Überwachung der Aufnahme und Lokalisation organischer Verbindungen in Pflanzengeweben mit einem hydroponischen 14-C-Radiomarkierungsassay und Phosphor-Imaging

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird eine Methode zur Untersuchung der pflanzenvermittelten Sanierung unter Verwendung von ¹⁴C-markierten organischen Schadstoffen vorgestellt. Es beschreibt die Vorbereitung hydroponischer Pflanzen, die Aufnahme von Radiomarkierungen und die Phosphorbildgebung, um die Absorption, Translokation und den Stoffwechsel von Schadstoffen zu verfolgen. Die Technik bietet ein wertvolles Instrument zur Bewertung des Phytosanierungspotenzials bei verschiedenen Pflanzenarten und Umweltschadstoffen.

Zusammenfassung

Die Phytoremediation, also der Einsatz von Pflanzen zur Minderung von Umweltschadstoffen, bietet einen nachhaltigen und kostengünstigen Ansatz zur Sanierung von Altlasten. Die Entwicklung von Methoden, die zur Aufklärung der Mechanismen hinter der pflanzlichen Aufnahme und dem Stoffwechsel von Schadstoffen beitragen, ist entscheidend für die Verbesserung der Phytosanierungspraktiken. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Bewertung der Aufnahme und Umwandlung organischer Schadstoffe durch Pflanzen unter Verwendung von radioaktiv markierten Verbindungen. ¹⁴C-markierte organische Verbindungen, wie z. B. C-Naphthensäuren des Modells ¹⁴, werden verwendet, um ihre Absorption, Translokation, Lokalisation und ihren Stoffwechsel in pflanzlichen Geweben zu verfolgen. Wir haben diese Methode bereits bei mehreren Pflanzenarten angewendet, darunter Elymus trachycaulus und Salix interior. Diese Beobachtungen werden hier durch die Modellpflanze Arabidopsis thaliana bestätigt, die hydroponisch in modifizierten Hoagland-Lösungen angebaut wird. Die Aufnahme von radioaktiven Markierungen wurde durch Flüssigszintillationszählung und Phosphor-Imaging überwacht, was die Visualisierung und Quantifizierung von radioaktiv markierten Verbindungen in pflanzlichen Geweben ermöglicht. Diese Methode beschreibt die Aufbereitung von Pflanzenmaterial, die Verwendung von radioaktiv markierten Verbindungen und den Prozess der Analyse der Verteilung und des Verbleibs von Schadstoffen in Pflanzen. Die Methode umfasst auch Strategien zur Bewertung der Exsudation von Verbindungen und ermöglicht die Bewertung sowohl der pflanzlichen Aufnahme als auch der Translokation von Umweltschadstoffen. Dieser Ansatz bietet Einblicke in pflanzenvermittelte Sanierungsprozesse und kann auf die Untersuchung einer Vielzahl von Umweltschadstoffen und Pflanzenarten angewendet werden.

Einleitung

Die Bioremediation ist eine Sanierungstechnologie, die durch biologische Einheiten wie Pflanzen und Mikroorganismen vermittelt wird. Die Phytosanierung, bei der Pflanzen oder Pflanzenprodukte verwendet werden, um Schadstoffe aus der Umwelt zu entfernen, kann die mikrobielle Sanierung ergänzen oder als Alternative dazu dienen, indem sie einige der Einschränkungen der alleinigen Verwendung von Mikroorganismen überwindet 1,2,3,4. Die Phytosanierung ist aufgrund der solarbetriebenen Prozesse von Pflanzen kostengünstig, bei denen Schadstoffe über ihre Wurzeln oder Triebe aufgenommen und zwischen Zellen und Geweben transportiert werden, wo sie metabolisiert, gebunden oder verflüchtigt werden können⁵. Die effektivsten Pflanzen für die Phytosanierung sind in der Regel widerstandsfähige, stresstolerante Arten mit hohen Transpirationsraten, schneller Biomasseproduktion und tiefen Wurzelsystemen, wie sie in den Gattungen Populus und Salix vorkommen⁶. Als sessile Organismen haben Pflanzen verschiedene Stoffwechselwege entwickelt, um mit toxischen Verbindungen in ihrer Umwelt fertig zu werden¹. Dies stattet sie mit einer Vielzahl von Genen und biochemischen Prozessen aus, die ihre Fähigkeit verbessern, mit Schadstoffen umzugehen.

Der Phytodegradationsrahmen, der erstmals von Sandermann et al. (1977)⁷ vorgeschlagen wurde, skizziert einen dreistufigen Prozess für die pflanzenvermittelte Entgiftung von Schadstoffen: Transformation, Konjugation und Kompartimentierung. In jeder Phase werden die Schadstoffe enzymatischen Modifikationen unterzogen, die ihre Hydrophilie erhöhen, ihre Toxizität verringern und sie anfälliger für die Sequestrierung oder weitere Mineralisierung machen⁴. Da Pflanzen jedoch hauptsächlich auf atmosphärisches Kohlendioxid zur Kohlenstofffixierung angewiesen sind, ist ihre Fähigkeit, organische Schadstoffe vollständig zu mineralisieren, möglicherweise begrenzt. Schadstoffe können stattdessen in Vakuolen oder Zellwänden sequestriert (Phytosequestrierung) oder in der Atmosphäre verflüchtigt werden (Phytoverflüchtigung)¹.

Eine zentrale Herausforderung in der Phytosanierungsforschung besteht darin, zu erkennen, ob Pflanzen organische Schadstoffe aus ihrer Umwelt aufnehmen und umwandeln können¹. Herkömmliche Nachweismethoden können die Wege der Schadstoffaufnahme und -translokation oft nicht genau verfolgen, was es schwierig macht, die Fähigkeit einer Anlage zur Sanierung bestimmter Schadstoffe zu beurteilen ^1,5. Radioaktiv markierte organische Kohlenstoff-14 (¹⁴C)-Verbindungen bieten eine leistungsstarke Lösung für dieses Problem. Indem sie Pflanzen ¹⁴C-markierten Schadstoffen aussetzen, können Forscher den Einbau von radioaktiv markiertem Kohlenstoff in Pflanzengewebe verfolgen und so einen genauen Einblick in die Aufnahme, Translokation und Umwandlung des Schadstoffs erhalten. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung von Pflanzenarten, die in der Lage sind, bestimmte organische Schadstoffe zu sanieren, und bietet eine zuverlässige Möglichkeit, die beteiligten physiologischen Wege zu bewerten. Letztendlich verbessert die Verwendung von ¹⁴C-markierten Verbindungen unser Verständnis des Phytosanierungspotenzials und unterstützt die Entwicklung effektiverer, gezielter Strategien zur Umweltsanierung.

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, bei der ¹⁴C-radioaktiv markierte organische Schadstoffe verwendet werden, um die Aufnahme, Translokation und den Verbleib dieser Schadstoffe aus einer hydroponischen Lösung durch Pflanzen zu überwachen. In einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung wurde eine ähnliche Methode zur Verfolgung des Verbleibs von ¹⁴C-markierten Herbiziden bei Blattapplikation beschrieben⁸. Die hier beschriebene Methode beschreibt jedoch, wie die Entfernung und Translokation von radioaktiv markierten Verunreinigungen aus hydroponischer Lösung zu beurteilen ist, mit Kommentaren, wie diese Methode an die Verwendung von Boden angepasst werden kann.

Protokoll

HINWEIS: Bevor Sie mit diesem Protokoll fortfahren, ist es wichtig, die einschlägigen institutionellen und nationalen Richtlinien und Vorschriften zur Sicherheit von Radioisotopen zu konsultieren. Kurz gesagt, fassen Sie alles radioaktive Material oder alles, was mit Radioisotopen in Kontakt gekommen sein könnte, mit Doppelhandschuhen, einem Laborkittel und einer Schutzbrille an. Das Verfahren wurde in einem speziellen Bereich im Labor mit Klebeband durchgeführt, um Abschnitte zu markieren, die Radioisotope enthalten. Reinigen Sie außerdem nach allen Eingriffen sofort die Glaswaren und Instrumente, tupfen Sie sie ab und testen Sie sie anhand von Szintillationszählungen auf das Vorhandensein kontaminierender Radioisotope. Alle Materialien und Flüssigkeiten, die in diesen Assays verwendet wurden, wurden ebenfalls in speziellen Behältern für radioaktive Abfälle entsorgt und gemäß den Richtlinien der University of Calgary und der Canadian Nuclear Safety Commission ordnungsgemäß entsorgt.

1. Zubereitung der Hoagland-Lösung

1. Bereiten Sie eine 0,5-fache (halbfeste) Hoagland-Lösung aus einer handelsüblichen Mischung her oder stellen Sie das Medium von Grund auf neu her, bestehend aus 0,5 mM NH₄H₂PO₄, 3 mM KNO₃, 2 mM Ca(NO₃)₂, 1 mM MgSO₄, 23 μM H₃BO₃, 5 μM MnCl₂•4H₂O, 400 nM ZnSO₄•7H₂O, 200 nM CuSO₄•5H₂O, 70 nM H₂MnO₄•1H₂O, 45 μM FeSO₄•7H₂O.
2. MES oder einen anderen geeigneten Puffer hinzufügen, um eine Endkonzentration von 10 mM zu erreichen.
3. Stellen Sie den pH-Wert auf den gewünschten Wert ein (hier lag der pH-Wert bei 5,0).

2. Herstellung der Radiomarkierungslösung

1. Das erforderliche Volumen von 0,5x Hoagland-Lösung (50 ml pro Replikat) wird in einen sauberen Kolben überführt.
2. Geben Sie 0,1-0,26 kBq/ml der radioaktiv markierten Verbindung in die Hoagland-Lösung.
   HINWEIS: In dieser Studie wurden ¹⁴in Methanol gelöste C-AdCA (Adamanan-1-carbonsäure) verwendet.
3. Den Kolben 2-3 Minuten lang gründlich schwenken.
4. Aliquotieren Sie 50 mL der Radiomarkierungslösung in 125 mL Erlenmeyerkolben für jedes Replikat.

3. Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) Vorbereitung der Pflanze

HINWEIS: Das Protokoll für den hydroponisch wachsenden Arabidopsis thaliana ist in Conn et al. (2013)⁹ detailliert beschrieben.

1. Entfernen Sie für jede Pflanze mit einer Schere eine Kappe aus einem Standard-1,7-ml-Mikrofugenröhrchen und stechen Sie mit einem Lederlocher ein Loch mit einem Durchmesser von 3 mm in die Mitte der Kappe.
2. Verschließen Sie vorübergehend die Oberseiten der Kappen mit Klebeband und füllen Sie die Kappen mit geschmolzenem 0,5x Hoagland-Medium mit 0,8 % Agar, dann legen Sie es in den Deckel einer modifizierten Tip-Box (dem Keimtank) (Abbildung 1A).
3. Arabidopsis-Samen werden durch aufeinanderfolgende Waschgänge in 70 % Ethanol für 10 Minuten, dann 5 Minuten sterilisiert und in der Durchflusshaube auf sterilem Filterpapier getrocknet.
4. Säen Sie die Samen durch das Loch, das in die Oberseite der Mikrozentrifugenkappe gestanzt ist, in das Agarmedium.
5. Stratifizieren Sie die Samen im Tip-Rack bei 4 °C für 2-4 Tage.
6. Bringen Sie das Keimbecken unter Langtagbedingungen (16 h hell, 8 h dunkel bei ~150 μmol/m,²s Licht und 22 °C) in eine Wachstumskammer.
7. Füllen Sie die Spitzenracks mit 0,5x Hoagland-Lösung.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Lösung den Agar berührt, um ein Austrocknen zu verhindern.
8. Züchten Sie die Pflanzen 2-3 Wochen lang und füllen Sie die Lösung nach Bedarf (alle 3-4 Tage) auf, damit der Agar in Kontakt mit der hydroponischen Lösung bleibt.
9. Verpflanzen Sie die Kappen und Setzlinge in eine Öffnung mit einem Durchmesser von 10 mm, die mit einer Bohrmaschine und einem Sägemeißel durch die Mitte eines 50-ml-Falcon-Rohrdeckels geschnitten wird (Abbildung 1B).
10. Bohren Sie mit einem Bohrer mit 30 mm Durchmesser (dem Reifebecken) 12 Löcher in den 10-Liter-Kunststoffdeckel.
11. Platzieren Sie die Falcon-Tubendeckel über den Öffnungen im Behälterdeckel, so dass die Wurzeln in den darunter liegenden Behälter gelangen.
12. Befestigen Sie die Ausströmersteine am Boden des Reifetanks und füllen Sie sie mit Hoagland-Lösung, bis die Wurzeln größtenteils untergetaucht sind.
13. Setze die Pflanzen wieder in die Wachstumskammer zurück und züchte weitere 6-8 Wochen (16 h hell, 8 h dunkel bei ~150 μmol/m,²s Licht und 22 °C), bis die Rosetten einen Durchmesser von etwa 10 cm haben.

Abbildung 1: Hydrokulturtanks für die Keimung und Reifung von Arabidopsis und das ¹⁴C-AdCA-Behandlungsgefäß. (A) Das Keimbecken, das zum Keimen von Arabidopsis-Samen für das hydroponische Wachstum verwendet wird. (B) Arabidopsis-Pflanzen im Reifebecken, bereit für Experimente. (C) Eine Arabidopsis-Pflanze, deren Wurzeln während des Versuchs in die ¹⁴C-AdCA-Lösung getaucht wurden. Die 50-ml-Kolben (das 14-C-Behandlungsgefäß) werden normalerweise während der Exposition mit Aluminiumfolie (nicht abgebildet) abgedeckt, um Algenwachstum zu verhindern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Baltische Binse (Juncus balticus Willd. ) Vorbereitung der Pflanze

1. Stratifizieren Sie die Samen zwischen zwei feuchten Stücken Filterpapier in einer Petrischale bei 4 °C für 1-2 Wochen.
2. Entfernen Sie das obere Filterpapier und stellen Sie die Schale unter Langzeitbedingungen (16 h hell, 8 h dunkel bei ~150 μmol/m,²s Licht und 22 °C) für 1 Woche in eine Wachstumskammer.
3. Umpflanzen Sie die Sämlinge in modifizierte Spitzengestelle, wie für Arabidopsis beschrieben (Schritt 3.1-3.4).
4. Bauen Sie die Pflanzen 2-3 Wochen lang an (16 h hell, 8 h dunkel bei ~150 μmol/m,²s Licht und 22 °C) oder bis die Wurzeln eine Länge von 3-4 cm erreichen.
5. Pflanzen in einen modifizierten 10-Liter-Behälter mit Ausströmersteinen umpflanzen, mit Hoagland-Lösung füllen, bis die Wurzeln größtenteils untergetaucht sind, und weitere 6-8 Wochen wachsen lassen (16 h hell, 8 h dunkel bei ~150 μmol/m,²s Licht und 22 °C).

5. Vorbereitung der Sandbankweide (Salix interior Rowlee)

HINWEIS: Das Protokoll für den Anbau von Sandbar-Weidenpflänzchen ist in Alberts et al. (2021)¹⁰ beschrieben.

1. Schneiden Sie 10 cm lange Stängelstecklinge (5 mm Durchmesser) ab und tauchen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur in_{diH 2}O ein, um sie mit Feuchtigkeit zu versorgen und die Bewurzelung anzuregen.
2. Übertragen Sie die hydratisierten Stecklinge mit 10 l 0,5x Hoagland-Lösung in belüftete Hydrokulturtanks und wachsen Sie 1 Monat lang (16 h hell, 8 h dunkel bei ~150 μmol/m,²s Licht und 22 °C), um das Wurzel- und Sprosswachstum zu etablieren.
   HINWEIS: Frischen Sie die Hoagland-Lösung alle 2 Wochen auf, um einen Nährstoffmangel während der Entwicklung der Pflänzchen zu vermeiden.

6. Radioisotopenmarkierung

1. Nach der Herstellung der Radiomarkierungslösung wird ein Aliquot von 100 μl aus der Lösung für die Flüssigszintillationszählung entnommen, um die anfängliche Isotopenkonzentration zu bestimmen.
2. Tupfen Sie die Pflanzenwurzeln vorsichtig trocken und geben Sie die Falcon-Röhrchenkappe in 125-ml-Erlenmeyerkolben (das 14-C-Behandlungsgefäß), die 0,5-fache Hoagland-Lösung mit den ¹⁴C-markierten organischen Verbindungen aus Schritt 2.4 enthalten.
3. Markieren Sie den Lösungsstand auf dem Kolben, um sicherzustellen, dass er während des Experiments unter Berücksichtigung der Evapotranspiration auf das Ausgangsvolumen aufgefüllt werden kann.
4. Wickeln Sie die Kolben in Aluminiumfolie ein und schütteln Sie sie bei 40-60 U/min unter Wachstumslicht für die Dauer des Assays oder bis die markierten Pflanzen für eine Chase-Periode in eine 0,5-fache Hoagland-Lösung ohne Radiomarkierung überführt werden.
5. Das Volumen im Kolben wird alle 1-2 h auf die in Schritt 6.3 mit Hoagland-Lösung ohne Radiomarkierung hergestellte Linie aufgefüllt, bevor 100 μl Aliquots entnommen werden. Stellen Sie sicher, dass Sie das Volumen des Hoagland-Kolbens messen, das jedem Kolben zugesetzt wird, um die Evapotranspirationsrate aus jeder Lösung zu vergleichen. Nach den ersten 6-8 h können sich die Probenahmezeiten auf alle 12-24 h erhöhen.
   HINWEIS: Dieser Schritt kann bei Bedarf mehrere Tage dauern, aber stellen Sie sicher, dass die Radioaktivität in den Aliquoten täglich überwacht wird, während das Experiment fortschreitet.
6. Optional: Zur Überwachung der Exsudation während der Chase-Periode wird die Anlage und die Falcon-Röhrchenkappe in einen Kolben mit 50 mL frischer Hoagland-Lösung (die keine ¹⁴C-markierte Verbindung enthält) überführt und in den ersten 6-8 Stunden alle 2 Stunden und dann in Abständen von 24 Stunden nach Beginn des Experiments ein Aliquot von 100 μl entfernt.
   HINWEIS: Zur Unterscheidung zwischen passiver diffuser und aktiver Exsudation der Verbindung aus den Pflanzenwurzeln kann ein aktiver Transportinhibitor wie Cyclosporin A in einer Konzentration von 20 μM zugesetzt werden.
7. Messen Sie die radioaktive Anzahl jedes Aliquots, das zwischen den Schritten 6.1 bis 6.6 gesammelt wurde, mit einem Flüssigszintillationszähler.

7. Phosphor-Bildgebung von Pflanzen

1. Spülen Sie die Wurzeln 15 Minuten lang in 0,5-facher Hoagland-Lösung ohne Radiomarkierung, um das lose gebundene Radioisotop zu entfernen.
2. Sammeln Sie 100 μl der Spüllösung für die Zählung der Flüssigszintillation.
3. Wiegen Sie die Pflanzen oder das nicht-holzige Pflanzenmaterial, um die frische Masse zu bestimmen.
4. Trocknen Sie das Pflanzenmaterial mit einem Geltrockner auf einem beschrifteten Stück Filterpapier bei 50 °C unter Vakuum für 2 h und lassen Sie es dann über Nacht bei Raumtemperatur trocknen.
   HINWEIS: Nach dem Trocknen können die Pflanzen für längere Zeiträume (4-6 Monate) gelagert werden und die Bildgebung kann zu einem späteren Zeitpunkt mit minimalem Abfall des radioaktiven Signals erfolgen.
5. Reinigen Sie das Phosphorsieb, indem Sie es 15 Minuten lang starkem Licht auf einem Phosphorradierer aussetzen.
6. 2-10 μl radioaktive Markierungslösung mit bekannter Radioaktivität auf ein Stück Filterpapier geben und über Nacht bei Raumtemperatur trocknen lassen.
   HINWEIS: Hier werden die Standards mit den Radioaktivitäten 67, 33, 17, 8, 4 und 2 Bq verwendet, die jedoch geändert werden können, um die Signalintensitäten der Pflanzenproben aufzunehmen.
7. Legen Sie das Phosphorsieb auf die getrockneten Pflanzenproben und die radioaktiven Standards im Dunkeln oder in einem geschlossenen undurchsichtigen Behälter und belichten Sie diese für mindestens 24 h.
   HINWEIS: Wenn das Bild unter- oder überbelichtet ist, passen Sie die Belichtungszeit entsprechend an.
8. Bilden Sie die Bildschirme mit einem Laserscanning-Phosphor-Imaging-System mit einer Auflösung von 50 μm ab.
9. Analysieren Sie die Intensitäten und Verteilungen des Phosphorbildsignals mit der ImageJ-Software¹¹.
   1. ImageJ Schritte: Öffnen Sie das Bild, indem Sie Datei auswählen > Analysieren > Messungen festlegen...  Bereich und mittlerer Grauwert auswählen > OK. Wählen Sie das Formauswahlwerkzeug, das am besten zum Gewebe passt. Klicken und ziehen Sie auf das Bild, um den Interessenbereich hervorzuheben. Drücken Sie Strg + M. Kopieren Sie den Bereich und den mittleren Grauwert in eine Tabelle.
10. Rechnen Sie die mittleren Grauwerte in Bq um, indem Sie die radioaktiven Standards in einer Standardkurve verwenden.
11. Berechnen Sie die Gesamtaktivität im Pflanzengewebe (integrierte Dichten) mit der folgenden Gleichung:
    Integrierte Dichte (Bq) = (Mittlere Bq des Gewebes (Bq/^{cm 2}) - Hintergrund (Bq/^{cm 2})) * Fläche (cm²)
    1. Optional: Konvertieren Sie das Graustufenbild mit der ImageJ-Software¹¹ in eine Farbintensitätsskala.

Ergebnisse

Das 14-C-Label-Aufnahmeverfahren ist auf eine Vielzahl von Pflanzenarten jenseits von Arabidopsis anwendbar, darunter Salix interior, Elymus trachycaulus (Link) Gould ex Shinners und Feuchtgebietsarten wie Juncus balticus^10,12. Zu repräsentativen Zwecken stellen wir jedoch Ergebnisse des Arabidopsis-Ökotyps Columbia-7 (Col-7) vor. Zuvor haben wir gezeigt, dass Umweltschadstoffe wie Naphthensäu...

Diskussion

Die Phytosanierung hat in den letzten Jahrzehnten als passive, wirtschaftliche und umweltfreundliche Methode zur Reinigung von Industrieabfällen und Altlasten an Bedeutung gewonnen¹. Die Identifizierung von Pflanzenarten mit erhöhter Schadstoffaufnahme und das Verständnis der molekularen Prozesse, die die Absorption organischer Moleküle steuern, könnten die Phytosanierungsstrategien verbessern. Im Gegensatz zu anderen indirekten Methoden kann die hier beschriebene...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Hoagland Modifizierte Basalsalzmischung	Laboratorien für Phytotechnologie	Nr. H353	Enthält Eisensulfat
Agar	BioShop	AGR001
MES (2-(N-Morpholino)-Ethansulfonsäure)	BioShop	MES555
pH-Messgerät	Mettler Toledo	FünfEinfach
Methanol	BioShop	MET302
12C-Adamantancarbonsäure	Sigma Aldrich	106399
14C-Adamantan-Carbonsäure	ViTrax		Kundenspezifische Synthese
125 mL Erlenmeyerkolben	VWR	30623-174
50 mL Falcon Röhrchen	VWR	CA21008-940
Mikrozentifugen-Röhrchen	VWR	87003-294
Pflanzenwachstumskammern	Conviron
Tipp-Boxen	DiaMed	DIATEC530-8376
Rubbermaid Roughneck 3 Gal Tragetasche	Amazonas	B0B3345MYH
Filterpapier	VWR	CA28320-020
Petrischale	VWR	11019-566
Schüttler mit Kolbenhaltern	Forma Scientific	Modell 4516
Szintillations-Cocktail	Forschungsprodukte International	111195
Szintillationsfläschchen	VWR	10014-296
Szintillationszähler	Beckman Coulter	LS 6000IC	Die verwendeten Fläschchen hängen von Ihrem Szintillationszähler ab
Gel-Trockner	Bio-Rad	Modell 583
Laserscanning-Phosphor-Imager	Bio-Rad	Molekularer Imager FX