Methodenartikel

SCAnED - Ein Open-Source-Hautsegmentierungsmakro für die halbautomatische Zell- und Zellkerndetektion in epidermalen und dermalen Hautkompartimenten

DOI:

10.3791/68746

⸱

8. August 2025

 ,  , 
1Department of Dermatology, Medical University of Vienna

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen wir ein halbautomatisches Protokoll zur Identifizierung und Quantifizierung von Immun- und Nicht-Immunzellen in Hautschnitten unter Verwendung von SCAnED vor, einem kostenlosen ImageJ-basierten Makro zur Hautsegmentierung.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die räumliche Verteilung von Immun- und Nicht-Immunzellen innerhalb von Geweben und die Expression zellspezifischer Marker liefern wesentliche Informationen über die Zellfunktion in situ. Die menschliche Haut ist ein hochkomplexes Organ mit definierten Kompartimenten, die aus verschiedenen Zellen mit unterschiedlichen Phänotypen bestehen. Durch die Verwendung von Multi-Fluoreszenz-Markierung können unterschiedliche Hautzellpopulationen bestimmt und weiter charakterisiert werden. Derzeit ist jedoch die Verfügbarkeit von nicht-kommerziellen Werkzeugen für die Bildanalyse von Hautproben, die eine In-silico-Segmentierung von Zellen spezifisch innerhalb der Epidermis oder der Dermis mit einer Einzelzellauflösung ermöglichen, begrenzt. Wir stellen hier ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Immunfluoreszenzfärbung von Hautschnitten, die konfokale Mikroskopie und die Bildanalyse mit unserem frei verfügbaren Tool SCAnED (Skin Compartment Analysis of Epidermis and Dermis) zur Verfügung. Das SCAnED-Makro ermöglicht die präzise Identifizierung und Klassifizierung von Zellen und Zellkernen sowohl in den epidermalen als auch in den dermalen Kompartimenten der menschlichen Haut. Wir geben Richtlinien zur Bestimmung der durchschnittlichen Intensität der Maker-Expression in verschiedenen Zellen und zellulären Kompartimenten, wie z. B. dem Zytoplasma und dem Zellkern, und zur Quantifizierung von Zellen, die unterschiedliche Mengen dieser Marker exprimieren, mit einer begleitenden Python-Pipeline, die als gebrauchsfertiges Jupyter-Notebook bereitgestellt wird, das in Google Colab ausgeführt wird. Dieses Protokoll ermöglicht es unerfahrenen Anwendern, zellspezifische Expressionsprofile innerhalb des Hautgewebes zu bestimmen und Einblicke in die räumliche Verteilung von Zellen innerhalb der epidermalen und dermalen Kompartimente zu erhalten, was ein tieferes Verständnis der komplizierten Gewebestruktur und Zellzusammensetzung der menschlichen Haut ermöglicht.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Verständnis des Hautgewebes auf zellulärer Ebene und die Unterscheidung von Zellphänotypen, Morphologie und deren Lokalisation sowohl innerhalb der epidermalen als auch der dermalen Kompartimente sind für die dermatologische Forschung und Histopathologie von zentraler Bedeutung 1,2. Die zelluläre Zusammensetzung innerhalb der Epidermis, die unter gesunden Bedingungen Keratinozyten, Melanozyten und Langerhans-Zellen umfasst, gerät bei entzündlichen Hauterkrankungen und Krebs stark aus dem Gleichgewicht. Darüber hinaus können sich der Phänotyp und die Lokalisation von Zellen innerhalb der Dermis, die sich unter der Epidermis befinden und Fibroblasten und die Mehrheit der Immunzellen beherbergen, bei Erkrankungen erheblich verändern. Daher ist die Segmentierung von Zellen und Zellkernen unerlässlich, um zelluläre Attribute wie Zellzahl, Proteinexpression, Morphologie und räumliche Organisation sowie Zellkerneigenschaften wie Größe, Form und Transkriptionsfaktorexpression zu beurteilen und damit das Verständnis der Hauthomöostase und von Krankheiten zu unterstützen 3,4,5.

Trotz der Verfügbarkeit von universellen Bildanalyseplattformen wie QuPath6, CellProfiler7 und ilastik8 erfordern diese Tools oft umfangreiche Anpassungen und Skripte, um sich an die strukturelle Komplexität und heterogene Zellmorphologie des Hautgewebes anzupassen. Nur wenige Tools wurden speziell auf die automatisierte Segmentierung von epidermalen und dermalen Kompartimenten zugeschnitten, und viele verfügbare Lösungen sind kommerziell und nicht frei zugänglich. Diese Einschränkungen machen es für Laien schwierig, effiziente Pipelines für die hautspezifische Analyse zu implementieren.

Hier präsentieren wir ein umfassendes Protokoll für die Analyse von Zellen und Zellkernen im Hautgewebe und seinen Kompartimenten, das alle wichtigen Schritte von der Gewebefärbung bis zur Bildanalyse mit unserer halbautomatischen Bildanalyse-Pipeline abdeckt. Wir beginnen mit detaillierten Informationen zur Immunfluoreszenzfärbung von Hautgewebe, einschließlich der Färbung mit E-Cadherin für die Epidermis/Dermis-Segmentierung und 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für den Zell-/Zellkernnachweis. Zwei interessante Marker, Vimentin (VIM) und CD90, wurden zu Validierungszwecken einbezogen. Wir empfehlen, Antikörper in optimierten Konzentrationen zu verwenden (siehe Tabelle 1) und Bilder mit konfokaler Mikroskopie mit konsistenten Einstellungen für Laserintensität, Belichtungszeit und Auflösung aufzunehmen, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.

Darüber hinaus stellen wir unser speziell entwickeltes ImageJ9 Makro SCAnED vor, das für Skin Compartment Analysis of Epidermis and Dermis steht, und wir bieten alle notwendigen Schritte für die In-silico-Segmentierung und den Nachweis von Zellkernen und Zellen sowohl in der Epidermis als auch in der Dermis. Benutzer können zwischen zwei verschiedenen Methoden zur Identifizierung von Kernen wählen, entweder mit einfachem und schnellem Thresholding oder dem Deep-Learning-Tool StarDist10 und unserem trainierten Hautmodell, bevor sie mit dem SCAnED-Protokoll fortfahren. Im Gegensatz zu herkömmlichen Instrumenten wurde SCAnED speziell für die Hauthistologie entwickelt und übertrifft diese, indem es die automatische Kompartimentierung von epidermalen und dermalen Regionen und die integrierte Quantifizierung mehrerer Marker in beiden Regionen ermöglicht. Dies ist besonders nützlich für Forscher, denen es an Erfahrung in Programmierung oder Deep Learning mangelt, und bietet ein gebrauchsfertiges Tool, das auf die Analyse von Hautbildern zugeschnitten ist.

Wir zeigen weiterhin, wie die mittleren Intensitätsniveaus pro Zelle aus Immunfluoreszenzbildern von bis zu fünf verschiedenen Markern von Interesse extrahiert werden. Schließlich stellen wir einen Python-Code für die statistische Analyse der erhaltenen Einzelzelldaten zur Verfügung, der in Google Colab11 geschrieben und ausgeführt und als Jupyter-Notebook freigegeben wurde. Unser Protokoll und das SCAnED-Makro zielen darauf ab, Hautforschern ohne fortgeschrittene Immunfluoreszenz- und Computerkenntnisse ein praktisches Werkzeug zur Markierung und halbautomatischen Quantifizierung der Zell- und Markerexpression in der menschlichen Haut an die Hand zu geben, wobei der Schwerpunkt auf den epidermalen und dermalen Kompartimenten liegt.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Immunfluoreszenzmarkierung von E-Cadherin, VIM und CD90 und Kernfärbung mit DAPI in paraffineingebetteten Hautschnitten

HINWEIS: Das Protokoll zeigt Schritte für in Paraffin eingebettete Abschnitte. Bei frischen und gefrorenen Gewebeproben fixieren Sie die Gewebeschnitte und fahren Sie mit Schritt 1.3 des Protokolls fort.

  1. Schmelzen Sie Paraffin mit einem Ventilator oder Ofen.
  2. Rehydrieren Sie Abschnitte, indem Sie abgestufte Alkohole mit zunehmendem Wassergehalt durchlaufen (z. B. Xylol → 100 % Ethanol → 85 % Ethanol → 70 % Ethanol → Wasser).
  3. Führen Sie die Antigen-Entnahmeschritte entsprechend den Antigenen durch.
  4. Permeabilisieren Sie Gewebeschnitte mit 0,3 % Triton X in PBS (3 x 20 min) (siehe Tabelle 2).
  5. Waschen Sie die Objektträger mit PBS (1 x 5 min).
  6. Umkreisen Sie jede Probe mit einem hydrophoben Schiebestift, um das Verschütten von Flüssigkeit zu verhindern und das Volumen der Reagenzien zu minimieren, und lassen Sie sie trocknen.
  7. Primäre Antikörper (Puffer für Abs: PBS + 2% BSA) applizieren (siehe Tabelle 1 und Tabelle 2). Legen Sie die Objektträger in eine befeuchtete Kammerbox (Nassbox) und inkubieren Sie sie über Nacht.
  8. Waschen Sie die Objektträger mit 0,3 % Triton X in PBS (3 x 5 min).
  9. Entfernen Sie überschüssiges Waschmittel, indem Sie die Objektträger mit PBS waschen (1 x 5 min).
  10. Sekundäre Antikörper und Ziegenserum auftragen (siehe Tabelle 1). Inkubieren Sie die Objektträger 1 Stunde lang an einem dunklen Ort.
  11. Waschen Sie die Objektträger mit 0,3 % Triton X in PBS (3 x 5 min).
  12. Entfernen Sie überschüssiges Waschmittel, indem Sie die Objektträger mit PBS waschen (1 x 5 min).
  13. Fügen Sie DAPI für die Zellkernfärbung hinzu (siehe Tabelle 1). Inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang an einem dunklen Ort.
  14. Waschen Sie die Objektträger mit 0,3 % Triton X in PBS (3 x 5 min).
  15. Waschen Sie die Objektträger mit PBS (1 x 5 min).
  16. Tragen Sie 1 Tröpfchen (~5-15 μl) Fluoreszenzeindeckmedium auf jede Probe auf und platzieren Sie vorsichtig Deckgläser (entfernen Sie ggf. Blasen). Lassen Sie die Dias im Dunkeln trocknen.
Antikörper & FarbstoffeArbeitsschwerpunktVerdünnung
Anti-Vimentin-Antikörper0,8 μg/ml1:50
Anti-E-Cadherin-Antikörper1 μg/ml1:333
Anti-CD90-Antikörper1:1000
AF488 Anti-Maus1:500
AF568 Anti-Kaninchen1:500
AF647 Anti-Maus1:500
DAPI1 μg/ml

Tabelle 1: Antikörper und Farbstoff.

1. Puffer zum Färben
ReagenzEndkonzentrationMenge
BSA2%1 g
PBS1x50 mL
Gesamtn/a50 mL
2. Permeabilisierungs-Puffer
ReagenzEndkonzentrationMenge
Triton X0.30%300 μL
PBS1x100 mL
Gesamtn/a100 mL

Tabelle 2: Rezepte für Lösungen.

2. Konfokale Bildgebung

HINWEIS: Für dieses Protokoll wurde ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop verwendet, das mit einem 10-fach-Objektiv (NA 0,4) und 4 Laserlinien (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm) ausgestattet ist.

  1. Nehmen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop auf (siehe Beispielbild in Abbildung 1).
  2. Verwenden Sie den folgenden Parameter für die Scangröße, um das Makro zu erstellen, das StarDist-Modell zu trainieren und idealerweise für die Bildaufnahme: Bildgröße = 4.096 x 4.096 Pixel (oder 1.273 x 1.273 Mikrometer), Bittiefe = 16 Bit, minimale Pixelgröße = 0,3 Mikrometer, Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) = mindestens 3.

figure-protocol-1
Abbildung 1: Immunfluoreszenzfärbung eines Hautschnitts. DAPI: markiert Zellkerne, CD90: Fibroblastenmarker, E-Cadherin: wird zur Markierung der Epidermis verwendet, VIM: VIM-exprimierende Zellen, Merge: Verschmelzung von DAPI (magenta), CD90 (blau), E-Cadherin (gelb) und VIM (grün). Maßstabsstäbe = 100μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Bildanalyse mit dem SCAnED-Makro (Supplemental File 1, Supplemental Video S1 und Supplemental Video S2)

  1. Starten Sie das Makro (SCAnED.mp4 Film).
    1. Öffnen Sie Immunfluoreszenzbilder in Fiji/ImageJ unter Verwendung von Bioformaten mit Standardeinstellungen.
      HINWEIS: Teilen Sie die Kanäle in diesem Schritt nicht.
    2. Laden Sie das SCAnED-Makro herunter und führen Sie es aus, indem Sie zu Plugins | Makros | Führen Sie das SCAnED-Makroskript aus, und wählen Sie es aus (Ergänzende Datei 1).
    3. Befolgen Sie die Schritt-für-Schritt-Anleitung auf dem Bildschirm, die vom Makro bereitgestellt wird.
  2. In-silico-Segmentierung von Epidermis und Dermis mit dem SCAnED-Makro.
    1. Wählen Sie den E-Cadherin-Kanal aus, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
    2. Passen Sie den Schwellenwert manuell an, indem Sie zu Bild | Anpassen | Schwellenwert und klicken Sie auf OK für den E-Cadherin-Kanal, um die epidermale Region vollständig zu erfassen.
    3. Bestätigen Sie bei Bedarf den Schritt Flood Fill, um Lücken in der E-Cadherin-Maske zu schließen, indem Sie das Symbol Flood Fill Tool in ImageJ auswählen, auf den oberen Teil der Epidermis klicken und dann auf OK klicken (Ergänzende Abbildung S1A-E und Tipps zur Fehlerbehebung im Diskussionsabschnitt).
    4. Wenn die Maske invertiert ist, wählen Sie Ja und OK aus, wenn Sie aufgefordert werden, die Auswahl umzukehren. Andernfalls wählen Sie Nein und OK aus (siehe Ergänzende Abbildung S1F,G und Tipps zur Fehlerbehebung im Abschnitt Diskussion).
    5. Wählen Sie den DAPI-Kanal aus, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Die Zellkernbilder vor und nach der epidermal-dermalen Segmentierung sind in Abbildung 2 dargestellt.
  3. Kernsegmentierung mit der Schwellenwertfunktion
    1. Definieren Sie automatisch Intensitätsstufen.
  4. Kernsegmentierung mit StarDist
    1. Öffnen Sie StarDist in ImageJ (Abbildung 3).
    2. Laden Sie das Kerndetektionsmodell (Supplemental File 2) in die StarDist-GUI (Abbildung 4). Das entsprechende Trainingspaar zum Erstellen des StarDist-Modells ist in der ergänzenden Abbildung S2 dargestellt.
      HINWEIS: Tensor Flow Version 1.15 sollte für dieses Modell verwendet werden, wenn ein StarDist-Fehler auftritt (siehe Ergänzende Abbildung S3).
    3. Klicken Sie zuerst auf den Kernkanal.
    4. Passen Sie die Kacheleinstellungen entsprechend an (stellen Sie sicher, dass die Anzahl der Kacheln der erwarteten Patch-Größe (256 x 256 px) entspricht (siehe Abbildung 3 und Abbildung 4).
      HINWEIS: Die StarDist-Segmentierung kann je nach Anzahl der Kerne einige Zeit in Anspruch nehmen.
  5. Intensitätsmessung und Quantifizierung von nukleären Proteinen
    HINWEIS: Gehen Sie vor dem Ausführen von SCAnED zu Analysieren | Stellen Sie Messungen ein und konfigurieren Sie die Parameter, um eine genaue und relevante Datenausgabe zu gewährleisten (Abbildung 5).
    1. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, wählen Sie Ja , um die Markierungsintensität in den Zellkernen zu messen.
    2. Wählen Sie den passenden Marker-Kanal (bis zu fünf möglich).
    3. Speichern Sie die Ergebnisse als CSV-Dateien, wie vom Makro angewiesen.
    4. Wiederholen Sie den Vorgang für jeden Kanal.
    5. Nachdem alle Kanäle verarbeitet wurden, speichern Sie die Ergebnisse als CSV-Dateien, wie vom Makro angewiesen.
      HINWEIS: Zur besseren Visualisierung haben wir für den Rest der Analyse eine vergrößerte Ansicht einer bestimmten Hautregion eingefügt (Abbildung 6).
  6. Zellsegmentierung (zytoplasmatische Region)
    HINWEIS: Die Zellsegmentierung basiert auf der Erweiterung des nukleären ROI und muss daher nach der Kernsegmentierung eingeleitet werden.
    1. Wenn die Schwellenwertfunktion für die Kernsegmentierung verwendet wurde, wenden Sie die binäre Dilatation an.
    2. Wenn StarDist für die Kernsegmentierung verwendet wurde, verwenden Sie die Vergrößerungsexpansion, die eine längere Verarbeitungszeit hat (siehe Ergänzende Abbildung S4).
  7. Intensitätsmessung und Quantifizierung von zytoplasmatischen Proteinen
    1. Wählen Sie Ja aus, um die Markierungsintensität in ganzen Zellen zu messen.
    2. Speichern Sie die CSV-Ergebnisdateien gemäß den Anweisungen des Makros.
    3. Wiederholen Sie den Vorgang für jeden Markierungskanal der Reihe nach.
    4. Behalten Sie die gleiche Reihenfolge der Kanäle für Kern- und Zellmessungen bei, um die Konsistenz der Ausgabedaten zu gewährleisten.
    5. Wählen Sie Verwerfen , wenn das Makro dazu auffordert, um eine Vermischung der Zellkerndaten zwischen Epidermis und Dermis zu vermeiden. Abbildung 7 veranschaulicht alle Schritte der schwellenwertbasierten Segmentierung.

figure-protocol-2
Abbildung 2: Kanalspezifische Zellkernanalyse und Trennung in epidermalen und dermalen Kernen. Die Immunfluoreszenzfärbung von DAPI zeigt die Morphologie und räumliche Verteilung der Zellkerne in der ganzen Haut (linkes Bild). Die Darstellung der Zellkernkanäle der mit DAPI gefärbten Epidermiskerne gibt Aufschluss über die Verteilung der Zellkerne innerhalb des epidermalen Kompartiments (mittleres Bild). Darstellung des Zellkernkanals von Hautkernen, die mit DAPI gefärbt wurden, und bietet eine Visualisierung der Zellkernverteilung innerhalb des dermalen Kompartiments (rechtes Bild). Maßstabsstäbe = 100μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-protocol-3
Abbildung 3: Verwendung der Option "StarDist". Screenshot, der die Position der Option "StarDist 2D" im Menü/Plugins/StarDist/StarDist 2D zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-protocol-4
Abbildung 4: Anweisungen zur Verwendung des Nuclei Detection Model. Laden Sie die Datei "nuclei_detection_model.zip" herunter und geben Sie den Dateipfad im Abschnitt "Durchsuchen " an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-protocol-5
Abbildung 5: Konfigurieren der Messeinstellungen. (A) Screenshot, der die Position der Option "Messungen festlegen" im Menü hervorhebt und die Anpassung der Messparameter für die nachfolgende Analyse ermöglicht. (B) Das Feld "Messungen einstellen " zeigt die Schnittstelle zum Anpassen der Messeinstellungen an, sodass Benutzer Parameter für die Datenerfassung und -analyse festlegen können. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-protocol-6
Abbildung 6: Vergrößerte Ansicht eines bestimmten Bereichs. (A) Verschmelzung von DAPI (Magenta) und VIM (grün) Färbung. (B) Vergrößerte Ansicht einer bestimmten Region von A, die eine detaillierte Visualisierung der VIM-Expression im Hautgewebe ermöglicht. Bitte beachten Sie die unterschiedliche Morphologie der Zellkerne innerhalb der Epidermis und der Dermis. Maßstabsleisten = 100 μm (A), 20 μm (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-protocol-7
Abbildung 7: SCAnED-Segmentierung in Epidermis und Dermis für Zellkerne und Zellen anhand des Schwellenwerts. (A) Gesamtes Bild: Zusammenführung der Färbung von DAPI (Magenta) und VIM (grün). Oberer Teil: (B) Verschmelzung der epidermalen Kerne, die nach der Trennung mit DAPI und VIM gefärbt wurden. (C) Maskierung der epidermalen Kerne unter Verwendung der Schwelle. (D) Die Zellkernsegmentierung der epidermalen Kerne, die mit der Verschmelzung von DAPI und VIM überlagert ist, unterstützt die Visualisierung der Kernverteilung innerhalb des epidermalen Kompartiments. (E) Die Zellsegmentierung der epidermalen Kerne, die sich mit der Verschmelzung von DAPI und VIM überlagert, unterstützt die Visualisierung der Kernverteilung innerhalb des epidermalen Kompartiments unter Verwendung von Schwellenwert und Dilatation, da sie zeigt, dass die Selektionsregion größer ist als die Zellkerne. Unterer Teil: (F) Verschmelzung der mit DAPI und VIM gefärbten Hautkerne nach der Trennung. (G) Maskierung der Hautkerne mit Hilfe der Schwelle. (H) Die Zellkernsegmentierung der dermalen Kerne überlagert die Verschmelzung von DAPI und VIM, was die Visualisierung der Kernverteilung innerhalb des dermalen Kompartiments erleichtert. (I) Zellsegmentierung der dermalen Kerne, die der Verschmelzung von DAPI und VIM überlagert sind, um die Sichtbarkeit der Zellkernverteilung innerhalb des dermalen Kompartiments zu erleichtern. Maßstabsbalken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Klassifizierung und Visualisierung von extrahierten Einzelzelldaten (Ergänzendes Video S3)

HINWEIS: Jeder Immunfluoreszenzmarker generiert zwei CSV-Dateien: eine für das epidermale Kompartiment und eine für das dermale Kompartiment.

  1. Legen Sie markerspezifische Intensitätsschwellenwerte mit Hilfe von Isotyp-Kontrollproben fest.
    1. Importieren Sie die vom SCAnED-Makro generierten CSV-Ausgabedateien mit dem bereitgestellten Jupyter Notebook in Google Colab. Laden Sie zunächst das entsprechende Jupyter Notebook herunter (z.B. Supplemental File 3 oder Supplemental File 4), gehen Sie zu Google Colab (https://colab.research.google.com/), klicken Sie auf Datei, öffnen Sie das Notebook, wählen Sie die Datei aus, führen Sie die Codezellen nacheinander aus. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, klicken Sie auf die Schaltfläche und laden Sie die .csv Datei hoch.
    2. Berechnen Sie für jeden Antikörper die mittlere Fluoreszenzintensität aus den Isotypkontrollen. Um den Cut-off für jeden Antikörper zu bestimmen, öffnen Sie das DotPlot-Notebook (Ergänzungsdatei 4), laden Sie die entsprechende Isotyp-Kontrolldatei hoch und führen Sie den Code aus.
    3. Wählen Sie basierend auf der Verteilung der Punkte in der Isotypkontrolle und den spezifischen Antikörperdiagrammen einen geeigneten Intensitätsschwellenwert, um den Hintergrund (Isotypkontrolle) vom Signal (spezifische Färbung) zu trennen. Verwenden Sie diese Werte als Grenzwerte, um einzelne Zellen für den Markerausdruck als positiv oder negativ zu klassifizieren.
  2. Vergleichen Sie die Markerintensitäten in experimentellen Proben mit den berechneten Schwellenwerten.
    1. Klassifizieren Sie Zellen mit Intensität ≥ Schwellenwert als positiv.
    2. Klassifizieren Sie Zellen mit Intensität < Schwellenwert als negativ.
    3. Klassifizieren Sie Subpopulationen basierend auf Kombinationen der Markerexpression, z. B. identifizieren Sie einfach positive, doppelt positive oder dreifach positive Zellpopulationen.
  3. Visualisieren Sie die Verteilung und die Beziehungen des Markerausdrucks mit zwei Arten von Diagrammen:
    1. Erstellen Sie Histogramme und Overlay-Histogramme, um die Intensitätsverteilung zwischen Erkrankungen (z. B. Kontroll- und erkrankte Haut) zu vergleichen, indem Sie den Histogramm-Code ausführen (laden Sie die ergänzende Datei 3 herunter, gehen Sie zu Google Colab (https://colab.research.google.com/), klicken Sie auf Datei, öffnen Sie das Notebook, wählen Sie die Datei aus, führen Sie den Code aus) (Abbildung 8).
    2. Erstellen Sie Punktdiagramme, um Streudiagramme im Durchflusszytometrie-Stil zur Bewertung von Co-Expressionsmustern zu simulieren, indem Sie den DotPlot-Code ausführen ( Laden Sie die Zusatzdatei 4 herunter, gehen Sie zu Google Colab (https://colab.research.google.com/), klicken Sie auf Datei, öffnen Sie das Notebook, wählen Sie die Datei aus, führen Sie den Code aus) (Abbildung 9).
    3. Exportieren Sie die aufbereiteten Daten für zusätzliche Analysen und die Bewertung signifikanter Unterschiede mit statistischen Tests.

figure-protocol-8
Abbildung 8: Overlay-Histogramm zum Vergleich der mittleren Intensität von VIM-positiven Zellen. Histogramm-Overlay, das die mittlere Intensität von VIM-Zellen in gesunden Proben (H) in Blau und Psoriasis-Proben (P) in Orange innerhalb der Dermis vergleicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-protocol-9
Abbildung 9: Doppelt positive Signale in einem Punktdiagramm. Eine Demonstration eines doppelt gefärbten Punktdiagramms, das zu einer besseren Visualisierung von einfach-positiven, doppelt positiven und doppelt negativen Populationen beitragen kann. Dieses Beispiel zeigt die doppelte Färbung von CD90 und VIM in der Dermis von (A) gesunder und (B) Psoriasis-Haut und in der Epidermis von (C) gesunden und (D) Psoriasis-Hautproben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In einer früheren Studie haben wir SCAnED erfolgreich eingesetzt, um Zellen und Expressionsniveaus von Lysyloxidase (LOX), einem zytoplasmatischen Protein, und dem Transkriptionsfaktor Hypoxie-induzierbarer Faktor 1 (HIF-1) in Zellen in der Dermis der menschlichen Haut12 zu detektieren und zu quantifizieren, was die Anwendbarkeit dieses Werkzeugs für die Hautforschung unterstreicht.

Um die Präzision unseres Hautsegmentierungsmakros bei der Identifizierung von Zellen und...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das SCAnED-Protokoll ist eine halbautomatische Methode zur kompartimentspezifischen Analyse von Immun- und Nicht-Immunzellen im menschlichen Hautgewebe. Der Workflow integriert ein E-Cadherin-basiertes Färbeprotokoll, um die Segmentierung von Epidermis und Dermis, die DAPI-basierte Zellkern- und Zelldetektion zu ermöglichen, gefolgt von der Quantifizierung der Markerexpression in Zellkernen und Zellen mit unserem ImageJ-basierten Makro. Darüber hinaus führen wir die Benutzer durch die An...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Entwicklung dieser Bildanalyse-Pipeline wurde vom Land Niederösterreich im Rahmen des Danube Allergy Research Clusters und von der Fellinger Krebsforschung gefördert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,3 % Triton X Sigma-AldrichT9284
BSA (Rinderserumalbumin)Sigma Aldrich
CD90ZellsignalübertragungD3V8A
DAPI Roche10236276001
Deionisiertes Wasser
E-cadherin Abcamab1416
Fluoreszenz-Montagemedium DakoS3023
Ziegen-Maus-IgG1 kreuzadsorbierter sekundärer Antikörper, Alexa Fluor 488  (AF 488 Anti-Maus)Thermo Fisher ScientificA-21121
Ziegen-Maus-IgG2a-kreuzadsorbierter sekundärer Antikörper, Alexa Fluor 647 (AF 647 Anti-Maus)Thermo Fisher ScientificA-21241
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Cross-Adsorb-Sekundärantikörper, Alexa Fluor 568 (AF 568 Anti-Kaninchen-Anti-Anti-Kaninchen)Thermo Fisher ScientificA-11011
Ziegenserum Agilent Technologies Ö sterreich GmbH, DakoX0907
PBS Gibco14190-094
Vimentin DakoM7020
Materialien
Kammerbox (Nassbox)
Coverslips Thermo Fisher
Flüssigkeitsabstoßender Dia-Markerstift zum Färben (hydrophob) Daido SangyoZ37782124x50mm
Lösungen
Permeabilisierungspuffer (0,3 % Triton X in PBS) Siehe Tabelle 2
Färbungspuffer (2 % BSA in PBS) Siehe Tabelle 2
Software und Datensätze
Konfokales Laserscanningmikroskop OlympFV3000 basierend auf dem invertierten IX83ausgestattet mit einem 10x-Objektiv (NA 0,4), 4 Laserlinien (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm, Kohärent)
Fiji (ImageJ) V1.54h
Google ColabGoogeln
GraphPad Prism GraphPad Software Inc.Prism 10für weitere statistische Analysen
HEILIGENSCHEINIndica Labs
Python-ProgrammPython 3.11.12
QuPathoffene Software (Bankhead, P. et al., https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5)v0.5.1
StarDistInstalliere die CPU-Version TF1.15.0

Referenzen

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  10. Schmidt, U., Weigert, M., Broaddus, C., Myers, G. Cell detection with star-convex polygons. Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention - MICCAI 2018. Frangi, A., Schnabel, J., Davatzikos, C., Alberola-Lopez, C., Fichtinger, G. 11071, Springer. Cham. Lecture notes in Computer Science 265-273 (2018).
  11. Google Colab. , Google. https://colab.research.google.com/ (2025).
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