Arbeitsablauf bei der Charakterisierung von Neuropeptiden von der Probenahme bis zur datenunabhängigen Erfassungs-Massenspektrometrie

Summary

Dieses Protokoll beschreibt einen umfassenden Neuropeptidomik-Workflow im Hirngewebe von Ratten, der datenabhängige Akquisitions-parallele Akkumulation-serielle Fragmentierung (DDA-PASEF) und datenunabhängige Akquisitions-Massenspektrometrie (DIA) kombiniert.

Abstract

Endogene Neuropeptide sind Schlüsselmodulatoren der Gehirnfunktion und spielen eine entscheidende Rolle bei Verhalten, Stress, Schmerzen und homöostatischer Regulation, doch ihre Analyse bleibt schwierig. Biologisch gesehen sind sie in geringer Häufigkeit, werden schnell abgebaut und unterschiedlich aus Vorläuferproteinen verarbeitet, wobei die Expression auf kleine, lokalisierte Zellpopulationen beschränkt ist. Technisch wird ihre Detektion durch einen großen Dynamikbereich, verschiedene posttranslationale Modifikationen und spärliche Signale in massenspektrometrischen Datensätzen erschwert. Dieses Protokoll beschreibt einen umfassenden Arbeitsablauf für die Neuropeptidanalyse im Hirngewebe von Rattus norvegicus unter Verwendung sowohl der datenabhängigen Akquisitions- (DDA) als auch der datenunabhängigen Akquisitions- (DIA) Massenspektrometrie (MS) auf einer timsTOF-Plattform. Nach einer optimierten Vorbereitung der Gehirnproben, einschließlich Dissektion, Peptidextraktion und Reinigung, wird die Nanoflüssigkeitschromatographie (LC)-MS mit Ionenmobilitätsgasphasenfraktionierung durchgeführt, um die Nachweisempfindlichkeit und -genauigkeit zu verbessern. Die DDA-generierte Spektralbibliothek unterstützt die DIA-basierte Quantifizierung in Skyline und ermöglicht so Messungen auf MS2-Ebene mit hoher Zuverlässigkeit. Dieser integrierte Workflow erhöht die Neuropeptidabdeckung und verbessert die quantitative Reproduzierbarkeit und bietet eine robuste Plattform für die Untersuchung von Neuropeptiden in komplexem Hirngewebe.

Introduction

Neuropeptide sind eine funktionell vielfältige Klasse endogener Signalmoleküle, die als kritische Modulatoren der neuronalen Kommunikation sowie der Funktionen des Nervensystems und des neuroendokrinen Systems dienen. Als Neuromodulatoren, Hormone oder Co-Transmitter beeinflussen sie eine Vielzahl physiologischer Prozesse, darunter Schmerzmodulation, Stressreaktion, zirkadiane Regulation und Appetitkontrolle. Im Gegensatz zu klassischen Neurotransmittern, die als kleine Moleküle synthetisiert werden, sind Neuropeptide in großen Vorläuferproteinen kodiert, die durch Translation von mRNA synthetisiert werden. Vorläuferproteine oder Prohormone werden dann proteolytisch verarbeitet, um die aktiven Peptide freizusetzen, die in Dichtkernvesikel (DCVs) verpackt werden. Bei der Stimulation werden Neuropeptide freigesetzt, um durch Wechselwirkungen mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren modulatorische, typischerweise langsamere und länger anhaltende Wirkungen auszuüben. Ihre Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Funktion des zentralen und peripheren Nervensystems hat sie zu einem Bereich von intensivem biologischem und klinischem Interesse gemacht 1,2,3,4,5.

Trotz ihrer Relevanz sind Neuropeptide analytisch nach wie vor schwer zu charakterisieren. Ihre hochgradig heterogenen Strukturen -- von kurzen bis zu ausgedehnten Sequenzen, die oft verschiedene posttranslationale Modifikationen (PTMs) wie Amidierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Aminosäureisomerisierung oder Trunkierung aufweisen -- führen zu einer Variabilität des Ionisations- und Fragmentierungsverhaltens in der Massenspektrometrie (MS)1,6,7,8 . Darüber hinaus liegen sie typischerweise in geringen Konzentrationen im Verhältnis zu biologischen Matrixkomponenten vor, sind leicht abbaubar und räumlich begrenzt innerhalb des komplexen Gewebes des Nervensystems lokalisiert. Diese Merkmale erschweren sowohl die Identifizierung als auch die Quantifizierung, insbesondere bei der Verwendung traditioneller Proteomik-Ansätze, die auf einem vorhersagbaren enzymatischen Verdau und einheitlichen Peptideigenschaften beruhen ^9,10,11.

Hier stellen wir eine umfassende Strategie zur Identifizierung und Quantifizierung endogener Peptide im Gehirn von Rattus norvegicus vor, mit besonderem Schwerpunkt auf Neuropeptiden. Der Arbeitsablauf beginnt hier mit optimierten Verfahren zur Probenahme des Gehirns, gefolgt von umfangreichen Flüssigkeitschromatographie (LC)-Trennungen und endet mit einer hochauflösenden MS-Analyse mittels paralleler Akkumulations-serieller Fragmentierung (PASEF) auf einer TIMS-Plattform (Trapped Ion Mobility Spectrometry) 12,13,14,15,16. Durch die Einbeziehung der Ionenmobilitäts-Gasphasenfraktionierung (IM-GPF) vor der Vorläuferauswahl ermöglicht der datenabhängige Erfassungs-PASEF (DDA-PASEF)-Ansatz eine verbesserte Vorläufertrennung und den verbesserten Nachweis von Neuropeptiden mit geringer Abundanz, von denen viele sonst in eindimensionalen DDA-Arbeitsabläufen übersehen würden¹⁷.

Während DDA aufgrund ihrer hochwertigen MS/MS-Spektren nach wie vor die am häufigsten verwendete Strategie bei der Peptididentifizierung ist, ist sie von Natur aus durch ihre Abhängigkeit von der Auswahl der Vorläuferionen nach Intensität begrenzt, was gegen Spezies mit geringer Abundanz spricht 18,19,20. Darüber hinaus führt die semi-stochastische Stichprobenziehung zu fehlenden Werten in allen Replikaten, was eine reproduzierbare Quantifizierung erschwert. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir eine robuste Spektralbibliothek mit unseren DDA-PASEF-Daten erstellt, die anschließend für die datenunabhängige Erfassungsanalyse (DIA) verwendet werden kann. Im Gegensatz zu DDA ermöglicht DIA alle Vorläuferionen innerhalb definierter m/z-Fenster, wodurch eine konsistente Probenahme sowohl von reichlich vorhandenen als auch von seltenen Peptiden gewährleistet wird, und in Kombination mit der Spektralbibliothek und der gezielten Analyse in Skyline eine empfindliche und reproduzierbare Quantifizierung auf MS2-Ebene^ermöglicht 21,22,23,24.

Dieser integrative Ansatz, der die Extraktion von Hirnpeptiden, die chromatographische Trennung, die durch Ionenmobilität verstärkte MS-Akquisition und die hybride DDA/DIA-basierte Quantifizierung umfasst, wurde unter Berücksichtigung der Komplexität von Neuropeptiden entwickelt. Es maximiert die Peptidabdeckung bei gleichzeitiger Minimierung von Datenverlusten und behebt die wichtigsten Einschränkungen einer einfacheren DDA-gesteuerten Peptidomik. Als solche stellen wir eine flexible und leistungsstarke Plattform für die Erforschung der Neuropeptidlandschaft im Säugetiergehirn vor, die leicht an eine Vielzahl von experimentellen Fragestellungen und Gewebeproben angepasst werden kann.

Protocol

Alle Tierversuche in dieser Studie wurden in Übereinstimmung mit dem Tierverwendungsprotokoll durchgeführt, das vom Illinois Institutional Animal Care and Use Committee (23228) genehmigt wurde, unter strikter Einhaltung sowohl der nationalen als auch der ANARRIVE-Standards für die ethische Behandlung und Pflege von Tieren.

1. Tiersektion und Isolation des Gehirns

1. Führen Sie eine kalte Kochsalzperfusion unmittelbar gefolgt von einem Snap-Freezing des Gewebes durch, um die Integrität des Neuropeptids zu erhalten, Abbauartefakte zu minimieren und die Datenqualität für die nachgelagerte Peptidomanalyse zu verbessern.
2. Euthanasieren Sie die Ratte mit der CO₂ -Methode gemäß den Richtlinien der institutionellen Tierpflege. Bestätigen Sie den Tod durch fehlenden Herzschlag und fehlende Reflexe.
3. Legen Sie die Ratte in Rückenlage; Machen Sie einen Schnitt, um die Brusthöhle freizulegen.
4. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der linken Herzkammer.
5. Machen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof, um den Abfluss von Blut und Perfusionslösung zu ermöglichen.
6. Führen Sie eine zugeschnittene Pipettenspitze aus Kunststoff, die an einer 60-ml-Spritze befestigt ist, die mit 50 mL eiskalter physiologischer Lösung (z. B. 0,9 % Kochsalzlösung oder mGBSS) gefüllt ist, in den linken Ventrikel ein.
7. Perfundierten Sie den Tierkörper mit der Lösung. Enthaupte die Ratte mit einer scharfen Schere oder einer Guillotine.
8. Haut und Schädel, die über dem Gehirn liegen, mit Rongeuren oder feiner Schere entfernen.
9. Hebe das Gehirn vorsichtig aus der Schädelhöhle und durchtrenne die Hirnnerven nach Bedarf.
10. Frieren Sie das Gehirn sofort auf Trockeneis ein oder gefrieren Sie es in Isopentan, das auf Trockeneis gekühlt wird.
11. In beschriftete Kryoröhrchen oder Folie umfüllen und dann bei -80 °C lagern.

2. Peptidextraktion aus Rattenhirngewebe

1. Wiegen Sie bei ganzen Hirnproben jedes gefrorene Gewebe schnell mit einer Analysenwaage. Homogenisieren Sie das Gewebe mit einer LC-MS-Lösung, die 10 % Eisessig und 1 % Wasser in Methanol enthält, unter Verwendung eines Lösungsmittel-zu-Gewebe-Verhältnisses von 10:1 (v/w).
2. Inkubieren Sie die homogenisierten Proben 20 Minuten lang auf Eis.
3. Zentrifugieren Sie die Proben bei 16.000 × g für 20 min bei 4 °C. Den Überstand vorsichtig auffangen, ohne das Pellet zu stören.
4. Resuspendieren Sie das Pellet in LC-MS-Wasser mit einem Lösungsmittel-zu-Gewebe-Verhältnis von 10:1 (v/w) und wiederholen Sie die Inkubation auf Eis für 20 Minuten.
5. Unter den gleichen Bedingungen (16.000 × g, 20 min, 4 °C) erneut zentrifugieren und den zweiten Überstand auffangen.
6. Kombinieren Sie beide Überstände und übertragen Sie 1/10 des Gesamtvolumens in ein neues Rohr für die Weiterverarbeitung. Trocknen Sie dieses Aliquot mit einem Vakuumkonzentrator, bis es vollständig trocken ist. Lagern Sie den restlichen Extrakt bei -80 °C für die zukünftige Verwendung.

3. Festphasenextraktion (SPE) mit C18-Spinsäulen

HINWEIS: Alle Lösungsmittel sollten LC-MS-Qualität sein. Sofern nicht anders angegeben, werden die Zentrifugationsschritte bei 1.500 × g bei Raumtemperatur mit einer Tischzentrifuge durchgeführt.

1. Vorbereitung der Reagenzien
   1. Aktivierungslösung (A) herstellen: 50 % Acetonitril/50 % 0,1 % Ameisensäure in Wasser.
   2. Äquilibrierung vorbereiten und Lösung (B) waschen: 0,1 % Ameisensäure in Wasser.
   3. Elutionslösung (C) herstellen: 50 % Acetonitril/50 % 0,1 % Ameisensäure in Wasser.
2. Probenvorbereitung
   1. Rekonstituieren Sie den getrockneten Peptidextrakt in 200 μl Lösung (B).
   2. Die Probe wird bei 16.000 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
   3. Sammeln Sie vorsichtig den Überstand für SPE.
3. Konditionierung und Äquilibrierung der Säule
   1. 150 μl Lösung (A) in die C18-Spin-Säule geben.
   2. 1 min bei 1.500 × g zentrifugieren.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.1 und 3.3.2 zweimal, um eine vollständige Aktivierung sicherzustellen.
   4. 150 μl Lösung (B) zugeben.
   5. 1 min zentrifugieren.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.4 und 3.3.5 zweimal.
4. Laden und Waschen von Proben
   1. Laden Sie 200 μl der vorbereiteten Probenlösung auf die Säule.
   2. 1 min zentrifugieren.
   3. Laden Sie den Durchfluss dreimal zurück auf die Säule, um die Peptidretention zu maximieren.
   4. 150 μl Lösung (B) zugeben.
   5. 1 min zentrifugieren.
   6. Die Schritte 3.4.4 und 3.4.5 sind dreimal zu wiederholen, um nicht zurückgehaltene Verunreinigungen zu entfernen.
5. Peptid-Elution
   1. 150 μl Elutionslösung (C) in die Säule geben.
   2. 1 min zentrifugieren.
   3. Wiederholen Sie die Elutionsschritte 3.5.1-3.5.2 noch einmal.
   4. Kombinieren Sie beide Eluate und lagern Sie sie auf Eis oder trocknen Sie sie unter Vakuum.

4. LC-MS/MS-Analyse

1. Lösung (A) herstellen: 0,1 % Ameisensäure in Wasser, Lösung; (B): 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril, Lösung; (C): 25 fmol/μl Retentionszeitstandard (iRT) 0,1 % Ameisensäure in Wasser.
2. Resuspendieren Sie die Proben vor der LC-MS-Injektion in 20 μl Lösung (C).
   HINWEIS: Es wurden zwei biologische Proben analysiert, die jeweils fünfmal sowohl für DDA- als auch für DIA-Läufe injiziert wurden, was zu fünf technischen Replikationen pro Methode und Probe führte.
3. Die Peptidtrennung wird mit einem Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-System (HPLC) durchgeführt, wobei die mobile Phase A aus Lösung (A) und die mobile Phase B aus der Lösung (B) besteht.
4. Laden Sie 1 μl Proben auf eine fünfundzwanzig C18-Analysesäule (150 μm × 250 mm, 1,9 μm Partikel, 120 Å Porengröße) und halten Sie die Temperatur während des gesamten Laufs bei 40 °C.
5. Führen Sie die LC-Trennung bei einer Durchflussrate von 600 nL/min unter Verwendung des folgenden Gradientenprofils durch: 0-5 min: 2-10% B; 5-85 min: 10-45% B; 85-87 min: 45-50% B; gefolgt von einem hohen organischen Waschen und einer Wiederherstellung des Gleichgewichts.
   HINWEIS: Der LC wurde über eine Ionenquelle direkt mit einem timsTOF MS gekoppelt.
6. Verwenden Sie für die DDA-Analyse die Standardanwendungsmethode DDA PASEF-standard_1.1sec_cycletime auf timsTOF MS.
   1. Kurz gesagt, betreiben Sie das Massenspektrometer im PASEF-Modus mit aktiviertem dynamischem Ausschluss . Legen Sie fest, dass jeder Zyklus aus 10 PASEF MS/MS-Scans über einen Arbeitszyklus von 1,1 s besteht.
   2. Der Massenbereich wird auf m/z 100-1700 und der Ionenmobilitätsbereich auf 0,60 bis 1,60 Vμs/cm² mit einer Rampenzeit von 100,0 ms eingestellt. Erhöhen Sie die Kollisionsenergie von 20,0 auf 59,0 eV in Abhängigkeit von der Ionenmobilität.
7. Ionenmobilität Gasphasenfraktionierung (IM-GPF)
   1. Segmentieren Sie den Ionenmobilitätsbereich von 0,6 bis 1,6 Vμs/cm² in drei überlappende Fenster: 0,6 bis 1,0, 0,9 bis 1,3 und 1,2 bis 1,6 Vμs/cm².
   2. Ändern Sie dazu die Start- und Endwerte der Mobilität in der TIMS-Einstellung von timsControl oder timsControl editor auf die entsprechenden Fensterwerte.
   3. Erfassen Sie Daten für jedes Fenster. Für alle Erfassungsfenster der Ionenmobilität ist eine konstante Akkumulations- und Rampenzeit von 100 ms zu verwenden.
   4. Erfassen Sie Daten im DDA-PASEF-Modus mit den gleichen Parametern, die in Schritt 4.6 beschrieben wurden.
8. Für die DIA-Analyse ist eine Isolationsfensterbreite von 25 m/z über den Massenbereich von 400-1200 m/z zu verwenden. Verwenden Sie die gleichen IMEX-Einstellungen (Ion Mobility Experimental) wie bei der DDA-Methode.
   1. Zu den zusätzlichen DIA-Einstellungen gehören eine MS1-Rampe, gefolgt von 16 MS/MS-Rampen pro Zyklus, was eine Gesamtzykluszeit von 1,8 s ergibt.
   2. Verwenden Sie die Standard-Proteomics-Methode DIA-PASEF als Vorlage für die Entwicklung von DIA-Methoden. Nachdem Sie die DIA-Methode erstellt haben, laden Sie sie in die Registerkarte "Methode " von Hystar. Es ist keine Aktivierung des DIA-Modus erforderlich.
      HINWEIS: Die DIA-Methode wird automatisch registriert, sobald sie erfolgreich geladen wurde.

5. Datenverarbeitung

HINWEIS: Nach der Datenerfassung sollte die Peptididentifizierung mit Bioinformatik-Tools wie PEAKS Online, PEAKS Studio, MSFragger, Maxquant oder ähnlichen Plattformen durchgeführt werden. In dieser Studie wurde Peaks Online verwendet, das in der Lage ist, mit Rohdaten im .d-Format zu arbeiten.

1. Datenbank-Suche
   1. Verwenden Sie eine geeignete Referenzdatenbank für die Peptidsuche, z. B. eine kuratierte Datenbank für Ratten-Signalpeptide, ein Rattenproteom oder das menschliche Proteom oder eine kuratierte Datenbank für Signalpeptide basierend auf der Probenquelle.
      HINWEIS: Diese Datenbanken können aus zuverlässigen Quellen wie NCBI oder UniProt (https://www.uniprot.org/) bezogen werden. Beachten Sie, dass nur Proteine oder Peptide in der Datenbank identifiziert werden. Die Rattensignaldaten wurden kuratiert, indem das Rattenproteom nach der Annotation "Signalpeptid" in UniProt gefiltert wurde. In den Begriffen von Uniprot bedeutet die Filterung nach "Signalpeptid" die Eingrenzung des Proteoms auf Proteine, die an der Sekretion, der Membranlokalisation oder dem kompartimentellen Transport beteiligt sind. Diese benutzerdefinierte Datenbank enthält 5630 Proteine. Die Begrenzung der Größe der Proteindatenbank von 50.000 auf 5.000 bietet mehrere Vorteile. Erstens erhöht es die Zuverlässigkeit der Identifizierung, indem es die Wahrscheinlichkeit zufälliger Peptid-Spektrum-Übereinstimmungen verringert und dadurch die Genauigkeit der Peptidzuordnungen erhöht. Zweitens verbessert eine kleinere Datenbank die Recheneffizienz, was schnellere Verarbeitungszeiten und einen geringeren Bedarf an Rechenressourcen ermöglicht. Drittens kann eine präzisere Datenbasis zu einer besseren Kontrolle der Falschentdeckungsrate (FDR) führen, was zu zuverlässigeren und statistisch robusteren Proteinidentifikationen führt. Die Datenbank muss jedoch relativ groß sein, um eine künstliche Inflation der Konfidenzwerte und eine ungenaue FDR-Schätzung zu vermeiden.
   2. Konfigurieren Sie die Datenbanksuche in der Benutzeroberfläche des Programms mit den folgenden empfohlenen Parametern: Toleranz der Vorläufer-Massenfehler: 10-25 ppm; Fehlertoleranz bei der Fragmentmasse: 0,01-0,05 Da; Enzymspezifität: keine (unspezifischer Verdau); Peptidlängenbereich: 4-45 Aminosäuren.
   3. Definieren Sie die Gruppe von PTMs, die in die Suche einbezogen werden sollen.
   4. Exportieren Sie nach Abschluss der Datenbanksuche die pepxml- und mzXML-Dateien (oder MGF-Dateien), die jedem Ionenmobilitätsfenster entsprechen, einschließlich des standardmäßigen vollen Mobilitätsbereichs (0,6-1,6 V·s/cm²).
2. Aufbau der Skyline-Bibliothek
   1. Öffnen Sie Skyline und erstellen Sie ein neues Dokument, stellen Sie sicher, dass die Proteomics-Benutzeroberfläche ausgewählt ist, und verwenden Sie die Standardeinstellungen , sofern nicht anders angegeben.
   2. Navigieren Sie zu Datei > Importieren > Peptidsuche.
   3. Wählen Sie im Assistenten für die Suche nach Importpeptiden die Option Erstellen aus, und fügen Sie die relevanten pepxml-Dateien hinzu (stellen Sie sicher, dass sich die entsprechenden mzXML- oder MGF-Dateien im selben Verzeichnis befinden).
   4. Legen Sie iRT-Standardpeptide auf Automatisch fest, wählen Sie DIA als Workflow aus und klicken Sie dann auf Weiter.
   5. Wählen Sie nach dem Aufbau der Bibliothek etwa 10-15 Peptide als iRT-Standards für die Ausrichtung über Replikate hinweg. Wenn Sie aufgefordert werden, iRT neu zu kalibrieren, klicken Sie auf OK , um fortzufahren.
   6. Klicken Sie auf der Seite "Chromatogramme extrahieren " auf "Durchsuchen ", um alle DIA-Rohdateien auszuwählen und zu importieren, und klicken Sie dann auf "Weiter".
   7. Legen Sie im Fenster Übergangseinstellungen den Gebührenbereich des Vorläufers auf 1-5 , den Ionengebührenbereich auf 1-3, die Ionentypen auf ,p,y,b fest und definieren Sie die Auswahl der Produktionen von Ion 2 bis zum letzten Ion. Weitere empfohlene Einstellungen: Ionenanpassungstoleranz: 0,05 Da, Zu pflückende Peaks: 5.
   8. Nehmen Sie im Fenster "Peptideinstellungen " Änderungen vor, die der in 4.1.3 beschriebenen Sucheinstellung "Peaks" entsprechen.
   9. Geben Sie auf der Seite Isolationsschema einen Namen für die Isolation und das Schema ein, und wählen Sie Vordefinierte Isolationsfenster aus. Klicken Sie auf Importieren und laden Sie eine der DIA-Dateien, um die Konfiguration des Isolationsfensters des Experiments automatisch zu importieren.
   10. Legen Sie die Einstellungen für die vollständige Scanerfassung mit den folgenden Parametern fest. Art der Erfassung: DIA; Produktmassenanalysator: Schwerpunktförmig; Isolationsschema: Verwenden Sie das oben definierte. Massengenauigkeit: 10-20 ppm; Auflösungsvermögen der Mobilität: 30-50; Aktivieren Sie Die Option "Nur verwenden" scannt innerhalb von 5 Minuten nach der vorhergesagten RT. Optional können Sie die MS1-Filterung ändern, wenn MS1-Chromatogramme importiert werden müssen. Wählen Sie einen geeigneten Massenanalysator und eine geeignete Auflösung für eine optimale MS1-Chromatogramm-Extraktion.
   11. Importieren Sie FASTA und generieren Sie Köder. Legen Sie die Methode zur Generierung von Ködern fest: Shuffle-Sequenz.
   12. Enzym auswählen: Der Verdau ist in der endogenen Peptidanalytik unspezifisch. Bearbeiten Sie das Enzym, indem Sie im Dropdown-Menü "Enzym" die Option "Hinzufügen " auswählen. Legen Sie den Namen des Enzyms, Type auf both, c-terminal c-terminal auf KR und cleft auf KR fest , lassen Sie die Semi-Spaltung zu, und klicken Sie auf OK. Setze die verpassten Dekolletés auf 3.
   13. Importieren Sie die FASTA-Zieldatei und klicken Sie dann auf Fertig stellen. Bestätigen Sie die Seite "Assoziierte Proteine ", wenn Sie dazu aufgefordert werden.
   14. Stellen Sie sicher, dass die Spektralbibliothek erfolgreich erstellt und die DIA-Daten importiert wurden. Überprüfen Sie die Liste der identifizierten Peptide manuell und fahren Sie mit der nachgelagerten quantitativen und qualitativen Analyse fort.
3. Qualitative und quantitative Messungen
   HINWEIS: Die qualitativen und quantitativen Analysen werden in Skyline durchgeführt. Weitere Informationen zur Analyse von DIA-Daten in Skyline finden Sie unter https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorial_dia_swath.
   1. Wenn DDA-Daten geladen werden, wählen Sie Einstellungen > Übergangseinstellung aus dem Menü aus, wählen Sie DDA in Acquisition Method aus. Wählen Sie unter Einstellungen > Peptideinstellung die Stufe MS 1 für die Quantifizierung aus.
   2. Wenn DIA-Daten geladen sind, wählen Sie unter Einstellungen > Übergangseinstellung die Option DIA in Erfassungsmethode aus. Wählen Sie unter Einstellungen > Peptideinstellung die Stufe MS 2 für die Quantifizierung aus.
   3. Wählen Sie in der Ansicht > Dokumentraster die Option Peptidquantifizierung und dann die Tabelle exportieren aus. Kombinieren Sie die Tabellenkalkulationen aus DDA-Ergebnissen und DIA-Ergebnissen.
      HINWEIS: Die Tabelle fasst die Peakbereiche für alle Peptide in der Bibliothek über alle Proben hinweg zusammen. In diesem Experiment wurden die Peptid-Peakbereiche auf das Retentionszeit-Standardpeptid GISNEGQNASIK normiert, das Teil der Pierce-Retentionszeitmischung ist. Die Normalisierung wurde durchgeführt, indem das Verhältnis der Peakfläche jedes Peptids zu der des Standards berechnet wurde.

Results

Ein repräsentatives experimentelles Schema ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Analyse der DDA-PASEF-Daten (Abbildung 2), die sowohl unter Verwendung des Standard-Ionenmobilitätsbereichs als auch des IM-GPF aufgenommen wurden, ergab eine wesentlich höhere Peptidabdeckung für den IM-GPF-Ansatz (Abbildung 2B). Bemerkenswert ist, dass sich die meisten Peptide, die mit der Standard-DDA-PASEF-Methode identifiziert wurden, mit denen im IM-GPF-Datensatz überschnitten. Um die Abdeckung der Peptididentifikation zu maximieren, wurde durch die Integration von Identifikationen aus beiden Ansätzen eine umfassende Spektralbibliothek erstellt.

Eine weitere Datenbankanalyse von Replikatdatensätzen, die über DDA- und DIA-PASEF gewonnen wurden (Abbildung 3), unter Verwendung einer kuratierten Datenbank von Ratten-Signalpeptiden, ergab 217 Proteine, die beiden Methoden gemeinsam sind. Darüber hinaus wurden 115 Proteine eindeutig durch DIA-PASEF identifiziert, während 69 ausschließlich durch DDA-PASEF identifiziert wurden. Explorative Analysen unter Verwendung von Spektralbibliotheken, die aus DDA- und IM-GPF-Daten abgeleitet wurden, zeigten, dass DIA-PASEF den sicheren Nachweis von Neuropeptiden wie NPAFLFQPQRF (Neuropeptid SF) und YGGFMRRVGRPEWWMDYQ (abgeleitet von Proenkephalin) ermöglichte. Diese Neuropeptide wurden in den entsprechenden DDA-PASEF-Datensätzen aufgrund einer schlechten Peakzuordnung nicht zuverlässig nachgewiesen (Abbildung 3B,C).

Aus quantitativer Sicht zeigt das Streudiagramm in Abbildung 4A eine moderate positive Korrelation zwischen der Intensität der DDA-Vorläufer und der Ionenintensität des DIA-Fragments, was zu erwarten war, da beide Ansätze die gleichen Peptide quantifizieren, aber unterschiedliche Ionentypen erfassen. Die in Abbildung 4B gezeigten Boxplots für ausgewählte Peptide veranschaulichen die Reproduzierbarkeit der quantitativen Messungen, die mit beiden Ansätzen erzielt wurden. Die Boxplots zeigen die relativen Peakbereiche für jedes Peptid, das mit DIA und DDA gemessen wurde, wobei Fehlerbalken die Messvariabilität über technische Replikate hinweg darstellen. Die ausgewählten Peptide stammen von Opioid-Prohormonen, darunter Proenkephalin (PENK) und Prodynorphin (PDYN), die beide eine zentrale Rolle bei der Modulation von Schmerzen und Analgesie spielen.

Abbildung 1: Überblick über den Peptidomics-Workflow zur Identifizierung und Quantifizierung endogener Peptide aus Rattenhirngewebe. Der Arbeitsablauf umfasst die Gewebedissektion, die Peptidextraktion und -reinigung, die Datenerfassung von LC-Ion Mobility-MS (LC-IM-MS) mittels Gasphasenfraktionierung (IM-GPF) und die Datenverarbeitung zur Generierung von Spektralbibliotheken und zur Durchführung quantitativer Analysen. Teile der Figur wurden in BioRender erstellt. Tan, Y. (2025) https://BioRender.com/vrejrsk. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Datenbank-Peptid- und Proteinidentifizierung. (A) Balkendiagramm, das die Gesamtzahl der Vorläufer, Peptid-Spektrum-Übereinstimmungen (PSMs) und einzigartigen Peptide vergleicht, die über verschiedene Ionenmobilitätsfenster hinweg identifiziert wurden. (B) Tortendiagramm, das den Anteil der Peptide veranschaulicht, die in allen Mobilitätsfenstern gemeinsam identifiziert wurden, und derjenigen, die innerhalb einzelner Fenster eindeutig nachgewiesen wurden. (C,D) Heatmaps, die die Verteilung von Ionensignalen über die m/z- und Ionenmobilitätsdimensionen für den gesamten Mobilitätsbereich (0,6-1,6 Vμs/cm²) (C) und das eingeschränkte Mobilitätsfenster (0,6-1,0 Vμs/^{cm 2}) (D) darstellen. (E) Upset-Diagramm, das die Anzahl der Proteine zeigt, die in Datensätzen identifiziert wurden, die mit DDA- und DIA-Methoden erfasst wurden, wobei gemeinsame und eindeutige Proteinidentifikationen hervorgehoben werden. (F) Heatmap, die Peptide darstellt, die von dem Proenkephalin-Vorläufer abgeleitet sind, der in DIA-erworbenen Replikaten (oberes Bild) und DDA-erworbenen Replikaten (unteres Bild) identifiziert wurde. Leu-Enkephalin wurde in zwei der vier DDA-Replikate nicht nachgewiesen, was auf möglicherweise fehlende Werte bei der DDA-basierten Akquisition hinweist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Vergleichende und explorative Analyse von DDA-PASEF- und DIA-PASEF-Daten unter Verwendung von Spektralbibliotheken. (A) Retentionszeit-Alignment von Neuropeptid-SF über DIA- und DDA-PASEF-Replikate. (B) EIC von PENK (212-229) fragmentiert Ionen aus DIA (oben) und DDA (unten) Datensätzen. (C) Fragmentionenchromatogramme von Neuropeptid-SF aus DIA-Replikaten, die eine hohe Co-Elution und spektrale Qualität zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Vergleich der quantitativen Messungen zwischen DIA-PASEF (MS2-Niveau) und DDA-PASEF (MS1-Niveau). (A) Dieses Streudiagramm vergleicht die Peptidsignalintensitäten, die mit den Modi DIA und DDA erhalten wurden. Insbesondere stellt die x-Achse die logarithmisch_{10-transformierte} Vorläufer-Peakfläche von DDA dar, während die y-Achse die logarithmisch_{10-transformierte} Fragment-Peakfläche von DIA für jedes Peptid zeigt. (B) Boxplots repräsentieren die relativen Peakbereiche von vier repräsentativen Peptiden, PENK 107-133, PENK 188-195, PDYN 221-233 und PDYN 235-248. Fehlerbalken stellen die Variabilität über technische Replikate hinweg dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

In der Peptidomik, insbesondere bei der Analyse endogener Peptide, ist die Beibehaltung des nativen Peptidprofils für die Datenintegrität und die biologische Interpretation unerlässlich. Die kalte Kochsalzperfusion entfernt nicht nur Blut, sondern kühlt auch das Gehirn, was den postmortalen proteolytischen Abbau, der aufgrund der Aktivität endogener Proteasen schnell erfolgt, erheblich reduziert. Durch die Senkung der Gehirntemperatur wird die enzymatische Aktivität verlangsamt und zirkulierende Proteasen aus dem Gefäßsystem gespült, während gleichzeitig die metabolischen Veränderungen nach dem Tod reduziert^{werden 25,26}. Durch die Perfusion mit eiskalter Kochsalzlösung wird auch Blut aus den Gefäßen des Gehirns ausgespült. Dieser Schritt ist besonders wichtig, da Blut Proteine mit hoher Häufigkeit (wie Albumin und Globuline) und zirkulierende Proteasen enthält, die den Neuropeptidnachweis beeinträchtigen können. Der postmortale Abbau von reichlich vorhandenen Blutproteinen kann die Komplexität von Neuropeptidextrakten erhöhen und Signale mit geringer Abundanz maskieren, was letztendlich sowohl die Identifizierung als auch die Quantifizierung beeinträchtigt 25,26,27. Das sofortige Einfrieren des Hirngewebes, entweder auf Trockeneis oder durch Schockfrosten in gekühltem Isopentan, stoppt enzymatische Prozesse fast sofort. Diese Konservierung ist besonders wichtig für den Nachweis von Neuropeptiden mit geringer Abundanz und voller Länge und die Gewährleistung einer zuverlässigen Quantifizierung. Ohne diese Schritte kann der Peptidabbau zu erhöhter Variabilität und Artefakten führen, die sowohl die Identifizierung als auch die Quantifizierung beeinträchtigen. Daher sind Blutentnahme, Kaltperfusion und schnelles Kühlen des Gehirns grundlegende Techniken, die sich direkt auf die Qualität, Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit von Peptidomik-Daten vor Messungen auswirken.

Die Analyse von Peptiden, die aus dem Rattengehirn extrahiert wurden, zeigte das Vorhandensein von zwei unterschiedlichen Ionenmobilitätsfahnen (Abbildung 2C,D). Dieses Phänomen kann entweder auf unterschiedliche molekulare Klassen oder auf unterschiedliche Ladungszustände der Peptide zurückgeführt werden. Wenn die Wolken unterschiedlichen molekularen Klassen entsprechen, können koeluierende Nicht-Peptid-Spezies mit Peptiden um Selektion und Fragmentierung konkurrieren. Wenn die Trennung auf Unterschiede in den Ladungszuständen zurückzuführen ist, wäre zu erwarten, dass die Plume, die hochgeladene Peptide enthält, qualitativ hochwertigere MS/MS-Spektren liefert, was eine zuverlässigere Peptididentifizierung ermöglicht.

Um dies zu untersuchen, implementierten wir eine Ionenmobilitätsfraktionierungsstrategie, bei der Daten über drei diskrete Mobilitätsfenster erfasst wurden: 0,6-1,0, 0,9-1,3 und 1,2-1,6 V·s/cm². Diese Fenster decken zusammen den gesamten Ionenmobilitätsbereich ab, der typischerweise in Standard-DDA-PASEF-Experimenten für Peptide analysiert wird. Wie in Abbildung 2 dargestellt, war die Gesamtzahl der detektierten Vorläufer zwar im gesamten Scanbereich am höchsten (0,6-1,6 V·s/^cm2), aber innerhalb des Zeitfensters von 0,6-1,0 V·s/^cm2 wurde eine signifikant größere Anzahl von Peptid-Spektrum-Übereinstimmungen (PSMs) beobachtet. Dieser Befund deutet darauf hin, dass das Vorhandensein von zwei Wolken tatsächlich auf die Interferenz anderer Moleküle zurückzuführen sein könnte.

Die auf Ionenmobilität basierende Vorläuferfraktionierung führte zu einer 30%igen Steigerung der Peptidabdeckung im Vergleich zur herkömmlichen Vollscan-Methode. Etwa 82 % der im Full-Scan-Datensatz identifizierten Peptide überlappten sich mit Peptiden, die durch Fraktionierung identifiziert wurden (Abbildung 2B), was die Konsistenz und Robustheit der Fraktionierungsstrategie unterstreicht. Basierend auf diesen Beobachtungen nutzten wir die Ionenmobilitätsfraktionierung und die Full-Scan-Daten, um Spektralbibliotheken für die quantitative Analyse von neuroendokrinen Peptiden mit DIA-PASEF zu erstellen.

Die Datenbankanalyse von Replikatdatensätzen, die über DDA und DIA erfasst wurden, ergab eine höhere Anzahl von Peptid- und Proteinidentifikationen in den DIA-Daten, einschließlich 115 Proteinen, die durch DIA eindeutig identifiziert wurden (Abbildung 2E). Dazu gehörten Neuropeptide wie die Pro-FMRFamid-verwandten Peptide FF und VF. Im Gegensatz dazu wurden 69 Proteine ausschließlich durch DDA identifiziert, von denen viele mit der Zelladhäsion und der neuronalen Entwicklung assoziiert sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass DDA- und DIA-Methoden komplementär angewendet werden können, um eine breitere Peptidabdeckung zu erreichen.

Weitere Analysen zeigten, dass die DIA-Akquisition einige der Probleme des fehlenden Wertes effektiv löst, das bei der endogenen Peptidanalyse mit DDA häufig auftritt. Zum Beispiel wurde Leu-Enkephalin nur in zwei von vier DDA-Replikaten nachgewiesen (Abbildung 2F, unteres Bild), während es konsistent in allen vier DIA-Replikaten nachgewiesen wurde (Abbildung 3F, oberes Bild).

Skyline, eine weit verbreitete Plattform für quantitative Proteomik, wurde zur Analyse von DDA- und DIA-PASEF-Datensätzen verwendet²⁸. Die Software erleichtert die Identifizierung von Peptiden durch den Abgleich von Spektralbibliotheken, die Co-Elution der Fragmentionen und die Ausrichtung der Retentionszeit. Um die Fähigkeit von DIA-PASEF zu bewerten, fehlende Identifizierungen zu reduzieren, führten wir eine qualitative Bewertung von Peptiden durch, die ausschließlich im DIA-Datensatz nachgewiesen wurden.

Wie in Abbildung 3D gezeigt, wurde Neuropeptid-SF konsistent über alle DIA-Replikate innerhalb desselben Retentionszeitfensters nachgewiesen. Die Detektion in den DDA-Replikaten wies eine beträchtliche Variabilität auf, wobei die Retentionszeiten zwischen 25 und 45 Minuten lagen (Abbildung 3A). Die beobachteten Inkonsistenzen, einschließlich Peak-Fehlzuweisungen mit niedrigen Konfidenzwerten, waren wahrscheinlich auf eine begrenzte oder minderwertige Fragmentionenabdeckung zurückzuführen, wie in Abbildung 3B gezeigt. Im Gegensatz dazu zeigt Abbildung 3C, dass Fragmentionen , die Neuropeptid-SF entsprechen, über alle DIA-Replikate hinweg gut ausgerichtet waren, was eine sichere automatisierte Identifizierung unterstützt.

Ein Vergleich der spektralen MS/MS-Qualität für das aus Proenkephalin abgeleitete Peptid PENK (212-229) zeigte die Vorteile von DIA-PASEF weiter. Spektren, die aus DIA gewonnen wurden, zeigten eine höhere Intensität und eine verbesserte Fragmentionenqualität im Vergleich zu DDA (Abbildung 3), was besonders vorteilhaft für den Nachweis von endogenen Peptiden mit geringer Abundanz ist.

Die quantitative Analyse bestätigte, dass DIA-PASEF konsistente und reproduzierbare Messungen über biologische Replikate hinweg lieferte, mit einer Leistung, die mit der von DDA vergleichbar war (Abbildung 4). Darüber hinaus ermöglichte DIA die Quantifizierung auf MS2-Ebene, was eine Spezifität auf Fragmentionenebene und ein erhöhtes Vertrauen in die Peptididentifizierung im Vergleich zu MS1-basierter DDA bietet. Diese Ergebnisse unterstützen die Verwendung von DIA-PASEF als zuverlässigen und effizienten Ansatz für die gezielte Quantifizierung von Neuropeptiden in komplexen biologischen Matrices, insbesondere wenn die Vollständigkeit und Reproduzierbarkeit der Daten entscheidend sind.

Dieses Protokoll beschreibt eine umfassende Strategie für die Analyse und Quantifizierung von Neuropeptiden. Der IM-GPF-Ansatz ermöglicht den Aufbau hochwertiger Spektralbibliotheken. Während DIA-PASEF im Vergleich zu DDA-PASEF eine verbesserte Reproduzierbarkeit und eine erhöhte Peptidabdeckung bietet, verbessert es auch die MS2-basierte Quantifizierung. Die Kombination beider Akquisitionsstrategien erhöht die Gesamtabdeckung der Peptide, da jede Methode auf einzigartige Weise zur Identifizierung unterschiedlicher Peptide beiträgt (Abbildung 2E). Die Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass ausreichend Probenmaterial benötigt wird, um sowohl die Generierung von Spektralbibliotheken als auch die Datenerfassung über DDA- und DIA-PASEF-Methoden zu unterstützen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 % Ameisensäure Wasser	Fisher Scientific	LS118-500	LC/
MS-Essigsäure	Fisher Wissenschaftlich	A11350	LC/
MS-Qualität Acetonitril	Fisher Scientific	AA47138K7	Ameisensäure in LC/MS-Qualität
	Fisher Scientific	PI28905	in LC/MS-Qualität
	Fisher Scientific	AA47192K7	LC/MS-Qualität
nanoELute2	Bruker	N/A
Pierce C18 Spin-Säulen	Fisher Scientific
Pierce Peptide Retention Time Calibration Mixture	Thermo Fisher	A11351	LC/MS grade
SpeedVac Vakuumkonzentrator	Genfc	https://scientificproducts.com/product_cat/benchtop-solvent-evaporators/	Das in dieser Studie verwendete Modell ist vom Hersteller nicht mehr erhältlich. Ein Link zum aktuellen äquivalenten Modell wird für die Referenz
timsTOF Pro2	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-pro-2.html
Water	Fisher Scientific bereitgestellt.	LC/MS-Qualität