff, lösen Sie die Kristalle in 100 μl DMSO in jeder Vertiefung auf und inkubieren Sie 15 Minuten lang, gefolgt von der Messung der optischen Dichte (OD) bei 595 nm.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann außerhalb der Dunstabzugshaube durchgeführt werden.

3. SA-β Galactosidase-Assay

  1. Medikamentöse Behandlung
    1. HepG2-Zellen werden in 35-mm-Schalen mit einer Dichte von 40 x 10 Platten mit 40 x 10Zellen in drei Sätzen plattiert, einer für Lapatinib, einer für Neratinib und eine unbehandelte Kontrolle.
      HINWEIS: Die Schritte zur Zellzählung und -plattierung sind wie in Schritt 2.1 beschrieben.
    2. 1 μl Lapatinib aus 5 mM Arbeitsmaterial und 1,43 μl Neratinib aus 3,5 mM Hauptmaterial in 2 mL Medium geben, um eine Endkonzentration von 2,5 μM (subletale Dosis) Lapatinib und Neratinib zu erreichen.
      HINWEIS: Die subletale Arzneimitteldosis wird anhand des Zellüberlebensdiagramms im MTT-Assay ausgewählt.
    3. Nehmen Sie das vorherige Medium aus dem Geschirr und waschen Sie es einmal mit 500 μl 1x PBS, fügen Sie arzneimittelhaltiges Medium hinzu (in der Haube) und bewahren Sie es 48 h lang im Inkubator auf.
  2. Fixieren und Färben
    1. Entfernen Sie nach 48 h das Medikament, waschen Sie es einmal schnell mit 500 μl 1x PBS und fixieren Sie es mit 1,5 mL 2% Formaldehyd und 0,2% Glutaraldehyd in 1x PBS für 10 min bei RT.
    2. Waschen Sie die Platten nach der Fixierung zweimal mit 1 ml 1x PBS und stellen Sie sicher, dass die Fixierlösung korrekt entfernt wird. 1,5 mL Färbelösung (40 mM Zitronensäure/Na-Phosphat-Puffer, 5 mM K4[Fe(CN)6], 5 mM K3[Fe(CN)6], 150 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 1 mg/mL X-gal in autoklaviertem Wasser) zugeben und 8 h bei 37 °C ohne CO2 inkubieren.
      HINWEIS: Die Inkubationszeit kann je nach Zelltyp variieren. Bei HepG2 sollte die Inkubationszeit 8 Stunden nicht überschreiten.
    3. Waschen Sie die Platten nach dem Färben zweimal schnell in 1 ml 1x PBS und nehmen Sie Hellfeldbilder bei 20- und 40-facher Vergrößerung mit einem Epi-Fluoreszenzmikroskop auf. Erfassen Sie mindestens vier bis fünf Felder für jede Behandlungsgruppe.
      HINWEIS: Das Volumen des Fixiermittels und der Färbelösung variiert mit der Plattengröße, und alle Schritte können außerhalb der Haube durchgeführt werden.
  3. Quantifizierung von Bildern
    1. Nehmen Sie ein Bild von einem Feld auf, zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen sowie die Zellen mit einem blauen Signal. Berechnen Sie manuell den Prozentsatz der Zellen mit einem blauen Signal. Berechnen Sie mindestens vier Bilder, nehmen Sie den Durchschnitt, zeichnen Sie in einem Tabellendiagramm und führen Sie einen t-Test durch.

4. ROS-Erkennung

  1. Zellplattierung und medikamentöse Behandlung
    1. Platte HepG2-Zellen in 35 mm Glasbodenschalen mit einer Dichte von 40 x 104 Zellen pro Platte in drei Sätzen: eine für Lapatinib, eine für Neratinib und eine unbehandelte Kontrolle.
      HINWEIS: Die Schritte zur Zellzählung und -plattierung sind wie in Schritt 2.1 beschrieben.
    2. Befolgen Sie die gleiche Behandlungsstrategie wie in Schritt 3.1 beschrieben.
  2. Färbung und Bildgebung
    1. Nach 48 Stunden Behandlung 2 μM cell ROX deep red Reagenz (5 mM Stammmaterial), 1 μM Mito Tracker Green (1 mM Stammmaterial) für 30 min zugeben und mit 500 nM Kernfärbefarbstoff Hoechst (500 μM Stamm) gegenfärben.
      HINWEIS: In der Motorhaube sollte Farbstoff zugesetzt werden, und direkte Lichteinwirkung sollte vermieden werden. Die Gegenfärbung erfolgt durch Zugabe des Kernfärbefarbstoffs Hoechst während der Verabreichung anderer Farbstoffe.
    2. Entfernen Sie nach 30 Minuten den Farbstoff und waschen Sie ihn mit 1x PBS, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen, und fotografieren Sie mit einem konfokalen Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung (Ölemersion, 640 nm, 488 nm bzw. 405 nm Anregungswellenlänge).
  3. Quantifizierung von Bildern
    1. Quantifizieren Sie das Signal der Zelle ROX rot mit der Fiji ImageJ Software und vergleichen Sie es mit dem Signal der unbehandelten Kontrolle. Verwenden Sie MitoTracker grün, um anzuzeigen, dass das Signal von Mitochondrien stammt. Nachdem Sie die Balkendiagramme mit Durchschnittswerten gezeichnet haben, führen Sie einen t-Test durch.

5. Sammlung von konditionierten Medien (CM)

  1. Behandlung von HepG2-Zellen mit 2,5 μM Lapatinib oder Neratinib für 48 h (Behandlungsstrategie ähnlich wie in Schritt 3.1, außer in diesem Experiment, Platte 70 x104 Zellen in einer 60-mm-Schale).
  2. Entfernen Sie nach 48 h das Medikament und waschen Sie es einmal mit 500 μl 1x PBS.
  3. Am maximalen Tag der Seneszenz (nach 48 Stunden medikamentöser Behandlung) geben Sie 4 ml serumfreies MEM-Medium (ohne FBS oder andere Ergänzungen) zu den medikamentös behandelten Zellen sowie der unbehandelten Kontrolle für 48 Stunden.
    HINWEIS: Das Volumen des serumfreien Mediums hängt von der Plattengröße ab.
  4. Sammeln Sie anschließend das serumfreie Medium, das das gesamte Sekretom enthält, das als konditioniertes Medium bezeichnet wird, und lagern Sie es für die zukünftige Verwendung bei -80 °C.
    HINWEIS: Nach dem Sammeln des CM sollte es 5 Minuten lang bei 2800 g (4000 U/min) zentrifugiert werden, um abgestorbene Zellen und andere Zelltrümmer zu entfernen. RAW264.7-Zellen werden in der Regel in DMEM kultiviert, aber CM wird in MEM gemäß den HepG2-Kulturbedingungen gesammelt. Um die Kompatibilität zu erhalten, sollten konditionierte Medien vor der Inkubation mit RAW264.7 im Verhältnis 1:1 mit serumfreiem DMEM gemischt werden.

6. M1/M2-Polarisation in RAW264.7

  1. Beschichtung von Zellen
    1. Befolgen Sie die Zellzählung und Zellplattierung wie in Schritt 2.1 beschrieben, mit Ausnahme des Schritts der Trypsinisierung. Während der Trypsinisierung von RAW264.7-Zellen werden 600-700 μl 0,5x Trypsin zugegeben, 15-20 Minuten im Inkubator inkubiert und zur Neutralisierung von Trypsin 2 ml Wachstumsmedium (DMEM + 10% FBS) hinzugefügt und 70 x104 Zellen in einer 60-mm-Schale in drei Sätzen plattiert: Lapatinib, Neratinib und eine unbehandelte Kontrolle.
  2. RAW264.7 Induktion
    1. Entfernen Sie das normale Wachstumsmedium, waschen Sie es einmal mit 1 mL 1x PBS und fügen Sie das entsprechende CM für 48 h hinzu.
      HINWEIS: Bevor Sie das CM hinzufügen, stellen Sie sicher, dass Sie es mit serumfreiem DMEM im Verhältnis 1:1 konditionieren, da RAW264.7-Zellen in DMEM wachsen, so dass das Halten der Zellen in MEM Stress verursacht, der das Ergebnis beeinträchtigen kann. Die Kultivierung von RAW264.7 in CM (serumfreies Medium) für 48 Stunden kann ebenfalls Stress verursachen; In diesem Fall kann eine 24-30-stündige Inkubation durchgeführt werden, bevor die Daten gesammelt werden.
    2. Nach der Inkubation das CM entsorgen, mit 1 ml 1x PBS waschen, 600 μl Trypsin in jede Platte geben, 10 Minuten inkubieren und dann bei 180 g (1000 U/min) für 3 Minuten bei RT pelletieren. Verwenden Sie das Pellet zur Proteinreinigung oder lagern Sie es bei -80 °C für die zukünftige Verwendung.
      HINWEIS: Die Trypsinisierungszeit variiert je nach Zelltyp, und eine Zentrifugation über 180 g wird nicht empfohlen.
  3. Proteinisolierung und Western Blotting
    1. Bereiten Sie den Lysepuffer vor, indem Sie den Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA), den Lysepuffer und den Proteaseinhibitor-Cocktail im Verhältnis 100:1 mischen. Geben Sie den Lysepuffer zum Zellpellet, resuspendieren Sie ihn und inkubieren Sie ihn 30 Minuten lang auf Eis.
      HINWEIS: Das Volumen des Lysepuffers variiert mit der Größe der Zellpalette, und die Lyse kann außerhalb der Haube durchgeführt werden. Wenn das Pellet bei -80 °C gelagert wird, tauen Sie das Pellet zuerst auf Eis auf, drehen Sie es kurz durch und entfernen Sie alle Medienreste.
    2. Nach der Inkubation wird das Zelllysat bei 20.000 g für 30 min bei 4 °C geschleudert. Den Überstand auffangen und für Western Blot verfahren oder für die zukünftige Verwendung bei -20 °C lagern.
    3. Bereiten Sie die Proteinprobe vor, indem Sie 35-40 μg Protein entnehmen, 1x Ladefarbstoff hinzufügen, 5-6 min bei 95 °C erhitzen, SDS-PAGE (10% und 12% Acrylamidgel) bei 90 V laufen lassen und auf die Nitrozellulosemembran übertragen.
    4. HINWEIS: Für detailliertere Informationen zum Western Blot siehe Joubert et al.32.
    5. Überprüfen Sie die Expression von M1- und M2-Polarisationsmarkern, indem Sie den Blot mit einem Meerrettichperoxidase (HRP)-Entwickler, iNOS (M1) bzw. Arginase1 (M2) unter Verwendung von Anti-NOS2- und Anti-ARG1-Antikörpern entwickeln.
      HINWEIS: Die Konzentration für beide primären Antikörper, Anti-NOS2 und Anti-ARG1, beträgt 1:1000 und die Konzentration für sekundäre Anti-Kaninchen-Antikörper 1:10.000.
  4. Makrophagen-Polarisation mittels LPS und IFN-γ
    1. Platte 70 x 104 RAW264.7 Zellen in zwei 60 mm Schüsseln.
      HINWEIS: Das Beschichtungsverfahren ähnelt dem in Schritt 6.1.
    2. Nach 12-16 h 4 μl 1 μg/ml Lipopolysaccharid (LPS, Stammkonzentration beträgt 1 mg/ml) und 1,33 μl 33 ng/ml Interferon-γ (IFN-γ, Stammkonzentration 100 μg/ml) in 4 ml Wachstumsmedium (DMEM + 10 % FBS) mischen und zu dem vorplattierten RAW264.7 hinzufügen, wobei eine nicht induzierte Kontrolle beibehalten wird.
    3. Nach 48 Stunden wird das Zellpellet durch Trypsinisierung entnommen, das Protein isoliert, ein Western Blot durchgeführt und die Expression von iNOS (M1) bzw. ARG1 (M2) mit anti-iNOS- und anti-ARG1-Antikörpern überprüft.
      HINWEIS: Alle Zellkulturabfälle und biochemischen Abfälle sollten in einem Behälter für biologische Gefahrstoffe entsorgt, ordnungsgemäß autoklaviert und dann entsorgt werden.

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Ergebnisse

Eine Reihe von Assays wurde durchgeführt, um die Auswirkungen von TKI Lapatinib und Neratinib auf hepatozelluläre Karzinomzellen (HepG2) und ihre nachgeschalteten parakrinen Wirkungen auf Makrophagen zu bewerten. HepG2-Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Lapatinib oder Neratinib behandelt, und die Zellviabilität wurde nach 48 Stunden mit dem MTT-Assay gemessen (Abbildungen 1A, B). Basierend auf den Übe...

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Diskussion

Die vorliegende Studie untersucht die indirekten Auswirkungen der Behandlung mit Lapatinib oder Neratinib auf die Polarisation von Makrophagen durch konditionierte Medien, die aus TKI-behandelten HepG2-Leberzellen gewonnen wurden. Unter Verwendung von RAW264.7-Makrophagen beobachten wir einen M2-Phänotyp bei Exposition gegenüber den konditionierten Medien, was durch die Hochregulierung von ARG1 angezeigt wird. Morphologisch zeigten die behandelten Makrophagen eine charakteristische vergr...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Danksagungen

Die Autoren danken der Shiv Nadar Institution of Eminence für die Unterstützung der Infrastruktur. Diese Studie wird durch das Stipendium des Department of Science and Technology CRG/2022/003242 finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
HepG2-ZelllinieNCCSAdhärente Zelllinie
RAW264.7-ZelllinieNCCSAdhärente Zelllinie
DMEM (Dulbaccos modifiziertes Eagle Medium)HimediaAT066Hoher Blutzucker, Pulver
MEM (Modified Eagle Medium)Gibco611100-053Pulver
PBS (Phosphatpuffer-Kochsalzlösung)HimediaTS1101Pulver
Trypsin-EDTA-LösungHimediaTCL007Lösung
FBS (Fetal Bovine Serum)HimediaRM1112Flüssigkeit
MTT DyeHimediaTC191Pulver
LapatinibSelleckchemS2111Pulver
NeratinibCayman Chemical Company18404Pulver
DMSO (Dimethylsulfoxid) HimediaTC185Lösung
Formaldehyd RankemF0080Lösung
GlutaraldehydSigma-aldrich340855Lösung
Zitronensäuremonohydrat, reinHimediaGRM229Pulver
Natriumphosphat dibasisch wasserfrei  HimediaMB024Pulver
Kaliumferrocyanid, K4[Fe(CN)6]Fisher Scientific P-236-500
Kaliumferricyanid, K3[Fe(CN)6]Fisher Scientific P-232-500
NaClSRL41721Pulver
MgCl2-HexahydratHimediaGRM-1068Pulver
X-GalSRL45904Pulver
LipopolysaccharidSigma-aldrichL6529
Menschliches rekombinantes Interferon-&-Gamma;HimediaCF040-20MCG
Zell-ROX tiefrotes ReagenzThermofischer-WissenschaftlerC10422
HoechstInvitrogen, Thermo Fisher ScientificH3570Pulver
MitoTRACKER GrünInvitrogen, Thermo Fisher Scientific1842298Pulver
Anti-ARG1-AntikörperAffinitätDF6657Lösung, berechnete MW – 35 kDa, beobachtete MW – 65 kDa
Anti-NOS2-AntikörperCloudo Klonkorporation.PAA837Hu01Lösung, berechnete MW – 130 kDa, beobachtete MW – 65 kDa
Anti-iNOS-AntikörperAffinitätLösung, berechnete MW – 130 kDa, beobachtete MW – 120 kDa
Anti-GAPDH-AntikörperBiobharati LifeScience Pvt.LtdBB-AB0060Lösung
Anti-Kaninchen-AntikörperCayman Chemical Company10004301Lösung
Nitrocellulosemembran  Merck Millipore Ltd. HATF00010 (Produktnummer)
femtoLUCENTTMPLUS HRPG Bioscience 786-003
60-mm-SchüsselnNUCK150462
96-Brunnen-Platte, NUCK165306
Zellkultur-Inkubator Thermo Fisher Scientific371
Mikroskop 1. LEICA Invertiertes Mikroskop     2. Nikon Konfokalmikroskop 1. DMIL LED        2. Ti2E, A1R  Beide haben Modellnummern
iBright BildgebungssystemInvitrogen, Thermo Fisher ScientificCL1500 (Modellnummer)
KennzeichenleserBio-RADiMark-Mikroplattenleser
Zentrifuge Thermo Fisher ScientificSorvall ST 8R (Modellnummer)

Referenzen

  1. Xuhong, J. C., Qi, X. W., Zhang, Y., Jiang, J. Mechanism, safety and efficacy of three tyrosine kinase inhibitors lapatinib, neratinib and pyrotinib in HER2-positive breast cancer. Am J Cancer Res. 9 (10), 2103-2119 (2019).
  2. Yang, X., Wu, D., Yuan, S. Tyrosine kinase inhibitors in the combination therapy of HER2-positive breast cancer. Technol Cancer Res Treat. 19, 1533033820962140(2020).
  3. Slamon, D. J., et al. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 235 (4785), 177-182 (1987).
  4. Viganò, M., et al. Hepatotoxicity of small molecule protein kinase inhibitors for cancer. Cancers (Basel). 15 (6), 1766(2023).
  5. Chan, A., et al. Final efficacy results of neratinib in HER2-positive hormone receptor-positive early-stage breast cancer from the Phase III ExteNET trial. Clin Breast Cancer. 21 (1), 80-91.e87 (2021).
  6. Hoofnagle, J. H., Serrano, J., Knoben, J. E., Navarro, V. J. LiverTox: a website on drug-induced liver injury. Hepatology. 57 (3), 873-874 (2013).
  7. Guengerich, F. P. Cytochrome P-450 3A4: regulation and role in drug metabolism. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 39, 1-17 (1999).
  8. Jackson, K. D., Durandis, R., Vergne, M. J. Role of cytochrome P450 enzymes in the metabolic activation of tyrosine kinase inhibitors. Int J Mol Sci. 19 (8), 2367(2018).
  9. Paludetto, M. N., Puisset, F., Chatelut, E., Arellano, C. Identifying the reactive metabolites of tyrosine kinase inhibitors in a comprehensive approach: implications for drug-drug interactions and hepatotoxicity. Med Res Rev. 39 (6), 2105-2152 (2019).
  10. Kalgutkar, A. S., Dalvie, D. K. Drug discovery for a new generation of covalent drugs. Expert Opin Drug Discov. 7 (7), 561-581 (2012).
  11. Andreu, I., et al. Protein binding of lapatinib and its N- and O-dealkylated metabolites interrogated by fluorescence, ultrafast spectroscopy and molecular dynamics simulations. Front Pharmacol. 11, 576495(2020).
  12. Lin, W., et al. Promoting reactive oxygen species accumulation to overcome tyrosine kinase inhibitor resistance in cancer. Cancer Cell Int. 24 (1), 239(2024).
  13. Choi, Y. W., et al. Senescent tumor cells build a cytokine shield in colorectal cancer. Adv Sci (Weinh). 8 (4), 2002497(2021).
  14. Birch, J., Gil, J. Senescence and the SASP: many therapeutic avenues. Genes Dev. 34 (23-24), 1565-1576 (2020).
  15. Dong, Z., et al. Cellular senescence and SASP in tumor progression and therapeutic opportunities. Mol Cancer. 23 (1), 181(2024).
  16. Salminen, A., Kauppinen, A., Kaarniranta, K. Emerging role of NF-κB signaling in the induction of senescence-associated secretory phenotype (SASP). Cell Signal. 24 (4), 835-845 (2012).
  17. Lichtnekert, J., Kawakami, T., Parks, W. C., Duffield, J. S. Changes in macrophage phenotype as the immune response evolves. Curr Opin Pharmacol. 13 (4), 555-564 (2013).
  18. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat Immunol. 12 (11), 1035-1044 (2011).
  19. Wang, N., Liang, H., Zen, K. Molecular mechanisms that influence the macrophage M1-M2 polarization balance. Front Immunol. 5, 614(2014).
  20. Tardito, S., et al. Macrophage M1/M2 polarization and rheumatoid arthritis: a systematic review. Autoimmun Rev. 18 (11), 102397(2019).
  21. Novak, M. L., Koh, T. J. Macrophage phenotypes during tissue repair. J Leukoc Biol. 93 (6), 875-881 (2013).
  22. Kanterman, J., Sade-Feldman, M., Baniyash, M. New insights into chronic inflammation-induced immunosuppression. Semin Cancer Biol. 22 (4), 307-318 (2012).
  23. Mazzoni, M., et al. Senescent thyrocytes and thyroid tumor cells induce M2-like macrophage polarization of human monocytes via a PGE2-dependent mechanism. J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 208(2019).
  24. Hartley, J. W., et al. Expression of infectious murine leukemia viruses by RAW264.7 cells, a potential complication for studies with a widely used mouse macrophage cell line. Retrovirology. 5, 1(2008).
  25. Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogenesis study: phenotype and stimuli. J Cell Mol Med. 23 (5), 3077-3087 (2019).
  26. Li, Y., et al. D(-)-Salicin inhibits the LPS-induced inflammation in RAW264.7 cells and mouse models. Int Immunopharmacol. 26 (2), 286-294 (2015).
  27. Castell, J. V., Jover, R., Martínez-Jiménez, C. P., Gómez-Lechón, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
  28. Huang, Y., et al. The hepatic senescence-associated secretory phenotype promotes hepatocarcinogenesis through Bcl3-dependent activation of macrophages. Cell Biosci. 11 (1), 173(2021).
  29. Wang, B., Han, J., Elisseeff, J. H., Demaria, M. The senescence-associated secretory phenotype and its physiological and pathological implications. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (12), 958-978 (2024).
  30. Ohtani, N. The roles and mechanisms of senescence-associated secretory phenotype (SASP): can it be controlled by senolysis. Inflamm Regen. 42 (1), 11(2022).
  31. Cuollo, L., Antonangeli, F., Santoni, A., Soriani, A. The senescence-associated secretory phenotype (SASP) in the challenging future of cancer therapy and age-related diseases. Biology (Basel). 9 (12), 485(2020).
  32. Joubert, O., Nehmé, R., Bidet, M., Mus-Veteau, I. Heterologous expression of human membrane receptors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 601, 87-103 (2010).

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