Steuerbare in vivo Reprogrammierung von Tumorzellen zu konventionellen dendritischen zellähnlichen Zellen vom Typ 1

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die in vivo Reprogrammierung von Krebszellen der Maus in dendritisch-ähnliche Zellen vom Typ 1 innerhalb der Tumormikroumgebung durch erzwungene Expression der Transkriptionsfaktoren PU.1, IRF8 und BATF3.

Zusammenfassung

Die Wirksamkeit der Krebsimmuntherapie beruht auf der Rekrutierung und Aktivierung zytotoxischer T-Zell-Antworten gegen solide Tumore durch konventionelle dendritische Zellen vom Typ 1 (cDC1s). Die Erzeugung von cDC1s für die Krebsimmuntherapie ist jedoch mit erheblichen Einschränkungen konfrontiert, darunter eine schlechte Zellausbeute, funktionelle Heterogenität und Anfälligkeit für Immunsuppression in der Tumormikroumgebung (TME). Wir haben kürzlich eine Immuntherapie-Modalität entwickelt, die auf der In-vivo-Reprogrammierung von Krebszellen in immunogene cDC1-ähnliche Zellen basiert, die es Krebszellen ermöglichte, Tumorantigene als cDC1s zu präsentieren und polyklonale zytotoxische T-Zell-Antworten sowie eine dauerhafte systemische Anti-Tumor-Immunität hervorrief. Hier beschreiben wir ein handhabbares Protokoll zur Erzeugung von cDC1-ähnlichen Zellen innerhalb der TME durch Überexpression des minimalen cDC1-spezifischen genregulatorischen Netzwerks PU.1, IRF8 und BATF3 (zusammen als PIB bezeichnet) in Krebszellen, gefolgt von der subkutanen Implantation einer Mischung aus transduzierten und elterlichen Zellen. Die PIB-Überexpression treibt die allmähliche Akquisition des hämatopoetischen Markers CD45 und des professionellen Antigen-Präsentationskomplexes MHC Klasse II auf Tumorzellen voran und dient als Zelloberflächenauslesung für die in vivo cDC1-Reprogrammierung. Im Vergleich zum Reprogrammierungsprozess in vitro zeigte die Reprogrammierung des YUMM1.7-Mausmelanommodells in vivo eine schnellere Kinetik und eine höhere Effizienz. cDC1-ähnliche Zellen induzierten einen schnellen Umbau der TME, indem sie innerhalb der ersten 3 Tage Immunzellen des Wirts rekrutierten und bis zum 9. Tag zur Bildung einer tertiären lymphoiden Struktur führten. Reprogrammierte cDC1-ähnliche Zellen blieben mindestens 9 Tage lang in Tumoren bestehen, wurden aber an Tag 15 nicht entdeckt. Das hier beschriebene in vivo cDC1-Reprogrammierungsprotokoll bietet eine handhabbare und robuste Methode, um "immunkalte" Tumoren effektiv in "immunkalte" Tumoren umzuwandeln. Insgesamt bietet es eine leistungsstarke Plattform, um die Mechanismen zu untersuchen, die der cDC1-vermittelten Anti-Tumor-Immunität zugrunde liegen, und synergistische Kombinationen mit anderen Krebsimmuntherapie-Modalitäten aufzudecken.

Einleitung

Jüngste Fortschritte bei der Krebsimmuntherapie, einschließlich der Immun-Checkpoint-Blockade (ICB), der adoptiven Zelltherapie (ACT) und der Impfstoffe, haben die Landschaft der Krebsbehandlung verändert¹. Beim Melanom können die Ansprechraten auf die Hemmung des programmierten Zelltods Protein 1 (PD-1) und des zytotoxischen T-Lymphozyten-assoziierten Proteins 4 (CTLA-4) bis zu 60 %² erreichen. Dennoch sprechen über 40 % der Melanompatienten nicht auf ICB an, und die Ansprechraten bei weniger immunogenen Krebsarten wie Brustkrebs, mikrosatellitenstabilem Darmkrebs und Glioblastom bleiben unter 5 %, was klinische Lücken hervorhebt ^3,4,5. Ein Haupthindernis für einen breiten klinischen Erfolg ist die schlechte Aktivierung zytotoxischer T-Zell-Reaktionen, die von einer effizienten Antigenpräsentation in der Tumormikroumgebung (TME) ^abhängen6.

Konventionelle dendritische Zellen vom Typ 1 (cDC1s) sind selten, aber unverzichtbar für die Initiierung einer tumorspezifischen Immunität und bieten drei Schlüsselsignale für die Prime-T-Zell-Antworten: (1) professionelle Verarbeitung und Präsentation von Antigenen auf den Haupthistokompatibilitätskomplexen (MHC) Klasse I und II, (2) Co-Stimulation über CD80 und CD86 und (3) proinflammatorische Zytokin-Signalübertragung einschließlich IL-12 ^7,8. Unter den dendritischen Zellen (DC) zeichnen sich cDC1s durch die Kreuzpräsentation von Tumorzell-assoziierten Antigenen aus, um naive oder reaktivierende CD8⁺ T-Zellen zu primen oder die CD4⁺ T-Zell-Differenzierung zu Typ-1-T-Helferzellen (T_H1) voranzutreiben⁹. Darüber hinaus sind cDC1s die Hauptproduzenten von Chemokinen, den C-X-C-Motiv-Chemokin-Liganden 9 und 10 (CXCL9/10), die die Rekrutierung von T-Zellen an das Tumorgewebe vermitteln 10,11,12,13. In den letzten Jahren haben zahlreiche Studien gezeigt, dass die Tumorabstoßung und das effektive Ansprechen auf ICB oder ACT stark mit dem Vorhandensein von intratumoralem cDC1s korrelieren^12,13. Daher haben sich cDC1s zu einem attraktiven Ziel für die Krebsimmuntherapie entwickelt, und die erfolgreiche Nutzung ihrer einzigartigen Eigenschaften kann ein erhebliches translationales Potenzial haben.

Derzeitige Methoden zur Erzeugung von cDC1s basieren auf der Blutisolierung oder -differenzierung aus CD34⁺-Vorläuferzellen oder pluripotenten Stammzellen 14,15,16. Die vorherrschenden klinischen Strategien beruhen darauf, eine Mischung aus autologen DC-Untergruppen aus dem Blut zu isolieren und sie ex vivo mit Toll-like-Rezeptoragonisten oder proinflammatorischen Zytokinen zu stimulieren, um vor der Reinfusion ein ausgereiftes, immunogenes Programm zu induzieren¹⁶. Diese Strategien sind jedoch durch eine schlechte Zellreifung, immunsuppressive Barrieren in der TME und eine Teilmenge der Heterogenität in der infundierten DC-Mischung begrenzt, in der nur ein kleiner Teil von cDC1s vorhanden ist⁷. Darüber hinaus ist die Isolierung von cDC1s für die Krebsimmuntherapie oder -impfung eine Herausforderung, da sie im peripheren Blut extrem gering sind (<0,3 %)¹⁶. Darüber hinaus können cDC1s aus CD34⁺-Vorläuferzellen oder induzierten pluripotenten Stammzellen unter Verwendung von Zytokinen und NOTCH-Signalweg hergestellt werden. Diese Methoden erfordern jedoch komplexe und lange Protokolle und führen zu geringen Zahlen und heterogenen Populationen von DC-Untergruppen 17,18,19.

Um diese Einschränkungen zu beheben, bietet die In-vivo-Reprogrammierung eine geeignete Strategie für die Krebsimmuntherapie, um cDC1-ähnliche Zellen zu erzeugen, die den phänotypischen, transkriptionellen und funktionellen Eigenschaften von cDC1s^{ähneln 20}. Durch die Überexpression des cDC1-spezifischen minimalen genregulatorischen Netzwerks -- PU.1, IRF8 und BATF3 (zusammen als PIB bezeichnet) -- wurden Fibroblasten, Stromazellen und Krebszellen allmählich in cDC1-ähnliche Zellen umprogrammiert, die die Verarbeitung und Präsentation von Tumorantigenen auf MHC-Klassen I und II, die co-stimulatorische Signalübertragung über CD80 und CD86 und die Zytokin-/Chemokinsekretion, einschließlich CXCL9/10 und IL-12,^{ermöglichten 20,} 21,22,23. Die cDC1-Reprogrammierung verlief in menschlichen Xenotransplantaten in vivo und unabhängig von der Immunsuppression schneller und effizienter und erzeugte cDC1-ähnliche Zellen mit einer reifen immunogenen Signatur²⁰. In syngenen Melanomtumoren beobachteten wir, dass cDC1-ähnliche Zellen ihre TME umbauten, die Bildung einer tertiären lymphatischen Struktur (TLS) induzierten und polyklonale T-H1- und zytotoxische Gedächtnis-T-Zellen rekrutierten und expandierten, was zu einer langfristigen systemischen Immunität führte²⁰. Schließlich haben wir eine neuartige Krebsimmuntherapie-Modalität entwickelt, die auf der in situ Reprogrammierung von Krebszellen in cDC1-ähnliche Zellen durch intratumorale Injektion von adenoviralen Vektoren^{basiert 20}. Diese Ergebnisse ebnen den Weg für die klinische Umsetzung der cDC1-Reprogrammierung als neue Krebsimmuntherapie-Modalität, die die funktionellen Eigenschaften von cDC1s nutzen kann.

Hier stellen wir ein handhabbares Protokoll zur Generierung von cDC1-ähnlichen Zellen innerhalb des TME vor, das auf in vivo cDC1-Reprogrammierung basiert. Die lentivirale Verabreichung von PIB an Krebszellen und die anschließende Implantation als definierter Mix aus transduzierten Krebszellen mit nicht transduzierten elterlichen Krebszellen ermöglicht in vivo die Reprogrammierung einer kontrollierten Fraktion von Krebszellen innerhalb der TME. Darüber hinaus ist diese Methode nicht durch die In-situ-Verabreichungseffizienz viraler Vektoren begrenzt²⁰. Wir skizzieren die Schritte für eine effiziente Produktion lentiviraler Vektoren, die funktionelle Titration und die in vivo cDC1-Reprogrammierung am Beispiel des syngenen Melanommodells YUMM1.7. Wir beschreiben den experimentellen Aufbau und die Gating-Strategie zur Analyse in vivo reprogrammierter cDC1-ähnlicher Zellen mittels Durchflusszytometrie nach Tumordissoziation. Wir bieten auch die Schritte zur Bewertung von Veränderungen in der TME an, indem wir Kryokonservierung, Schnitte und Immunfluoreszenzfärbung von Tumorschnitten durchführen, gefolgt von konfokaler Mikroskopie. Schließlich befassen wir uns mit der Überwachung der cDC1-induzierten Immunität durch Messung des Tumorwachstums und des Tumorüberlebens. Dieser handhabbare und skalierbare Ansatz bietet Forschern ein wertvolles Werkzeug, um kombinatorische Behandlungsstrategien mit in vivo cDC1-Reprogrammierung zu bewerten, Veränderungen in der TME- und TLS-Neogenese in Krebsmodellen zu charakterisieren oder große Screenings durchzuführen, um die Expression verschiedener Immunsignale, z. B. der Antigenpräsentation oder der Zytokin-/Chemokinsekretion, zu modifizieren und deren Auswirkungen auf die Antitumorimmunität zu entschlüsseln.

Protokoll

Tierversuche wurden nach Genehmigung durch das schwedische Landwirtschaftsamt in Übereinstimmung mit den schwedischen Vorschriften durchgeführt.

1. Vorbereitung des Reagenzes

1. Zur Herstellung des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco werden 10 % (v/v) fötales Rinderserum (FBS), 1 mM Natriumpyruvat, 100 U/ml Penicillin (Pen), 2 mM Glutaminersatz und 100 mg/ml Streptomycin (Streptomycin) hinzugefügt.
2. Zur Herstellung eines RPMI 1640 Komplettmediums fügen Sie 10 % (v/v) FBS, 2 mM Glutaminersatz, 1 mM Natriumpyruvat, 50 mM 2-Mercaptoethanol, 100 U/ml Pen und 100 mg/ml Streptokokken hinzu.
3. Zur Herstellung von DMEM/F12-Komplettmedien fügen Sie 10 % (v/v) fötales Rinderserum (FBS), 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren und 100 U/ml Pen und 100 mg/ml Streptokokken hinzu.
4. Zur Herstellung von 1 mg/ml Polyethylenimin (PEI) lösen Sie 100 mg PEI-Pulver in 100 ml sterilem deionisiertem Wasser in einem Glasbecherglas oder konischen Röhrchen auf. Stellen Sie das Becherglas auf einen Magnetrührer und rühren Sie es bei Raumtemperatur (RT) um, bis es sich vollständig aufgelöst hat. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,9-7,1 ein, fügen Sie Salzsäure (HCl)/Natriumhydroxid (NaOH) tropfenweise hinzu und filtrieren Sie die Lösung durch einen 0,22 μm PES-Membranfilter.
5. Zur Herstellung von 1 mM Natriumbutyrat lösen Sie 1,10 mg in 10 ml sterilem deionisiertem Wasser auf.
6. Zur Herstellung von 8 mg/ml Polybren lösen Sie 80 mg Polybrene-Pulver in 10 ml sterilem entionisiertem Wasser auf.
7. Zur Herstellung von FACS-Puffer fügen Sie 2 % FBS und 1 mM EDTA zu phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hinzu.

2. Produktion von Lentiviren

1. Tauen Sie HEK 293T-Zellen auf, indem Sie 1 ml Zellen zu 9 mL vorgewärmtem Komplettmedium DMEM hinzufügen und die Zellen 5 Minuten lang bei 350 × g zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 20 mL DMEM-Komplettmedium und die Kulturzellen in einer 150-mm-Platte bei 37 °C mit 5 % CO₂.
2. Expandieren und teilen Sie HEK 293T-Zellen, wenn sie eine Konfluenz von 80-90 % erreichen. Um die Zellen zu teilen, waschen Sie sie einmal mit PBS, fügen Sie 5 ml Trypsin hinzu, um sie von der Platte zu trennen, und inkubieren Sie sie 5-10 min bei 37 °C mit 5% CO₂.
3. Sammeln Sie Zellen mit 5 mL DMEM-Komplettmedium, zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 350 × g und spalten Sie sie 1:6 in neue 150-mm-Platten, 48 Stunden vor der Transfektion.
   HINWEIS: Die Qualität der Lentivirus-produzierenden Zelllinie ist entscheidend für die Produktion hoher Titer. Lassen Sie die Zellen nicht mehr als 95 % Konfluenz überschreiten und vermeiden Sie es, sie bei einer Konfluenz von <30 % zu säen.
4. Nach 48 Stunden oder wenn die Zellen eine Konfluenz von 70-80 % erreichen, bereiten Sie die Transfektionsmischung in einem konischen 50-ml-Röhrchen vor. Verwenden Sie das folgende Transferplasmid: 1) SFFV-PIB-IRES-eGFP-ein polycistronischer lentiviraler Vektor, der die Transkriptionsfaktoren PU.1, IRF8, BATF3, eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES) und ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein (eGFP) als fluoreszierenden Transduktionsreporter enthält; oder 2) SFFV-eGFP, ein lentiviraler Kontrollvektor mit einer multiplen Klonierungsstelle und eGFP; oder 3) SFFV-mCherry, ein lentiviraler Vektor, der mCherry exprimiert. Zugabe von 10 μg Transferplasmid, 7,5 μg Verpackungsplasmid psPAX2 und 2,5 μg Hüllplasmid pMD2.G. Füllen Sie das Röhrchen mit Opti-MEM auf, um ein Gesamtvolumen von 2 mL zu erreichen. Zum Schluss fügen Sie der Transfektionsmischung 60 μl des Transfektionsreagenzes PEI (aus dem 1 mg/ml-Stamm) hinzu.
   HINWEIS: Der lentivirale Vektor SFFV-eGFP wird als Transduktionskontrolle für Reprogrammierungsexperimente verwendet, um die lentivirale Immunogenität zu berücksichtigen, während SFFV-mCherry zur Erzeugung fluoreszenzmarkierter Krebszelllinien verwendet wird.
5. Vortex: Die Transfektion mischt sich 1 min lang gründlich und inkubiert 15 min bei RT, um die Bildung von DNA-Lipid-Komplexen zu ermöglichen.
   HINWEIS: Die Konfluenz beeinflusst die Virustiter erheblich. Die Transfektion von Zellen mit einer Konfluenz von weniger als 70 % führt zu niedrigeren Virustitern, da weniger Zellen die Plasmide erhalten.
6. Aspirieren Sie das Medium der HEK 293T-Zellen und fügen Sie 10 mL DMEM ohne Pen/Step und mit 10 % sterilfiltriertem FBS hinzu.
7. Die Transfektionsmischung tropfenweise auf die 150 mm Platten geben und 16 h bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.
8. Nach der Transfektion wird das Medium durch 20 ml DMEM-Vollmedium ersetzt, das mit 1 mM Natriumbutyrat ergänzt wird, und die Zellen 24 Stunden lang bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.
   HINWEIS: Natriumbutyrat ist ein Histon-Deacetylase (HDAC)-Inhibitor der Klasse 1 und kann die Genexpression in HEK 293T-Zellen verbessern, indem es eine Histon-Hyperacetylierung induziert, die die Chromatinstruktur öffnet und die Transkription von Virusverpackungs- und Transferplasmiden erleichtert. Die Transfektionseffizienz kann durch Überprüfung der eGFP-Expression mit einem Fluoreszenzmikroskop beurteilt werden.
9. Sammeln Sie den Lentivirus-haltigen Überstand 48 h und 60 h nach der Transfektion in konische 50-ml-Röhrchen. Geben Sie nach der ersten Entnahme 12 mL vorgewärmtes DMEM-Komplettmedium pro 150-mm-Platte für die zweite Entnahme hinzu. Lagern Sie die Sammlungen bei 4 °C, filtrieren Sie sie durch einen 0,45 μm PES-Filter mit geringer Proteinbindung und kombinieren Sie sie.
10. Um das Virus zu konzentrieren, pipettieren Sie 37 g Lentivirus-haltiges Medium in 38,5 ml dünnwandige Polypropylen-Röhrchen. Messen Sie das Gewicht der Rohre mit einer Tischwaage.
    HINWEIS: Messen Sie das Gewicht des Lentivirus-haltigen Mediums und nicht dessen Volumen, da das Gewicht eine höhere Genauigkeit für den Ausgleich bietet. Das Gewicht der Röhrchen muss gut ausbalanciert sein, um eine Beschädigung der Ultrazentrifuge zu vermeiden.
11. Legen Sie die Röhrchen in die Ultrazentrifugationseimer, schließen Sie die Deckel und setzen Sie die Eimer in einen Ausschwingrotor. Bei 25.000 × g für 90 min bei 4 °C zentrifugieren.
12. Nach dem Zentrifugieren die Röhrchen aus den Eimern nehmen und den Überstand absaugen.
    HINWEIS: Die gleichen Röhrchen können wiederholt befüllt und für eine Gesamtanzahl von drei Zentrifugationsrunden verwendet werden, um ein größeres Lentivirus-Pellet pro Röhrchen herzustellen.
13. Legen Sie die offenen, dünnwandigen Polypropylen-Rohre 5 Minuten lang kopfüber auf ein Labortuch oder ein ähnliches saugfähiges Material, damit überschüssige Flüssigkeit abfließen und das Pellet trocknen kann.
14. Geben Sie 200 μl eiskaltes DMEM, ergänzt mit HEPES oder PBS, zu jedem Pellet. Legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in konische 50-ml-Röhrchen und schließen Sie den Deckel, um die Sterilität zu erhalten.
15. Inkubieren Sie das Pellet über Nacht bei 4 °C, um eine Resuspension zu ermöglichen.
16. Kombinieren Sie die resuspendierten Pellets, aliquot, und lagern Sie sie bis zu einem Jahr bei -80 °C.
    HINWEIS: Um einen Titerverlust durch wiederholte Gefrier- und Auftaurunden zu vermeiden, verwenden Sie kleinere aliquote Volumina (z. B. 50-200 μL).

3. Funktionelle Virustitration

HINWEIS: Dieser Schritt sollte für jede Charge von Lentiviren wiederholt werden, um die optimale Virusdosis zu bestimmen, die erforderlich ist, um ein Verhältnis von transduzierten (eGFP⁺) zu nicht transduzierten (eGFP^-) Zellen von 1:1 zu erreichen.

1. Auftauen und Expandieren von Krebszellen in geeigneten Nährmedien (z. B. die YUMM1.7-Mausmelanomzelllinie in DMEM/F12-Komplettmedium).
   HINWEIS: Die Zellen sollten vor einem Reprogrammierungsexperiment mindestens eine Teilungsrunde durchlaufen. Die Passagen der Zellen sollten zwischen den Experimenten ähnlich sein.
2. Einen Tag vor der Tumoretablierung ziehen Sie Krebszellen auf, indem Sie ihre Nährmedien aspirieren, einmal mit PBS waschen und 2 ml oder 5 ml Trypsin pro 100-mm-Platte oder 150-mm-Platte hinzufügen. Inkubieren Sie 5-10 Minuten lang bei 37 °C mit 5 % CO₂ und sammeln Sie die Zellen, indem Sie 8 mL bzw. 5 mL vollständiges Medium pro 100 mm bzw. 150 mm Platte in konische 50 mL Röhrchen geben.
3. Die Zellen werden 5 Minuten lang bei 350 × g zentrifugiert, um Trypsin zu entfernen und in vollständigem Medium zu resuspendieren.
4. Nehmen Sie ein 10 μl Aliquot von Zellen, fügen Sie 10 μl Trypanblau hinzu und zählen Sie lebensfähige Zellen mit einem Hämozytometer.
5. 6 × 10⁵ Zellen werden in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen mit 12 ml vollständigem Medium überführt und 12 μl 8 mg/ml Polybren in die Zellsuspension gegeben, um eine Arbeitskonzentration von 8 μg/ml zu erreichen.
6. Pipettieren Sie 2 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung auf einer 6-Well-Gewebekulturplatte.
   HINWEIS: Erhöhen Sie bei Bedarf die Zellzahl auf 1,2-1,8 x 10⁶ pro 6-Well-Platte.
7. Geben Sie in jeder Vertiefung zunehmende Volumina an Lentiviren, um das optimale Volumen zu bestimmen, das erforderlich ist, um ein Verhältnis von transduzierten (eGFP⁺) zu nicht transduzierten (eGFP⁺) Zellen von 1:1 zu erreichen.
   HINWEIS: Fügen Sie die empfohlenen Lentivirus-Volumina von 1, 2, 4, 8, 16 und 32 μl in dreifacher Ausfertigung hinzu. Führen Sie die funktionelle Titration für die leeren lentiviralen Kontrollvektoren SFFV-eGFP und SFFV-mCherry durch.
8. Die Zellen werden 24 h bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert.
9. An Tag 0 werden die lentivirushaltigen Medien entfernt, durch frische Medien ersetzt und 72 h bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert.
10. Überprüfen Sie die Zellen an Tag 3 unter einem Fluoreszenzmikroskop auf eGFP-Expression.
    HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht eine schnelle Überprüfung der Zelltransduktion, ersetzt jedoch nicht die Durchflusszytometrie in Schritt 3.14 zur Bestimmung des genauen Verhältnisses von eGFP⁺- zu eGFP-Zellen.
    In einigen Krebszellen (z. B. B16-Melanomzellen der Maus) kann das eGFP-Signal niedrig sein und mit einem Fluoreszenzmikroskop schwer zu erkennen sein. Es wird empfohlen, direkt mit der Durchflusszytometrie fortzufahren.
11. Aspirieren Sie das Medium, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und fügen Sie 500 μl Trypsin pro Vertiefung hinzu. 5-10 min bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.
12. Erhöhen Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit 1,5 ml FACS-Puffer und pipettieren Sie die Zellsuspension in 5-ml-Polystyrolröhrchen. Nehmen Sie ein Aliquot und zählen Sie lebensfähige Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau-Färbung.
13. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension 5 Minuten lang bei 350 × g , resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl FACS-Puffer und fahren Sie mit der Durchflusszytometrie-Analyse fort.
14. Quantifizieren Sie das genaue Verhältnis von transduzierten (eGFP⁺) zu nicht transduzierten (eGFP^-) Zellen durch Durchflusszytometrie. Verwenden Sie für In-vivo-Tests das Lentivirusvolumen, das einem Verhältnis von 1:1 am nächsten kommt.
    HINWEIS: Um das Verhältnis von eGFP⁺- zu eGFP-Zellen genau zu bestimmen, schließen Sie nicht transduzierte Krebszellen als Negativkontrollen für das Gating ein.

4. Subkutane Tumoretablierung für die in vivo Reprogrammierung

1. Auftauen und expandieren Sie Krebszellen in ihrem geeigneten Kulturmedium zur Erzeugung von mCherry-exprimierenden Zellen.
   HINWEIS: Die mCherry-Expression erleichtert die Unterscheidung von Krebszellen während der Durchflusszytometrie-Analyse von anderen Populationen im Tumor, z. B. endogenen Stroma- und Immunzellen.
2. Die Schritte 3.2 bis 3.4 werden durchgeführt und die Zellen in vollständigen Medien in einer Konzentration von 10⁵ Zellen pro ml resuspendiert.
3. Geben Sie 8 μg/ml Polybren und das bestimmte Volumen des SFFV-mCherry-Lentivirus in die Zellsuspension, um eine Transduktionseffizienz von >90 % zu erreichen.
   HINWEIS: Wenn das Erreichen einer Transduktion von >90 % die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigt, sortieren Sie mCherry⁺ -Zellen 72 Stunden nach der Transduktion durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) und expandieren Sie die sortierten Zellen in Kultur.
4. 5 ml der Zellsuspension (mit 5 × 10⁵ Zellen) pro 100 mm Platte auffüllen und die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 24 h inkubieren.
5. Nach 24 h wird das Medium durch 10 ml vollständiges Medium ersetzt und die Zellen erweitert, indem man sie mindestens 7 Tage lang bei 37 °C mit 5 % CO₂ kultiviert, bevor man mit den Reprogrammierungsexperimenten beginnt.
6. Nach der Expansion befolgen Sie die Schritte 3.2-3.4, um die Zellsuspensionen für die anschließende Transduktion mit dem zuvor bestimmten Volumen von SFFV-PIB-IRES-eGFP vorzubereiten, was zu einem engsten Verhältnis von 1:1 von transduzierten (eGFP⁺) zu nicht transduzierten (eGFP^-) Zellen an Tag 3 führt.
7. Geben Sie 8 μg/ml Polybren in die Zellsuspension zusammen mit dem zuvor bestimmten Volumen an Lentivirus in konischen 50-ml-Röhrchen in die Zellsuspension. Gut mischen, ohne Blasen zu bilden.
8. 2 ml der Zellsuspension (mit 10⁵ Zellen) pro Well in eine 6-Well-Gewebekulturplatte pipettieren und 24 h bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.
   HINWEIS: Alternativ können Sie die Zellen in 5 ml Transduktionsmedium in 100-mm-Gewebekulturplatten plattieren. Es ist jedoch zu beachten, dass die Transduktionseffizienz bei größeren Volumina verringert sein kann und empirisch bestimmt werden sollte, wie in den Schritten 3.1-3.13 beschrieben.
   Es wird empfohlen, mindestens 10 % mehr Zellen zu transduzieren, um einen möglichen Zellverlust während des Transduktionsprozesses zu kompensieren und ein ausreichendes Volumen für das Pipettieren oder die Injektion während der Tumoretablierung zu gewährleisten.
9. Nach 24 h das lentivirushaltige Medium entfernen, zweimal mit PBS waschen, 500 μl Trypsin in jede Vertiefung geben und 5-10 min bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.
10. Prüfen Sie unter einem Lichtmikroskop, ob sich die Zellen vollständig von den Platten dissoziiert haben, und sammeln Sie sie dann mit dem vollständigen Medium in konischen 50-ml-Röhrchen.
11. Pelletieren Sie die Zellen, indem Sie sie 5 Minuten lang bei 350 × g zentrifugieren, waschen Sie das Pellet mit PBS und zentrifugieren Sie erneut 5 Minuten lang bei 350 × g. Nehmen Sie ein Aliquot und zählen Sie lebensfähige Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau-Färbung.
12. Resuspendieren Sie das Pellet in eiskaltem PBS, um eine Konzentration von 2-4 × 10⁷ Zellen pro ml zu erreichen, was 1-2 × 10⁶ Zellen in 50 μl Injektionsvolumen pro Tumor entspricht.
    HINWEIS: Wichtig ist, dass diese Zahlen für YUMM1.7-Melanomtumoren validiert wurden, um in vivo reprogrammierte cDC1-ähnliche Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse zu isolieren. Für andere Zelllinien und für andere experimentelle Messungen, wie z. B. Tumorwachstums- und Überlebensexperimente, müssen die Zahlen empirisch überprüft werden. Für Experimente zum Tumorwachstum und -überleben werden niedrigere Zellzahlen von 100.000 bis 250.000 Zellen pro Tumor empfohlen.
13. Ziehen Sie in den Arbeitsbereich um, in dem Tierversuche durchgeführt werden, und halten Sie die Zellen auf Eis.
    HINWEIS: Führen Sie nach der Zellvorbereitung so schnell wie möglich Zellinjektionen durch, da die Lebensfähigkeit der Zellen mit der Zeit abnimmt.
14. Bereiten Sie die Anästhesielösung vor, die 3 μl Xylazin (20 mg/ml), 27 μl Ketamin (100 mg/ml) und 30 μl PBS pro Maus enthält.
15. Anästhesieren Sie CD45.1-Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 60 μl Anästhetikum. Randomisieren Sie die Mäuse und halten Sie sie auf einem Wärmekissen, um einen Abfall der Körpertemperatur zu vermeiden. Tragen Sie Augencreme auf die Augen auf, um eine Austrocknung der Augen während der Narkose zu verhindern.
    HINWEIS: Es ist wichtig, CD45.1-Mäuse zu verwenden, um eine Unterscheidung zwischen in vivo reprogrammierten cDC1-ähnlichen Zellen, die das Wildtyp-CD45.2-Allel exprimieren, und endogenen Immunzellen zu ermöglichen. Wenn es sich bei der Zelllinie um CD45.1 C57BL/6 handelt, können Mäuse (CD45.2) als Empfänger verwendet werden. Die Mäuse sollten zwischen den Versuchsgruppen nach Geschlecht und Alter abgestimmt und vor der Tumorbildung randomisiert werden.
16. Warten Sie 5-10 Minuten, bis alle Mäuse vollständig betäubt sind.
17. Rasieren Sie die rechte Flanke der Mäuse mit einem Rasiermesser; Optional können Sie diese mit einem Ohrabschneider markieren. Desinfizieren Sie die Stelle und wischen Sie die restlichen Haare mit 70% Ethanol weg.
18. Resuspendieren Sie Krebszellen, indem Sie mit einer P1000-Pipette auf und ab pipettieren. Laden Sie die Zellsuspension in eine 0,5 mL 30 G Spritze.
19. Heben Sie die Haut der rasierten Flanke der Maus vorsichtig mit zwei Fingern an und führen Sie die Spitze der Nadel dort ein, wo die Haut eine Falte bildet.
    HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, dass Sie sich mit der Nadel die Finger durchstechen.
20. Lösen Sie die Haut, halten Sie die Spritze mit einer Hand fest und dehnen Sie mit zwei Fingern der anderen Hand die Haut der Maus.
21. Injizieren Sie langsam 50 μl der Krebszellsuspension, um an der Injektionsstelle eine ovale Ausbuchtung (subkutane Schwellung) zu erzeugen.
    HINWEIS: Wenn sich keine Ausbuchtung bildet, ist die Suspension möglicherweise in das umgebende Unterhautgewebe ausgelaufen, was zu einer inkonsistenten oder fehlgeschlagenen Tumorbildung führen kann.
22. Überwachen Sie nach dem Eingriff das Aufwachen aller Mäuse, um das Überleben nach der Anästhesie zu gewährleisten.
23. Halten Sie die Mäuse in einer kontrollierten Temperaturumgebung mit 23 ± 2 °C und einem festen Hell-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden und freiem Zugang zu Futter und Wasser.
    HINWEIS: Wenn Sie das Tumorwachstum überwachen möchten, fahren Sie mit den Schritten 4.24-4.26 fort. Andernfalls überspringen Sie diese Schritte und fahren Sie direkt mit den nächsten Abschnitten fort.
24. Um das Tumorwachstum zu überwachen, halten Sie die Maus vorsichtig mit einer Hand fest, um eine klare Visualisierung des Tumors zu ermöglichen.
25. Messen Sie mit einem elektronischen Messschieber die Länge (l), Breite (b) und Höhe (h) des Tumors. Berechnen Sie das Tumorvolumen (V) mit der Formel: V = (l x b x h) / 2.
26. Messen Sie die Tumordimensionen alle zwei bis drei Tage. Wenn der Tumor ein Volumen erreicht, das das humane Endpunktkriterium erfüllt (z. B. 1.500 mm³), schläfern Sie das Tier gemäß den ethischen und institutionellen Richtlinien ein.

5. Tumorisolierung für die durchflusszytometrische Analyse

1. Bereiten Sie Scheren, Pinzetten, FACS-Puffer und 12-Well-Nicht-Gewebekulturplatten mit eiskaltem RPMI-Komplettmedium für die Entnahme von Tumorproben vor.
2. Bereiten Sie die Tumorverdauungslösung vor, indem Sie 30 μl 100 mg/ml Kollagenase D und 3 μl 10 mg/ml DNAse I in 3 ml RPMI-Komplettmedium pro Tumor mischen (um eine Arbeitskonzentration von 1 mg/ml Kollagenase D und von 10 μg/ml DNAse I zu erreichen).
   HINWEIS: Wenn die Verdauungseffizienz suboptimal ist, fügen Sie 2-5 mM CaCl₂ hinzu, um die Kollagenaseaktivität zu unterstützen.
3. Euthanasieren Sie die Mäuse durch Gebärmutterhalsluxation oder CO₂ -Erstickung am Tag der Isolierung.
4. Exzitieren Sie subkutane Tumoren mit Schere und Pinzette und legen Sie jeden Tumor mit eiskaltem RPMI in eine Vertiefung der 12-Well-Nicht-Gewebekulturplatte. Versuchen Sie, die Exzision von Nicht-Tumorgewebe zu minimieren.
5. Schneiden Sie die Tumorproben mit einer Schere in 1-2 mm³ Stücke, sammeln Sie die Stücke in konische 50-ml-Röhrchen mit 3 mL Aufschlusslösung und inkubieren Sie bei 37 °C unter Schütteln bei 200-250 U/min für 30-45 Minuten.
   HINWEIS: Alle 15 Minuten vortexen oder pipettieren, um den Verdauungsprozess zu erleichtern.
6. Nach dem Aufschluss pipettieren Sie die Mischung 1 Minute lang kräftig mit einer serologischen 5-ml-Pipette. Filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 70 μm Zellsieb in ein neues konisches 50 mL Röhrchen.
7. Verwenden Sie den Kolben einer 10-ml-Spritze, um unverdaute Stücke gegen das 70-μm-Zellsieb zu schlagen, und spülen Sie das Sieb mit 10 mL RPMI-Komplettmedium aus.
8. Die Zellsuspension wird 5 Minuten lang bei 4 °C bei 350 × g zentrifugiert, in 1 ml FACS-Puffer resuspendiert und lebensfähige Zellen gezählt.
9. Die Zellsuspension wird in 5 mL Polystyrolröhrchen überführt, die Zellen 5 Minuten lang mit 350 × g gekörnt und 10⁶ lebensfähige Zellen pro 100 μl FACS-Puffer resuspendiert.
10. Separate Zellen für einfarbige (SC) und FMO-Steuerungen in separaten Polystyrolröhrchen.
11. Bereiten Sie einen Antikörper-Färbe-Mastermix mit Rattenserum (1:100) vor, um eine unspezifische Bindung zu blockieren. ein fixierbarer Viabilitätsfarbstoff (1:100), um tote Zellen in der Analyse auszuschließen; und fluoreszenzmarkierte Antikörper anti-CD45.1, anti-CD45.2 und anti-MHC-II in ihrer optimalen Konzentration. Geben Sie 100 μl des Mastermixes zu jeder Probe und inkubieren Sie 20 Minuten lang bei 4 °C im Dunkeln.
12. Waschen Sie die Proben 2x mit 2 mL FACS-Puffer und fahren Sie mit der Durchflusszytometrie-Analyse fort.
13. Quantifizieren Sie den Prozentsatz von cDC1-ähnlichen Zellen, die CD45.2 und/oder MHC-II exprimieren, durch Gating in transduzierten (eGFP⁺) Krebszellen (CD45.1-mCherry⁺).
    HINWEIS: Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine Immunphänotypisierung von Tumoren nach einer in vivo cDC1-Reprogrammierung durchzuführen, indem das Färbepanel mit Antikörpern gegen endogene lymphoide und/oder myeloische Immunzellpopulationen ergänzt wird.

6. Einfrieren und Schneiden von Tumoren für die konfokale Mikroskopie

1. Bereiten Sie sich auf die Tumorisolierung vor, indem Sie die Schritte 5.1 und 5.3 befolgen. Exzitieren Sie subkutane Tumoren mit Schere und Pinzette.
2. Fixieren Sie Tumore in frisch zubereitetem 4%igem Paraformaldehyd (PFA) in PBS bei 4 °C durch sanftes Schütteln. Passen Sie die Fixierungszeit an die Tumorgröße an, wobei Sie 1 h pro mm³ Gewebe als Richtwert verwenden.
3. Tumoren in 15 % Saccharose in PBS übertragen und bei 4 °C inkubieren, während das Gewebe vorsichtig geschüttelt wird, bis es auf den Boden des Röhrchens sinkt. Verschieben Sie sie dann unter den gleichen Bedingungen auf 20% Saccharose in PBS.
4. Sobald sich die Tumore am Boden des Röhrchens abgesetzt haben, inkubieren Sie sie in einer 1:1-Mischung aus 20% Saccharose in PBS und OCT-Verbindung für 30 min bei 4 °C unter Schütteln.
5. Entfernen Sie die Mischung, betten Sie das Gewebe in einen Kryomold mit 100% OCT ein und frieren Sie es mit flüssigem Stickstoff ein.
   HINWEIS: Tragen Sie immer geeignete persönliche Schutzausrüstung (Kryohandschuhe, Gesichtsschutz und Laborkittel), um Kälteverbrennungen oder Verletzungen durch schnelle Dampfausdehnung zu vermeiden. Arbeiten Sie in einem gut belüfteten Bereich, um Erstickungsgefahr zu vermeiden.
   1. Lagern Sie die Blöcke bei -80 °C in geschlossenen Behältern, um eine Austrocknung zu verhindern.

7. Immunfluoreszenzfärbung von Tumorschnitten

1. Schneiden Sie die Tumore mit einem Kryostaten in ca. 8 μm dicke Schnitte und montieren Sie sie auf Objektträger. Lagern Sie die Objektträger bei Bedarf bei -80 °C.
   HINWEIS: Um die Integrität des Gewebes zu erhalten, bewahren Sie die Blöcke und Objektträger mit montierten Tumorschnitten während des Transports zum und vom Kryostaten auf Trockeneis auf. Stellen Sie sicher, dass der Kryostat während des Schneidens bei -20 °C gehalten wird.
2. Tauen Sie die Objektträger 5 min lang in PBS auf und fixieren Sie sie 10 min lang in einer 4%igen PFA-Lösung bei RT.
3. Nach dem Fixieren die Objektträger 5 Minuten lang in PBS waschen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Gewebe hydratisiert bleibt; Bewahren Sie sie während aller nachfolgenden Färbeschritte immer in Flüssigkeit auf. Wenn das Experiment pausiert werden muss, können die Objektträger bis zu 3 Stunden lang in PBS bei RT gespeichert werden. Vermeiden Sie es, die Objektträger über Nacht in PBS zu lagern.
4. Für die Antigengewinnung füllen Sie einen Dampfgarer mit Wasser und schalten Sie ihn ein. Stellen Sie ein Glas mit deionisiertem Wasser und ein Glas mit 10 mM Natriumcitrat (pH 6) in den Dampfgarer und decken Sie die Öffnung mit Alufolie ab. Führen Sie, ohne den Deckel zu entfernen, ein Thermometer durch die Lüftungsschlitze des Dampfdeckels, durchstechen Sie die Aluminiumfolie und überwachen Sie die Temperatur, um sicherzustellen, dass die Lösungen ~99 °C erreichen.
5. Wenn die Puffer ~99 °C erreichen, tauchen Sie die Objektträger 10 s lang in entionisiertes Wasser und überführen Sie sie dann schnell in die Antigen-Rückgewinnungslösung.
6. Inkubieren Sie die Objektträger bei ~99 °C für 15 min.
7. Waschen Sie die Objektträger in 1x PBS für 3 x 5 min.
8. Verwenden Sie einen hydrophoben Barriere-Pap-Stift, um jeden Gewebeabschnitt abzugrenzen und einen hydrophoben Perimeter zu bilden, der verhindert, dass Flüssigkeit, die dem Gewebe zugesetzt wird, austritt.
   HINWEIS: Nachfolgende PBS-Waschungen können den hydrophoben Perimeter, der das Gewebe umgibt, stören und eine Erneuerung erfordern. Zeichnen Sie es bei Bedarf erneut.
9. Blockieren und permeabilisieren Sie das Gewebe mit 150 μl Blockierungspuffer (5 % Serum und 0,5 % Triton X-100 in 1x PBS) für 60 Minuten bei RT. Verwenden Sie für alle Färbeschritte Serum von der gleichen Spezies wie der Wirt des Sekundärantikörpers.
10. Waschen Sie die Objektträger in 1x PBS für 3 x 5 min.
11. Inkubieren Sie das Gewebe mit 20 μg/ml des primären Anti-CD45-Antikörpers in einem Blockpuffer (5 % Serum und 0,5 % Triton X-100 in 1X PBS) über Nacht bei 4 °C.
    HINWEIS: Um andere Antikörper zu verwenden, validieren Sie die Antikörperkonzentration empirisch.
12. Waschen Sie die Objektträger in 1x PBS für 3 x 5 min.
13. Inkubieren Sie die Gewebeschnitte mit dem Ziegen-Anti-Ratten-Sekundärantikörper, der mit AlexaFluor-647 konjugiert ist, in einer Verdünnung von 1:250 in Blockierungspuffer (5 % Serum) für 2 Stunden im Dunkeln bei RT.
    HINWEIS Führen Sie nach Zugabe des Sekundärantikörpers alle nachfolgenden Schritte im Dunkeln durch, um ein Photobleichen der Fluorophore zu verhindern.
14. Waschen Sie die Objektträger in 1x PBS für 3 x 5 min.
15. Inkubieren Sie Gewebe mit 1 μg/ml DAPI und 20 μg/ml AlexaFluor-594-konjugierten Antikörpern in Blockierungspuffer (5 % Serum) für 1 h im Dunkeln bei RT.
16. Waschen Sie die Objektträger in 1x PBS für 3 x 5 min.
17. Geben Sie einen Tropfen Eindecklösung auf jeden Tumorabschnitt und tragen Sie dann einige Tropfen Eindeckmittel auf das Deckglas auf. Drehen Sie das Deckglas schnell auf den Objektträger, um es zu montieren und sicherzustellen, dass keine Blasen in der Nähe der Tumore vorhanden sind.
18. Lassen Sie die Objektträger über Nacht trocknen und bilden Sie sie durch konfokale Mikroskopie ab.

Ergebnisse

Eine schematische Übersicht über das steuerbare in vivo Reprogrammierungsprotokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Zuerst stellten wir den polycistronischen lentiviralen Vektor SFFV-PIB-IRES-eGFP (PIB-eGFP) her, der für die cDC1-instruktiven Reprogrammierungsfaktoren PU.1, IRF8, BATF3 kodiert, gefolgt von einer internen ribosomalen Eintrittsstelle (IRES) und einem verstärkten grün fluoreszierenden Protein (eGFP) in der HEK 293T-Verpackungszelllinie. Um die Lentivirus-vermittelte Immunogenität zu kontrollieren, haben wir einen leeren SFFV-MCS-eGFP (eGFP)-Vektor hergestellt, der eine multiple Klonierungsstelle (MCS) und IRES-eGFP enthält, aber die Reprogrammierungsfaktoren ausschließt. Nach der Virusproduktion haben wir den Lentivirus-haltigen Überstand geerntet und durch Ultrazentrifugation konzentriert. Wir titrierten das Virus funktionell, um die Menge zu bestimmen, die erforderlich ist, um ein 1:1-Verhältnis von transduzierten (eGFP⁺) zu nicht transduzierten (eGFP^-) Zellen zu erreichen, das wir an Tag 3 nach der Transduktion evaluierten. Dann verwendeten wir die resultierende Virusmenge, um die ausgewählte Krebszelllinie an Tag -1 zu transduzieren. Nach 24 Stunden sammelten wir die Zellen und implantierten sie subkutan, um Tumore zu etablieren. Diese Strategie stellte sicher, dass transduzierte Zellen in vivo innerhalb der TME in cDC1-ähnliche Zellen umprogrammiert wurden. Zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Transplantation exzidierten und bearbeiteten wir Tumore für nachgelagerte Analysen, einschließlich der Durchflusszytometrie dissoziierter Tumorzellen, um die in vivo Reprogrammierungseffizienz zu quantifizieren, oder der Immunfluoreszenzfärbung von kryokonservierten Tumorschnitten zur Charakterisierung von Veränderungen in der TME.

Um die Produktion hoher lentiviraler Titer sicherzustellen, überwachten wir zunächst HEK 293T-Zellen vor der Transfektion, um eine Konfluenz von 70-80% zu erreichen, und 24 Stunden später bewerteten wir die Transfektionseffizienz durch eGFP-Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 2A). Als nächstes sammelten wir virushaltiges Medium 48 h und 60 h nach der Transfektion, ultrazentrifugierten es und lagerten es in Aliquoten bei -80 °C (Abbildung 2B). Anschließend ermittelten wir die optimale Virusmenge, die erforderlich ist, um ein 1:1-Verhältnis von eGFP⁺- zu eGFP-Zellen in YUMM1.7-Melanomzellen zu erreichen. Wir säten 10⁵ YUMM1,7-Zellen pro Well in eine 6-Well-Platte, transduzierten die Zellen mit zunehmendem Lentivirus-Volumen und ersetzten den virushaltigen Überstand nach 24 h durch frisches DMEM/F12-Komplettmedium (Abbildung 2C). An Tag 3 untersuchten wir die eGFP-Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie, bevor wir mit der Quantifizierung der genauen Prozentsätze von eGFP⁺-Zellen durch Durchflusszytometrie fortfuhren (Abbildung 2C). Um das Verhältnis von eGFP+^{- zu eGFP-Zellen} zu quantifizieren, haben wir lebende Einzelzellen eingeschlossen, um tote Zellen und Dubletten auszuschließen (Abbildung 2D). Das optimale Volumen der produzierten Lentivirus-Charge wurde sowohl für PIB-eGFP als auch für das Kontroll-eGFP-Virus mit 2 μl pro 10⁵ YUMM1,7 Zellen bestimmt, was zu 50,0 ± 0,3% bzw. 63,0 ± 0,9% eGFP⁺ Zellen führte (Abbildung 2E).

Um die Effizienz der In-vivo-Reprogrammierung zu bewerten, erzeugten wir als Nächstes eine fluoreszenzmarkierte (mCherry⁺) Krebszelllinie (YUMM1,7-mCherry). Dies stellte sicher, dass wir zwischen Krebszellen und Stroma- oder Immunzellen unterscheiden konnten, indem wir lebende mCherry⁺-Zellen in der Durchflusszytometrie-Analyse eingruben (Abbildung 3A,B). Anschließend transduzierten wir YUMM1,7-mCherry-Zellen mit 2 μl PIB-eGFP oder Kontroll-eGFP-Viren pro 10⁵ Zellen, um ein Verhältnis von 1:1 eGFP⁺ zu eGFP^- zu erreichen. Wir implantierten subkutan 1,6 × 10⁶ Zellen pro Tumor in CD45.1-Mäuse und bewahrten ein Aliquot von Zellen auf, um sie in vitro zum Vergleich zu kultivieren. Wir untersuchten die Effizienz der Reprogrammierung mittels Durchflusszytometrie, indem wir lebende mCherry⁺ eGFP⁺ und CD45.1-Zellen gatingten, um Immunzellen des Wirts auszuschließen, die eGFP oder mCherry verschlungen haben (Abbildung 3B). Von Tag 1 bis 9 beobachteten wir den allmählichen Erwerb der CD45.2- und/oder MHC-II-Expression, wobei teilweise reprogrammierte cDC1-ähnliche Zellen (CD45.2⁺ MHC-II^- oder CD45.2-MHC-II⁺) und vollständig reprogrammierte cDC1-ähnliche Zellen (CD45⁺ MHC-II⁺) markiert wurden (Abbildung 3C). Wir validierten, dass die Reprogrammierung von Mauskrebszellen in vivo zu einem höheren Prozentsatz von cDC1-ähnlichen Zellen an Tag 9 im Vergleich zu in vitro Bedingungen führte (9,54 ± 1,54% CD45⁺ MHC-II⁺in vivo vs. 4,72 ± 1,1 % CD45⁺ MHC-II⁺in vitro, P = 0,018). Die Kinetik der Reprogrammierung wurde ebenfalls beschleunigt, da wir bereits an Tag 4 einen höheren Prozentsatz an cDC1-ähnlichen Zellen beobachteten (8,7 ± 3,3% CD45⁺ MHC-II⁺in vivo vs. 0,3 ± 0,1 % CD45⁺ MHC-II⁺in vitro, P = 0,05), was darauf hindeutet, dass das Vorhandensein von Umweltreizen eine schnellere und effizientere Reprogrammierung in Richtung cDC1-ähnlicher Zellen fördert¹⁹. Während in vitro reprogrammierte cDC1-ähnliche Zellen bis zum 15. Tag vorhanden waren, blieben in vivo cDC1-ähnliche Zellen 9 Tage lang bestehen, waren aber am 15. Tag nicht entdeckt, was auf eine Depletion der TME durch das Immunsystem des Wirts hindeutet (Abbildung 3C). 

Schließlich zielten wir darauf ab, frühe Veränderungen der TME als Ergebnis der in vivo cDC1-Reprogrammierung in den ersten 9 Tagen zu charakterisieren. Wir führten eine Immunfluoreszenzfärbung von kryokonservierten und geschnittenen Tumorgeweben sowohl von eGFP- als auch von PIB-eGFP-Tumoren nach 3 und 9 Tagen in vivo-Reprogrammierung durch, wobei wir uns auf die Infiltration von Immunzellen konzentrierten, die durch den pan-hämatopoetischen Marker CD45 markiert sind. Bemerkenswert ist, dass cDC1-ähnliche Zellen an Tag 3 im Vergleich zu eGFP-Tumoren signifikant mehr CD45-Zellen für die TME rekrutierten (49,6 ± 17,0 vs. 8,0 ± 5,8 eGFP mittlere Fluoreszenzintensität der CD45-Färbung pro Tumorbereich; Abbildung 4A,B). Interessanterweise konnten wir TLS innerhalb der TME von Tumoren nach 9 Tagen in vivo Reprogrammierung nachweisen. Dies deutet darauf hin, dass cDC1-ähnliche Zellen die TME innerhalb von 3 Tagen schnell von einer "immunkalten" zu einer "immunheißen" Umgebung umgestalten können, was dann am 9. Tag zur TLS-Bildung führt.

Abbildung 1: Überblick über das Protokoll zur Generierung von cDC1-ähnlichen Zellen durch in vivo Reprogrammierung von Krebszellen. Lentivirale Vektoren SFFV-PIB-IRES-eGFP-kodierende PU.1, IRF8 und BATF3 in einer polycistronischen Kassette unter der Kontrolle des Milzfokus-bildenden Viruspromotors (SFFV) und eGFP nach einer internen Ribosomeneintrittsstelle (IRES) zur Verfolgung transduzierter Zellen mittels Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie - werden in der HEK 293T-Verpackungszelllinie hergestellt. Anschließend werden lentivirale Vektoren ultrazentrifugiert und funktionell titriert, um die Menge an Viren zu bestimmen, die für die Transduzierung von Krebszellen in einem Verhältnis von 1:1 transduzierten eGFP⁺ zu nicht transduzierten eGFP-Zellen erforderlich ist. Für In-vivo-Reprogrammierungsexperimente werden Krebszellen an Tag -1 mit der optimalen Menge an Lentivirus plattiert. Am nächsten Tag wird diese 1:1-Mischung aus transduzierten GFP⁺- und nicht transduzierten ^GFP-Zellen gewaschen und für die subkutane Tumoretablierung in Mäusen gesammelt. Parallele In-vitro-Kulturen werden aufrechterhalten, um die Transduktion an Tag 3 durch Durchflusszytometrie zu validieren. Die Tiere werden alle 2-3 Tage auf Tumorwachstum und Überleben überwacht. Tumore werden zu definierten Zeitpunkten gesammelt, dissoziiert und für die Oberflächenmarkerexpression für die Durchflusszytometrie-Analyse gefärbt. Alternativ werden ganze Gewebe fixiert, kryokonserviert und für die Immunfluoreszenzfärbung und konfokale Mikroskopieanalyse geschnitten. Die Effizienz der In-vivo-Reprogrammierung wird durch Durchflusszytometrie bewertet, während Veränderungen in der Tumormikroumgebung durch konfokale Bildgebung charakterisiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Produktion und funktionelle Titration von Lentiviren für die in vivo cDC1-Reprogrammierung. (A) Wenn HEK 293T-Zellen eine Konfluenz von ~70-80 % erreichen, werden sie mit einer Mischung transfiziert, die 10 μg Transferplasmid entweder SFFV-PIB-eGFP (PIB-eGFP) oder leere lentivirale Vektorkontrolle SFFV-eGFP (eGFP) enthält, zusammen mit 7,5 μg psPAX2 und 2,5 μg mPD2.G und 60 μl 1 mg/ml PEI. Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie-Bilder von HEK 293T-Zellen zeigen die eGFP-Expression 24 h nach der Transfektion, was auf eine erfolgreiche Plasmidabgabe hinweist. Maßstabsbalken = 200 μm. (B) Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs bei der Ultrazentrifugation zur Konzentration von Lentiviren. Der Lentivirus-haltige Überstand der HEK 293T-Zellen wird 48 h und 60 h nach der Transfektion gesammelt, durch einen 0,45 μm PES-Filter mit geringer Proteinbindung filtriert und 37 g in Open-Top-Dünnwand-Polypropylen-Röhrchen mit einer Tischwaage gewogen. Die Röhrchen werden in einem Ausschwingrotor ultrazentrifugiert, der Überstand wird angesaugt und das Pellet 5 min lang getrocknet. Die Pellets werden dann in eiskaltem, HEPES-haltigem DMEM resuspendiert und über Nacht inkubiert, bevor sie aliquotieren und bei -80 °C gelagert werden. (C) Experimentelle Strategie der funktionellen Titration zur Bestimmung der optimalen Virusdosis für das Erreichen eines 1:1-Verhältnisses von GFP+- zu GFP-Zellen. Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie-Bilder zeigen die eGFP-Expression in YUMM1.7-Melanomzellen, 72 h nach der Transduktion, was auf eine erfolgreiche Verabreichung der Reprogrammierungsfaktoren und des eGFP hinweist. Maßstabsbalken = 100 μm. (D) Repräsentative Diagramme der Durchflusszytometrie, die die Gating-Strategie zur Quantifizierung des Verhältnisses von eGFP⁺ -Zellen zeigen. Lebende Zellen wurden auf Viabilitätsfarbstoff-negative Population (DAPI) untersucht, gefolgt von einem Dublett-Ausschluss. (E) Durchflusszytometrische Quantifizierung der Transduktionseffizienz mit steigenden Virusdosen, um das optimale Volumen für das Erreichen von 1:1 GFP⁺/^GFP-Zellen zu bestimmen. Sowohl für PIB-eGFP als auch für eGFP-Lentiviren erreichten 2 μl Volumen pro 10⁵ Zellen das gewünschte Verhältnis. Abkürzungen: cDC1s = konventionelle dendritische Zellen vom Typ 1; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; PIB = PU.1, IRF8 und BATF3; PEI = Polyethylenimin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Bewertung der in vivo cDC1-Reprogrammierungseffizienz. (A) Schematische Darstellung des experimentellen Arbeitsablaufs zur Bewertung der in vivo cDC1-Reprogrammierungseffizienz. Krebszellen werden zunächst mit einem Lentivirus transduziert, das mCherry exprimiert, um eine fluoreszenzmarkierte Zelllinie (YUMM1,7-mCherry) zu erzeugen, gefolgt von der Transduktion mit der optimierten Dosis des PIB-eGFP-Lentivirus an Tag -1. Die Zellen werden dann am Tag 0 subkutan mit einem 1:1-Verhältnis von eGFP⁺/eGFP-Zellen injiziert, um Tumore in CD45.1-Mäusen zu etablieren und es den PIB-transduzierten Zellen zu ermöglichen, sich innerhalb der TME in cDC1-ähnliche Zellen umzuprogrammieren. Die Tumore werden dann zu den angegebenen Zeitpunkten isoliert, dissoziiert und mittels Durchflusszytometrie auf CD45.1, CD45.2 und MHC-II gefärbt. Dies ermöglicht den Ausschluss von CD45.1-Wirtsimmunzellen, um die in vivo cDC1-Reprogrammierungseffizienz durch Expression von CD45.2 und MHC-II zu quantifizieren. Parallele in vitro Kulturen werden als Vergleich zur in vivo Reprogrammierung über die gesamten Zeitpunkte aufbewahrt. (B) Repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme, die die Gating-Strategie an Tag 9 veranschaulichen. Die Zellen wurden auf mCherry⁺ und GFP⁺ gestoppt, um erfolgreich transduzierte Krebszellen zu identifizieren. Immunzellen des Wirts wurden ausgeschlossen, indem CD45.1^+-Zellen ausgeschaltet wurden. (C) Quantifizierung der in vivo Reprogrammierungseffizienz (links) von YUMM1,7-mCherry-Zellen mittels Durchflusszytometrie als prozentualer Anteil von CD45⁺ MHC-II⁺ Zellen (vollständig reprogrammiert) und CD45.2⁺ HLA-DR- oder CD45.2-HLA-DR⁺ cDC1-ähnlichen Zellen (teilweise reprogrammiert), die innerhalb von eGFP⁺ mCherry⁺ gesteuert sind Zellen. Repräsentative Diagramme der Durchflusszytometrie (rechts), die den allmählichen Erwerb der CD45.2- und MHC-II-Expression in PIB-eGFP-transduzierten YUMM1.7-mCherry-Zellen während der angegebenen Zeitpunkte zeigen. Als Kontrolle wurden eGFP-transduzierte YUMM1,7-mCherry-Zellen verwendet und in vitro wurden reprogrammierte cDC1-ähnliche Zellen zum Vergleich verwendet. Die Daten in (C) geben die mittlere ± SD von 3-5 biologischen Replikatexperimenten an. Die statistische Analyse in (C) wurde für CD45⁺ MHC-II⁺ Zellen mit dem Mann-Whitney-Test durchgeführt. *P < 0,05. Abkürzungen: cDC1s = konventionelle dendritische Zellen vom Typ 1; PIB = PU.1, IRF8 und BATF3; TME = Tumor-Mikroumgebung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Analyse der Immuninfiltration in der Tumormikroumgebung nach in vivo cDC1-Reprogrammierung. (A) Repräsentative konfokale Bilder, die CD45⁺ -Zellen in YUMM1.7-Tumoren nach subkutaner Implantation von PIB-eGFP- oder Kontroll-eGFP-transduzierten Zellen (1:1-Verhältnis von transduzierten zu elterlichen Zellen) an den Tagen 3 und 9 zeigen. Maßstabsbalken = 500 μm. (B) Quantifizierung des MFI für die CD45-Färbung in PIB-behandelten und kontrollierten eGFP-transduzierten YUMM1.7-Tumoren an den Tagen 3 und 9. Die Daten in (B) zeigen die mittlere ± SD von 3-6 biologischen Replikatexperimenten. Die statistische Analyse in (B) wurde mit dem Mann-Whitney-Test durchgeführt. *P < 0,05 und ***P < 0,001. Abkürzungen: cDC1s = konventionelle dendritische Zellen vom Typ 1; PIB = PU.1, IRF8 und BATF3; MFI = mittlere Fluoreszenzintensität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

In diesem Protokoll beschreiben wir eine handhabbare Methode zur Erzeugung von cDC1-ähnlichen Zellen, die auf der in vivo Reprogrammierung von Krebszellen aus soliden Tumoren basiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Überexpression von PU.1, IRF8 und BATF3 den allmählichen Erwerb eines cDC1-Phänotyps in der TME bis zum Tag 9 vorantreibt, wonach cDC1-ähnliche Zellen aus Tumoren depletiert werden. Letztendlich führt dies zu einer verstärkten Infiltration von CD45-Zellen in die TME bis zum 3. Tag, wodurch der Umbau einer "immun-kalten" TME zu "immun-hot" wird.

Zu den derzeitigen Protokollen zur Erzeugung von cDC1 gehören die Anreicherung autologer DCs aus peripherem Blut, die Differenzierung von CD34⁺ hämatopoetischen Vorläuferzellen oder die Differenzierung von pluripotenten Stammzellen 14,15,16,17,18,19. Diese Methoden weisen jedoch limitierende Faktoren auf: unzureichende Reifung, reduzierte Antigenpräsentation und reduzierte Zytokin-/Chemokinproduktionskapazität in vivo, Anfälligkeit für Immunsuppression, hohe DC-Heterogenität und geringe Anzahl erzeugter Zellen⁷. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, das die skalierbare Generierung von cDC1-ähnlichen Zellen in vivo für funktionelle und mechanistische Studien ermöglicht.

Mit dieser Methode wurde getestet, ob die Expression der Transkriptionsfaktorkombination PU.1, IRF8 und BATF3 ausreicht, um die in vivo Reprogrammierung voranzutreiben. Dieses Protokoll ermöglicht eine präzise Kontrolle der Verabreichungseffizienz, da die Variation der Dosis genetisch veränderter Zellen, die implantiert werden, die Wirksamkeit der Behandlung direkt beeinflusst. Wir haben bereits gezeigt, dass 2% transduzierte Zellen, was 0,15% CD45⁺ und MHC-II⁺ cDC1-ähnlichen Zellen entspricht, ausreichend sind, um eine Anti-Tumor-Immunität hervorzurufen²⁰. Darüber hinaus deutet die an Tag 3 beobachtete schnelle Immuninfiltration darauf hin, dass teilweise reprogrammierte cDC1-ähnliche Zellen in vivo funktionell aktiv sind, da es zu diesem Zeitpunkt keinen wesentlichen Anstieg an vollständig reprogrammierten cDC1-ähnlichen Zellen gibt. In Zukunft wird es interessant sein, die funktionelle Rolle von teilweise im Vergleich zu vollständig reprogrammierten cDC1-ähnlichen Zellen bei der Anti-Tumor-Wirksamkeit zu entschlüsseln, indem modifizierte Vektoren, die ein Suizid-Gen enthalten, verwendet werden, um den Zelltod in ausgewählten Zellpopulationen zu definierten Zeitpunkten zu induzieren²⁴. Dieses Protokoll kann ferner verwendet werden, um die Kombination mit epigenetischen Adjuvantien zu untersuchen, die die Effizienz der Reprogrammierung erhöhen können²⁵. Schließlich könnte diese Methode auch angepasst werden, um andere DC-Subtypen in vivo zu erzeugen und verschiedene Arten von Immunantworten auszulösen, z. B. antivirale oder tolerogene Reaktionen¹⁴. Darüber hinaus können wir die In-vivo-Reprogrammierung als Plattform nutzen, um barcodierte Screenings für Transkriptionsfaktorkombinationen durchzuführen, um verschiedene Immunzelltypen zu erzeugen. Diese Möglichkeit könnte die Flexibilität von Behandlungen erhöhen, indem sie die vielfältigen funktionellen Eigenschaften bestimmter Immununtergruppen nutzt.

In unserer vorherigen Studie konnten wir zeigen, dass die immunsuppressive in vivo-Umgebung die Reprogrammierung menschlicher Krebszellen in immunogene cDC1s^{nicht behindert 20}. In diesem Artikel zeigen wir, dass die Reprogrammierung bei Mäusen in vivo schneller und effizienter ist als bei in vitro, was darauf hindeutet, dass die in vivo beobachtete verstärkte Reprogrammierung ein konserviertes Phänomen bei beiden Spezies ist. Eine der Einschränkungen dieser Methode ist jedoch das Fehlen der In-vivo-Umgebung während der anfänglichen Vektorverabreichung; Daher kann es nicht erkennen, ob Umwelteinflüsse die Effizienz der In-vivo-Verabreichung beeinflussen. Dies soll in situ durch den Vergleich verschiedener Einheiten ermittelt werden. Adenovirale Vektoren, die wir für die In-situ-Verabreichung als effizienter als lentivirale Vektoren identifiziert haben²⁰ , könnten mit nicht-viralen Einheiten wie linearen, zirkulären und selbstamplifizierenden RNAs oder niedermolekularen Cocktails verglichen werden^26,27.

Wir haben bereits gezeigt, dass die cDC1-Reprogrammierung Krebszellen mit proinflammatorischen Zytokin- und Lymphozyten-rekrutierenden Chemokinsekretion sowie einer professionellen Antigenverarbeitung und -präsentation auf MHC-I und MHC-II in Melanommodellen ausstattet^23,28. Dies führt zu einem Umbau der TME von einem "immunkalten" in einen "immun-heißen" Zustand, indem die TLS-Bildung induziert wird, was die Infiltration von zytotoxischen Effektor-T-Zellen, NK-Zellen und B-Zellen erhöht und immunsuppressive Populationen wie regulatorische und erschöpfte T-Zellen reduziert²⁰. Bei Patienten wurde ein positives Ansprechen auf die Immuntherapie mit dem Vorhandensein von TLS in Tumoren in Verbindung gebracht, wobei ein anhaltendes T- und B-Zell-Priming gegen Tumorantigene tumorspezifische Antikörperreaktionen hervorruft^29,30. In Zukunft stellen wir uns vor, dieses in vivo cDC1-Reprogrammierungsprotokoll einzusetzen, um die Mechanismen der induzierten TLS-Neogenese, des TME-Umbaus und der Anti-Tumor-Immunität bei verschiedenen Krebsarten zu entschlüsseln und zu charakterisieren, ob die Produktion von tumorspezifischen Antikörpern stimuliert wird.

Wir haben bereits einen Synergismus zwischen der in vivo cDC1-Reprogrammierung und ICB mit anti-PD-1 oder anti-CTLA-4 beobachtet²⁰. Dies deutet darauf hin, dass die durch cDC1-Reprogrammierung erzeugte "immunheiße" TME ein günstiges Umfeld für mögliche Kombinationen mit anderen Immuntherapien wie ACT bieten könnte, einschließlich T-Zell-Rezeptor (TCR)-T-Zellen, chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen oder tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs). Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, große unverzerrte kombinatorische oder CRISPR-Screenings durchzuführen, bei denen immunologische Rezeptoren, Zytokine, Chemokine oder Lymphotoxine in cDC1-ähnlichen Zellen in resistenten Tumortypen überexprimiert oder depletiert werden könnten, wodurch die Rolle unterschiedlicher Signalwege bei der Verbesserung der cDC1-vermittelten Immunität entschlüsselt werden könnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das aktuelle Protokoll eine wertvolle Ressource für eine breite wissenschaftliche Gemeinschaft darstellt, da die in vivo cDC1-Reprogrammierung eine flexible und leistungsstarke Plattform für mechanistische Studien und therapeutische Innovationen in der Krebsimmuntherapie darstellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,45 μ m Bindungsfilter mit niedrigem Proteingehalt, 150 mL Vakuumfilter mit Flaschenaufsatz	Fischer wissenschaftlich	15983297
2-Mercaptoethanol 50 mM	ThermoFisher Scientific	31350010
Monoklonaler Anti-Maus-CD45-Antikörper (Klon: 30-F11), Ratten-IgG2b und Kappa;	ThermoFisher Scientific	14-0451-82
B6. SJL-PtprcaPepcb/BoyCrl (CD45.1)	Das Jackson-Labor	002014
BD Micro-Fine U-100 Insulinspritzen (0,5 mL)	Fisher Scientific	11395751
C57BL/6J Mäuse	Das Jackson-Labor	000664
Kollagenase D	Sigma Aldrich	11088882001
Corning Falcon Zellsieb zur Verwendung mit konischen 50-ml-Röhrchen	Sigma Aldrich	CLS352340
Corning Deckgläser 24 x 50 mm	Sigma Aldrich	CLS2975245
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol, Dihydrochlorid)	ThermoFisher Scientific	Nr. D1306
DNase I	Sigma Aldrich	10104159001
eBioscience Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff eFluor 450	Invitrogen	65-0863-14
eBioscience IHC Antigen-Rückgewinnungslösung - Niedriger pH-Wert (10x)	ThermoFisher Scientific	00-4955-58
Fötales Rinderserum (FBS)	ThermoFisher Scientific	A5256701
Fluoromount-G Eindeckmedium	ThermoFisher Scientific	00-4958-02
GFP Antikörper [Alexa Fluor 594]	Novus Biologicals	NB600-308AF594
Gibco DMEM/Nährstoffmischung F-12 (DMEM/F-12)	ThermoFisher Scientific	31331028
Gibco MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x)	ThermoFisher Scientific	11140035
Gibco Opti-MEM I	ThermoFisher Scientific	11058021
Gibco Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Mittel	ThermoFisher Scientific	52400025
Gibco Natriumpyruvat (100 mM)	ThermoFisher Scientific	11360070
Gibco Trypanblaue Lösung, 0,4 %	ThermoFisher Scientific	15250061
GlutaMAX Ergänzung	ThermoFisher Scientific	35050061
Ziegen-Anti-Ratten-IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, polyklonal, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	Nr. A-11006
HEK 293T Zellen	ATTC	CRL-11268
Hexadimethrinbromid (Polybrene)	Sigma Aldrich	Nr. H9268
HyClone Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt	Cytiva	SH30243.01
HyClone Penicillin Streptomycin 100x Lösung (Pen/Strepto)	Cytiva	SV30010
HyClone Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Cytiva	SH30028.02
Ketaminol Tierarzt. Injektionslösung 100 mg/ml	MSD Animal Health Schweden	QN01AX03
Mikrotom-Klinge - C35	pfm medical	207500005
Maus Anti-CD45.2 (104), Oberfläche, APC, monoklonal	Biolegende	109814
Maus-Anti-MHCII (M5/114.15.2), Oberfläche, PE-Cy7, monoklonal	Biolegende	107630
Normales Ziegenserum	Abcam (Englisch)	AB7481
Normales Rattenserum (steril)	Abcam (Englisch)	AB7488
Dünnwandige Polypropylen-Rohre mit offenem Oberkörper	Beckman Coulter Biowissenschaften	326823
Paraformaldehyd, 16 % w/v aq. Soln., methanolfrei	ThermoFisher Scientific	043368.9M
pFUW-tetO-Batf3, eine monocistronic Kassettenkodierungsmaus Batf3	Addgene	139837
pFUW-tetO-Irf8, eine monocistronic Kassettenkodierungsmaus Irf8	Addgene	139838
pFUW-tetO-Pu.1, eine monocistronische Kassettenkodierungsmaus Pu.1	Addgene	139839
Plasmid pMD2.G	Addgene	12259
Plasmid psPAX2	Addgene	12260
Plasmid SFFV-eGFP (eGFP)	Inhouse-Klonen	-
Plasmid SFFV-mCherry (mCherry)	Inhouse-Klonen	-
Plasmid SFFV-PIB-eGFP,  eine Polycistronic-Kassettenkodierung der Maus PU.1, IRF8 und BATF3 (PIB)	Inhouse-Klonen	-	Konstrukte und Vektoren, die für die Reprogrammierung verwendet werden, sind von Asgard Therapeutics im Rahmen einer Materialtransfervereinbarung mit dem Unternehmen erhältlich
Polyethylenimin (PEI), linear, MW 25000, Transfektionsqualität	Polywissenschaften	23966
ReadyProbes Hydrophober Barriere-Pap-Stift	ThermoFisher Scientific	Nr. R3777
Natriumbutyrat	Sigma Aldrich	303410
Saccharose	Sigma-Aldrich	Nr. S7903
SuperFrost Plus Adhäsionsmikroskop-Objektträger	Epredia	J1800AMNZ
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583
TrypLE Express Enzym (1x) ohne Phenolrot	ThermoFisher Scientific	12604021
TT Cryomold Intermediate, quadratisch (15 x 15 x 5 mm)	Sakura Finetek	4566
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Invitrogen	15575020
Xysol Tierarzt. Injektionslösung 20 mg/ml	VM Pharma	QN05CM92
YUMM1.7 Zellen	Antineo