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Methodenartikel

Präparation meiotischer Chromosomenspreizungen aus Maus-Eizellen zur Beurteilung von Synapse und Rekombination

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DOI:

10.3791/68749

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18. Juli 2025

1Department of Biomedical Sciences, Cornell University, 2Cornell Reproductive Sciences Center, Cornell University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Meiotische Fehler in Synapsen und Rekombination sind bei Säugetier-Eizellen üblich. Eine rigorose Analyse der Proteine, die an diesen Prozessen beteiligt sind, ist unerlässlich, um zu verstehen, wie und warum die Oogenese oft schief geht. Die hier vorgestellten Techniken ermöglichen ein umfassendes Monitoring von Rekombination und Synapsen, um die Eizellqualität bei Mäusen zu bewerten.

Zusammenfassung

Drei kritische und voneinander abhängige Prozesse definieren die meiotische Prophase I: Homologe Chromosomen müssen sich miteinander paaren, eine proteinöse Struktur, die als synaptonemaler Komplex bezeichnet wird, bildet sich, um Homologe miteinander zu verbinden (Synapse), und Homologe durchlaufen eine Rekombination, bei der genetisches Material wechselseitig ausgetauscht wird, um Crossover (COs) zu bilden. Fehler in diesen Prozessen können zu vorzeitiger Ovarialinsuffizienz, Aneuploidie und schließlich zu Schwangerschaftsverlust und Unfruchtbarkeit führen. Die meiotische Rekombination ist bei Eizellen besonders fehleranfällig, da über 7 % der menschlichen Eizellen mindestens ein Chromosomenpaar ohne Kreuzung enthalten und zwischen 20 % und 80 % der Eizellen und 2,5 % bis 7 % der Spermien aneuploid sind. Es bleibt jedoch unklar, warum Chromosomenfehler so eklatante Geschlechterunterschiede aufweisen. Das vorliegende Protokoll beschreibt Verfahren zur Präparation und Analyse von Prophase-I- und Metaphase-I-Chromosomenausbreitungen von Eizellen bei fötalen bzw. juvenilen Mäusen. Um die kritische Chromosomendynamik während der meiotischen Prophase I zu verfolgen, verwendet dieses Protokoll Immunfluoreszenzfärbung gängiger Marker für meiotische Rekombination (RAD51 für Doppelstrangbrüche, MSH4 für CO-Zwischenprodukte und MLH1/MLH3 zur Identifizierung der meisten COs) und Synapse (SYCP3 für Chromosomenachsen, SYCP1 für synapsierte Regionen und HORMAD1 für asynapsierte Regionen). Darüber hinaus verwendet dieses Protokoll die In-vitro-Reifung von entnommenen Eizellen, um die Anzahl der gepaarten Chromosomen (bivalente) und die Gesamtzahl der Crossover (Chiasmata) in der Metaphase I zu bestimmen. Zusammen bieten diese Techniken einen umfassenden und quantitativen Rahmen zur Untersuchung von Mechanismen, die die frühe Chromosomendynamik bei der weiblichen Meiose regulieren.

Einleitung

Meiose ist eine spezialisierte Zellteilung, die für die Produktion haploider Gameten unerlässlich ist. Während der Prophase I müssen homologe Chromosomen (die jeweils aus Schwesterchromatiden bestehen, die durch Kohäsin zusammengehalten werden) drei kritische Aufgaben erfüllen: 1) einander erkennen und miteinander paaren, 2) durch Bildung des synaptonemalen Komplexes (SC) zwischen ihren lateralen Achsen zusammenschließen und 3) DNA über homologe Rekombination austauschen, was zu Crossovers (COs) zwischen Nicht-Schwesterchromatiden führt 1,2. Die physikalische Verbindung, die sich aus der Crossover-Bildung ergibt und durch Kohäsin aufrechterhalten wird, gewährleistet eine korrekte Chromosomenbiorientierung und -segregation während der MetaphaseI 3,4,5.

Die meiotische Prophase I besteht aus fünf Stadien, die jeweils durch den Status der Synapse6 definiert sind. Beim Leptonem (griechisch für dünner Faden) kondensieren die Chromosomen, da sich das axiale Element (markiert durch SYCP3) entlang der Chromosomenachsen bildet. Während des Zygonems (verbundene Fäden) beginnen Homologe zu synapsen, da sich das transversale Element des SC (SYCP1) zwischen den Achsen7 bildet. Beim Pachynem (dicker Faden) sind die Chromosomen über ihre gesamte Länge synapsiert. Der SC zerlegt sich dann während des Diplonems (zwei Fäden), so dass Homologe nur an Kreuzungsstellen (Chiasmen) verbunden sind. Chiasmen sind das Produkt der homologen Rekombination, einem Prozess, der mit der programmierten Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) eingeleitet wird. Von Hunderten von DSBs werden nur ~10% zu COs. Bei Mäusen bilden sich die meisten (90%-95%) über den durch MutLγ (MLH1-MLH3) erleichterten CO-Signalweg der Klasse I, während die restlichen COs von MUS81-EME1 über den CO-Signalweg der Klasse II 8,9,10,11 gebildet werden.

Paarung, Synapse und Rekombination sind hochgradig regulierte und voneinander abhängige Prozesse. Fehler lösen in der Regel Checkpoint-Mechanismen aus, die zum Zelltod führen. Bei Frauen kann der Keimzellverlust durch frühe Prophase-I-Fehler zu einer vorzeitigen Ovarialinsuffizienz führen12,13, während späte Fehler (z. B. fehlende Homologe, Fehlplatzierungen von COs oder vorzeitiger Kohäsinverlust) zu Chromosomenmissegregation und Aneuploidie führen können. Beim Menschen sind meiotische Fehler eine der Hauptursachen für Schwangerschaftsverluste und Unfruchtbarkeit. Die weibliche Meiose ist besonders fehleranfällig. Etwa 20%-80% der menschlichen Eizellen (gegenüber 2,5%-7% der Spermien) tragen abnormale Chromosomenzahlen, die meisten resultieren aus Fehlern in der ersten meiotischen Teilung 14,15,16,17. Obwohl das Alter als die häufigste Ursache für mütterliche Aneuploidie identifiziert wurde, bleibt der Grund, warum Eizellen so anfällig für Fehler sind, unklar.

Obwohl es wichtig ist, die Faktoren zu verstehen, die den hohen Fehlerraten bei Eizellen zugrunde liegen, stammt der größte Teil unseres Wissens über die Regulation von Prophase-I-Ereignissen aus Studien zur männlichen Meiose. Da ein kleines Fragment von adultem Hodenmaterial ausreichendes Material liefert, um alle Stadien meiotischer und postmeiotischer Keimzellen zu beurteilen, war die männliche Meiose für Forscher lange Zeit leichter zugänglich. Im Gegensatz dazu verläuft die weibliche Meiose diskontinuierlich. Bei Mäusen verläuft die Prophase I semisynchron im fötalen Eierstock, beginnend etwa 14 Tage nach dem Koitum (dpc; Abbildung 1A), kurz nach der Geschlechtsbestimmung der Gonaden 18,19,20. Um die Zeit der Geburt herum treten die Eizellen bis zum Eisprung Monate (bei Mäusen) oder Jahrzehnte (beim Menschen) später in einen diktyaten Arrest ein 21,22,23. Folglich sind spezifische Prophase-I-Stadien nur in begrenzten Entwicklungsfenstern zugänglich (Abbildung 1A), wobei Post-Prophase-I-Ereignisse nur in wenigen Eizellen gleichzeitig bei Jugendlichen und Erwachsenen auftreten. Obwohl technische Fortschritte die Meiose von Säugetieren verbessert haben, bleiben diese Methoden im Vergleich zu vergleichbaren Techniken, die in männlichen Studien verwendet werden, herausfordernd und zeitaufwändig.

Die meiotische Analyse bei Frauen wird durch die Einschränkung der Pachyten-Eizellen unter dem Staging weiter erschwert - entscheidend für die Untersuchung der Crossover-Bezeichnung und -Reifung. Männliche Studien profitieren von einer gut charakterisierten Dynamik der Paarung von Geschlechtschromosomen und dem Vorhandensein der Histonvariante H1t, die als Marker für frühes, mittleres und spätes Pachynema dienen 24,25,26. Es wurde jedoch keine zuverlässige Methode für das Sub-Staging von Pachyten-Eizellen formalisiert.

Die hier vorgestellten Protokolle ermöglichen eine umfassende Analyse der Synapse und Rekombination in Maus-Eizellen von der frühen Prophase I bis zur Metaphase I. Diese Arbeit baut auf klassischen Chromosomenspreizungstechniken auf, die von Peters et al.27 und Tarkowski28 entwickelt wurden, und auf früheren Verfeinerungen dieser Methoden durch Hunt29 und Sun und Cohen30. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um folgende Schwerpunkte zu legen: 1) Anreicherung und Identifizierung spezifischer Prophase-I-Substadien, 2) Maximierung der Anzahl der pro Paar fetaler Eierstöcke durchgeführten Anwendungen und 3) gründliche, zugängliche Metriken zur Bewertung von Synapsendefekten und Rekombination von Herden zu Chiasmen.

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Protokoll

Alle Tierbehandlungen und -verfahren wurden nach Genehmigung durch das Cornell Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) gemäß Protokoll 2004-0063 durchgeführt.

1. Vorbereitung des Prophase-I-Chromosomen-Spread-Objektträgers der Eizelle

  1. Am späten Nachmittag vereinbaren Sie zeitlich festgelegte Paarungen von weiblichen C57BL/6J-Mäusen (2 - 6 Monate alt) mit männlichen Mäusen (2 - 12 Monate alt). Ab dem nächsten Tag sollten Sie die Weibchen jeden Morgen (vor 9 Uhr) auf einen Kopulationspfropfen untersuchen. Der Mittag am Tag des Steckers ist definiert als 0,5 dpc.
  2. Bereiten Sie Folgendes vor, bevor Sie trächtige Mäuse opfern.
    1. Stellen Sie eine Befeuchtungskammer mit Raumtemperatur H2O auf.
    2. Bereiten Sie 10 ml hypotonen Extraktionspuffer (HEB; siehe Tabelle 1) bestehend aus 30 mM Tris-HCl, 50 mM Saccharose, 17 mM Natriumcitrat, 5 mM EDTA, 2,5 mM DTT und 0,5 mM PMSF in Milli-Q Wasser vor. Vor der Zugabe von DTT und PMSF den pH-Wert mit 50 mM Borsäure auf 8,2 - 8,4 einstellen. Machen Sie HEB frisch und verwenden Sie es innerhalb von 2 Stunden nach Zugabe von DTT.
    3. Bereiten Sie 100 mM Saccharose vor, indem Sie 342 mg Saccharose zu 10 ml ultrareinem H2O hinzufügen. Bei Nichtgebrauch bei 4 °C lagern.
    4. Reinstes H2O in einer handelsüblichen Mikrowelle 1 min (bis 90 - 95 °C) vorheizen. Geben Sie unter einem Abzug das erhitzte hochreine H2O zu 0,5 g Paraformaldehyd (PFA). Fügen Sie zwei Tropfen 1 N NaOH hinzu, mischen Sie es und lassen Sie es auf Raumtemperatur abkühlen. Stellen Sie den pH-Wert mit 50 mM Borsäure auf 9,2 - 9,3 ein und fügen Sie Triton X-100 auf 0,15 % (v/v) hinzu. Geben Sie ultrareines H2O zu einem Endvolumen von 50 mL (1%ige PFA-Fixierlösung) und gießen Sie das Fixiermittel in ein 50 mL Coplin Färbeglas aus Glas.
      HINWEIS: Dieses Protokoll wurde unter Verwendung von fast kochendem Wasser zur Herstellung von PFA optimiert. Das Erhitzen von PFA in Lösung über 65 °C kann jedoch zum Abbau und zur Freisetzung giftiger Dämpfe führen. Alternativ Reinstwasser H2O im Wasserbad auf 60 °C vorheizen.
    5. Reinigen Sie Mikroskopobjektträger aus Glas mit 70 % Ethanol. Verwenden Sie einen hydrophoben Barriere-PAP-Stift, um bis zu drei Quadrate (ca. 20 x 20 mm; siehe Abbildung 1E) zu zeichnen. Ein einzelnes Paar Eierstöcke bietet ausreichend Material für sechs Quadrate (oder zwei Objektträger mit je 3 Quadraten).
  3. Tötet trächtige Mäuse 14,5 - 18,5 dpc durch CO2 -Erstickung und Gebärmutterhalsdislokation gemäß den IACUC-Richtlinien.
    1. Die Zeitpunkte für die Anreicherung bestimmter Stadien der Prophase I bei C57BL/6J-Mäusen sind in Abbildung 1A dargestellt. Für die gegebenen Entwicklungszeitpunkte wurde der ungefähre Prozentsatz der Eizellen in jedem Stadium der Prophase I unter Verwendung von Daten von Evans et al. (1982)31 ermittelt. Für zygotene Eizellen auf 16,5 dpc sammeln; frühes Pachyten mit 17,5 dpc; und Mid-Pachyten-Diploten mit 18,5 dpc.
  4. Verwenden Sie eine Präparierschere, um die Bauchhöhle zu öffnen und die Gebärmutterhörner zu entfernen.
  5. Präparieren Sie die fötalen Mäuse aus dem Gebärmutterhorn, dem Dezidualgewebe und dem Dottersack. Legen Sie fötale Mäuse in eine 100 mm Petrischale mit 1x Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS).
  6. Präparieren Sie die Eierstöcke jeweils von einem weiblichen Fötus, während der Rest in 1x PBS bleibt. Opfern Sie fötale Mäuse durch Enthauptung gemäß den IACUC-Richtlinien. Befestigen Sie den Rumpf mit Probenstiften aus Edelstahl an einem Silikonpad in einer Präparierstale.
  7. Verwenden Sie eine Mikrodissektionsschere, um einen Bauchschnitt direkt unter dem Nabel zu machen, und achten Sie darauf, dass die Arterien nicht eingekerbt werden. Verschieben Sie den Darm mit einer feinen Zange, bis die Gebärmutterhörner des Fötus sichtbar sind.
  8. Um die Eierstöcke zu lokalisieren, folgen Sie jedem Gebärmutterhorn von der Blase nach außen in Richtung Niere. Der Eierstock und der Eileiter erscheinen als kleine Kügelstrukturen an den Enden der Gebärmutterhörner, die sich direkt unter der Niere und in der Nähe des hinteren Teils der Peritonealhöhle befinden (Abbildung 1B).
  9. Kneifen Sie mit einer feinen Pinzette die Eierstöcke ab und sammeln Sie sie in einem kleinen Uhrenglas, das mit 750 μl 1x PBS gefüllt ist.
  10. Präparieren Sie den Eierstock vom umgebenden Gewebe und legen Sie beide Eierstöcke in ein Uhrglas mit 750 μl HEB, wobei Sie darauf achten, dass die Eierstöcke vollständig untergetaucht sind (siehe Abbildung 1C und 1D). Inkubieren Sie die Eierstöcke 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  11. Pipettieren Sie 35 μl 100 mM Saccharose auf einen konkaven Objektträger. Übertrage mit einer feinen Pinzette beide Eierstöcke von HEB auf Saccharose.
  12. Verwenden Sie eine 25-G-Nadel, um einen Eierstock am Objektträger zu befestigen, während Sie eine zweite Nadel verwenden, die nach unten abgeschrägt ist, um die Eizellen aus dem Eierstock herauszudrücken.
    1. Wenn der Eierstock durchsichtig und geleeartig wird, entfernen Sie den Eierstock aus dem HEB und wiederholen Sie den Vorgang mit dem zweiten Eierstock. Pipettieren Sie die Lösung vorsichtig, um die Zellen zu dispergieren.
  13. Tauchen Sie den Objektträger in den Coplin-Färbebehälter mit PFA und tupfen Sie den Rand des Objektträgers kurz gegen ein Papiertuch. Nachdem das PFA in kleinen Tropfen entlang der hydrophoben Grenze jedes Quadrats gesammelt wurde (Abbildung 1E), pipettieren Sie 5 μl der Eizell-Saccharose-Lösung in jeden Tropfen PFA.
  14. Verteilen Sie die Eizellen über die quadratischen Abschnitte, indem Sie die Objektträger vorsichtig hin und her kippen. Achten Sie darauf, dass die Lösung von einem Quadrat nicht auf benachbarte Quadrate überschwappt.
  15. Legen Sie den Objektträger in eine feuchte Kammer und fahren Sie mit der Herstellung von Objektträgern fort, bis die Eizell-Saccharose-Lösung erschöpft ist.
  16. Wiederholen Sie die Schritte 1.6 - 1.15, bis alle weiblichen Föten verwendet wurden. Inkubieren Sie die Objektträger in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur für 2 h.
  17. Öffnen Sie nach der Inkubation die Feuchtkammer. Da der größte Teil (wenn nicht sogar alles) der Flüssigkeit/des Fixiermittels noch auf der Objektträgeroberfläche vorhanden sein sollte (ca. 10 μl in jedem quadratischen Abschnitt), übertragen Sie die Objektträger vorsichtig auf ein Papiertuch und lassen Sie die Objektträger vollständig bei Raumtemperatur auf einem Labortisch an der Luft trocknen (dieser Vorgang dauert in der Regel 30 - 60 Minuten, abhängig von der lokalen Luftfeuchtigkeit).
    HINWEIS: Objektträger können auch unter einem Abzug an der Luft getrocknet werden, um eine mögliche Exposition gegenüber PFA-Restdämpfen zu verringern. Dadurch verkürzt sich auch die Trocknung auf ca. 20 - 30 min.
  18. Objektträger in 0,4 % Netzmittel in hochreinem H2O 2 min waschen. Lassen Sie die Objektträger vollständig trocknen.
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Objektträger bei -80 °C gelagert werden. Bestimmte Epitope sind jedoch instabil (z. B. färbt sich MLH1 unserer Erfahrung nach schlecht und die SYCP3-Färbung weist nach dem Einfrieren signifikante Artefakte auf). Es wird dringend empfohlen, Objektträger sofort immungefärbt zu machen.

2. Immunfluoreszenzfärbung von Prophase-I-Chromosomenspreizungen

  1. Bereiten Sie einen 10-fachen Antikörperverdünnungspuffer (ADB; siehe Tabelle 2) vor, der 10 % (v/v) normales Ziegenserum, 3 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) und 0,05 % Triton X-100 in 1 x PBS enthält. Mit einem 0,45 μm Filter sterilisieren und bis zu 2 Wochen bei 4 °C lagern.
  2. Waschen Sie die Objektträger in einem Coplin-Färbeglas mit 0,4 % Netzmittel in 1x PBS für 10 min. Waschen Sie die Objektträger in einem Coplin-Färbeglas mit 0,1 % Triton X-100 in 1x PBS für 10 Minuten. Objektträger in einem Coplin-Färbeglas mit 1x ADB für 10 min blockieren.
  3. Verdünnen Sie ausgewählte Primärantikörper in 10x ADB (siehe Materialtabelle für eine Liste der Antikörper und ihrer jeweiligen Verdünnungen).
    1. Bereiten Sie vier Kombinationen von Antikörpern für die Multiplex-Immunfärbung vor: (1) SYCP332,33, SYCP133, HORMAD133; (2) SYCP332,33, RAD5132,33, MLH332; (3) SYCP332,33, MSH432, MLH332; und (4) SYCP334, MLH1 32,33,34, CREST 35.
  4. Entfernen Sie die Objektträger aus der ADB, klopfen Sie überschüssige Flüssigkeit ab und legen Sie die Objektträger in eine befeuchtete Kammer mit Wasser bei Raumtemperatur. Tragen Sie 30 μl verdünnte Antikörper pro Quadratabschnitt jedes Objektträgers auf und achten Sie darauf, dass Antikörper aus einem Quadrat nicht in benachbarte Quadrate überschwappen.
  5. Schließen Sie die Befeuchtungskammer und lassen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren.
  6. Öffnen Sie am nächsten Morgen die Feuchtkammer und klopfen Sie die verdünnten Antikörper von den Objektträgern ab. Wiederholen Sie Schritt 2.2.
  7. Verdünnen Sie ausgewählte Sekundärantikörper in 10x ADB (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt sind Objektträger und Antikörper lichtempfindlich. Schließe alle nachfolgenden Inkubationen im Dunkeln ab.
  8. Entfernen Sie die Objektträger aus dem ADB, klopfen Sie überschüssige Flüssigkeit ab und legen Sie die Objektträger in eine befeuchtete Kammer mit Wasser bei Raumtemperatur. Tragen Sie 30 μl ausgewählter verdünnter Antikörper pro quadratischem Querschnitt jedes Objektträgers auf und achten Sie darauf, dass Antikörper aus einem Quadrat nicht in benachbarte Quadrate überschwappen.
  9. Schließen Sie die Befeuchtungskammer und lassen Sie die Objektträger 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.
  10. Objektträger 3x für je 5 min in Coplin-Färbegläsern mit 0,4 % Netzmittel in 1x PBS waschen. Waschen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in einem Coplin-Färbeglas mit 0,4 % Netzmittel in hochreinem H2O.
  11. Tragen Sie einen kleinen Tropfen (ca. 10 μl) Antifading-Eindeckmedium mit 4', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) oder einer gleichwertigen Nukleinsäurefärbung auf. Legen Sie auf jeden Objektträger ein 60 mm x 24 mm großes Glasdeckglas Nr. 1,5 und tupfen Sie überschüssige Flüssigkeit vorsichtig ab.
    HINWEIS: Die Dias können entweder mit klarem Nagellack oder Gummizement versiegelt werden. Bei Verwendung eines aushärtenden Eindeckmittels ist eine Abdichtung der Objektträger nicht erforderlich. Die Objektträger sollten in einer Objektträgerbox oder einem Ordner bei 4 °C aufbewahrt werden. Obwohl es am besten ist, Objektträger kurz nach der Färbung abzubilden, können Objektträger, die im Dunkeln bei 4 °C gelagert werden, unserer Erfahrung nach ihre Signalintensität über mehrere Monate bis zu einem Jahr behalten. Für eine längerfristige Lagerung können Dias mehrere Jahre lang bei -20 °C aufbewahrt werden, ohne dass die Signalqualität wesentlich beeinträchtigt wird.
  12. Abbildung von Zellen bei 63x mittels Epifluoreszenzmikroskopie (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie eine Bildanalysesoftware (z. B. Zen von ImageJ, siehe Materialtabelle), um die SC-Länge und die Fluoreszenzintensität aller Kanäle entlang der Achse zu messen. Verfolgen Sie die Länge jeder Chromosomenachse (SYCP3), beginnend am Zentromer (CREST- oder DAPI-dichte Region).
    1. Für die Analyse von HORMAD1 und SYCP1 ist die Länge der Fluoreszenzsignalpeaks aufzuzeichnen. Berechnen Sie die Gesamtlängen der HORMAD1- oder SYCP1-Peaks und dividieren Sie diese durch die Länge der Chromosomenachse.
    2. Für die Analyse von MSH4 ist die Anzahl der Fluoreszenzsignalpeaks für jede Messung von SYCP3 zu quantifizieren. Notieren Sie sowohl die Gesamtzahl der MSH4-Peaks pro Zellkern als auch die Anzahl der MSH4-Peaks, die MLH3-Peaks überlappen. Bestätigen Sie die Anzahl von MSH4, indem Sie die Peaks mit der entsprechenden Foki-Anzahl vergleichen.

3. Diakinese/Prometaphase-Präparate zur Beobachtung von Chiasmen

  1. Um die Ausbeute an meiotisch kompetenten Eizellen zu maximieren, verwenden Sie juvenile weibliche Mäuse (25 - 28 Tage alt).
    HINWEIS: Eine Stimulation durch intraperitoneale Injektion von 5 I.E. Serumgonadotropin (PMSG) an weibliche Mäuse 48 h vor der Eizellentnahme kann durchgeführt werden, um die Ausbeute zu erhöhen. Für die Zwecke der Chiasmata-Analyse können jedoch ausreichend Keimbläschen-Eizellen (GV) von nicht stimulierten Weibchen entnommen werden.
  2. Bereiten Sie vor dem Opfern von Mäusen die folgenden Reagenzien und Lösungen vor.
    1. Lassen Sie M2 (3 mL pro Maus) und KSOM (1 mL pro Maus) in einem Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO2) mindestens 1 h lang äquilibrieren.
      HINWEIS: Röhrchen mit Aliquoten für gefrorene Medien können am Abend vor der Eizellentnahme mit gelockerten Deckeln in den Inkubator gelegt werden, so dass eine Äquilibrierung von etwa 14 Stunden möglich ist.
    2. Bereiten Sie M2-Medien mit 2,5 μM Milrinon vor (einem Phosphodiesterase-Isoenzym-Inhibitor, der die Wiederaufnahme der Meiotisierung verhindert)36. Pipettieren Sie fünf 20-μl-Tropfen M2 + Milrinon in eine 35-mm-Petrischale und überziehen Sie sie mit leichtem Mineralöl (Abbildung 2C).
    3. Pipettieren Sie fünf 20-μl-KSOM-Tropfen in eine 35-mm-Petrischale und überlagern Sie sie mit leichtem Mineralöl (Abbildung 2C).
      ACHTUNG: Die Kontrolle der Temperatur und des pH-Werts ist entscheidend für die In-vitro-Reifung von Eizellen. Die Entnahme der Eizellen sollte auf einer beheizten (37 °C) Tischplatte erfolgen. Alle Medien sollten bis zu ihrer Verwendung im Inkubator aufbewahrt werden, und die Schalen mit den Medien sollten nacheinander entfernt werden, um Störungen durch den Kontakt mit der Umgebungsluft zu vermeiden.
    4. Mikroskopische Objektträger aus Glas mit 70% Ethanol reinigen und an der Luft trocknen lassen. Ritzen Sie auf der Rückseite von Objektträgern aus Glas leicht ein Raster (mit einem Diamantstift) oder zeichnen Sie (mit einer wasserfesten Tinte) ein 5 x 5 Raster von ~ 4 mm x 4 mm Quadraten (ein Beispiel ist in Abbildung 2B dargestellt und kann zum Nachzeichnen des Rasters verwendet werden).
  3. Sammeln Sie Eizellen von jeweils einer Maus. Opfern Sie eine weibliche Maus durch CO2 -Erstickung und Gebärmutterhalsluxation gemäß den IACUC-Richtlinien.
  4. Verwenden Sie eine Präparierschere, um die Bauchhöhle zu öffnen. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um den Darm zu verdrängen.
  5. Folgen Sie jedem Gebärmutterhorn von der Blase in Richtung Niere. Eierstöcke und Eileiter werden mit einem kleinen Fettpolster in der Nähe der Niere in Verbindung gebracht.
  6. Verwenden Sie eine Mikrodissektionsschere, um die Eierstöcke zu entfernen, und legen Sie sie in ein mit Milrinon begastes M2-Medium.
  7. Verwenden Sie eine Mikrodissektionsschere, um sämtliches Fett und anderes Gewebe (einschließlich des Schleimbeutels) aus den Eierstöcken zu entfernen. Verwenden Sie 25G-Nadeln, um Antralfollikel zu reißen.
  8. Verteilen Sie die Eizellen in M2 + Milrinon mit einer Transferpipette in einer dünnen Schicht in einer 100-mm-Petrischale, wobei Sie darauf achten müssen, dass das Medium nicht mit den Seiten der Schale in Berührung kommt (Abbildung 2C).
  9. Verwenden Sie ein Präpariermikroskop (Vergrößerung 25x - 50x), um GV-Eizellen sichtbar zu machen (Abbildung 2F). GV-Eizellen können mit Kumuluszellen in einem Kumulus-Oozyten-Komplex (KOK) assoziiert sein. Entfernen Sie Kumuluszellen durch wiederholtes Pipettieren.
  10. Entnahme von GV-Eizellen mit einer mundbetriebenen Glaspipette (100 - 150 μm Durchmesser; Abbildung 2A). Übertragen Sie GV-Eizellen in einen 20-μl-Tropfen M2 + Milrinon, der mit leichtem Mineralöl überzogen ist (Abbildung 2C). Geben Sie nicht mehr als 30 Eizellen in einen einzigen Tropfen.
  11. Wenn alle GV-Eizellen entnommen wurden, passieren Sie sie mit zwei oder drei 20-μl-Tropfen M2 + Milrinon, die mit leichtem Mineralöl überzogen sind, um somatische Zellen zu entfernen.
  12. Übertragen Sie GV-Eizellen (mit so wenig Medien wie möglich) in einen 30 μl Tropfen KSOM. Waschen Sie das Milrinon aus, indem Sie die Eizellen durch fünf KSOM-Tropfen leiten (Abbildung 2C).
  13. Übertragen Sie alle GV-Eizellen in 20 μl Tropfen KSOM, die mit leichtem Mineralöl überzogen sind, maximal 30 Eizellen pro KSOM-Tropfen (Abbildung 2C). Legen Sie die Eizellen in einen Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO2).
  14. Inkubieren Sie die Eizellen für ca. 5 Stunden.
    ANMERKUNG: GV-Zerfall (Markierung des Verschwindens der Kernhülle und Wiederaufnahme der meiotischen Hülle); Abbildung 2G) tritt typischerweise nach 2 Stunden in Kultur auf, aber die Geschwindigkeit der Eizellreifung kann je nach Mausstamm oder Hormonstimulation variieren. Unserer Erfahrung nach sind insgesamt 5 h in Kultur bei den meisten Mausstämmen am besten für Chiasmata-Ausbreitung optimiert. Wenn man sie zu lange reifen lässt, kann es zur ersten meiotischen Teilung und Polkörperextrusion kommen (Abbildung 2H).
  15. 5 - 10 Eizellen (mit so wenig KSOM wie möglich) in einen 30 μl Tropfen hypotoner Lösung (0,9 % Natriumcitrat in hochreinem H2O) überführen. Inkubieren Sie die Eizellen in der hypotonen Lösung für 5 - 10 min.
  16. Pipettieren Sie einen kleinen Tropfen (~ 1 μL) angesäuertes Wasser (8 Tropfen Eisessig in 50 mL ultrareines H2O) auf eines der Quadrate auf den vorbereiteten Objektträgern (Abbildung 2B).
  17. Verwenden Sie eine mundbetriebene Glaspipette mit einem Durchmesser von 100 - 150 μm, um schnell eine Eizelle vom Wasser auf den angesäuerten Wassertropfen zu übertragen. Übertragen Sie so wenig hypotonische Lösung wie möglich mit der Eizelle. Entferne mit derselben Pipette einen Teil der Flüssigkeit, bis die Eizelle am Objektträger klebt.
    HINWEIS: Das Volumen der Flüssigkeit um die Eizelle herum ist entscheidend. Es sollte so viel Flüssigkeit vorhanden sein, dass die Eizelle vor der Fixierung nicht austrocknet, aber nicht so viel, dass die Eizelle nicht am Objektträger haften kann.
  18. Wechseln Sie schnell zu einer Glaspipettenspitze mit einem Durchmesser von 150 μm. Geben Sie einen Tropfen frisches Carnoy's Fixiermittel (drei Teile absolutes Methanol auf einen Teil Eisessig) in die Eizelle. Lassen Sie das Fixiermittel über den Objektträger verteilen. Die Eizelle sollte weniger deutlich zu werden scheinen und schmelzen, wenn die Säure aus dem Fixiermittel die Zona pellucida auflöst und die Zellen platzen.
  19. Wenn sich die Vorderseite des Fixiermittels zusammenzuziehen beginnt, fügen Sie schnell 2 - 3 weitere Tropfen Fixiermittel hinzu. Blasen Sie vorsichtig auf den Objektträger, um das Trocknen zu beschleunigen.
  20. Wiederholen Sie die Schritte 3.16 - 3.19 mit weiteren Eizellen aus der hypotonen Lösung.
  21. Wiederholen Sie die Schritte 3.15 - 3.20, bis alle Eizellen fixiert sind. Überprüfen Sie die Ausbreitung der Chromosomen mit einem Phasenkontrastmikroskop.
  22. Wenn der Objektträger vollständig an der Luft getrocknet ist, legen Sie den Objektträger in ein Coplin-Färbeglas mit 50 mL 4 % Giemsa (v/v) in ddH2O. Färben Sie Objektträger in Giemsa für 6 min bei Raumtemperatur.
  23. Waschen Sie die Objektträger 3x für je 3 min in ddH2O bei Raumtemperatur. Lassen Sie die Objektträger vollständig trocknen.
  24. Tragen Sie eine dünne Schicht (~60 μl) Permount auf einen 60 mm x 24 mm großen Glasdeckglas Nr. 1,5 auf. Montieren Sie Dias, indem Sie sie auf die Deckgläser drehen und überschüssige Flüssigkeit vorsichtig auswischen. Lassen Sie die Objektträger über Nacht trocknen, bevor Sie mit 63x im Hellfeld fotografieren.

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Ergebnisse

Bewertung von Synapsendefekten in pachytenähnlichen Zellen
Dieses Experiment untersucht Synapsendefekte in Pachyten-Eizellen und überwacht das Fortschreiten der Prophase I (Abbildung 3A). Die Immunfärbung von SYCP3 (axiale/laterale SC-Elemente), SYCP1 (zentrales SC-Element) und HORMAD1 (unsynapsierte/desynapsierte Chromosomenachsen) ermöglicht das Staging und die Beurteilung der Synapse. HORMAD1 kolokalisi...

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Diskussion

Säugetier-Eizellen sind im Vergleich zu Spermatozyten besonders fehleranfällig. Während der weniger effiziente Spindelanordnungs-Checkpoint (SAC) der Eizelle zu dieser Schwachstelle beiträgt 14,52,53, schlagen Hassold und Hunt vor, dass Mehrfachtreffer zu Aneuploidie führen, wobei eine defekte Rekombination ein primärer Faktor ist 54. Humanstudien bringen Aneuploidie mit ...

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Offenlegungen

Der Autor hat keine Konflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Finanzierung dieses Projekts erfolgte durch einen K99-Preis des Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Development (HD112986 to TH).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,45 μ m SpritzenfilterMillipore SigmaSLHAR33SBzur Herstellung von mundbetriebener Pipette
0,5 M EDTA, pH 8,0Corning46-034-CI für HEB
1 ml sterile Spritze mit 25-Gauge, 16 mm NadelFisher Scientific14-817-125 Für das Platzen der Eierstöcke
100 x 15 mm PetrischüsselVWR25384-302 
14,6 cm Einweg-Borosilikatglas-Pasteur-PipettenFisher Scientific13-678-20B zur Herstellung von mundbetriebener Pipette
35 x 10 mm PetrischaleCorning351008
40 mm x 0,45 mm #3 Edelstahlstifte für EntomologieAmazonB0CSSPW5S7zum Feststecken von fetalen Mäusen zur Dissektion
Essigsäure, glazialFisher ScientificA38-212für Carnoys Fixativ
Aspiratorrohr-Baugruppen für kalibrierte MikrokapillarpipettenMillipore SigmaA5177-5EAzur Herstellung von mundbetriebener Pipette
B.P.I. Watch GlassNDS Technologies 1580-00Alternativ verwenden Sie eine 30 mm breite x 12 mm tiefe Embryoschale (Electron Microscopy Sciences SKU: 70543-30).
BorsäureFisher ScientificBP168-1zur Anpassung des pH-Werts von HEB, PFA
Rinderserum-AlbuminMillipore SigmaA7906-100Gfür ADB
CO2-Tankfür den Inkubator
Corning-Mikroskop-ObjektträgerMillipore SigmaCLS294875X25L x W 75 mm x 25 mm, eine Seite mattiert
Corning-Mikroskop-Objektträger, mit Frost an einer Seite, an einem EndeVWR294875X25
Deckglas rechteckig. 60 x 24 mm, #1,5VWR48393-251
SeziertellerElektronenmikroskopiewissenschaften70540
SektionsmikroskopJedes Standardmodell
Sektionsschere, scharfe Spitze, 10,5 cmVWR82027-578
Besonders feine, scharfe Spitzen-TangenVWR76548-836
Giemsa StainMillipore SigmaGS500-500Zur Färbung von Chiasmaten-Ausbreitungen
ImmEdge hydrophobe Barriere PAP-StiftVektorlaboreH-4000
InkubatorJedes Standardmodell mit CO2- und wasserummantelter Technologie
IVF-ArbeitsstationK-SystemsJedes Modell mit beheizter Arbeitsplatte
Kodak Photo-Flo 200 LösungBH Foto & Video1464510für Slide-Washes
MethanolFisher ScientificA412-4für Carnoys Fixativ
MP Biomedicals Coplin-FärbeglasFisher ScientificICN17006201
Normales ZiegenserumGibco16210-072für ADB
Paraformaldehyd, EM-Qualität, gereinigter PrillElektronenmikroskopiewissenschaften19200
PermountFisher ScientificSP15-100for  Montage-Objektträger für Chiasmata-Spreads
ProLong Glass Antifade Mountant mit NucBlue StainThermowissenschaftlichP36985zum Anbringen immungefärbter Objektträger
Silikonrohr, Innendurchmesser: 0,125", Außendurchmesser: 0,25"VWR89068-474zur Herstellung von mundbetriebener Pipette
Natriumcitrat-DihydratFisher ScientificS279-500für HEB, hypotonische Lösung
StainTray Folien-FärbesystemElektronenmikroskopiewissenschaften71396-BZur Nutzung als befeuchtete Kammer. Man muss den schwarzen Deckel für die Immunfluoreszenzfärbung verwenden. Alternativ kann man den Boden einer undurchsichtigen Folienbox oder Tupper-Ware mit feuchten Papiertüchern auslegen, um sie als befeuchtete Kammer zu verwenden;
Stripper-Spitzen – 100Cooper ChirurgieMXL3-100für mundbetriebene Pipette
Stripper-Spitzen – 150Cooper ChirurgieMXL3-150für mundbetriebene Pipette
SucroseMillipore SigmaS-8501für HEB, sukkrosagenhypotonische Lösung
Tris BaseFisher ScientificBP152-5für HEB
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100 für PFA, ADB und Triton-PBS
United Scientific Coplin-FärbeglasFisher ScientificS17495AUndurchsichtiger weißer Kunststoff für Washes und Blockieren von Objektträgern nach Zugabe photosensitiver sekundärer Antikörper
United Scientific Glas-Konkavitäts-ObjektträgerFisher ScientificS1395331,3 mm dick, 2 Brunnen zählen
Vannas Mikrodissektionsschere 5 mm geradeVWR76457-358
Zeiss Axio Imager.Z2, Colibri 7Carl Zeiss000000-2624-307
Zen Blue 3.11 SoftwareCarl ZeissBildaufnahme- und Analysesoftware
Antikörper
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')? Fragment-Ziegen-Anti-Maus-IgG, Fc-Fragment-spezifischJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-546-071verwendete 1:1.000-Verdünnung
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')? Fragment Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, Fc-Fragment-spezifischJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.111-546-046verwendete 1:1.000-Verdünnung
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')? Fragmentziegen-antimenschliches IgG, Fcγ fragmentspezifischJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.109-606-170verwendete 1:1.000-Verdünnung
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Meerschweinchen IgG, Fc-Fragment-SpezifikationJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.106-605-008verwendete 1:1.000-Verdünnung
Meerschweinchen anti-MLH3 pAbmaßgefertigt mit Thermo-Fisher, verwendet 1:500 Verdünnung
Meerschweinchen anti-SYCP1 pAbvon Christer Hö ö g (Kouznetsova et al. 2005), verwendete 1:200-Verdünnung
Humanes Anti-Centromer-Protein pAbAntikörper Inc.15-234verwendete 1:1.000-Verdünnung
Maus anti-MLH1 mAbBD Biosciences550838Verwendete 1:100-Verdünnung
Maus anti-SYCP3 mAbAbcamab97672verwendete 1:1.000-Verdünnung
Kaninchen-Anti-HORMAD1 pAbProteintech13917-1-APverwendete 1:500-Verdünnung
Kaninchen-Anti-MSH4 pAbAbklonalA8556Verwendete 1:100-Verdünnung
Kaninchen anti-RAD51 pAbMilliporePC130verwendete 1:500-Verdünnung
Kaninchen anti-SYCP3 pAbAbcamab15093verwendete 1:1.000-Verdünnung
Rhodamin Red-X (RRX) AffiniPure F(ab')? Fragment-Ziegen-Anti-Maus-IgG, Fc-Fragment-spezifischJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-296-071verwendete 1:1.000-Verdünnung
Rhodamin Red-X (RRX) AffiniPure F(ab')? Fragment Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, Fc-Fragment-spezifischJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.111-296-046verwendete 1:1.000-Verdünnung

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